專利名稱：精確長度的聚酰胺鏈、其制備方法和其與蛋白質(zhì)的綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及精確長度(即精確的單體單元數(shù)目)的聚酰胺鏈及其制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及通過共價連接精確長度的聚酰胺鏈進行化學修飾目標分子如大分子(特別是生物上重要的多肽)和表面(例如金或玻璃)的方法，發(fā)明背景大家都知道許多物質(zhì)諸如肽、多肽如蛋白質(zhì)及生物綴合物的性能可通過在其上接枝有機鏈狀分子來增強。這種接枝可提高作為連接結(jié)構(gòu)基元的多個拷貝的連接體的物質(zhì)的有效性、提高物質(zhì)免受免疫系統(tǒng)影響和提高物質(zhì)的半衰期。生物傳感器表面也可在共價連接生物分子之前首先在表面(通常為金或玻璃)上接枝有機鏈狀分子來增強，例如Biacore AB(瑞典)出售的葡聚糖涂覆的傳感器。
常用于增強性能的有機鏈狀分子是聚乙二醇基即“PEG基”的鏈，即基于重復單元-CH2CH2O-的鏈。參見例如Tsutsumi等人，Jpn.J.CancerRes.859-12(1994)，其中顯示單甲氧基聚乙二醇的酯提高人腫瘤壞死因子α效能。PEG基的鏈為柔韌、兩親、非免疫原性的并且不易受蛋白水解酶的剪切。經(jīng)PEG或PEG基鏈修飾的物質(zhì)的制劑已降低了免疫原性和抗原性。參見例如Abuchowski等人，Journal ofBiological Chemistry 252(11)3578-3581(1977)，其中顯示了PEG改變了牛血清清蛋白的免疫性能。PEG也用于提高其所連接物質(zhì)的分子尺寸，由此提高其生物半衰期。這些PEG修飾物質(zhì)的有益性質(zhì)使得其在各種治療應(yīng)用中非常有用。
人們已知將PEG鏈或基于PEG的鏈接枝到蛋白質(zhì)上。參見例如Zalipsky的美國專利5122614號，其描述了被轉(zhuǎn)變成其N-琥珀酰亞胺碳酸酯衍生物的PEG。已知的還有用反應(yīng)性基團修飾以便于接枝到蛋白質(zhì)上的PEG鏈。參見例如Harris的美國專利5739208號，其描述了用砜部分活化而選擇性連接到分子和表面的硫醇部分的PEG衍生物以及參見Harris等人的美國專利5672662號，其公開了具有單個丙酸或丁酸部分的PEG酸的活性酯。Zalipsky在BioconjugateChemistry 6150-165(1995)中對該領(lǐng)域進行了廣泛詳盡地綜述。除了使用PEG外，Wright的EP 0605963 A2描述了包含與蛋白質(zhì)上的醛基形成腙鍵的水溶性聚合物的連接試劑。
聚酰胺鏈也可用作增強性能的有機鏈狀分子。此外，在嚙齒動物中進行的急性毒性篩選也表明聚酰胺既無毒性也無免疫原性(Hai等人，Bioconj.Chem.9645-654(1998))。
但是，由于該領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀不能提供具有可測長度的有機鏈狀分子的合成，也遇到了一些問題。
用于制備PEG或PEG基鏈[甚至是那些相當?shù)头肿恿咳?400的鏈(參見例如Kramer等人，Nature 395710(1998))]的技術(shù)涉及難控制的聚合步驟，其產(chǎn)生具有一平均值附近的寬范圍鏈長的制劑，即它們涉及-(CH2CH2O)m-的聚合物制劑，其中m不是一個獨立的值而是一個平均值附近的范圍值。這在PEG鏈本身和已接枝PEG鏈的化合物的質(zhì)譜上看得很明顯。例如，在John等人，Chemistry & Biology 4939(1997)中，當標示相對分子量3400和5000的PEG鏈接枝到一種小肽上時，產(chǎn)生均值±1000的質(zhì)量范圍，即2000amu的范圍的產(chǎn)物。這是現(xiàn)有技術(shù)方法的典型結(jié)果。當可獲得足夠的質(zhì)量分辨時，光譜圖顯示出許多相隔44amu的信號。例如，參見Lu等人，Int.J.PeptideProtein Res.43127-138(1994)。這種大的質(zhì)量范圍相應(yīng)于相應(yīng)的鏈長范圍。因此，含這種PEG或PEG基鏈的產(chǎn)物并不均一，其包括具有短、中和長鏈的分子。這種情況在具有兩個PEG鏈的化合物情況下更糟，因為統(tǒng)計上它們必須由具有兩個短鏈、一個短鏈和一個長鏈和兩個長鏈的分子混合物組成，因此在質(zhì)量上的變化比只具有一個鏈的產(chǎn)物更大。因為當這種鏈用于連接兩個部分(如在Johnson等人，Chemistry & Biology，上述)時，鏈長影響質(zhì)量、生物半衰期、免于來自免疫系統(tǒng)的作用和亞基的間隔，具有一個或多個常規(guī)PEG鏈的化合物的生物作用為所存在的各種物質(zhì)(具短鏈、具中鏈和具長鏈的物質(zhì))及其相對濃度(因為對于一系列類似的化合物來說生物半衰期是質(zhì)量的函數(shù)，因此其主要隨時間變化)的平均作用。因為PEG非常有用，所以這種復雜的狀況被容忍。
固相肽合成產(chǎn)生充分定義的重復單元“-NH-Y-CO-”的聚酰胺，但是需要保護衍生物和去保護步驟。重復單元-NH-Y-NH-CO-X-CO-如“-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)4-CO”的聚酰胺(例如Nylon 66)通過聚合二酸和二胺來制備。這種合成與涉及二酸和二胺的溶液聚合的更新的技術(shù)一起產(chǎn)生了具有寬范圍鏈長的產(chǎn)物。所得到的這些聚酰胺的鏈長非均一性很大程度上歸于沒有保護基。
從用有機鏈狀分子修飾的物質(zhì)的許多潛在用途來看，本領(lǐng)域需要有用于修飾目標大分子或物質(zhì)如表面的改良鏈。因此，需要有一種制備這種聚合物并使其具有可定長度的方法，它通過自動固相合成而無需保護基。具體地說，需要有精確長度的PEG基鏈(即含一個-(CH2CH2O)m-基團的鏈，其中m為一單值)以及構(gòu)建這種鏈的方法。這樣，可克服在目前所用于醫(yī)藥和非醫(yī)藥用途的PEG鏈中固有的及可看到的缺陷。本發(fā)明提供的精確長度的聚酰胺鏈和方法滿足了這類需要以及其它需要。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種新類型的聚合物，含精確數(shù)量的重復單體單元(-NH-Y-NH-CO-X-CO-)的聚酰胺基鏈，其通過無需保護基的自動固相合成來合成，其中每個步驟中X和Y可獨立變化。顯示為噬菌體源結(jié)合肽的二聚物、支鏈結(jié)構(gòu)物和多聚體分子容易與這些精確長度聚酰胺鏈裝配，這些精確長度聚酰胺鏈可用于作為分子間隔基取代多肽和聚乙二醇。
更具體地說，本發(fā)明提供了具有精確重復單元數(shù)目的精確長度的水溶性有機聚酰胺基鏈，它是基于形成精確數(shù)目的單體單元的酰胺鍵構(gòu)建的，同時本發(fā)明提供了制備這類鏈的方法。這種鏈具有式(III)-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且對于每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在。
更具體地說，本發(fā)明提供了基于精確數(shù)目的重復聚乙二醇基單元的精確長度的聚乙二醇基鏈以及制備這種鏈的方法。
本質(zhì)上，本發(fā)明并不增加含-(CH2CH2O)m-基團鏈中的m(這將隨m變大并取范圍值而不是獨立值導致非均一性)，而是通過酰胺鍵連接一系列含-(CH2CH2O)p-基團的單體單元，其中p為足夠小的單體單元數(shù)目值從而使p為單一值而非范圍值。
本發(fā)明的另一方面提供了在溫和條件下用一個或多個精確長度的聚酰胺鏈修飾大分子(如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)體)或物質(zhì)如表面的方法和化合物。
在本發(fā)明的另一方面，其中n’為1的式(III)的鏈通過下面步驟合成(a)用摩爾過量的試劑L-CO-L’(其中L和L’為離去基團并且相同或不同)?；絑-Q載體化合物的氨基或羥基，其中Z為H2N-或HO-；Q為連接基(可以為氨基酸殘基)或目標分子；所述載體為一固相、基體或表面；(b)用摩爾過量的式NH2-Y’-NH2的二胺氨解步驟(a)的產(chǎn)物；(c)用摩爾過量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物?；襟E(b)的產(chǎn)物；(d)活化步驟(c)產(chǎn)物的游離羧基；(e)用摩爾過量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步驟(d)的產(chǎn)物；和(f)任選使用式HOOC-X-COOH的二酸衍生物和式NH2-Y-NH2的二胺重復步驟(c)-(e)，其中所述X和Y取代基和在任何前面氨解和?；襟E中所用的X和Y取代基相同或不同。
在本發(fā)明的另一方面，n’為0的式(III)的鏈通過下面步驟合成(a)用摩爾過量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物?；絑-Q載體化合物的氨基或羥基，其中Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；所述載體為一固相、基體或表面；(b)活化步驟(a)產(chǎn)物的游離羧基；(c)用摩爾過量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步驟(b)的產(chǎn)物；和(d)任選使用式HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重復步驟(a)-(c)，其中所述X和Y取代基和在任何前面?；桶苯獠襟E中所用的X和Y取代基相同或不同。
本發(fā)明的另一方面為具有精確重復單元數(shù)目的水溶性有機聚酰胺基組成，所述組成具有式(IV)[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；q為一個1到10的整數(shù)；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且對于每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；V選自其性質(zhì)有待修飾或增強并且具有任選的二價間隔基或連接基的一價或多價目標分子；具有多價連接基的報道基團；反應(yīng)性基團；和具有多價連接基的端基，所述端基選自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-載體，其Z為二價間隔基諸如-NH-、-O-或不存在，Q為連接基或目標分子，所述載體為固相、基體或表面；U選自其性質(zhì)有待修飾或增強并且具有任選的二價間隔基或連接基的目標分子；端基；肽鏈；保護基；載體和反應(yīng)性基團。
本發(fā)明的又一方面是具有精確重復單元數(shù)目的水溶性有機聚酰胺基均一組成，所述組成具有式(IV)[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；q為一個1到10的整數(shù)；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且對于每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；V選自為少于50個氨基酸殘基的肽并且具有任選的二價間隔基或連接基的目標分子；具有多價連接基的報道基團；反應(yīng)性基團；和具有多價連接基的端基，所述端基選自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-載體，其Z為二價間隔基諸如-NH-、-O-或不存在，Q為連接基或目標分子，所述載體為固相、基體或表面；U選自為少于50個氨基酸殘基的肽并且具有任選的二價間隔基或連接基的目標分子；端基；肽鏈；保護基；載體和反應(yīng)性基團；其中U或V的至少一個是目標分子。
本發(fā)明的再一方面提供合適用于合成水溶性有機聚酰胺基鏈的試劑的試劑盒和含有這種試劑或其性質(zhì)有待修飾或增強并且具有任選的二價間隔基或連接基的這種鏈和目標分子的試劑盒。
具體實施方案的說明在生物化學和醫(yī)學中，需要生物相容的分子鏈在其末端顯示出結(jié)合模量(參見例如Kramer等人的上述文獻；Peters等人，Science2821439(1998)；Johnson等人在上述Chemistry & Biology中的文章和Terskikh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941663-1668(1997))，有時為了其它目的也是如此(Zalipsky，Bioconjugate Chemistry，上述)。理想情況下，這些鏈應(yīng)具有規(guī)定的結(jié)構(gòu)，即具有規(guī)定的長度，而不是不同長度鏈的混合物。多肽鏈提供了一種可能性，但主要是易受水解蛋白剪切并可能證明是免疫原性的。聚乙二醇(“PEG”)提供了另一種可能性。
