專利名稱：使用多糖分離物質(zhì)混合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離物質(zhì)混合物，特別是對(duì)映體的方法，其中使用化學(xué)和物理未改性的、不溶于水的、直鏈多糖的球狀微粒作為分離材料。
色譜法是一種完全分離混合物各組分，特別是分離類似化合物例如立體異構(gòu)體的混合物的有效方法。由于越來(lái)越關(guān)注用于藥物和生物化學(xué)的活性物質(zhì)和農(nóng)作物保護(hù)劑的純對(duì)映體，所以對(duì)對(duì)映體化合物的色譜分離是特別感興趣的。為了純化這些化合物，一直在研究開(kāi)發(fā)改進(jìn)方法和尋求更好的分離材料，特別是多糖纖維素和淀粉基的分離材料，這是二種易于獲得和廉價(jià)的含手性原子的聚合物。
因此，《色譜》65，(Chromatography 65)，LaborPraxis，730-738(1990)，概述了與三乙酰纖維素相比，在色譜法中使用顆粒尺寸是10至20微米的微晶三苯甲酰纖維素作為對(duì)映體分離的吸附劑。這二種物質(zhì)可用于分析和制備分離。它們可以通過(guò)纖維素的衍生來(lái)獲得。不使用未改性的聚合物。為了避免死體積和在操作過(guò)程中柱的致密，加入尺寸最大為5微米的相對(duì)小的顆粒被認(rèn)為是所希望的。
WO95／05879同樣涉及通過(guò)液相色譜法分離對(duì)映體的方法。這里特別值得注意的是用于改善分離效率的流動(dòng)相。固定相是纖維素和直鏈淀粉的氨基甲酸酯衍生物和纖維素的酯衍生物。
DE-A-4317139描述了一種借助于制備氣相色譜法分離吸入麻醉劑的對(duì)映體的特殊方法。固定相是在多孔載體材料(紅色硅藻土色譜載體)上的聚硅氧烷溶液中的酯基衍生的環(huán)糊精。為了獲得合適的分離材料，必須對(duì)環(huán)糊精進(jìn)行化學(xué)改性，溶解在聚硅氧烷中并固定在合適的載體材料上。
US5，403，898采用含環(huán)糊精衍生物的聚硅氧烷作為分析和制備氣相色譜法(GC)、色譜法(LC)中的手性固定相。這些全烷基環(huán)糊精化學(xué)鍵合在聚硅氧烷上。所使用的這些材料因此可以通過(guò)環(huán)糊精的化學(xué)改性和隨后在硅氧烷上的化學(xué)固定而獲得。
在US5，302，633中，為了實(shí)現(xiàn)手性固定相的不溶解性，首先將多糖(例如纖維素)的乙烯衍生物吸附在多孔載體(例如硅膠)的表面，然后進(jìn)行聚合反應(yīng)。第二種方案是使含乙烯基的多孔載體(例如改性的硅膠)與多糖的乙烯衍生物進(jìn)行共聚反應(yīng)。同樣這里需要進(jìn)行化學(xué)改性以便獲得合適的分離材料。
EP-B-O157365描述了用于對(duì)映體和異構(gòu)體分離和用于凝膠滲透色譜法的基于多糖氨基甲酸酯衍生物的固定相。合適的多糖是纖維素、直鏈淀粉、脫乙酰殼多糖、木聚糖、葡聚糖和菊粉。這里可以直接或者在物理或化學(xué)固定在多孔載體上之后使用制備的顆粒直徑是1微米至300微米的粉末。因此也需要化學(xué)改性以獲得合適的分離材料。
在DE-C2655292和DE-C2555361中，使用由葡聚糖衍生物制備的多孔凝膠作為電泳分離材料中的分離介質(zhì)。為了獲得不溶解性，含乙烯基的葡聚糖衍生物必須通過(guò)自由基聚合反應(yīng)進(jìn)行交聯(lián)。
因此，已經(jīng)已知許多在色譜分離方法中使用的多糖。然而，為了獲得好的分離性能、顆粒尺寸分布、溶劑穩(wěn)定性和耐溶劑性，總是必須對(duì)它們進(jìn)行化學(xué)和／或物理改性。這點(diǎn)也涉及到成本的提高。
術(shù)語(yǔ)化學(xué)和／或物理改性特別地理解為通過(guò)引入特定基團(tuán)的衍生化、在載體材料上的共價(jià)鍵固定和隨后的化學(xué)和／或物理交聯(lián)。
因此，本發(fā)明的目的是通過(guò)避免所使用的分離材料的化學(xué)和物理改性使分離方法簡(jiǎn)單化并降低成本。
本發(fā)明的目的是通過(guò)一種物質(zhì)混合物的色譜分離方法實(shí)現(xiàn)的，在該方法中使用未進(jìn)行化學(xué)和物理改性的、不溶于水的、直鏈多糖的球狀微粒(以下稱作本發(fā)明的分離材料)作為分離材料。
術(shù)語(yǔ)“球狀微?！睉?yīng)該理解為大體呈球形的微粒。在通過(guò)以共同的起點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)的在指向空間上等長(zhǎng)軸線(其被定義為在所有空間方向上的球體半徑)描述球形時(shí)，對(duì)于球狀微粒來(lái)說(shuō)軸長(zhǎng)度的偏差可以是1至40％。優(yōu)選獲得偏差最高達(dá)25％，特別優(yōu)選最高達(dá)15％的球狀微粒。球狀微粒的表面在宏觀上可與覆盆子果(Himbeere)的表面相比，這里“凹陷處”或“凹處”的深度最大應(yīng)是球狀微粒平均直徑的20％。附

