專利名稱：高親和力抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體及其治療用途。
這種成功的相對(duì)缺乏可能至少在某種程度上是由于使用了來(lái)源于嚙齒類的單克隆抗體，該抗體很少具有高于10-9M的親和力。具有這種親和力水平的抗體治療效用有限，因?yàn)橐炎C明很難將足夠的抗體運(yùn)送至靶標(biāo)以實(shí)現(xiàn)有用的生物學(xué)活性?？贵w與抗原結(jié)合是可以逆轉(zhuǎn)的，并且在體內(nèi)實(shí)際使用的抗體濃度下，更傾向于解離而不是結(jié)合。原則上，有可能通過(guò)增加抗體濃度來(lái)抵消抗原的解離。然而，這可能會(huì)引起無(wú)法接受的臨床副作用并且也將增加治療相關(guān)的費(fèi)用。
根據(jù)本發(fā)明，一種高親和力抗體具有如下特征的親和力(ⅰ)在抗原包被的微量滴定板的孔內(nèi)溫育第一種和第二種抗體樣品，其濃度選擇在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性反應(yīng)部分之中，pH7.2,37℃,1小時(shí)；(ⅱ)從兩種樣品中去除未結(jié)合的抗體；(ⅲ)將第一種樣品與PBS在pH7.2,37℃條件下溫育1小時(shí)，并將第二種樣品的pH值降至pH3或更低后37℃溫育1小時(shí)；(ⅳ)去除兩種樣品中未結(jié)合的抗體；
(ⅴ)將兩種樣品與抗抗體堿性磷酸酶偶聯(lián)物在37℃溫育1小時(shí)；(ⅵ)去除兩種樣品中未結(jié)合的偶聯(lián)物；以及(ⅶ)向樣品中加入PNPP底物，測(cè)定樣品在405nm的光吸收值，以確定與抗原結(jié)合的抗體量，其中第二種樣品的結(jié)合量大于50％的第一種樣品的結(jié)合量。
優(yōu)選地，步驟(ⅲ)中最大pH值為2.5，更優(yōu)選為2.0。
預(yù)計(jì)具有酸耐受性的抗體或抗體片段更有利于結(jié)合而非解離，因而它們?cè)诎形稽c(diǎn)具有更長(zhǎng)的定居時(shí)間，導(dǎo)致更高的定居于靶位點(diǎn)的抗體濃度。
特別地，本發(fā)明涉及一種高親和力單鏈Fv抗體片段的生產(chǎn)。這種ScFv具有特別的優(yōu)點(diǎn)，它可允許其在體內(nèi)更好地靶定位點(diǎn)。
抗體基因可以同毒素、放射性同位素、酶或其它任何合乎需要的分子共表達(dá)或化學(xué)交聯(lián)，以提供具有強(qiáng)結(jié)合特點(diǎn)的融合蛋白。進(jìn)一步，抗體可通過(guò)US-A-5770429所述的方法由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行生產(chǎn)。
抗體可以是包括重鏈和輕鏈以及恒定區(qū)和可變區(qū)的完整抗體。另外可選擇地，抗體可以是抗體片段，例如F(ab′)2、Fab、Fv或單鏈Fv片段，只要包含了賦予“酸耐受性”的可變區(qū)的至少一部分。抗體也可以是動(dòng)物抗體、嵌合抗體或人源化抗體。專利WO-A-92/15699中公開(kāi)了一種生產(chǎn)人源化抗體的適當(dāng)方法。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體為單鏈Fv片段。單鏈Fv片段包含由一適宜的肽連接的重鏈和輕鏈的可變區(qū)。
本發(fā)明的抗體可以由其酸耐受性定義，其可由如上所述的酸洗的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EIA)表征。一般，與pH7.2條件下樣品由EIA獲得的A405值相比較，pH3或更低pH值條件下樣品的A405值將代表＞50％的抗體結(jié)合。優(yōu)選地，樣品在pH2條件下的A405值將代表＞60％，更優(yōu)選地為70％的pH7.2條件下獲得的抗體結(jié)合。
經(jīng)受免疫接種的動(dòng)物不是嚙齒類，而是選擇可產(chǎn)生更高親和力抗體的動(dòng)物?？梢允褂萌魏未笮筒溉轭悇?dòng)物，且適宜的動(dòng)物包括兔子、山羊、母牛和綿羊。
本發(fā)明的抗體可用于治療，并且可以與生理可接受的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制入任何適當(dāng)?shù)慕M合物。
以下實(shí)施例闡明了本發(fā)明。
淋巴結(jié)細(xì)胞經(jīng)沖洗后與綿羊異骨髓瘤融合伴侶SFP3.2進(jìn)行融合。融合細(xì)胞在含HAT(生命技術(shù)公司)的培養(yǎng)基中以大約106細(xì)胞/m的總濃度進(jìn)行鋪板。然后用常規(guī)EIA和酸洗EIA兩種方法篩選樣品中分泌針對(duì)特異抗原的高親和力抗體的雜交瘤。
標(biāo)準(zhǔn)的EIA篩選實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行用CEA(0.4μg/ml CEA于磷酸緩沖鹽中，pH7.2)包被Maxisorb實(shí)驗(yàn)板(NUNC)，每孔100μl,4℃過(guò)夜。然后用pH7.2含0.01％Tween20去污劑的磷酸緩沖鹽洗板3次。然后每孔加入200μl含0.2％脫雕牛奶蛋白的pH7.2的PBS溶液37℃半小時(shí)，以封閉所有板上遺留的反應(yīng)位點(diǎn)。如上述方法用PBS洗板3次，然后板內(nèi)每孔加入45μl抗體樣品。樣品在37℃溫育1小時(shí)后，如前所述方法洗板。結(jié)合的抗體用磷性磷酸酶偶聯(lián)的驢抗-綿羊抗體(Sigma A5187，經(jīng)含1％BSA的PBS(pH7.2)1/5000稀釋)進(jìn)行檢測(cè)。然后洗板，每孔加100μl PNPP(SigmaN2770)溶液。使用分光光度計(jì)測(cè)定樣品在405nm的光吸收值，并以磷酸緩沖鹽作為對(duì)照。