本發(fā)明提供了一種制備結(jié)合了多肽(精確長度，便于合成)和PEG(柔韌、兩親、非免疫原性、對蛋白酶不敏感)兩者優(yōu)點的新類型的生物適合的聚合物的方法并由此可用于代替合成和半合成結(jié)構(gòu)的常規(guī)多肽或PEG分子間隔基。
通過本發(fā)明方法，人們不再局限于極少的商品PEG連接基的標準長度，長度可非常接近地微調(diào)。本方法也方便地使用商品物質(zhì)，易于自動化，并消除了保護和去保護步驟。此外，正如期望的PEG基分子那樣，本發(fā)明方法生產(chǎn)的聚酰胺完全溶于水和有機溶劑如二甲基甲酰胺，但不溶于乙醚。
本發(fā)明進一步提供了一種基于精確數(shù)目重復單體單元的酰胺鍵形成構(gòu)建的精確長度的水溶性有機聚合物基鏈以及制備這種鏈的方法。眾多有機前體可用于本發(fā)明的鏈。為了說明而非限定，本發(fā)明可由含-CH2CH2O-單元的參考單體來說明，其得到的產(chǎn)物稱為聚乙二醇基(“PEG-基)鏈。但是，應(yīng)理解此處所謂的“PEG-基”鏈意欲指任何“水溶性聚合物基”鏈或“水溶性有機”鏈。此外，由于所述連接基或鏈通過形成酰胺鍵來構(gòu)建，所以應(yīng)理解本發(fā)明的水溶性聚合物基鏈也可適當?shù)胤Q為“水溶性有機聚酰胺基”鏈。術(shù)語“連接基”和“鏈”可替換使用，因為本發(fā)明的鏈可用于將目標連接在一起和連接到單個目標上。
因此，本發(fā)明提供了以精確數(shù)目的單體單元為基礎(chǔ)的精確長度的水溶性有機聚酰胺基鏈。非常短的精確長度的化學鏈被用于構(gòu)建(優(yōu)選在固相上)這些精確長度的水溶性有機聚酰胺基鏈。具體地說，本發(fā)明使用精確長度的非常短的鏈來構(gòu)建精確長度的PEG基鏈。這種短鏈易于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成。此外，這些非常短的鏈的一些可通過商業(yè)渠道獲得并且如Wilbur等人在BioconjugateChemistry 8572-584(1997)中所述已經(jīng)用于短PEG連接基的溶液合成。
本發(fā)明也涉及通過共價連接此處所述的精確長度的聚酰胺基鏈化學修飾目標分子和表面(如金或玻璃)的方法。這些鏈具體可用于增強目標分子的性能，用于將另外的分子(諸如熒光團、金屬螯合劑或其它報道基團、或藥物分子)結(jié)合到目標分子上，或?qū)讉€較小的目標分子連接在一起而形成具有增強的性能的較大分子(二聚物、三聚物、四聚物和更高級的低聚物)。本發(fā)明也嘗試使用所述水溶性有機聚酰胺基鏈修飾用于生物傳感器和其它用途的表面諸如金或玻璃或塑料。
術(shù)語“目標分子”是指其性能有待通過連接此中所述精確長度的水溶性有機聚酰胺基鏈改進或增強的一價或多價目標分子，特別是大分子。這種目標分子可以是分子量至少為100并高至10000或10000以上的有機分子(包括生物源的分子以及具有無機組分的有機分子)。一般這種有機分子具有至少1000的分子量，更常具有約1000-2000的分子量。通常所述目標分子是生物學上重要的蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸、核酸、脂質(zhì)體或治療劑。目標分子的例子(用于說明而非限定)包括血漿蛋白質(zhì)諸如血纖蛋白原、免疫球蛋白或其片斷、激素諸如胰島素、細胞因子諸如腫瘤壞死因子和酶諸如組織纖溶酶原激活物。所述目標分子可衍生自天然或重組來源或可以是合成物諸如熒光團、金屬螯合劑或其它報道基團。當所述目標分子是多價時，它可與幾個本發(fā)明的鏈相連。為了容許目標分子的進一步增強或修飾，目標分子可在其和所述鏈之間具有多價連接基。
在本發(fā)明的另一實施方案中，用LiAlH4或乙硼烷還原聚酰胺鏈提供了一種新類型的多胺，它可以具有哌嗪的有用性質(zhì)(參見例如Ferrari等人，Gene Ther.41100-1106(1997))同時也可對結(jié)構(gòu)(線性、長度、疏水性、電荷間距)進行總的控制。
一般，本發(fā)明方法是三步固相法，涉及商業(yè)可得的二胺(或衍生物)，如下式(I)所示的短二胺單體NH2-Y-NH2和商業(yè)可得的此中稱為“二酸衍生物”的可?；幕罨问?諸如環(huán)酐)的二酸，如下面的式(II)所示的短二酸單體HOOC-X-COOH。
所述X和Y取代基獨立地選自無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或不存在。X和Y可相同或不同。適用的二價有機基團是非反應(yīng)性基團諸如取代或未取代、分支或線性、脂族或芳族基團諸如苯基或C1-C10亞烷基部分、C1-C10烷基基團或其組合，并可任選含有一個或多個雜原子。示例性的二價有機基團包括(用于說明而非限定)烷基基團諸如-(CH2)2-和-(CH2)6-；含雜原子的烷基基團諸如-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3-]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-等。
此中所用的術(shù)語“反應(yīng)性官能基”是指(用于說明而非限定)任何游離氨基、羧基、硫羥、烷基鹵、羥基或醛基。重要的是所述短單體原料沒有任何干擾后文詳細描述的本發(fā)明的?；?、活化和氨解步驟的官能度。但是，如果反應(yīng)性官能基受保護而達到非反應(yīng)性，那么這種反應(yīng)性官能基可存在于X或Y上，例如可存在受保護的氨基。例如，X和Y取代基可含有受叔丁氧基羰基(Boc)保護的氨基。但是，應(yīng)注意的是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)并不十分適合作為在X或Y中氨基的保護基，因為它不耐受氨解條件。
優(yōu)選式(I)和(II)的單體為對稱的，所以也優(yōu)選X和Y取代基為對稱的，否則端基(氨基或羧基)會不同，從而導致非均一性。例如琥珀酸(以其酸酐形式，其中X取代基為基團-CH2CH2-)是對稱的，在酰化中只會形成一種酰胺產(chǎn)物HOOCCH2CH2CO-NH-，因此是一種適合的二酸。甲基琥珀酸酐能形成兩種產(chǎn)物HOOCCH(Me)CH2CO-NH-和HOOCCH2CH(Me)CO-NH-，因此是不那么適合的酸。
優(yōu)選所述式(I)或(II)的短單體為水溶性聚合物基單體，從而使X、Y或兩者取代基為含約1到5個聚合物基團的精確長度的二價有機基團。在一個優(yōu)選實施方案中，X或Y或兩者為含約1到5個PEG(-CH2CH2O-)基團的二價有機基團。對稱可通過審慎地選擇例如在-CH2CH2CH2(OCH2CH2)pCH2-中的末端基團來保持，其中對于給定的式(I)或(II)的化合物來說p為1到5的整數(shù)但取一獨立的值。許多其它基團適合用于本發(fā)明中代替PEG基團。它們包括(用于說明而非限定)亞甲基、丙二醇和其低聚物(即(-CH2CH2CH2O-)p)、-CH2CH2O-和-CH2CH2CH2O-基團的限定共聚物、四氫呋喃的限定低聚物和乙烯基吡咯烷酮的限定低聚物。
最有用的一種精確長度的短PEG基對稱二胺是4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺(Fluka Chemicals，Buchs，Switzerland)NH2-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH24，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺是式(I)的二胺單體，式中Y包含三個聚乙二醇基團(-OCH2CH2-)并且具有對稱式-(CH2CH2CH2-O-CH2CH2)-O-(CH2CH2-O-CH2CH2CH2)-。
這種物質(zhì)的一個合乎需要的特性是其如上所示的那樣提供有三個PEG基團并且基本上免除了具有一、二、四或甚至五個PEG基團的同系化合物。這可作為當單體單元被說成“精確長度”時所需情況的例子。由這種物質(zhì)制備的聚酰胺也是精確長度的，只要其以非連續(xù)步驟制備并且并非通過不受控制的與二酸的聚合而不象常規(guī)方法那樣進行。其被稱為PEG-基鏈或連接基，甚至PEG單元(-OCH2CH2-)處處被酰胺鍵或其它基團間斷。
類似于4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺但具有一個、兩個、四個或甚至五個PEG基團的單體單元也可易于通過本領(lǐng)域人員已知的方法合成。這種單體基本上消除了具有不同數(shù)目PEG基團的均勻化合物。
也可用于本發(fā)明中的精確長度的一種非PEG基二胺是下式的4，9-二氧雜-1，12-十二烷二胺NH2-(CH2)3-O(CH2)4-O-(CH2)3-NH2其由Johnson等人描述于Bioconjugate Chemistry 8447-452(1997)。這里，Y具有對稱式-[(CH2)3-O-(CH2)2]-[(CH2)2-O-(CH2)3]-。
該文章例舉了二酸組分的活性形式諸如HOOC-CH2OCH2-COOH和HOOC-CH2N(CH3)CH2-COOH的酸酐。
可用于本發(fā)明方法中的另一種非PEG基二胺是1，6-二氨基己烷，NH2-(CH2)6-NH2(“DAH”)。此外，有許多商業(yè)可得的二酸和二胺，其廣泛詳細地描述于通過引用并入本文的上述Hai等人的文章中。正如下面將描述的，可以通過選擇每一步適合的二酸和二胺能夠調(diào)節(jié)因子諸如沿所述鏈長方向的疏水性(這里使用二胺如1，6-二氨基己烷說明)、向鏈末端加入反應(yīng)性基團如成肟基團和通過肽合成標準技術(shù)延長鏈。
優(yōu)選的式(II)的二酸包括(用于說明而非限定)HOOC-CH2CH2-COOH。
通常，本發(fā)明方法是三步固相方法，涉及式(I)的二胺和二酸的衍生物，所述二酸具有式(II)，這里顯示的為含氨基樹脂(NH2-樹脂)的情況。這種方法并不需要使用保護基。步驟1是一?；襟E，它使用一種二酸的衍生物
步驟2是一活化步驟，其使用例如羰基二咪唑
最終，步驟3是一氨解步驟，其使用一種二胺
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，存在X和Y的至少一個，并更優(yōu)選兩個都存在。但是，本發(fā)明并不打算使用X、Y或兩者都不存在的式(I)和(II)的化合物。一種特殊情況是-CO-代替-CO-X-CO-的二酸碳酸的情況，重復單元變成-NH-Y-NH-CO-，然后產(chǎn)物應(yīng)更準確地稱為聚脲，其為一種類型的聚酰胺。在這種特殊的情況下，使用為二活性碳酸簡便(convenient)形式的羰基二咪唑?qū)Ⅴ；襟E和活化步驟合并成一個步驟
所述咪唑基-CO-NH-樹脂然后可直接使用一種二胺進行氨解
如上所示，式(I)和(II)的單體單元被用于構(gòu)建精確長度(即具有精確數(shù)目的重復單體單元-NH-Y-NH-CO-X-CO-)的鏈。在本發(fā)明的一個方面，每輪這種合成使用相同的式(I)的二胺NH2-Y-NH2和相同的式(II)的二酸HOOC-X-COOH。因此，在本發(fā)明的一個方面，式(I)和(II)的單體單元被用于構(gòu)建具有精確數(shù)目的重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈，所述鏈具有式(III)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)n-(NH-Y’-NH)n’-，其中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或不存在并且可相同或不同，并且對于各所述重復單元而言可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或不存在。