圖1至4表示所使用的球狀微粒的掃描電鏡(SEM)的顯微圖(Camscan S-4)。
此外，回避對(duì)直鏈多糖進(jìn)行化學(xué)和物理改性可以避免高成本的處理步驟，因此將提高色譜法的經(jīng)濟(jì)性。另一優(yōu)點(diǎn)是色譜法非常好的再現(xiàn)性。
術(shù)語(yǔ)“物理改性”不能理解為常規(guī)的加工步驟，例如攪拌、離心、懸浮等。
根據(jù)本發(fā)明直鏈多糖可以是聚葡聚糖(polyglucane)或其它直鏈多糖，例如支鏈淀粉、果膠、甘露聚糖或聚果聚糖(Polyfructane)。然而，特別優(yōu)選的是聚(1，4-α-D-葡聚糖)。
本發(fā)明的分離材料可用于物質(zhì)混合物，特別優(yōu)選是立體異構(gòu)體，更優(yōu)選是對(duì)映體的色譜分離。因此，特別感興趣的是在制備和分析色譜法，例如氣相色譜法，制備和分析薄層色譜法和特別是高效液相色譜法(HPLC)中使用本發(fā)明的分離材料。同樣感興趣地是在凝膠滲透色譜法(GPC)中使用本發(fā)明的分離材料來(lái)分離具有不同分子量的聚合物。同樣屬于本發(fā)明范圍的應(yīng)用是通過(guò)與低分子量或聚合化合物的特定或非特定的相互作用從溶液、乳液或懸浮液中分離物質(zhì)。然而，同樣該應(yīng)用對(duì)離子型化合物，特別是金屬陽(yáng)離子也是感興趣的。特別地，由于與多糖結(jié)構(gòu)的類似性，在分離單糖、二糖和低聚糖中可以獲得特別的效果。
同樣由于本發(fā)明分離材料的生物相容性，本發(fā)明也涉及水處理，特別是廢水處理，生物材料的分析，特別是血液和血清，或者例如基因材料(核苷酸)或其它生物化合物(例如寡核苷酸、肽或蛋白質(zhì))的分離或除去。
在本發(fā)明的意義上，術(shù)語(yǔ)“色譜法”應(yīng)該理解為物理分離方法，其中物質(zhì)的分離是通過(guò)在固定相和流動(dòng)相之間的分配和／或吸附進(jìn)行的。在本發(fā)明的范圍中，本發(fā)明的分離材料，優(yōu)選是聚(1，4-α-D-葡聚糖)，作為固定相使用，并與液體和／或氣體的流動(dòng)相結(jié)合。因此，特別的實(shí)施方案是HPLC、GPC、GC、TLC和其它或可能的色譜法或類色譜法的分類說(shuō)明。原則上，本發(fā)明可用于任何色譜法。
HPLC表示高效或高壓液相色譜法。在HPLC中，使用非常細(xì)的材料(3至10微米)，因?yàn)殡S著固定相顆粒尺寸的降低柱的分離效率提高。分離材料的細(xì)顆粒特性需要高的壓力(最高達(dá)400巴)。
在同樣可以作為HPLC操作的凝膠滲透色譜法(GPC)(也被稱作凝膠過(guò)濾色譜法)中，固定相由具有雜多孔溶脹網(wǎng)結(jié)構(gòu)的其孔尺寸分布在幾個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)變化的珠子組成，這樣通過(guò)分子尺寸進(jìn)行分級(jí)分離，這可以快速測(cè)定聚合物的分子尺寸分布。
氣相色譜法(GC)用于分離呈氣態(tài)或者可以蒸發(fā)而不分解的物質(zhì)混合物，其中使用氣體流動(dòng)相。氣相色譜法分析首先是在恒溫的分離柱中施加氣體、揮發(fā)性液體或揮發(fā)性固體。借助于載體氣體(He、N2或H2)輸送物質(zhì)通過(guò)該柱，在柱中發(fā)生色譜分離。
薄層色譜法(TLC)是一種采用多步分配過(guò)程的色譜法，其中固定相(這里分離材料被稱為吸附劑)以薄層的形式固定在合適的載體，例如玻璃、聚酯或鋁上。在該薄層上通過(guò)洗脫液(流動(dòng)相)的洗脫進(jìn)行分離。
因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的分離材料，其本身包含未化學(xué)和物理改性的、不溶于水的、直鏈多糖和任選的其它助劑、添加劑和載體材料的球狀微粒。
此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明分離材料和任選的其它助劑和添加劑的應(yīng)用，就其作為過(guò)濾器介質(zhì)或吸附劑而言用于除去或截留物質(zhì)(參見(jiàn)直鏈多糖是由單糖、二糖或其它單體單元以這種方式即單糖、二糖或其它單體單元總是以相同的方式相互連接而構(gòu)成的多糖。以這種方式定義的每一個(gè)基本單元或者構(gòu)件正好具有二個(gè)鍵，在每種情況下用于一個(gè)單體與另一個(gè)單體鍵合。但其中排除構(gòu)成多糖的前端和末端的二個(gè)基本單元。這兩個(gè)基本單元僅具有一個(gè)用于與另一個(gè)單體鍵合的鍵。在三個(gè)鍵(共價(jià)鍵)的情況下涉及支化。不出現(xiàn)支化或僅小范圍地出現(xiàn)支化，這樣在非常小的支化比例下常規(guī)的分析方法不能獲知。