酸洗EIA篩選實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行如以上標(biāo)準(zhǔn)EIA所述方法進(jìn)行抗體樣品的包被和結(jié)合。然而不同的是，抗體樣品溫育后洗板，并在每孔加入200μlpH2的HCl(10mM貯存液)37℃1小時(shí)。洗3次后，按上述方法用堿性磷酸酶偶聯(lián)的驢抗-綿羊抗體和PNPP檢測(cè)殘留的與抗原結(jié)合的抗體。為確保對(duì)不同濃度下抗體的適當(dāng)比較，選取每種樣品使之在常規(guī)EIA(即EIA曲線中的線性反應(yīng)部分)中的A405值約為1.0。
與在非酸洗的EIA中的抗體結(jié)合相比較，3個(gè)分泌抗體的雜交瘤(1D2,6G11和6H9)在酸洗的EIA中保留了大于50％的抗體結(jié)合。
然后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增cDNA，并使用由重鏈和輕鏈可變區(qū)框架序列設(shè)計(jì)的引物生成雙鏈DNA。擴(kuò)增重鏈和輕鏈區(qū)分別采用獨(dú)立的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，并從凝膠中切下輕鏈和重鏈基因?qū)?yīng)的DNA條帶進(jìn)行純化。
等摩爾量的重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA與一條寡核苷酸連接頭DNA混合在一起。連接頭DNA編碼氨基酸序列(Gly4Ser)3，并含有與重鏈可變區(qū)3′末端和輕鏈可變區(qū)5′末端互補(bǔ)的附加核苷酸。3條DNA分子在兩階段PCR反應(yīng)中的第一階段進(jìn)行變性、退火和延伸(無(wú)引物)，使片段連接并由此排列成單鏈Fv。
單鏈FvDNA在第二階段的PCR擴(kuò)增所使用的引物對(duì)來(lái)源于重鏈和輕鏈可變區(qū)末端，并添加了限制酶識(shí)別位點(diǎn)Alw44i和NotⅠ。單鏈Fv基因產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析并進(jìn)行純化。然后用限制酶Alw44i和NotⅠ消化單鏈Fv并克隆至表達(dá)載體中。然后此載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。載體經(jīng)設(shè)計(jì)以在SFv的羧基COOH末端包括6-組氨酸(6-His)尾。單鏈Fv用鎳螯合物親和層析進(jìn)行純化，并通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別公開(kāi)于SEQ ID No.2和SEQ ID No.4。酸洗EIA也用來(lái)測(cè)定單鏈Fv的酸耐受性。
酰洗EIA如下進(jìn)行癌胚抗原(CEA)包被的微量滴定板按前述方法制備。單鏈Fv樣品(6H9)由含1％牛血清白蛋白(BSA)的pH7.2 PBS稀釋至1ng/ml～100ng/ml的濃度范圍。微量滴定板每孔加入100μl樣品37℃溫育1小時(shí)。洗板后每孔加入200μl檸檬酸鹽，37℃溫育1小時(shí)。此時(shí)酸的制備是采用100mM檸檬酸鹽貯存液在反應(yīng)混合物中稀釋至pH值分另為4.0、3.5、3.0、2.5和2.0。pH7.2的PBS用作參比對(duì)照。洗板后每孔加入100μl小鼠抗-四組氨酸抗體(Qiagen)(由含1％BSA的pH7.2PBS稀釋至100ng/mB,37℃溫育1小時(shí)。洗板后樣品與每孔100μl山羊抗-小鼠堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Sigma A3688，由含1％BSA的pH7.2PBS 1/1000稀釋)在37℃溫育1小時(shí)。然后洗板，如前所述用PNPP處理，并用分光光度計(jì)測(cè)定405nm時(shí)的光吸收值。
作為酸耐受性的對(duì)照，SFv樣品與PBS在pH7.2條件下共溫育以產(chǎn)生SFv樣品的EIA反應(yīng)曲線。在線性區(qū)，SFv樣品濃度為10-20ng/ml，對(duì)應(yīng)給出的光吸收值A(chǔ)405為1.0-1.5，因而該樣品濃度用于確定在酸洗樣品中抗體結(jié)合量占對(duì)照樣品中抗體結(jié)合量的百分率。
6H9完整抗體和6H9單鏈Fv的酸耐受性用于同小鼠來(lái)源的抗一癌胚抗原的完整抗體、ASB7和單鏈Fv MFE的酸耐受性進(jìn)行比較。結(jié)果如

圖1所示，與抗原結(jié)合的小鼠來(lái)源的抗體在pH3.5顯著減小，在pH2.5低于5％。相反，6H9抗體在pH3.5仍保持＞70％的抗原結(jié)合，在pH2.5＞60％，在pH2.0＞50％。