需要著重指出的是如果需要，則X取代基、Y取代基或兩者可在合成的每個步驟中各不相同，并且無需到處一樣。在所述連接基的合成中，X和/或Y不同具有幾個原因，最重要的一個原因是調(diào)節(jié)沿連接基長度方向的疏水性的能力，包括使連接基的一部分如一端比其它部分更親水或疏水。這易于通過在鏈合成的其后循環(huán)過程中使用一個或多個不同的式(I)的二胺NH2-Y-NH2和/或一個或多個不同的式(II)的二酸HOOC-X-COOH來達到，即在每個?；桶苯獠襟E中可獨立地選擇X和Y取代基。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，X和Y取代基中至少一個包含約1到5個-CH2CH2O-基團。這通過將式(I)或(II)或兩者作為PEG基單體來達到。這樣X可具有式-a-(CH2CH2O)p-b-和/或Y可具有式-a’-(CH2CH2O)p’-b’-，其中a、a’、b和b’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或不存在并且可相同或不同。優(yōu)選a、a’、b和b’取代基從而如上所述保持單體單元的對稱。整數(shù)p和p’為約1到5，但可為0。一種優(yōu)選的本發(fā)明的聚酰胺基連接基具有下式(III)的一種變體-{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-或-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-這里a、a’、b、b’、p和p’和上面的定義相同?；蛘撸绻鼍埘０坊B接基被用于非藥用目的，那么p和p’可以為0。需要著重指出的是對于所述連接基每個合成步驟中的二酸組分和二胺組分而言，a、a’、b、b’、p和p’均獨立地變化，正如上述式(III)的情況。這樣式-a-(CH2CH2O)p-b-的X和式-a’-(CH2CH2O)p’-b’-的Y在沿本發(fā)明的連接基的長度方向可顯示出多種組合。導入這種變化的一個原因是使得沿連接基長度方向的疏水性和親水性變化，另一個原因可能是例如用為-CH2N(CH3)CH2-的X導入帶電基團。
下面精確長度鏈說明本發(fā)明，并不以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限定。一個特別優(yōu)選的本發(fā)明的鏈是式(III)的PEG基鏈，式中Y為-a’-(CH2CH2O)p’-b’-，其a’為-CH2-、b’為-(CH2)3-，并且p’為3，n’為0并且X為-(CH2)2--{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n-其也可寫成-{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}3-該鏈也可稱為-(‘PEG’-succ)n-鏈，其中‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。這種鏈的例子包括-(‘PEG’-succ)3-和-(‘PEG’-succ)8-。
所述-(‘PEG’-succ)n-鏈也是那些在每個重復單體單元中X和Y取代基保持相同的本發(fā)明的鏈的示例。其它這種鏈包括例如-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-諸如(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-和-(‘DAH’-succ)n-，其中‘DAH’代表式-NH-(CH2)6-NH-。
在重復單體單元中X和Y取代基不同的本發(fā)明的鏈的例子包括例如-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)n-和-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)z-‘DAH’-succ-‘PEG’-，其中z為1-49的整數(shù)。盡管在這些實例中使用的有兩個Y取代基，但是應(yīng)理解可在本發(fā)明的鏈中使用兩個以上的不同Y取代基。此外，在這些實例中X保持相同；但是應(yīng)理解X也可正如所述Y取代基一樣變化。
式(III)的聚酰胺鏈可容易地作為一個中心重復單元-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-并入到水溶性有機聚酰胺基成分或物質(zhì)即“產(chǎn)物”中。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，單個V或U取代基(如下定義)可通過連接一個或多個本發(fā)明的鏈修飾或增強。這種具有精確重復單元數(shù)目的水溶性有機聚酰胺基組成具有式(IV)[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V這里n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；q為1-10的整數(shù)；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或不存在并可相同或不同，并可隨每個所述重復單元獨立地變化；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或不存在；V選自其性能有待修飾或增強并且具有一任選的二價間隔基或連接基的一價或多價目標分子；具有多價連接基的報道基團；反應(yīng)性基團；和具有多價連接基的端基，所述端基選自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-載體，這里Z為二價間隔基諸如-NH-、-O-或可不存在，Q為連接基或目標分子，并且所述載體是一固相、基體或表面；U選自其性能有待修飾或增強并且具有一任選的二價間隔基或連接基的目標分子；端基；肽鏈、保護基團、載體、和反應(yīng)基團；正如上面所述，X和Y取代基可在所述鏈的合成中改變。
在其最簡單的形式即q為1的情況下，式(IV)的組成包括通過本發(fā)明的鏈連接的U和V基團U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-V。
應(yīng)理解本發(fā)明描述了鏈及其合成方法，而基團U和V只以實例的形式描述，其并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。V可為一價或多價目標分子，其性能有待修飾或增強并且具有一任選的二價間隔基或連接基諸如肟連接基。V也可以是報道基團諸如具有多價連接基的熒光團或金屬螯合劑。此中所用的術(shù)語“多價”意欲指大于一的價位，并包括術(shù)語“二價”。
V還可以是一個諸如為本領(lǐng)域人們熟悉的反應(yīng)基，例如適合于聚合物的交聯(lián)或生物分子的綴合的反應(yīng)基。其例子包括(用于說明而非限定)溴乙?；滨；T如酪氨?；蚪z氨?；被趸阴；⒁胰；?、巰基乙?；?、巰基丙酰基。此外，Bioconjugate Techniques，Hermanson，G.T.，Academic Press，San Diego，1996中描述了許多可用于生物分子綴合的基團。
V也可以是具有多價連接基的端基，所述端基選自-OH、-NH2、-H和-Z-Q載體，這里Z為二價間隔基諸如-NH-、-O-或可不存在，Q為連接基或目標分子，并且所述載體是一固相、基體或表面諸如(用于說明而非限定)天然樹脂和合成樹脂；細胞和膜；硅集成電路片；傳感器集成電路片；金、玻璃、塑料和其它生物傳感器表面；和組織培養(yǎng)平板。
適合的作為“Q”取代基或連接到目標分子的間隔基/連接基的二價有機基團的例子包括(用于說明而非限定)Sasrin連接基-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-、-C(O)O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-、氨基氧乙酰基(NH2OCH2CO-)連接基、-COCH2ON＝CH-CO、-CH＝NOCH2CO-等。
正如上面所指出的，Q取代基可以為目標分子。一般，當目標分子為使用為人們熟知的固相技術(shù)合成的肽并且構(gòu)成用于所述連接基合成的Z-Q載體試劑的一部分時可以是這種情況。端基可含有通過與目標分子結(jié)合的反應(yīng)基(諸如烷基硫醇)。這種反應(yīng)基受到保護(或通過構(gòu)建PEG基連接基后的正交保護/去保護策略連接)。正交保護策略為本領(lǐng)域人員所熟悉。參見Methods in Enzymology第289卷。在一優(yōu)選的實施方案中，V為其性質(zhì)有待通過本發(fā)明的連接基修飾或增強的一價或多價目標分子，例如大分子或固相或基體。
U選自其性質(zhì)有待修飾或增強并具有任選的二價間隔基或連接基諸如肟連接基的目標分子；選自H-、HC(O)CO-、NH2OCH2CO-和脂族?；亩嘶浑逆?，包括單肽鏈或多肽鏈；保護基諸如Boc或Fmoc；載體諸如一固相或基體；和如上所述的反應(yīng)基。
在一優(yōu)選的實施方案中，至少一個U或V是其性質(zhì)有待通過與精確長度的聚酰胺基連接基連接來修飾或增強的目標分子。這種如上定義的“目標分子”是有機分子，優(yōu)選為生物學上重要的蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸、脂質(zhì)體或治療劑。在另一優(yōu)選的實施方案中，至少一個U或V是為少于50個氨基酸殘基的肽并且具有一任選的二價間隔基或連接基的目標分子。
下面的組成用于本發(fā)明的說明，但并不以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限定。示例性的式(IV)的組成包括
H-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-H，其U和V為氫端基并且n為例如7；H-Ser-(“PEG’-succ)n-‘PEG’-Ser-H，其U和V為氨基酸并且n為例如16；(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-肟-(肽)，其中U和V為具有肟連接基的肽，例如具有-COCH2ON＝CH-CO-連接基的紅細胞生成素模擬肽(“EMP”)，諸如酰胺-GRLPQCVWTMPGNHCAYLGG--COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-C(O)CH＝NOCH2CO--GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO1)，并且n為例如12或16；H-(‘PEG’-succ)n-Leu-PAM樹脂，式中U為H，并且V為-Z-Q載體，這里Z不存在，Q為一氨基酸殘基(Leu)，載體為PAM樹脂；H-Tyr-(‘PEG’-succ)n3-Leu-OH，式中U為氨基?；鶊F(Tyr-)，V為一個氨基酸殘基(Leu)，n為例如3；肽-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)n)-NH2，式中U為氨基氧乙?；鶊F(NH2OCH2CO-)，V為具有一連接基-Lys酰胺的目標肽分子，例如H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Iyr-Glu-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8)-NH2(SEQ ID NO4或SEQ ID NO3加上作為部分連接基的賴氨酸)，n為例如8；H-Ser-(‘PEG’-succ)n-Abu-OH，式中U為氨酰基基團(Ser-)，V為目標分子氨基丁酸，n為例如8；H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)n-‘DAH’-succ-‘PEG’-H，其中U和V均為氫端基，n為例如3；肽-(‘PEG’-succ)n-Lys(AoA)-酰胺(SEQ ID NO6)，式中AoA為氨基氧乙?；⑶襫為例如8。目標肽分子可以為例如-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)；和正如上面所述，本發(fā)明的鏈可用于修飾各種目標肽，特別是少于50個氨基酸殘基并具有適合的端基如(用于說明而非限定)-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)的肽，從而提供均勻組成。
本發(fā)明組成也可利用幾個鏈來形成分支結(jié)構(gòu)。例如一種示例性組成是式(IV)的支化組成，其中U為氨基?；?Ser-)，V為多價目標分子Lys2Lys-NHCH2CH2SH。賴氨酸“樹”首先被合成，其具有四個游離氨基。四次循環(huán)產(chǎn)生四個式H-Ser-(‘PEG’-succ)4-的連接基，每個連接基連接到四個游離氨基中的一個上(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH。
分支組成的另一例子是式(IV)的均勻分支組成(其U為具有肟連接基的肽，V為一種氨基酸(Lys))(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-Lys((肽)-肟-(‘PEG’-succ)n)酰胺，這里一種示例性的肽為-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)并且n為例如2。