優(yōu)選的不溶于水的直鏈多糖的實(shí)例是直鏈聚-D-葡聚糖，這里鍵的類型是不重要的，只要存在本發(fā)明意義中的線性。實(shí)例是聚(1，4-α-D-葡聚糖)和聚(1，3-β-D-葡聚糖)，這里聚(1，4-α-D-葡聚糖)是特別優(yōu)選的。
如果基本單元具有三個(gè)或更多的鍵，那么采用術(shù)語(yǔ)“支化”。所謂的支化度是指每100個(gè)基本單元中未參與直鏈聚合物骨架的構(gòu)成而形成支鏈的羥基的數(shù)目。
根據(jù)本發(fā)明，直鏈不溶于水的多糖的支化度低于8％，也就是說(shuō)，每100個(gè)基本單元中它們的支鏈低于8。支化度優(yōu)選低于4％，特別是至多1．5％。
如果不溶于水的直鏈多糖是聚葡聚糖，例如聚(1，4-α-D-葡聚糖)，那么在6位上的支化度低于4％，優(yōu)選最大2％，特別優(yōu)選最大0．5％，在不參與直鏈鍵合的其它位置上的支化度，例如在優(yōu)選的聚(1，4-α-D-葡聚糖)中的2或3位的支化度優(yōu)選在每種情況下最大是2％，特別地最大是1％。
特別優(yōu)選的是未支化的或者其支化度太低以致于不能用常規(guī)方法確定的多糖，特別是聚-α-D-葡聚糖。
根據(jù)本發(fā)明，標(biāo)記“α”、“β”或“D”僅指形成聚合物骨架的鍵，而不是支鏈的。
術(shù)語(yǔ)“性質(zhì)相同的多糖”被理解為不是天然以這種形式出現(xiàn)的或者僅在與其它化合物(也可以是聚合物)的混合物中存在的的聚合物。這種性質(zhì)相同的聚合物可以通過(guò)屬于生物技術(shù)和基因工程方法(以其最廣義的意義定義的)范疇的方法來(lái)制備。因此，這首先被理解為如下文所定義生物技術(shù)方法，但也指那些通過(guò)使用和改變例如細(xì)菌、真菌或藻類獲得相應(yīng)化合物的方法。另一方面，該術(shù)語(yǔ)例如也涵蓋通過(guò)將生物技術(shù)或基因工程方法用于高級(jí)植物以從該植物進(jìn)行分離而獲得的多糖。這些植物特別地包括馬鈴著、玉米、谷類、木薯、稻類和豌豆。然而，本發(fā)明在這一方面也包括其它生產(chǎn)多糖的植物。
在本發(fā)明的范圍中，優(yōu)選在生物技術(shù)，特別是生物催化／生物轉(zhuǎn)化或發(fā)酵方法制備的直鏈、不溶于水的多糖。術(shù)語(yǔ)“生物技術(shù)方法”覆蓋所有的生物催化方法(=生物轉(zhuǎn)化方法，即僅通過(guò)酶或與形成胞內(nèi)或胞外蛋白質(zhì)(承擔(dān)該任務(wù))的生物體相結(jié)合可以進(jìn)行的方法)或者采用天然形成的或重組生物體進(jìn)行的發(fā)酵方法。
在本發(fā)明的范圍中，通過(guò)生物催化(即生物轉(zhuǎn)化)制備的直鏈多糖是指使用所謂的生物催化劑，通常是酶，在適合于該反應(yīng)的條件下，通過(guò)單體基本單元例如寡聚糖如單糖和／或二糖的催化反應(yīng)制備的直鏈多糖。
在本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)中，來(lái)自發(fā)酵的直鏈多糖是指通過(guò)使用天然形成的生物體例如真菌、藻類或細(xì)菌或者使用非天然形成的生物體，例如借助于常規(guī)定義的基因工程方法改性的天然生物體例如真菌、藻類或細(xì)菌的發(fā)酵方法制備的直鏈多糖。
此外，為了獲得本發(fā)明中描述的效果，也可以通過(guò)使用一種或多種酶以這樣的方式處理含支鏈的非直鏈多糖來(lái)獲得直鏈多糖，即從多糖的骨架上裂解掉支鏈，在將支鏈除去之后獲得直鏈多糖。這些酶例如是淀粉酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶或葡萄酸水解酶。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“不溶于水的多糖”是指根據(jù)德國(guó)藥典(DeutschenArzneimittelbuch)(DAB=德國(guó)藥典，WissenschaftlicheVerlagsgesellschaft mbH，Stuttgart，Govi-Verlag，F(xiàn)rankfurt，Edition，1987)對(duì)應(yīng)于第4至7組，屬于分類“微溶解”、“難溶解”、“非常難溶解”或“實(shí)際上不溶解”化合物中的化合物。