序列表<110>KS Biomedix Ltd<120>抗體<130>rep05827wo<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>363<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述抗體片段<220><221>CDS<222>(1)..(363)<400>1cag gtg cag ctg cag gag tcg gga ccc agc ctg gtg aag ccc tca cag 48Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15acc ctc tcc ctc acc tgc acg gtc tct gga ttc tca tta acc aag tat 96Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Lys Tyr20 25 30ggt gtt agt tgg gtc cgc cag gct cca gga aag gcg ctt gag tgg cta 144Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45ggt ggt gtg tcc agt ggt gca cta aca gcc tat aac aca gcc cta cag 192Gly Gly Val Ser Ser Gly Ala Leu Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Gln50 55 60tcc cga ctc agc gtc acc agg gac acc tcc aag agc caa ttc tcc ctg 240Ser Arg Leu Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu65 70 75 80tca ctg agc agc gtg act act gag gac acg gcc att tac tac tgt gcg 288Ser Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95aaa tct gtc aat ggt gac agt gtt cct tat ggt ttg gac tac tgg agc 336Lys ser Val Asn Gly Asp Ser Val Pro Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Ser100 105 110cca gga crc cra crc acc gtc tcc rca 363Pro Gly Leu Leu Leu Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>121<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述抗體片段<400>2Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln15 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Lys Tyr20 25 30Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Gly Val Ser Ser Sly Ala Leu Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Gln50 55 60Ser Arg Leu Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Ser Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Lys Ser Val Asn Gly Asp Ser Val Pro Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Ser100 105 110Pro Gly Leu Leu Leu Thr Val Ser Ser115 120<210>3<211>333<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述抗體片段<220><221>CDS<222>(1)..(333)<400>3cag gat gtg ctg act cag ccg tcc tcc gtg tct ggg tcc ctg ggc cag 48Gln Asp Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln1 5 10 15agg gtc tcc arc acc tgc tct gga agc agc agc aac att gga ggt aat 96Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn20 25 30gct tat gtg ggc Tgg tac caa cag gtc cca gga rca gcc ccc aga ctc 144Ala Tyr Val Gly Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Arg Leu35 40 45ctc atc agt gct aca acc gat cga gcc tcg ggg atc ccc gac cga ttc 192Leu Ile Ser Ala Thr Thr Asp Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe50 55 60tcc ggc tcc agg tct ggg aac aca gcc acc ctg acc atc agc tcg ctc 240Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu65 70 75 80cag gct gag gac gag