分支組成的再一個例子為式[肽-(‘PEG’-succ)n-Lys(肟)酰胺]qLys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-報道基團的均勻分支組成，式中U為目標肽，V為具有多價連接基-Lys(AoA)酰胺-Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-的報道基團，例如[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-熒光素，其中存在四個目標肽分子的拷貝，例如-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)。
式(III)的聚酰胺精確長度鏈(其中n’為0)易于通過涉及酰化步驟、活化步驟和氨解步驟的如方案I-A所示的三步合成法容易地合成。固相合成的標準技術(shù)(Fieds，ed.，Solid phase peptide synthesis，Meth.Enzymol.289)可與適當編程的ABI 430A儀器或自制的設(shè)備一起使用。所述反應(yīng)也可相當容易地手工完成，盡管比較費時費事。在所述二酸碳酸的特定情況下，?；突罨襟E如上所述的那樣一起進行。
在本發(fā)明的一個實施方案中，具有精確數(shù)目重復單元并具有式(III)的水溶性有機聚酰胺基鏈(其中n’為1)
-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-(式中n為1-100的整數(shù)；X和Y為無反應(yīng)官能基的二價有機基團或不存在并且相同或不同，并且對于各所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)官能基的二價有機基團或不存在)通過包括下面的步驟的方法合成(a)用摩爾過量的試劑L-CO-L’(這里L和L’為離去基團并且可相同或不同)?；絑-Q-載體化合物(這里Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；載體為固相、基體或表面)的氨基或羥基；(b)用摩爾過量的具有式NH2-Y’-NH2的二胺氨解步驟(a)的產(chǎn)物；(c)用摩爾過量的具有式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化步驟(b)的產(chǎn)物；(d)活化步驟(c)的產(chǎn)物的游離羧基；(e)用摩爾過量的具有式NH2-Y-NH2的二胺氨解步驟(d)的產(chǎn)物；和(f)任選使用具有式HOOC-X-COOH的二酸衍生物和具有式NH2-Y-NH2的二胺重復步驟(c)-(e)，其中所述X和Y取代基可與用于任何所述前面氨解和?；襟E的X和Y取代基相同或不同。
該方法包括裂解例如在一試劑盒中用一適合載體包裝的與所述載體結(jié)合的連接基以便隨后連接到目標分子上。但是，所述方法也包括Q為含可裂解部分的連接基或通過含可裂解部分的連接基結(jié)合到載體上的目標分子，并且所述方法還包括裂解可裂解部分而從載體釋放精確長度的水溶性有機聚酰胺基鏈的步驟。
此中所用術(shù)語“可裂解部分”是指能被選擇性裂解而從固相釋放聚酰胺基連接基或目標分子的部分。可裂解部分必須能在適于本發(fā)明的?；?、活化和氨解步驟的條件下抗裂解。這種可裂解部分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。
任選的重復步驟可利用X和Y取代基沒有變化的二酸和二胺，從而產(chǎn)生相同重復單元的鏈諸如…-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-…。但是，分別使用其Y或X取代基與前面氨解或?；襟E所用不同的至少一種二酸或至少一種二胺將提供重復單元不同的鏈，諸如
…-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X2-CO}--{NH-Y2-NH-CO-X2-CO}-{NH-Y2-NH-CO-X3-CO}-…本發(fā)明的一種優(yōu)選方法如下面的方案I-A所示。
方案I-A?；襟E使用適合于固相肽合成的樹脂，例如Z-Q-載體，這里Z為NH2-或HO-并且Q和上面Q的定義相同，但一般是一個二價有機基團?；罨问降氖?II)的二酸衍生物HOOC-X-COOH被用于?；B接到所述載體上的氨基(或羥基)。其中X為-CH2CH2-的式(II)二酸琥珀酸HOOC-CH2-CH2-COOH的環(huán)酐特別適用于所述的?；襟E。在使用環(huán)酐的情況下或在本發(fā)明的一種典型的?；襟E中，樹脂首先在一適合的溶劑中溶脹，然后通過在室溫下渦動混合用過量活化形式的二酸(其溶解于適合的溶劑中)酰化。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的肽合成技術(shù)(Methods inEnzymology 289卷)，通常加入一種堿諸如N，N-二-異丙基乙胺(“DIEA”)或4-二甲基氨基吡啶(“DMAP”)和添加劑諸如N-羥基苯并三唑(“HOBT”)幫助?；．旛；u基樹脂(例如來自瑞士Bachem的Sasrin樹脂)時，優(yōu)選存在DMAP并且酰化重復第二次而使?；耆?。當酰化氨基樹脂(NH2-Q-載體)時，建議在進行活化步驟前進行Kaiser試驗(Kaiser等人，Analyt.Biochem.84595(1970)或Methods in Enzymology289卷54頁)來證實?；瓿伞Ｊ褂眠^量?；噭┮员愦偈狗磻?yīng)完全，否則會與固相肽合成的情況那樣會使缺乏大量重復單元的鏈在幾次循環(huán)后積累。
例如，將氨基樹脂如Boc-Leu-Pam樹脂(0.5g，約0.3mmol)在二甲基甲酰胺(“DMF”)中溶脹、去保護而形成H-Leu-Pam樹脂。然后通過在室溫下渦動混合10到30分鐘用4毫摩爾琥珀酸酐(“SA”)?；瘶渲?。將SA溶解于8毫升DMF(Burdick and Jackson高純級)中，其為0.5M的HOBT溶液，并往其中加入400微升DIEA。排出并用DMF洗滌樹脂后，進行Kaiser茚三酮試驗以檢驗?；欠裢瓿?。如果沒有完成，則重復?；襟E。
如果使用裸樹脂(例如Sasrin，Bachem)，則可使用O.5M DMAP代替HOBT，偶聯(lián)時間約為30分鐘(使用氨基樹脂時為10分鐘)并將偶聯(lián)步驟重復一次。
活化步驟活化步驟涉及游離羧基的活化，即沒有連接到鏈上的羧基的活化。當在?；襟E中使用環(huán)酐時這種活化步驟是必需的，因為沒有連接到鏈上的羧基是游離羧基(在方案II討論的?；襟E中使用雙活化二酸的情況下)。活化的結(jié)果是往游離羧基上連接一個離去基團或用于這種活化步驟的試劑是本領(lǐng)域人員所熟悉的(Methods inEnzymology 289卷并在此中作為參考)將一個離去基團“L”連接到游離羧基上的試劑。優(yōu)選使用過量的活化劑來使基本上所有羧基都被活化并因此避免缺乏大量重復單元的鏈的累積。適合的試劑是那些可過量使用而沒有副反應(yīng)的試劑，其包括碳酰二咪唑(“CDI”，其產(chǎn)生混合的酐咪唑基-CO-O-CO-X-等或?；溥蜻溥蚧?CO-X-等)和二琥珀酰亞胺基碳酸酯(其產(chǎn)生羥基琥珀酰亞胺酯)。也可成功地使用活化劑諸如O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)六氟磷酸鹽(“HATU”)并且只以比游離羧基稍為過量的量使用。
在本發(fā)明的一典型活化步驟中，在排出并用適合的溶劑洗滌樹脂后，用活化劑諸如CDI活化游離羧基，但因為CDI對濕度敏感所以要小心適當?shù)卮尜ACDI。例如，在排出并用DMF洗滌樹脂后，在渦動混合下用8毫摩爾CDI(Fluka)在8毫升DMF中的溶液活化游離羧基30分鐘。
事實上用CDI的活化可看成為兩步過程，首先羧酸用CDI活化羧酸形成咪唑基酸酐(這里“im”是咪唑基)
然后這種酸酐可與替代的咪唑分子反應(yīng)而形成im-CO-X-CO-NH-Q-載體其在氨解步驟中通過氨解產(chǎn)生NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-載體或者所述酸酐可經(jīng)直接氨解產(chǎn)生同樣的產(chǎn)物NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-載體兩種途徑均形成所需的產(chǎn)物。參見Aslam等人，Bioconjugation，387頁(Macmillan Reference，1998)。
氨解步驟所述氨解步驟涉及均勻長度的式(I)的二胺NH2-Y-NH2或在本發(fā)明的一典型氨解步驟中，在排出并用適合的溶劑洗滌后，用大過量的式(I)的二胺氨解樹脂結(jié)合的物質(zhì)。在充分洗滌后，Kaiser茚三酮試驗顯示了特征藍色，氨基樹脂可進行下一輪的?；?活化/氨解循環(huán)處理。
一種二胺即4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺特別良好地適用于所述氨解步驟。
例如，在簡短地排出并用DMF洗滌后，在渦動混合下用PEG基二胺(例如4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺，F(xiàn)luka，4ml二胺用4mlDMF(0.5M的HOBT溶液)預混合)氨解樹脂結(jié)合的咪唑30到60分鐘。用DMF充分清洗后，Kaiser試驗顯示出特征藍色，所述氨基樹脂可進行下一輪的?；?活化/氨解循環(huán)，即洗滌后，氨基可再用SA?；瘉砩扉L所述鏈等。需要著重指出的是一些疏水二胺如1，6-二氨基己烷可能需要在所有三個步驟(?；?、活化和氨解)中使用N-甲基吡咯烷酮代替DMF。
所述?；?、活化和氨解步驟因此可再重復一次以便加入第二個-NH-Y-NH-CO-X-CO-單元，形成(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-NH-Q-載體或(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-O-Q-載體等。一次?；?、活化和氨解步驟的循環(huán)得到(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-Z-Q-載體。幾個重復的?；⒒罨桶苯獠襟E的循環(huán)產(chǎn)生式(III)的鏈-(NH-Y-NH-CO-X-CO)n-(這里n’為0)，或式(IV)的產(chǎn)物[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n]q-V，這里例如U為H并且V為-Z-Q-載體，n’為0并且n為重復循環(huán)的次數(shù)。例如，當使用琥珀酸酐和4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺進行兩次的酰化、活化和氨解循環(huán)時，所述合成提供了一種如下的示例性的PEG基連接基-(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)2-或產(chǎn)物U-(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)2-V這里U為H并且V為-Z-O-載體。
在本發(fā)明的另一實施方案中，具有精確數(shù)目重復單元并具有式(III)的水溶性有機聚酰胺基鏈(其n’為1)-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-(式中n為1-100的整數(shù)；X和Y為無反應(yīng)官能基的二價有機基團或不存在并且相同或不同，并且各所述重復單元可各不相同)通過包括下面步驟的方法合成(a)用摩爾過量的具有式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化式Z-Q-載體化合物(這里Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；載體為固相、基體或表面)的氨基或羥基；(b)活化步驟(a)的產(chǎn)物的游離羧基；(c)用摩爾過量的具有式NH2-Y-NH2的二胺氨解步驟(b)的產(chǎn)物；和(d)任選使用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重復步驟(a)-(c)，其中所述X和Y取代基可與用于所述任何前面?；桶苯獠襟E的X和Y取代基相同或不同。
如上所述，該方法也包括裂解連接在載體上的連接基或通過作為連接基Q存在的可裂解部分或在將目標分子連接到載體上的連接基中的可裂解部分將連接基從載體裂解。另外，這種方法也考慮在合成步驟中使用相同或不同的X和Y取代基。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選方法如下面的方案I-B所示，其為方案I-A的變體，其中省略了第一循環(huán)中的?；襟E，但后面的循環(huán)中則包括?；襟E。這樣，方案I-B包括一個活化步驟和一個氨解步驟，接著一個或多個?；?活化/氨解步驟的循環(huán)。所用的反應(yīng)和試劑與方案I-A中描述的相同。