在使用的本發(fā)明的多糖的情況下這則意味著使用量的至少98％，特別是至少99．5％在標(biāo)準(zhǔn)條件(T=25℃+／-20％，P=101325帕+／-20％)下不溶于水(對(duì)應(yīng)于4或5組)。
對(duì)于本發(fā)明，優(yōu)選難溶解至實(shí)際上不溶解的化合物，特別是非常難溶解至實(shí)際上不溶解的化合物。
對(duì)應(yīng)于組6的“非常難溶解”可以通過(guò)下面的示例性描述來(lái)說(shuō)明在1巴的壓力下，在1升去離子水中將待試驗(yàn)的1克聚葡聚糖／多糖加熱至130℃，獲得的溶液僅短暫地保持幾分鐘的穩(wěn)定。在標(biāo)準(zhǔn)條件下冷卻時(shí)，該物質(zhì)再次沉淀出。在冷卻至室溫并借助于離心法分離之后，在考慮試驗(yàn)損失的情況下，可以至少回收使用量的66％。
均勻球狀微粒的制備優(yōu)選使用的聚(1，4-α-D-葡聚糖)可以各種不同的方法制備。一種非常有利的方法描述在WO95／31553中。其說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的內(nèi)容特意在此引入以供參考。在該方法中，在淀粉蔗糖酶的幫助下，借助于生物催化(生物轉(zhuǎn)化)方法來(lái)制備聚(1，4-α-D-葡聚糖)。聚(1，4-α-D-葡聚糖)也可以通過(guò)生物催化方法，使用多糖合成酶、淀粉合成酶、二醇轉(zhuǎn)移酶、1，4-α-D-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、糖原合成酶或磷酸化酶來(lái)制備。
專利申請(qǐng)DE-A-19737481描述了直鏈、不溶于水的多糖的球狀微粒的制備和它們的分子量和直徑。上述申請(qǐng)?jiān)诖艘胍怨﹨⒖肌?br> 球狀微?？梢匀缦轮苽鋵⒉蝗苡谒闹辨湺嗵?，特別是聚(1，4-α-D-葡聚糖)溶解在溶劑中，特別優(yōu)選溶解在DMSO中，將該溶液加入沉淀劑中，優(yōu)選水中，冷卻獲得的混合物優(yōu)選至10至-10℃，并分離出形成的微粒。伴隨使用合適的添加劑可以改善顆粒的性能，例如尺寸、表面結(jié)構(gòu)、孔隙率等，并且改進(jìn)該方法的進(jìn)行。合適的添加劑的實(shí)例是表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉或N-甲基葡聚糖酰胺(N-Methylglucanoamid)，和糖類，例如果糖、蔗糖和葡萄糖。
球狀微粒的性能本發(fā)明中使用的直鏈多糖的分子量Mw可以在103克／摩爾至107克／摩爾的寬的范圍內(nèi)變化。對(duì)于優(yōu)選的直鏈多糖聚(1，4-α-D-葡聚糖)來(lái)說(shuō)，其分子量Mw優(yōu)選是104克／摩爾至105克／摩爾，特別是2×104克／摩爾至5×104克／摩爾。分子量Mw表示重均分子量，是與使用直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)的校正值相比通過(guò)凝膠滲透色譜法測(cè)定的。
顆粒的平均直徑(數(shù)均)是1納米至100微米，優(yōu)選是100納米至10微米，特別優(yōu)選是1微米至5微米。直徑分布因高的均勻性而出色。
聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒因比表面積是1平方米2／克至100平方米2／克，特別優(yōu)選是3平方米2／克至10平方米2／克而出色。
微粒在各種不同溶劑中的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，大量不同的溶劑均適合于在本發(fā)明的色譜法中使用。所使用的充當(dāng)洗脫液的溶劑例如是正己烷、二氯甲烷、四氫呋喃、1，4-二噁烷、乙醇、丙酮、乙腈、甲醇、正庚烷和水。
色譜法在色譜法中，本發(fā)明的由直鏈多糖，特別是聚(1，4-α-D-葡聚糖)制成的微粒尤其懸浮在溶劑，例如正庚烷中，借助于Ultraturrax充分?jǐn)嚢?，在超聲浴中脫氣。將該懸浮液加入柱中，并通過(guò)反復(fù)輕拍、反復(fù)振動(dòng)和在超聲浴中短時(shí)處理以便均勻和密實(shí)地填充以獲得具有低比例死體積的填充。分離在現(xiàn)有技術(shù)中相應(yīng)地用于HPLC的色譜裝置中進(jìn)行。試樣濃度是2．0至0．025毫克／升溶劑，特別優(yōu)選是0．25至0．05毫克／升溶劑。洗脫速度是2．0至0．25毫升／分鐘，優(yōu)選1．0至0．4毫升／分鐘，特別優(yōu)選是0．5毫升／分鐘。這些數(shù)據(jù)可以根據(jù)使用的溶劑改變。使用的壓力主要取決于溶劑的極性。它們通常是30巴至200巴。例如測(cè)試的壓力是乙腈是138至159巴，乙酸乙酯是約100巴，叔丁基甲基醚是約62巴和正庚烷是54-70巴。例如可以使用內(nèi)標(biāo)，例如1，3，5-三叔丁基苯。