gcc gat tat tac tgt gca tcg tat caa agt act 288Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Gln Ser Thr85 90 95tac agt ggt gtt ttc ggc agc ggg acc agg ctg acc gtc ctg ggt 333Tyr Ser Gly Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly100 105 110<210>4<211>111<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述抗體片段<400>4Gln Asp Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln1 5 10 15Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn20 25 30Ala Tyr Val Gly Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Arg Leu35 40 45Leu Ile Ser Ala Thr Thr Asp Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Gln Ser Thr85 90 95Tyr Ser Gly Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly100 105 110
權(quán)利要求
1．一種高親和力單克隆抗體，其親和力的特征為(ⅰ)在抗原包被的微量滴定板的孔內(nèi)溫育第一種和第二種抗體樣品，其濃度選擇在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性反應(yīng)部分之中，pH7.2,37℃,1小時(shí)；(ⅱ)從兩種樣品中去除未結(jié)合的抗體；(ⅲ)將第一種樣品與PBS在pH7.2條件下37℃溫育1小時(shí)，并將第二種樣品的pH值降至pH3或更低后37℃溫育1小時(shí)；(ⅳ)去除兩種樣品中未結(jié)合的抗體；(ⅴ)將兩種樣品分別同抗抗體堿性磷酸酶偶聯(lián)物在37℃溫育1小時(shí)；(ⅵ)去除兩種樣品中未結(jié)合的偶聯(lián)物；以及(ⅶ)樣品中加入PNPP底物，測(cè)定樣品在405nm的光吸收值，以確定與抗原結(jié)合的抗體量，其中第二種樣品的結(jié)合量大于50％的第一種樣品的結(jié)合量。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中第二種樣品的抗體結(jié)合量大于60％的第一種樣品的抗體結(jié)合量。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的抗體，其中步驟(ⅲ)的pH值降至pH2.5-pH2.0。
4．根據(jù)前面任一權(quán)利要求的非嚙齒類的抗體。
5．根據(jù)前面任一權(quán)利要求的抗體，其中有針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的親和力。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的抗體，其中抗原為癌胚抗原。
7．根據(jù)前面任一權(quán)利要求的抗體，其為單鏈Fv、F(ab′)2、Fv或Fab。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的抗體，該抗體具有一個(gè)包含SEQ ID No.2中定義的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和一個(gè)包含SEQ ID No.4中定義的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或其變體。
9．一種編碼根據(jù)權(quán)利要求8的抗體的多聚核苷酸分子，其中多聚核苷酸包含SEQ ID No.1和3中定義的核苷酸序列，或其變體。
10．一種包含根據(jù)權(quán)利要求9的多聚核苷酸分子的克隆載體。
全文摘要
高親和力單克隆抗體,其親和力的特征為(ⅰ)在抗原包被的微量滴定板的孔內(nèi)溫育第一種和第二種抗體樣品,其濃度選擇在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分之中,pH7.2,37℃,1小時(shí);(ⅱ)去除兩種樣品中未結(jié)合的抗體;(ⅲ)將第一種樣品同PBS在pH7.2條件下37℃溫育1小時(shí),并將第二種樣品的pH值降至pH3或更低在37℃溫育1小時(shí);(ⅳ)去除兩種樣品中未結(jié)合的抗體;(ⅴ)將兩種樣品同抗－抗體磷性酸酶偶聯(lián)物在37℃溫育1小時(shí);(ⅵ)去除兩種樣品中未結(jié)合的偶聯(lián)物;以及(ⅶ)樣品中加入PNPP底物,測(cè)定樣品在405nm的光吸收值,以確定與抗原結(jié)合的抗體量,其中第二種樣品的結(jié)合量大于50%的第一種樣品的結(jié)合量。
文檔編號(hào)C07K16/32GK1315966SQ9981036
公開(kāi)日2001年10月3日 申請(qǐng)日期1999年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月28日
發(fā)明者P·J·哈里森 申請(qǐng)人:Ks生物醫(yī)學(xué)有限公司