方案I-B活化步驟使用一種適合于固相肽合成的樹脂，優(yōu)選具有適合的酸-可裂解羥基連接基的樹脂如Sasrin樹脂(HO-CH2-(C6H3(OCH3))-O-CH2-樹脂)或具有氨基的樹脂。首先，將樹脂在一適合的溶劑中溶脹。然后，在本發(fā)明的一典型的首先活化的步驟中，活化式Z-Q-載體樹脂的羥基(或氨基)。用試劑諸如CDI的活化是用仍具有離去基團的基團酰化羥基(或氨基)(HO-變成im-CO-O-，NH2-變成im-CO-NH-)式中L為離去基團。
排出和洗滌后，可重復所述活化步驟。
氨解步驟氨解步驟如上所述，其中將均一長度的式(I)的二胺NH2-Y’-NH2加入到經(jīng)活化的樹脂中。例如，在簡短地排出和洗滌后，如上所述將樹脂結(jié)合的物質(zhì)用PEG-基二胺氨解而得到H-HN-Y’-NH-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-載體酰化/活化/氨解步驟一個?；?活化/氨解循環(huán)將產(chǎn)生H-[HN-Y-NH-CO-X-CO]-HN-Y-NH-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-載體等，重復所示三個步驟?；?活化/氨解的循環(huán)直到連接基達到所需的長度。這產(chǎn)生式(III)的連接基-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-(式中n’為1)和式(IV)的產(chǎn)物[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V(式中U為H，V為-Z-Q-載體)。
在羥基樹脂的情況下，通過末端氨基甲酸的脫羧從樹脂裂解將形成式(IV)的產(chǎn)物(其中U和V為H)H-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-H在氨基樹脂的情況下，從樹脂裂解將形成式(IV)的產(chǎn)物(其中U為H并且V為CONH2)H-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-CONH2V也可認為是H，其通過二價連接基-CONH-連接。
方案I-A和I-B所述的?；?活化/氨解循環(huán)可使用相同或不同的二酸和二胺重復多次。因為低聚是定量進行的，一次一步，所以有機會在任何階段改變二胺和二酸組分(例如使用其中X為-(CH2)4-的二酸代替X為-(CH2)2的二酸)并由此控制疏水性和長度。
一旦所需次數(shù)的循環(huán)達到了所需的連接基長度，可使用固相合成的標準技術(shù)使鏈延長(例如用肽)。
可編程肽自動合成器來進行所述各步驟。一旦組裝了所需的鏈，可在端氨基上合成肽。因為在所述鏈的構(gòu)建中沒有使用保護基，可在以標準方法(Fields，上述)從樹脂裂解前使用標準Boc(叔丁氧羰基)或Fmoc(芴甲氧基羰基)技術(shù)進行這種鏈延長?；蛘撸稍趶臉渲呀馇盎蚝?，通過標準技術(shù)(Rose，J.Am.Chem.Soc.11620(1994))將端基用氨基氧乙?；蛉┣绑w修飾。所述PEG基鏈包含醚鍵和酰胺鍵，兩者均可適于常規(guī)的肽去保護和裂解技術(shù)，包括液態(tài)氟化氫(“HF”)。
通過肽化學標準技術(shù)從樹脂裂解和純化后的產(chǎn)物具有式(IV)[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V并且包含具有精確數(shù)目式(III)重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-應(yīng)該指出的是本發(fā)明循環(huán)中的?；突罨襟E類似于常規(guī)的固相肽合成循環(huán)的?；襟E并不干擾常規(guī)的可能在所述連接基或產(chǎn)物中的取代基上存在的通常的保護基，無論所述保護基是Boc-、Fmoc-、丁基-或芐基基的基團。但是，氨解步驟涉及過量的伯胺，因此會影響氨基的Fmoc保護和色氨酸的甲?；Ｗo，所以在計劃合成時應(yīng)考慮這個情況。
本發(fā)明的另一合成反應(yīng)涉及兩個步驟酰化和氨解。通過在酰化步驟中使用過量雙活化的二酸，無需在氨解步驟前活化游離酸基，正如方案II所示。
方案II酰化步驟在使用雙活化二酸(諸如酰氯或活性酯，由“L”表示，其中L為離去基團)?；B接到適用于固相肽合成的樹脂上的氨基(NH2-Q-載體或HO-Q-載體)情況下或重要的是使用相對于存在的氨基過量的?；瘎┮员苊庥欣凇皹蜻B”副反應(yīng)，依此同一二價酸衍生物酰化兩個氨基。這種橋連物質(zhì)不能參與氨解和鏈延長并帶來收率的損失以及出現(xiàn)必須在從載體裂解產(chǎn)物后除去的雜質(zhì)。
一種特殊的情況是當所述二酸為碳酸的情況。碳酰二咪唑是這種二酸的適合的雙活化形式。它的使用分別產(chǎn)生了咪唑基-CO-NH-Q-載體和咪唑基-CO-O-Q-載體。
氨解步驟所述氨解步驟涉及加入均一長度的式(I)的二胺NH2-Y-NH2
然后如上面方案I中所述將?；桶苯獠襟E重復幾次。
重要的是在每個方案I和II的反應(yīng)步驟中使用足量的反應(yīng)劑溶液來使樹脂形成淤漿。因為隨著循環(huán)次數(shù)的增加樹脂極大地溶脹，優(yōu)選使用類似于上面方案中所述的絕對濃度并依此調(diào)節(jié)體積。此外，當以約0.3毫摩爾的樹脂開始時，對于合成較長的鏈來說優(yōu)選使用8毫升以上的溶液。溶脹度取決于所用載體或樹脂的類型(組成、交聯(lián)度等)，還取決于取代(即多少mmol/g)以及長度。因此，液體(溶液)量不足可能導致達不到定量偶合。盡管?；襟E易于通過Kaiser試驗監(jiān)測，但活化步驟則較難跟蹤。當一次循環(huán)中活化步驟不完全時，在隨后的循環(huán)中活化仍舊進行，而導致缺失，即產(chǎn)物可能缺失一個重復單元-(CO-X-CO-NH-Y-NH)-。過量反應(yīng)劑的使用能消除這個問題。術(shù)語“過量”是指二酸(或衍生物)、活化劑和二胺試劑的摩爾過量對于二酸、活化劑和二胺來說分別優(yōu)選約3-20倍、10-40倍和20-200倍的摩爾過量；更優(yōu)選約4-15、15-30和40-180倍的摩爾過量；最優(yōu)選約5-14、20-28和50-150倍的摩爾過量。
有許多樹脂適用于固相肽合成并因此也良好地適用于本發(fā)明的合成方案。這些樹脂可從商業(yè)渠道獲得或通過標準技術(shù)合成，其包括例如叔丁氧羰基-Leu-O-CH2-苯基(乙酰胺基)樹脂(“Boc-Leu-PAM”樹脂，Bachem，Bubendorf，瑞士)、9-芴甲氧基羰基-半胱胺-Sasrin樹脂(“Fmoc”-半胱胺-Sasrin樹脂，Bachem)、Fmoc-氨基丁酸-Sasrin樹脂(Bachem)、Fmoc-Lys(4-甲基三苯甲基)-甲基二苯甲基胺樹脂(“Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA”樹脂)等。上述的任何樹脂均可氨基去保護并用于采用二酸衍生物的?；?。
類似地，諸如Sasrin(Bachem)、Wang或PAM的羥基樹脂可直接用二酸衍生物?；??；蛘?，諸如Sasrin(Bachem)、Wang或PAM的羥基樹脂可通過CDI活化而形成im-CO-O-CH2-連接基-樹脂，注意在Sasrin的情況下，其形成im-CO-O-CH2-(C6H3(OCH3))-O-CH2-樹脂。參見Bethel等人，J.Biol.Chem.2542572-2574(1979)。這種活化的羥基樹脂可用二胺氨解形成上面Bethel等人所述的NH2-Y-NH-CO-O-Q-樹脂。
在正交保護的二氨基樹脂諸如Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA-樹脂的情況下，在?；耙话阒挥幸粋€氨解去保護。否則，二酸衍生物諸如SA可直接與樹脂諸如Sasrin偶聯(lián)而形成具有可用于活化的游離羧基的樹脂。氨基去保護后的樹脂可通過式NH2-Q-載體說明，式中Q為二價有機基團，例如-CH(R’)-CO-(式中R’為氨基酸側(cè)鏈，正如在去保護Boc-Leu-的情況下)、-CH2-CH2S-(在去保護Fmoc-半胱胺的情況下)、-CH2-CH2-CH2CO-(在去保護的Fmoc-氨基丁酸的情況下)、-CH(CH2-CH2-CH2-CH2NH-Mtt)CO-(在Fmoc-去保護的Fmoc-Lys(Mtt)的情況下)，或者可代表側(cè)鏈保護的多肽，在這種情況下NH2-Q-載體的NH2基團被認為是指先前在載體上合成的多肽的游離氨基。NH2-Q-載體也可用于代表MBHA樹脂。當樹脂由HO-Q-載體表示時，Q為設(shè)計用來在從樹脂裂解上述鏈時，從?；?酯連接)鏈釋出端羧基的連接基團。這種基團為人們所熟悉(Methods in Enzymology 289卷)并被結(jié)合到可從Bachem和其它供應(yīng)商購置的PAM樹脂和Sasrin樹脂中。然后使用適合于具體所用樹脂的標準技術(shù)從樹脂裂解出產(chǎn)物。載體可以是例如工業(yè)PAM、Sasrin或MBHA樹脂的聚苯乙烯樹脂，或用于固相肽合成和在Methods in Enzymology 289卷提及的其它類似載體。但是，也考慮載體的其它物質(zhì)和結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，發(fā)現(xiàn)一旦活化樹脂用二胺氨解形成NH2-Y-NH-CO-X-CO-O-Q-載體，就可用二酸衍生物?；坞x氨基并且聚酰胺延長過程可進行許多次循環(huán)而得到良好收率的所需產(chǎn)物。這與某些副反應(yīng)如兩個活化基團通過二胺的橋連會很快使技術(shù)上不可行的情況不同。在通過標準技術(shù)從樹脂裂解后，聚酰胺釋放出端氨基，可供官能化(例如產(chǎn)生對稱分子)。
如上所述，本發(fā)明的聚酰胺基鏈可用于修飾目標分子或物質(zhì)如表面。這些鏈可與大分子的殘基如多肽的氨基酸殘基偶聯(lián)而不會劇烈改變殘基上存在的電荷或沒有就地導入可能干擾大分子結(jié)合性能的基團，這些鏈通過在各種條件下(特別是在生理學相關(guān)的條件下)穩(wěn)定的鍵連接。特別適用于將本發(fā)明的PEG基鏈與多肽和蛋白質(zhì)相連的途徑包括如通過引用并入本文的Rose等人的歐洲專利0243929中所述的那樣通過在多肽鏈的氨基端和羧基端的腙和肟化學連接。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，蛋白質(zhì)和其它有機目標分子可通過綴合本發(fā)明的精確長度水溶性有機聚合物基鏈如此中所述的PEG基鏈來化學修飾。由于通過水溶性聚合物的連接賦予了所需的性能，這種蛋白質(zhì)綴合物的生產(chǎn)是有意義的。這些所需的性能包括增大的在水溶液中的溶解度、提高的存貯穩(wěn)定性、降低的免疫原性、增加的對酶降解的抗性、增寬的各種給藥系統(tǒng)的相容性和增加的體內(nèi)半衰期。當所述多肽被用作注入體內(nèi)的治療劑或當所述多肽被用于非醫(yī)學用途諸如用于檢測和/或定量目標化合物的測定(通常是免疫測定)時，用PEG或其它水溶性聚合物進行的多肽的修飾帶來的這些性能特別有意義。
“修飾的”目標分子或物質(zhì)是通過綴合一個或多個本發(fā)明的聚酰胺基鏈來修飾的分子或物質(zhì)。本發(fā)明的“均勻”修飾的組成是指基本上所有修飾目標分子或物質(zhì)具有基本相同的聚酰胺基鏈，即不存在連接的聚合物分子量范圍的化學組成。例如，本發(fā)明的PEG基鏈可具有以式(III)的X、Y或兩種取代基形式存在的-(CH2CH2O)p-基團，產(chǎn)生下式-{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，或-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-一個這種示例性鏈具有下面的PEG基式-(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)n-在均勻組成中存在的PEG基鏈均具有相同的p或p’整數(shù)值并且所述組成會基本上不包括具有不同p或p’值的同系PEG基鏈。需要著重理解其參照是在給定單體單元諸如-{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-或-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}-內(nèi)的一個常數(shù)p或p’。也可能在不同的循環(huán)選擇具有不同p或p’值的單體單元，并且確實也可能在合成的每個循環(huán)改變a、a’、b、b’、p、p’和X并仍獲得均一組成。