附圖的描述附圖1使用的球狀微粒的掃描電子顯微照片(參見(jiàn)實(shí)施例4)，放大倍數(shù)5000x。
附圖2使用的球狀微粒的掃描電子顯微照片(參見(jiàn)實(shí)施例4)，放大倍數(shù)10000x。
附圖3使用的球狀微粒的掃描電子顯微照片(參見(jiàn)實(shí)施例4)，放大倍數(shù)15000x。
附圖4使用的球狀微粒的掃描電子顯微照片(參見(jiàn)實(shí)施例4)，放大倍數(shù)20000x。
附圖5實(shí)施例12中描述的瓊脂糖凝膠(在256納米下使用0．5pg／ml溴化乙錠檢測(cè))，注意標(biāo)題。
附圖6實(shí)施例12中描述的瓊脂糖凝膠(在256納米下使用0．5pg／ml溴化乙錠檢測(cè))，注意標(biāo)題。
下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不是將本發(fā)明限于這些實(shí)施例實(shí)施例1采用淀粉蔗糖酶以生物催化方法體外制備直鏈不溶于水的多糖，例如聚(1，4-α-D-葡聚糖)將10升20％的蔗糖溶液加入15升的無(wú)菌容器中。一次加入包含淀粉蔗糖酶的酶提取物。在該試驗(yàn)中酶的活性是20單位(1單位=1μmol蔗糖×min-1×mg酶)。該裝置配有同樣是無(wú)菌的KPG攪拌器。將該容器密閉，儲(chǔ)存在37℃下并攪拌。在僅幾個(gè)小時(shí)之后，形成白色沉淀。在96小時(shí)之后，反應(yīng)結(jié)束。過(guò)濾出沉淀物，反復(fù)用水洗滌以便除去低分子量的糖。借助于膜式泵(Firma Vacuubrand GmbH＆Co．，CVC2)，在干燥櫥中，在40℃下，在施加真空的條件下干燥過(guò)濾器中遺留的殘?jiān)?。重量?51克(產(chǎn)率65％)。
實(shí)施例2測(cè)定實(shí)施例1中由淀粉蔗糖酶合成的不溶于水的聚(1，4-α-D-葡聚糖)的分子量在室溫下，將來(lái)自實(shí)施例1的2毫克聚(1，4-α-D-葡聚糖)溶解在二甲基亞砜(DMSO，Riedel-de-Haen)并過(guò)濾(2微米過(guò)濾器)。將部分該溶液注射到凝膠滲透色譜柱中。所使用的洗脫液是DMSO。借助于RI檢測(cè)器測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度，并與直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)(Firma PolymerStandard Systems)相比較進(jìn)行評(píng)價(jià)。流動(dòng)速度是1．0毫升／分鐘。測(cè)量的結(jié)果是數(shù)均分子量(Mn)是7000克／摩爾，重均分子量(Mw)是34000克／摩爾。
實(shí)施例3制備聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒
a)在60℃下，在1．5小時(shí)內(nèi)，將400克聚(1，4—α-D-葡聚糖)溶解在2升二甲基亞砜(DMSO，Riedel-de-Haen)中。然后將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。在攪拌下，在2小時(shí)內(nèi)，經(jīng)滴液漏斗將該溶液加入20升二次蒸餾水中。將該批料在4℃下儲(chǔ)存44小時(shí)。形成細(xì)懸浮液。首先通過(guò)潷析上清液分離出顆粒物。將沉積物制漿，并一小部分一小部分地進(jìn)行離心分離(RC5C超速離心機(jī)，每次在5000轉(zhuǎn)／分鐘下旋轉(zhuǎn)5分鐘)。使用二次蒸餾水懸浮固體殘?jiān)?，并再次離心分離，將該過(guò)程再重復(fù)二次。收集固體，將約1000毫升懸浮液冷凍干燥(Christ Delta 1-24KD)。分離出283克白色固體(產(chǎn)率71％)。
b)將收集的上清液在18℃下儲(chǔ)存過(guò)夜。如上所述進(jìn)行加工。進(jìn)一步分離出55克白色固體(產(chǎn)率14％)。
實(shí)施例4借助于電子顯微鏡觀測(cè)實(shí)施例3獲得的微粒為了表征顆粒，拍出掃描電子顯微鏡(SEM)照片(Camscan S-4)。附圖1至4表示顆粒的顯微照片，該照片顯示出它們是球狀的，并且在形狀、尺寸和表面粗糙度方面是非常均勻的。
實(shí)施例5研究實(shí)施例3的顆粒的尺寸分布為了表示實(shí)施例3的顆粒的尺寸分布特征，使用標(biāo)準(zhǔn)篩(MalvernInstruments)進(jìn)行試驗(yàn)。該試驗(yàn)在假定密度是1．080克／立方厘米和體積濃度是0．012至0．014％下以Fraunhofer方式(評(píng)價(jià)多方式，數(shù)目)進(jìn)行。
表1實(shí)施例3的顆粒直徑特性實(shí)施例直徑顆粒分布1No． dn-2Dw-2dw／dn-3d(10％)-4D(50％)-5d(90％)-6(μm)(μm) (μm) (μm) (μm)3a 1，664 4，184 2，541 0，8731，5042，6243b 0，945 2，345 2，481 0，5870，8711，399*1dn數(shù)均直徑*2dw重均直徑*3dw／dn顆粒直徑分散度*4d(10％)所有顆粒的10％的直徑小于標(biāo)示的值*5d(50％)所有顆粒的50％的直徑小于標(biāo)示的值*6d(90％)所有顆粒的90％的直徑小于標(biāo)示的值實(shí)施例6測(cè)定聚(1，4-α-D-葡聚糖)(對(duì)比實(shí)施例)的比表面積和聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒和馬鈴薯淀粉(對(duì)比實(shí)施例)的比表面積使用Sorptomatic 1990(Fa．Fisons Instruments)測(cè)量比表面積。使用“Default method sorptomatic”方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于該試驗(yàn)，在減壓下將試樣在80℃下干燥過(guò)夜(來(lái)自Firma Vacuubrand GmbH＆Co．，CVC2的膜式泵)。事先對(duì)馬鈴薯淀粉和直接由生物轉(zhuǎn)化法獲得的聚(1，4-α-D-葡聚糖)進(jìn)行研磨，以使顆粒的尺寸小于200微米。為此使用商業(yè)上可獲得的磨(Waring)。
表2聚(1，4-α-D-葡聚糖)(參見(jiàn)實(shí)施例3)的比表面積特性實(shí)施例序號(hào) 物質(zhì)比表面積(平方米／克)1 聚(1，4-α-D-葡聚糖)2．2433 聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒4．527- 馬鈴薯淀粉(Toffena，F(xiàn)a．Suedstaerke) 1．280實(shí)施例7試驗(yàn)微粒在各種不同溶劑中的穩(wěn)定性以確定合適的溶劑為了試驗(yàn)各種不同溶劑在采用聚(1，4-α-D-葡聚糖)的色譜應(yīng)用中的適用性，使用如下步驟在凸緣玻璃瓶中在每種情況下在100毫克的實(shí)施例3的顆粒上加入一層3毫升溶劑。觀察時(shí)間是24小時(shí)。以小時(shí)為間隔觀察顆粒的變化。為此反應(yīng)容器是搖動(dòng)的。
結(jié)果表明，對(duì)于這里描述的色譜應(yīng)用可以使用非常廣的溶劑。只是甲苯、乙酸乙酯和二甲基亞砜例外。在未示出的個(gè)別情況下，必須首先試驗(yàn)溶劑的可應(yīng)用性。試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表3。這里給出介電常數(shù)和偶極矩和／或Snyder極性指數(shù)以表示溶劑的極性。
表3聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒(見(jiàn)實(shí)施例3)在各種不同溶劑中的穩(wěn)定性結(jié)果溶劑 介電常數(shù)偶極矩 極性 觀察結(jié)果(ε)*1D*2指數(shù)*3(24小時(shí)后)正己烷 1，8865 - 0，0無(wú)變化正庚烷 1，9209 - 0，0無(wú)變化甲苯2，379 0，375 2，3透明，微溶脹的材料，渾濁的上清液乙酸乙酯 6，0814 1，78 - 顆粒粘附，渾濁的上清液二氯甲烷 8，93 1，60 3，4 無(wú)變化四氫吡喃 7，2 1，75 4，2 無(wú)變化1，4-二噁烷 2，2189 - 4，8 無(wú)變化乙醇 25，3 1，69 5，2 無(wú)變化丙酮 21，012，88 5，4 無(wú)變化乙腈 36，643，924 6，2 無(wú)變化甲醇 33，0 1，76，6 無(wú)變化二甲基甲酰胺 38，253，82 - 無(wú)變化二甲亞砜 47，243，96 - 溶解水 80，100 1，854 9，0 無(wú)變化*1根據(jù)《化學(xué)和物理手冊(cè)》(Handbook of Chemistry and Physics)第77版的介電常數(shù)*2根據(jù)《化學(xué)和物理手冊(cè)》(Handbook of Chemistry and Physics)第77版的偶極矩*3來(lái)自Merck，ChromBook的Snyder極性指數(shù)實(shí)施例8使用實(shí)施例3a的微粒填充色譜柱將5克實(shí)施例3a的顆粒懸浮在約60毫升庚烷中。