本發(fā)明的聚酰胺基鏈通過如肟鍵的共價綴合連接到目標分子上。“共價綴合”或“綴合”是指通過生物綴合物化學的標準技術(shù)(上述的Bioconjugate Techniques)，特別是通過在Rose等人的歐洲專利0243929中所述的N-和C-端標記技術(shù)將聚酰胺基鏈連接到目標分子上。例如，PEG基鏈可包含能與蛋白質(zhì)上的醛基反應(yīng)形成肟鍵的端氨基氧乙?；?NH2OCH2CO-)基團，或者它可包含與蛋白質(zhì)上的氨基氧基(例如通過如Werlen等人在Cancer Research 56809-815(1996)中所述用BrCH2CO-NHCH2CH2NHCOCH2ONH2將硫醇烷基化導入)反應(yīng)的乙醛?；?O＝CHCO-)，或者它可包含能烷基化蛋白質(zhì)上的硫醇的溴乙?；??；蛘?，在PEG基鏈和目標分子之間的綴合可通過在鏈(例如其中V為-OH并且n’為O)上的端羧基的活化(例如用一種二酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺)和在目標分子上的氨基(諸如賴氨酸側(cè)鏈)的酰化來實施，或者綴合可通過在目標分子上的羧基的活化(例如用水溶性碳化二亞胺)接著通過加入具有游離氨基的PEG基鏈(例如其中，U為H)來實施。
如果修飾分子被用于抗原的或免疫原性的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道所用的任何間隔基不應(yīng)是強免疫原性的。如果綴合聚合物將被用于結(jié)合目的，任何間隔基基團應(yīng)能增強或至少不影響諸如結(jié)合、親和力、產(chǎn)品穩(wěn)定性或溶解性的性質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種制備用一個或多個精確長度的聚乙二醇基鏈修飾的蛋白質(zhì)的方法。更具體地說，描述了用一個或多個精確長度的聚乙二醇基鏈在溫和條件下修飾大分子目標諸如蛋白質(zhì)、肽、其它有機化合物諸如塑料或含大分子的表面的方法和化合物。
一種優(yōu)選的綴合方法是以標準化學為基礎(chǔ)的，其以下面的方式進行。PEG基鏈具有在合成時連接的氨基氧基乙?；?例如通過用活化的Boc-氨基氧基乙酸?；?、消除保護并且使用固相肽合成的標準技術(shù)(Methods in Enzymology 289卷和實施例)將PEG基鏈從樹脂上裂解、純化和鑒定。目標分子具有末端絲氨酸或蘇氨酸殘基，其按照Rose，J.Am.Chem.Soc.11630-33(1994)和歐洲專利0243929在溫和條件下用高碘酸氧化成乙醛?；被趸M分和醛組分在室溫和弱酸性pH(2到5)下以1-10mM的濃度在水溶液中以大致相等的比例混合，通過反相高壓液相色譜(HPLC)和電子噴霧離子化質(zhì)譜(ES-MS)跟蹤綴合反應(yīng)(肟化反應(yīng))。反應(yīng)速度取決于濃度、pH和空間因素，但在通常幾小時內(nèi)處于平衡，而平衡極有利于綴合物(Rose等，Bioconjugate Chemistry 7552-556(1996))。一種組分稍微過量(最高至五倍)迫使綴合反應(yīng)向完成方向移動。如上對肟的所述，進行產(chǎn)物的分離和鑒定。肽和小蛋白質(zhì)(如胰島素)可通過反相HPLC純化(Rose，J.Am.Chem.Soc.，上述和Rose等人，Bioconjugate Chemistry，上述)，而較大蛋白質(zhì)(例如抗體和它們的片斷)最好通過離子交換色譜純化或通過凝膠過濾技術(shù)純化，諸如Werlen等人，Cancer Research 56809-815(1996)中所述的對三肟的純化。
綴合的另一種方法以下面的方式進行。PEG基鏈在購自Bachem的Sasrin樹脂上合成。使用樹脂生產(chǎn)商(Bachem)推薦的方法，通過用1％TFA的二氯甲烷溶液重復處理，從樹脂上裂解所述鏈并將所裂解的鏈的溶液用吡啶甲醇溶液中和。假定為多肽的情況那樣，在室溫下(沒有加熱)蒸發(fā)掉溶劑并將裂解的鏈純化后，將連接到樹脂上的羧基活化(例如用HATU)并通過肽化學標準技術(shù)偶聯(lián)到目標分子(或表面)上的親核基團(如氨基)上。
如果需要，可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的各種純化方法諸如大小排阻色譜法、疏水作用色譜法、離子交換層析、制備性等電聚焦等將修飾的目標分子或物質(zhì)從反應(yīng)混合物中純化出來。大分子純化、特別是蛋白質(zhì)純化的通用方法和原理可參見例如Scopes的“Protein PurificationPrinciples and Practice”，第二版，Springer-Verlag，New York，NY(1987)，其通過引用并入本文。
如上所述，本發(fā)明的PEG基連接基具體可用于增強目標分子或物質(zhì)的性能。例如，已有許多文獻報道了在蛋白質(zhì)上偶聯(lián)水溶性聚合物、特別是聚乙二醇的優(yōu)點，包括在生理pH下(此時，天然蛋白質(zhì)不溶或只部分溶解)，提高修飾蛋白質(zhì)(與天然蛋白質(zhì)相比)的溶解性、降低由天然蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答、增加藥物動力學分布、增加貯存期限和增加生物半衰期。更概括地講，本發(fā)明具體在生物學上重要的目標分子如多肽情況下的一項重要優(yōu)點是大分子可通過連接PEG或水溶性聚合物基連接基修飾但基本不會降低或影響大分子的生物活性。術(shù)語“生物活性”包括酶活性、結(jié)合受體(包括抗體)的能力、結(jié)合配體的能力、誘導免疫應(yīng)答的能力、產(chǎn)生治療效果的能力等。
本發(fā)明的另一優(yōu)點是通過本發(fā)明的精確長度PEG基鏈修飾的大分子如多肽基本上是均一化合物，不像通過連接幾個不同長度的水溶性聚合物[如含-(CH2CH2O)m-基團的聚合物，其中聚合物間的m值差異很大]制備的化合物。因此，本發(fā)明提供了具有綴合水溶性聚合物帶來的優(yōu)點而又減少了修飾帶來的均一性的損失的修飾目標。均一性對于生物藥物降低批次間差異和便于產(chǎn)品開發(fā)、鑒定、結(jié)果的表達(均勻化合物而非混合物)和獲得管理部門批準是及其重要的。
目標多肽包括單克隆和多克隆抗體；激素；細胞因子，包括集落刺激因子諸如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；干細胞生長因子；淋巴因子；IL-2和IL-3；生長因子，包括PDGF，EGF；肽激素，包括hGH和紅細胞生成素；凝血因子，包括因子VIII；免疫原；酶和酶抑制劑；配體；疫苗抗原等。目標多肽可從其天然源、遺傳工程細胞分離或通過各種體外合成方法生產(chǎn)。下面專利申請(其通過引用并入本文)報告了各種生物上重要的蛋白質(zhì)的PEG基修飾美國專利4179337、4609546、4261973、4055635、3960830、4415665、4412989、4002531、4414147、3788948、4732863和4745180；EP 152847、1984年1月11日公開的EP 98110和JP 5792435。未修飾狀態(tài)的這些蛋白質(zhì)是如此中所述用于修飾的目標分子。
術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”在此中可互換使用，是指天然存在或重組形式以及其它與天然存在的肽或蛋白質(zhì)形式足夠相同而具有類似生物或化學活性的非天然存在肽或蛋白質(zhì)形式。
盡管本發(fā)明的鏈可稱為“連接基”，本發(fā)明也考慮在無需連接另一分子的目標分子上使用這些鏈。因此，單個目標大分子可連接單個式(III)的鏈而形成式(IV)的產(chǎn)物(其q為1)U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-V以致U(或V)為目標分子并且V(或U)為端基。在本發(fā)明的另一實施方案中，單個目標分子具有幾個在各種位置與其連接的式(III)的鏈。
在以連接基的功能使用本發(fā)明的鏈時，相同或不同的兩個目標分子連接于單個式(III)的鏈，從而在式(IV)的產(chǎn)物中基團U和V相同或不同但均為目標大分子。后一種實施方案可稱為具有“啞鈴形”結(jié)構(gòu)。
因此，本發(fā)明的另一實施方案提供了經(jīng)本發(fā)明的PEG基鏈修飾的目標分子。此中它們被稱為“聚合物綴合物”。如上所討論，優(yōu)選目標分子為多肽，更優(yōu)選為具有生物重要性的多肽。
本發(fā)明也考慮通過與不同實施方案的PEG基鏈的反應(yīng)，由一個或多個不同的本發(fā)明的PEG基鏈修飾的個別的目標分子。此外，個別目標分子可在目標分子的單個位置上用多個PEG基鏈修飾。
特別有意義的是使用本發(fā)明的PEG基連接基以便修飾用作藥物和用于測定的多肽。用于測定的多肽包括特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)、由特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)識別的多肽和酶。特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)是指抗體、激素受體、凝集素等。術(shù)語“抗體”意欲包括具有天然免疫球蛋白序列的多克隆和單克隆抗體、合成抗體衍生物等。此外，可將抗體修飾而結(jié)合任何不同的標記物、熒光的、放射性的、酶的、生物素/抗生物素蛋白等。合成抗體衍生物包括經(jīng)突變和選擇用于改變結(jié)合特異性的天然免疫球蛋白序列、通過遺傳修飾細菌產(chǎn)生的各種源于免疫球蛋白基因的多肽(一般為單鏈)、為了包含修飾的恒定區(qū)而修飾的抗體等；這種基于抗體形成的原理的合成的抗體衍生物的一篇綜述文章為Winter等人，Nature，349293-299(1991)。一種抗體是球蛋白型的糖蛋白，其應(yīng)答抗原的給藥而在動物體中形成并能與所述抗原特異結(jié)合。它們也被稱為免疫球蛋白。抗體片斷可保留一些選擇性結(jié)合其抗原或半抗原的能力。與抗原或半抗原結(jié)合的能力通過抗原結(jié)合試驗測定(參見例如AntibodysA Laboratory Manual，Harlow和Lane編，Cold Spring Harbor，New York(1988)，其通過引用并入本文)。這種抗體片斷包括(但不限于)Fab、Fab’和(Fab’)2。天然抗體是從動物或從動物或雜交動物(雜交瘤)細胞系分離的抗體。
目標大分子多肽也可以通過原核微生物或已用天然或修飾的多肽-編碼DNA序列轉(zhuǎn)化的真核細胞(優(yōu)選人類起源)生產(chǎn)。目標多肽也可通過噬菌體信息庫技術(shù)鑒定，然后如實施例那樣化學合成。其中氨基酸序列保持基本一致[即序列相同，或其不同處在于一個或多個氨基酸的改變(缺失、加入、取代)，而這種改變不會引起誘變修飾蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)間實際不利的功能不同]的天然存在多肽的變體可在此中使用。
當此中所述的任何目標分子如多肽、水溶性聚合物和其衍生物存在于(或分離自)各種pH下的水溶液時，會自然形成這類分子的鹽。所有具所示生物活性的肽和其它大分子的鹽均被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例子包括羧酸殘基的堿金屬、堿土金屬和其它金屬的鹽、氨基殘基的酸加成鹽(如HCl)、通過相同分子內(nèi)的羧酸和氨基殘基間的反應(yīng)形成的兩性離子。
如上所述，目標分子可以是核酸，包括(用于說明而非限定)核苷酸、低聚核苷酸和線性或環(huán)化、單鏈或雙鏈DNA和RNA。為了增強核酸的性能諸如增強測定條件下的遷移率，通常需要將一聚合物鏈導入到核酸中。這已經(jīng)通過使用環(huán)氧乙烷基連接基獲得了成功(參見例如Grossman等人的美國專利5777096)。因此，可以期待用本發(fā)明的精確長度PEG基鏈修飾的核酸具有類似增強的性能。
所述目標分子也可以是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體具有許多用途，但是特別有意義的是作為藥物傳遞的載體。為了增強脂質(zhì)體的性能，通常需要將功能化合物諸如蛋白質(zhì)、肽等導入到脂質(zhì)體表面。因為這已經(jīng)通過使用其它PEG基連接基達到(參見例如Tagawa等人的美國專利5556948號)，所以期待用本發(fā)明的精確長度PEG基鏈修飾的脂質(zhì)體具有類似的增強性能。
此外，本發(fā)明的PEG基鏈也可連接到基質(zhì)或固相諸如(用于說明而非限定)硅集成電路片或傳感器集成電路片或金或玻璃的表面或其它生物傳感器表面、組織培養(yǎng)板、細胞或膜、或合成或天然樹脂上。人們可通過使用導入到固相中的互補官能基化學選擇性地將PEG基鏈配位到固相上。這種固相可易于通過交替浸漬于式(I)的二胺浴和式(II)的二酸衍生物浴(中間插入活化浴和洗滌浴)而將本發(fā)明的PEG基鏈連接到其表面。