借助于Ultraturrax(Fa．Ika)進(jìn)行短暫的攪拌，并隨后在超聲浴(SonorexSuper RK510H)中脫氣。然后在最大流速下將該懸浮液加入長(zhǎng)度是125毫米和直徑是4毫米的柱(HibarFertigsaeule der Firma Merck AG)中。反復(fù)輕拍該色譜柱，或者反復(fù)搖動(dòng)和在超聲浴中短時(shí)地處理約1分鐘以確保密實(shí)和均勻地填充分離材料，以便獲得的填充具有低比例的死體積。
實(shí)施例9庚烷中吲哚和2-甲基吲哚的分離分離在Firma Merck的色譜裝置Lichograph中進(jìn)行。各個(gè)部件是梯度泵L6200A、UV檢測(cè)器L-400(在254納米下測(cè)定)、色譜-積分儀D-2500和分離柱HibarFertigsaeule RT-125-4。試樣濃度理想地是0．05至0．1毫克／毫升溶劑?？梢允褂?，3，5-三叔丁基苯(Fa．Fluka)作為內(nèi)標(biāo)。
使用正庚烷(Aldrich用于HPLC)準(zhǔn)備好色譜柱。該裝置通過(guò)正庚烷運(yùn)行。洗脫速度是0．5毫升／分鐘。壓力是54巴。待分離的物質(zhì)是吲哚和2-甲基吲哚。
表4在正庚烷中分離吲哚和2-甲基吲哚的結(jié)果物質(zhì)反應(yīng)時(shí)間(分鐘)1，3，5-三叔丁基苯(標(biāo)準(zhǔn)) 1．86吲哚 9．12吲哚／2-甲基吲哚 8．98／7．372-甲基吲哚7．20
實(shí)施例10在庚烷中分離吲哚和2-萘酚如實(shí)施例10所述，進(jìn)行該試驗(yàn)。
表5在庚烷中分離2-萘酚和吲哚的結(jié)果物質(zhì)保留時(shí)間(分鐘)2-萘酚 2．242-萘酚／吲哚1．92／9．16吲哚9．12實(shí)施例11分離對(duì)映體混合物外消旋1-(2-萘基)乙醇。
類似于實(shí)施例10進(jìn)行該試驗(yàn)。在該實(shí)施例中，壓力約是70巴。試樣的濃度是0．25毫克／毫升溶劑。
表6在庚烷中分離外消旋1-(2-萘基)乙醇的結(jié)果物質(zhì) 保留時(shí)間(分鐘)1，3，5-三叔丁基苯(標(biāo)準(zhǔn))1．89S-(-)-1-(2-萘基)乙醇32．031，3，5-三叔丁基苯(標(biāo)準(zhǔn))1．87R-(+)-1-(2-萘基)乙醇36．30實(shí)施例12使用本發(fā)明的分離材料作為過(guò)濾器介質(zhì)分離或保留物質(zhì)在使用580毫克實(shí)施例3制備的微粒作為過(guò)濾材料或吸收劑的條件下，使用3毫升的緩沖溶液1(參見(jiàn)下面)平衡一次性離心過(guò)濾器(Firma Schleicher&Schuell，例Centrix，目錄號(hào)467012(1996年4月)附圖5和6中的“過(guò)濾器1”)。(如果需要離心分離(2000rpm))。隨后，向過(guò)濾器中加入2毫升濃度是50μg／ml的DNA質(zhì)粒水溶液(所使用的質(zhì)粒pBluescript II SK)(如果需要進(jìn)行離心分離(在2000U／min下5分鐘))。進(jìn)行采用(附圖5和6中“過(guò)濾器2”)QiagenMidipraep(Hilden，Deitschland)的對(duì)照過(guò)程和另一個(gè)采用QiagenMidipraep柱體而無(wú)Qiagen過(guò)濾器介質(zhì)(填充有分離材料)的對(duì)照過(guò)程。
在每種情況下，賦予5μl洗脫液濃度約1／10的著色試劑(標(biāo)記)，并且涂覆在瓊脂糖凝膠板上(60％蔗糖、20mMEDTA、0．025％溴酚藍(lán))，隨后進(jìn)行凝膠電泳(Firma Biorad，Power Supply，100／200型)。作為對(duì)照以用于被檢測(cè)的質(zhì)粒的評(píng)價(jià)和分類，在泳道1中涂覆標(biāo)記(MG5000)和涂覆所使用的DNA質(zhì)粒溶液作為對(duì)照。附圖5表示通過(guò)本發(fā)明的分離材料試樣DNA被保留。
隨后在柱(過(guò)濾器)中加入5毫升第2緩沖溶液以便進(jìn)行洗脫，并且通過(guò)離心法(在2000rpm下5分鐘)快速處理。
將洗脫液(如上所述的對(duì)照)涂覆在瓊脂糖凝膠板上(60％蔗糖、20mMEDTA、0．025％溴酚藍(lán))，隨后進(jìn)行凝膠電泳(Firma Biorad，PowerSupply，100／200型)(參見(jiàn)附圖6)。作為對(duì)照涂覆標(biāo)記(MG5000)(泳道1)和涂覆DNA質(zhì)粒溶液(泳道7)。