當目標分子用作人和獸的有效治療劑時，如用于癌癥治療和傳染病治療時，所述修飾的目標分子一旦生產(chǎn)和純化就可混入到這種用途的藥用組合物中。
用作獸藥時，治療劑可以是任何防止或減輕疾病或穩(wěn)定或減輕動物病情的分子。治療劑可包括(但不限于)抗腫瘤抗生素、抗病毒蛋白質(zhì)、放射性同位素、藥劑或毒素?？梢云诖么酥兴龅木埘０坊溞揎椀闹委焺┚哂信c未修飾的治療劑相同或類似的生物活性但改善了上面討論的性能。
所述修飾治療劑可在無毒、惰性藥學可接受的含水載體介質(zhì)中配制?！八帉W可接受的載體”是指任何標準藥用載體諸如磷酸鹽緩沖的鹽水；水；或乳液如油/水乳液；可能包括各種類型的潤濕劑。所述修飾治療劑可在無毒、惰性藥學可接受的含水載體介質(zhì)中配制，所述介質(zhì)的優(yōu)選pH范圍為3到8，更優(yōu)選為6到8。當用于體內(nèi)治療時，經(jīng)滅菌的修飾治療劑組合物將包括溶解于具可接受pH的水緩沖液(復制后)中的修飾蛋白質(zhì)。這種修飾治療劑可用各種賦形劑諸如氨基酸、聚合物、多元醇、糖、緩沖劑、保存劑、其它蛋白質(zhì)等配制。具體例子包括辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物；聚乙二醇單硬脂酸酯化合物；聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯；蔗糖；果糖；右旋糖；麥芽糖；葡萄糖；葡聚糖；甘露糖醇；山梨醇；肌醇；半乳糖醇；木糖醇；乳糖；海藻糖；牛或人血清清蛋白；檸檬酸鹽；乙酸鹽；林格溶液和Hank氏溶液；生理鹽水；磷酸鹽；半胱氨酸；精氨酸；肉堿；丙氨酸；甘氨酸；賴氨酸；纈氨酸；亮氨酸；聚乙烯基吡咯烷酮；聚乙二醇等。優(yōu)選這種制劑在4℃下穩(wěn)定至少6個月。
組合物形式的修飾治療劑可用本領(lǐng)域人員熟悉的方法對受治療者給藥，這里“給藥”是指供給受治療者有效量的化合物或藥用組合物。給藥的方法包括(但不限于)經(jīng)口、靜脈、經(jīng)皮和腸胃外給藥。給藥可在整個治療過程中連續(xù)或間歇進行。決定給藥的最有效方式和劑量的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并且隨用于治療的化合物或組合物、治療目的和受治療動物或病人的不同而不同。所述組合物可包含其它增加有效性或促使達到具體目標分子的所需量的化合物。所述組合物必須能安全地用于經(jīng)所選途徑給藥、無菌和有效。為保持無菌性和增加修飾治療劑的穩(wěn)定性，所述組合物可凍干和在使用前復制。
所述制劑優(yōu)選適合于以治療有效量對人或動物腸胃外給藥。所述量可通過使用所關(guān)注病情的動物模型臨床前試驗獲得的體內(nèi)效能數(shù)據(jù)或與體內(nèi)效能相關(guān)的普遍接受的體外測定來決定。
以試劑盒的形式提供本發(fā)明的聚酰胺基鏈也是有意義的，可提供感興趣的目標分子的方便和可重復的修飾。所述試劑盒可包括含有本發(fā)明的聚酰胺基鏈的溶液、緩沖劑、反應(yīng)指示化合物、說明書、蛋白質(zhì)濃度測量試劑(如用于Bradford測定)等。試劑溶液優(yōu)選以預定量提供。或者，所述試劑盒可包括含有用于合成聚酰胺基鏈的衍生物形式的二酸的溶液和含二胺的溶液以及上述的材料。所述試劑盒也可包含其性能有待改進或增強的目標分子。
試劑盒可包含一系列與已知分子量和組成的目標分子連接的已知組成、分子量和構(gòu)型(是否為單聚合物、雙聚合物或多聚合物)的聚酰胺基鏈單一溶液(或粉末形式)，其可用作例如作為評估綴合反應(yīng)的完成和/或收率的標準物或用于提供分子量標準物。
一種可用于合成具有精確數(shù)量重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈的優(yōu)選試劑盒包括(a)Z-Q-載體，其中Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；并且所述載體為固相、基體或表面；(b)具有式HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物；和(c)具有式NH2-Y-NH2的二胺；所述鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在。
另一種示例性的本發(fā)明的試劑盒也可用于增強或修飾目標分子并且包括(a)用于合成具有精確數(shù)量重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈的試劑，所述鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；包括(i)Z-Q-載體，其中Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；并且所述載體為固相、基體或表面；(ii)具有式HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物，其中X為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；和(iii)具有式NH2-Y-NH2的二胺，其中Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；和(b)其性能有待修飾和增強的目標分子，并且其具有任選的二價間隔基或連接基。
前述的試劑盒可進一步包括一個或多個下面物質(zhì)至少一種式HOOC-X-COOH的另外的二酸或其衍生物，式中X取代基與第一種二酸中的X取代基不同；至少一種具有式NH2-Y-NH2的另外的二胺，式中Y取代基與第一種二胺中的Y取代基不同；和一種選自碳酰二咪唑、二琥珀酰亞胺基碳酸酯和O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽的活化劑。
本發(fā)明的另一實施方案是可用于增強或修飾目標分子的試劑盒，其包括(a)具有精確數(shù)量重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈，所述鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；和(b)其性能有待修飾或增強的目標分子，并且其具有任選的二價間隔基或連接基。
本發(fā)明的修飾目標分子或物質(zhì)可用于診斷目的的改進試劑盒或改進的測定試劑，例如用于結(jié)合測定如免疫測定。例如，攜帶有抗原肽的修飾的目標分子組成提供了固相免疫測定中增高的檢測靈敏度。較大的、二價或多價修飾物質(zhì)可更易于結(jié)合到諸如用于免疫測定的多孔板的表面。多價物質(zhì)可具有增強得多的結(jié)合親和力(例如上面Terskikh等人所述)，并且PEG基鏈可用于裝配合成的多價結(jié)構(gòu)物(參見實施例)。修飾目標分子、特別是含多個PEG基鏈的目標分子可用于使用信號放大步驟進行分析物檢測的體外測定，如像分支DNA基測定。放大通過向單一分析物分子連接多個PEG基鏈(而不是單一PEG基鏈)來獲得，其中連接到每個PEG基鏈上的報道基團都在隨后的測定步驟中有助于檢測信號。增加血細胞比容的治療劑可通過本發(fā)明的PEG基聚酰胺連接基連接兩個紅細胞生成素模擬肽制備(實施例11和12)。
本發(fā)明還提供PEG基鏈的體外用途。PEG基鏈可用于“標記”目標分子，從而可進行目標分子的隨后檢測和/或各種方式的定量。最簡單來說，連接PEG基鏈可讓人們進行簡單的大小分離而將PEG基鏈標記的目標分子與混合物中的其它分子分離。顯然人們可在該方法中簡單地通過改變聚合物的方式利用有機聚合物的不同物理化學性質(zhì)的優(yōu)點。例如，微疏水的PEG基鏈可容許進行基于疏水性的分離，或者人們可使用按需要選擇或排斥PEG基鏈的聚合物結(jié)合柱。此外可選擇或修飾PEG基鏈從而使其可直接檢測。這賦予了所述PEG基鏈可包含多個可檢測位點(或重復單元)的優(yōu)點，從而使每個存在于聚合物中的位點被檢測系統(tǒng)結(jié)合或識別，從而導致檢測信號的放大。
實施例縮寫詞Abu 氨基丁酸amu 原子質(zhì)量單位AoA 氨基氧基乙?；鵅oc 叔丁氧基羰基2BrZ 2-溴芐氧基羰基Bzl 芐基
CDI 羰基二咪唑DAH 1，6-二氨基己烷，H2N-(CH2)6-NH2‘DAH’ DAH的殘基DCM 二氯甲烷DIEA 二異丙基乙胺DMAP 4-二甲基氨基吡啶DMF 二甲基甲酰胺EMP 紅細胞生成素模擬肽EPO 紅細胞生成素Fmoc 9-芴基甲氧基羰基HATU O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽HF氟化氫HOBT N-羥基苯并三唑MALDI-TOF 矩陣輔助的行程激光解吸離子化時間MBHA 甲基二苯甲基胺Mtt 4-甲基三苯甲基NMP N-甲基吡咯烷酮OSu 羧酸或Fmoc保護基的N-羥基琥珀酰亞胺酯PAM 苯基(乙酰胺基)甲基，即嚴格地為-C6H4CH2CONHCH2C6H4-(聚苯乙烯)，如Boc-Leu-OCH2-PAMPEG 聚乙二醇，-CH2CH2O-的低聚物‘PEG’ -NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-，其為PEG基二胺的殘基，NH2CH2CH2CH2- (OCH2CH2)3-CH2NH2SAC4H4O3，琥珀酸酐
succ-COCH2CH2CO-，琥珀酸的殘基t-Bu叔丁基TFA 三氟乙酸TFMSA 三氟甲磺酸實施例1H-(‘PEG’-succ)3-Leu-PAM樹脂的合成在H-Leu-PAM樹脂(Bachem)上進行‘PEG’-succ-的三個循環(huán)，得到H-[NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-CO-CH2CH2CO]3-Leu-PAM樹脂。
將0.5g(約0.3mmol)Boc-Leu-PAM樹脂(Bachem，瑞士)在DMF中溶脹并在一臺ABI 430A肽合成器上用TFA去保護。排出TFA并將樹脂以常規(guī)方式用DMF洗滌。這產(chǎn)生準備用于酰化的H-Leu-PAM樹脂(以其TFA鹽的形式)。有時這種產(chǎn)物被寫成H-Leu-OCH2-PAM樹脂，有時為H-Leu-PAM樹脂，但是兩者均指標準的PAM肽合成樹脂。
這里“Leu”是亮氨酸的殘基(-NH-CH(C4H9)-CO-)，該產(chǎn)物正確的寫法為“H-Leu-PAM”樹脂，而非經(jīng)常使用的“Leu-PAM”。與此類似方式以及正如上面縮寫詞部分所指出的，‘PEG’為殘基(-NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-)，并且類似地當在末端時，所述端基(這里為氫)應(yīng)顯示出來。
?；瘜⑷缟现苽涞腍-Leu-PAM樹脂在DMF中溶脹、排出并用4毫摩爾SA在室溫下，渦流攪拌30分鐘酰化。將SA溶解于8毫升的DMF(Burdick and Jackson高純級)中，其為0.5M的HOBT(Fluka)溶液并往其中加入400微升的DIEA。排出并用DMF洗滌樹脂后，Kaiser茚三酮試驗表明?；耆?br> 活化將游離羧基用8毫摩爾CDI(Fluka)在8毫升DMF中活化30分鐘。
氨解在簡短排出并用DMF洗滌后，將樹脂結(jié)合的imidazolide用‘PEG’基二胺NH2CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH2(4ml二胺與4ml為0.5M HOBT溶液的DMF預混)氨解。用DMF充分清洗后，Kaiser試驗顯示出特征藍色并且這種氨基樹脂可供下一次的?；?活化/氨解循環(huán)。
再重復兩次所述?；?、活化和氨解循環(huán)而得到H-(‘PEG’-succ)3-Leu-PAM樹脂。產(chǎn)物通過進一步的鏈延長并接著如實施例2所述的那樣裂解來鑒定。
實施例2H-Tyr-(‘PEG’-succ)3-Leu-OH的合成將來自實施例1的H-(‘PEG’-succ)3-Leu-PAM樹脂的第三個‘PEG’的樹脂結(jié)合氨基使用標準HBTU活化和DIEA作為堿在ABI 430A上用Boc-Tyr(2BrZ)?；?，然后將樹脂以正常方式處理以去保護/裂解(用TFA去除Boc、用HF在5％對甲苯酚的存在下在0℃60分鐘去除芐基側(cè)鏈保護2BrZ并從樹脂上裂解)。蒸發(fā)掉HF后，用-20℃乙醚提取對甲苯酚。將得到的樹脂餅和產(chǎn)物溶于50％乙腈中并將樹脂濾除。通過冷凍干燥將產(chǎn)物從濾液中分離。反相高效液相色譜(Nucleosil300 5μm C8柱，250×4mm id，0.6mL/min，溶劑A為1g TFA/1升水，溶劑B為1g TFA溶解于100ml水后用乙腈稀釋成1升，梯度為從100％A到100％B)分析表明只有一個主組分，其通過電子噴霧離子化質(zhì)譜鑒定為所要的H-Tyr-(‘PEG’-succ)3-Leu-OH(實測質(zhì)量1201.5，計算值為1201.6)。