附圖6表示，在使用本發(fā)明的分離材料時(shí)，再次將所使用的質(zhì)粒DNA從柱中洗脫出。與商業(yè)上可獲得的過(guò)濾材料對(duì)比表明至少具有相同質(zhì)量的過(guò)濾性能。
緩沖液的描述緩沖液1750mMNaCl50mMMOPS(3-[N-嗎啉代]丙磺酸，pKa7．2)15％異丙醇0．15％TritonX-100緩沖液21．25MNaCl50mM Tris，Tris*Clm，Ph8．515％異丙醇附圖5從左向右泳道1標(biāo)記(Boehringer Mannheim DNA Molecular Weight MarkerX)泳道2無(wú)分離材料的過(guò)濾器2(空白對(duì)照)泳道3填充本發(fā)明分離材料的過(guò)濾器2泳道4過(guò)濾器1具有本發(fā)明分離材料的柱Qiagen泳道5過(guò)濾器1QiagenMidipraep(Hilden，Deutschland)對(duì)照泳道6采用分離材料的過(guò)濾器2泳道7純的DNA-質(zhì)粒溶液(商業(yè)上通用的質(zhì)粒pBluescriptⅡSK)。
附圖6從左向右泳道1標(biāo)記(Boehringer Mannheim DNA Molecular Weight MarkerX)泳道2無(wú)分離材料的過(guò)濾器2(空白對(duì)照)泳道3填充本發(fā)明分離材料的過(guò)濾器2泳道4過(guò)濾器1具有本發(fā)明分離材料的柱Qiagen泳道5過(guò)濾器1QiagenMidipraep(Hilden，Deutschland)對(duì)照泳道6采用分離材料的過(guò)濾器2泳道7純的DNA-質(zhì)粒溶液(商業(yè)上通用的質(zhì)粒pBluescript ⅡSK)。
權(quán)利要求
1．一種物質(zhì)混合物的色譜分離方法，其中使用未進(jìn)行化學(xué)和物理改性的、不溶于水的、直鏈多糖的球狀微粒。
2．權(quán)利要求1的方法，其特征在于，通過(guò)柱色譜法進(jìn)行分離。
3．權(quán)利要求2的方法，其特征在于，借助于HPLC(高效或高壓液相色譜法)進(jìn)行分離。
4．權(quán)利要求1的方法，其特征在于，通過(guò)薄層色譜法進(jìn)行分離。
5．權(quán)利要求1的方法，其特征在于，借助于凝膠滲透色譜法進(jìn)行分離。
6．權(quán)利要求1至5之一的方法，其特征在于，所述的物質(zhì)混合物是立體異構(gòu)體。
7．權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述的物質(zhì)混合物是對(duì)映體。
8．權(quán)利要求1至7之一的方法，其特征在于，微粒的直徑是10納米至100微米。
9．權(quán)利要求8的方法，其特征在于，微粒的直徑是1微米至5微米。
10．權(quán)利要求1至7之一的方法，其特征在于，使用聚(1，4-α-D-葡聚糖)作為多糖。
11．權(quán)利要求1至7之一的方法，其特征在于，使用通過(guò)生物技術(shù)方法獲得的多糖。
12．直鏈、不溶于水的多糖的球狀微粒的應(yīng)用，其用于色譜分離物質(zhì)混合物。
13．直鏈、不溶于水的多糖的球狀微粒的應(yīng)用，其用作吸收劑和過(guò)濾器介質(zhì)。
14．一種分離材料，其包括化學(xué)和物理未改性的、不溶于水的直鏈多糖和任選的助劑、添加劑和／或載體的球狀微粒。
15．權(quán)利要求14的分離材料，其特征在于，微粒的比表面積是3平方米／克至10平方米／克。
16．包括化學(xué)和物理未改性的、不溶于水的直鏈多糖和任選的助劑、添加劑和／或載體的球狀微粒的過(guò)濾材料和／或吸收劑。
17．權(quán)利要求1至16之一的分離材料的應(yīng)用，其用于從液體中除去和如果需要純化和分離生物材料。
18．權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中生物材料是核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及色譜分離物質(zhì)混合物的方法,其中使用化學(xué)和物理未改性的、不溶于水的、直鏈多糖的球狀微粒。
文檔編號(hào)C07C29/76GK1289263SQ99802491
公開(kāi)日2001年3月28日 申請(qǐng)日期1999年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月29日
發(fā)明者H·本格斯, A·施奈勒, G·博姆, D·安德特 申請(qǐng)人:阿溫提斯研究技術(shù)兩合公司