實施例3H-Ser-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH的合成以類似于實施例1中所述的方式在Abu-Sasrin樹脂上進行PEG-succ的八個循環(huán)而得到H-[NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-CO-CH2CH2CO]8-Abu-Sasrin樹脂用Fmoc-Ser(t-Bu)?；诎藗€‘PEG’的樹脂結(jié)合氨基。樹脂的一部分用哌啶Fmoc去保護并然后用TFA處理以除去丁基側(cè)鏈保護和從樹脂上裂解。另一部分如生產(chǎn)商(Bachem)建議的那樣使用1％TFA的DCM溶液從樹脂上裂解，完全去除Fmoc和丁基保護。已知(參見Bachem提供的關(guān)于Sasrin樹脂的小冊子)Sasrin樹脂易于減慢(24小時)二胺的氨解，導致作為酰胺的生長鏈的釋放和樹脂上羥基的釋出。雖然在所述氨解中這種反應(yīng)只發(fā)生小的程度，但在隨后的步驟中任何釋出的鏈均被洗滌掉并且因此不會污染產(chǎn)物。
兩種產(chǎn)物均給出非常純凈的色譜圖，并且其質(zhì)譜分析得到預期的質(zhì)量Fmoc-Ser(But)-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH在分別相應(yīng)于M＋4H+和M＋3H+的m/z 722.9和963.5處給出了信號，得到質(zhì)量為2887.5，計算值為2887.5；H-Ser-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH在分別相應(yīng)于M＋5H+、M＋4H+和M＋3H+的m/z 523.0、653.6和871.0處給出信號，得到質(zhì)量為2609.3，計算值為2609.2。在質(zhì)譜圖中沒有觀察到缺-CH2CH2O-(44amu)的痕量物質(zhì)，其足夠的強度表明雜質(zhì)低至1％的水平。
完全受保護的產(chǎn)物可良好地溶解于水/乙腈/TFA的HPLC溶劑系統(tǒng)中。這是一種所期待的聚乙二醇的性質(zhì)，而完全保護的肽通常不溶于大多數(shù)溶劑。正如大家所熟悉的，具有末端游離羧酸的受完全保護的產(chǎn)品對于在片斷縮合(匯集合成)中活化和偶聯(lián)是有用的。Ser基團的去保護后，可用高碘酸在非常溫和的條件下將其氧化而提供適合于形成非肽鍵(如肟)的醛基。這種氧化和肟化由Rose在上述的J.Am.Chem.Soc.中描述。
實施例4(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH的合成將Fmoc-半胱胺Sasrin樹脂(Bachem，200mg，0.51mmol/g)進行Fmoc去保護(由于如所述的氨基數(shù)目的增加，取比通常更少的樹脂)。成對進行Fmoc-Lys(Fmoc)的兩個循環(huán)而產(chǎn)生具有四個游離氨基(代替原來的一個)的賴氨酸“樹”。
如實施例1所述在樹脂上進行四個‘PEG’-succ循環(huán)。然后將樹脂用Fmoc-Ser(t-Bu)酰化、Fmoc-去保護并然后在三異丙基硅烷的存在下用TFA處理除去丁基和從樹脂上裂解。通過HPLC分離所需產(chǎn)物(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH并通過質(zhì)譜鑒定(質(zhì)量5647.9)。所述硫醇在pH7的磷酸鹽緩沖液中用5-碘乙酰氨基熒光素(Fluka)烷基化而形成所期待的攜帶熒光團的烷基化四分支產(chǎn)物。通過HPLC分離產(chǎn)物并通過質(zhì)譜鑒定。它給出了分別相應(yīng)于M+9H+、M＋8H+、M＋7H+、M＋6H+和M＋5H+的在m/z 671.9、755.7、863.5、1007.1和1208.2處的信號，得到6037.0的質(zhì)量，計算值6037.2。所述Ser殘基可通過溫和高碘酸處理(其并不影響熒光團)氧化并且如上面的Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的那樣與肽或其它攜帶氨基氧基的分子形成四肟。
分支產(chǎn)物(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH的收率比用線性‘PEG’-succ甚至那些具有8個重復單元的低聚物獲得的收率低得多，可能是由于在分支結(jié)構(gòu)情況下被二胺近處分隔的活性羧基的增強的橋連傾向。為此，當通過肟化構(gòu)建分支結(jié)構(gòu)時，可能優(yōu)選縮合例如含線性‘PEG’-succ化合物(肽)-(PEG’-succ)n-‘PEG’-COCH2ONH2與分支的(O＝CHCO-)4Lys2-Lys-NH2而不是縮合(肽)-COCH2ONH2與分支的含‘PEG’-succ化合物(O＝CHCO-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NH2。
實施例5肽二聚物(肽)-肟-(‘PEG-succ)16-‘PEG’-肟-(肽)的合成在該實施例中使用未修飾的Sasrin樹脂(0.25mmole，Bachem)。用SA(10摩爾)在5ml含1摩爾DMAP的DMF中酰化樹脂結(jié)合的羥基40分鐘。重復這種?；磻?yīng)以確保Sasrin樹脂的羥基的高度?；Ｔ谶@個階段的產(chǎn)物為HOOC-CH2CH2-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-聚苯乙烯，其為如方案1所述的HOOC-X-CO-O-Q-載體的形式，其中Q為Sasrin連接基-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-，所述載體為Sasrin珠的聚苯乙烯，X為-CH2CH2-。
用DMF洗滌后，用8毫摩爾CDI在8毫升DMF中活化所述酸的游離羧基30分鐘。
如實施例1所述用‘PEG’氨解活化樹脂。如實施例1那樣再進行7個‘PEG’-succ循環(huán)。(在另一情況下，再進行5個而不是7個循環(huán))。
然后在標準條件下使用HBTU/DIEA用Boc-Ser(Bzl)?；税被Ｍㄟ^用1％TFA/DCM溶液多次處理，如Sasrin生產(chǎn)商推薦的那樣用吡啶甲醇溶液中和每個等份樣來從樹脂上轉(zhuǎn)移所述鏈。這個階段通過在室溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)分離產(chǎn)物Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-COCH2-CH2CO-OH，或更簡單Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)8-OH并通過反相HPLC純化。(在另外的情況下，制備Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-OH)。在標準條件下用HATU(一當量)NMP溶液活化羧基10分鐘并將活化化合物用‘PEG’(半當量，以有利于‘PEG’的兩個氨基的?；?氨解2天。通過反相HPLC分離產(chǎn)物并通過電子噴霧離子化質(zhì)譜鑒定為對稱化合物Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-Ser(Bzl)Boc其也可寫成Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-Ser(Bzl)Boc在上面結(jié)構(gòu)中，可理解對稱中心‘PEG’的兩個端氨基用Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)8-己?；沂諷er(Bzl)因此為-CO-CH(CH2OBzl)NH-而不是更常見的-NH-CH(CH2OBzl)CO-，因此Ser殘基顯示為斜體以表明這個情況。實測質(zhì)量為5613(計算值5612.9)。在所述另一情況下產(chǎn)物是對稱化合物Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser(Bzl)Boc其也可寫成Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)12-‘PEG’-Ser(Bzl)Boc并且實測質(zhì)量為4403.4(計算值4403.4)。
通過用TFA(每毫克20微升TFA)以標準方法處理4分鐘后加入三氟甲烷磺酸(每毫克2微升)在室溫下處理25分鐘除去保護基(Boc，Bzl)。將去保護的物質(zhì)沉淀并用預先冷卻到-20℃的乙醚洗滌三次而得到對稱的化合物H-Ser-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-Ser-H或H-Ser-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-Ser-H其通過反相HPLC分離并通過電子噴霧離子化質(zhì)譜鑒定實測質(zhì)量為5232，計算值為5232.4。
可將未保護的絲氨酸基如上面Rose，J.Am.Chem.Soc.所述用HIO4氧化形成端醛基
在標準肟化條件下加入NH2OCH2C(O)-肽得到啞鈴形二肟肽-COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-C(O)CH＝NOCH2CO-肽其也可寫成肽-COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-C(O)CH＝NOCH2CO-肽或(肽)-肟-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-肟-(肽)其可通過HPLC分離并通過質(zhì)譜鑒定。
適合使用的肽序列的例子是上面的Johnson等人在Chemistry &Biology中所述的肽序列-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-(SEQ ID NO1)。
這種肽與分子量約3400的連接基的二聚顯示出導致生物活性約1000倍的提高。實施例7描述了這種肽如何以適合的形式(氨基氧基乙酰基和二硫鍵存在)生產(chǎn)而供肟化成氧化PEG連接基。
實施例6與PEG連接基結(jié)合的肽(肽)-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8-)-酰胺的合成在該實施例中使用MBHA樹脂(0.5毫摩爾，Novabiochem，瑞士)。樹脂結(jié)合的氨基在標準條件下用Fmoc-Lys(Mtt)?；?。去除Fmoc基后(20％哌啶的DMF溶液，20分鐘)，在實施例1的條件下增加八個‘PEG’-succ循環(huán)。第八個‘PEG’基的端氨基用Boc-Glu(Ochxl)?；?。然后用等份的1％TFA/DCM溶液去除Mtt基(但不是Boc基)直到不再有黃色釋放出來。在使用標準Boc化學、用序列H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-(SEQ IDNO2)延伸所述肽前將游離氨基用Fmoc-O-Su(1毫摩爾在4毫升含0.4毫升N-甲基嗎啉的DMSO中，1小時；用Kaiser試驗檢查并且如果需要重復酰化，但是第二次只使用0.2毫升N-甲基嗎啉)。在上面Terskikh等人的文獻中已描述了序列H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-(SEQ ID NO3)。當適合留間隔時這種肽的五個拷貝提供了五個數(shù)量級的與病理細胞系更好的結(jié)合。
Fmoc基團(和在色氨酸的側(cè)鏈上的甲酰基)用哌啶的DMF溶液去除，并且游離氨基用Boc-NHOCH2CO-OSu?；?完全和以上所述的Fmoc-O-Su偶聯(lián)相同)。Boc基團用TFA去除，樹脂用10％DIEA/DMF溶液中和、用DMF洗滌后用DCM洗滌并接著用1∶1DCM∶MeOH洗滌并高真空下干燥。如實施例2那樣進行用HF的裂解和產(chǎn)物分離。通過反相HPLC分離的產(chǎn)物通過電子噴霧離子化質(zhì)譜鑒定H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8)-NH2(SEQ ID NO4)，實測質(zhì)量4261.9，計算值4261.1。
只使用4個‘PEG’-succ循環(huán)如上制備具更短連接基的化合物。這種化合物具有3051.5的實測質(zhì)量，計算值為3051.6。
這些具有PEG基連接基和氨基氧基乙酰基(NH2OCH2CO-)的肽被用于肟化反應(yīng)來使用上面Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的化學制備二聚物和更高級的聚肟。
實施例7肽二聚物(肽)-肟-(‘PEG’-succ)2-Lys-((肽)-肟-(‘PEG’-succ)2)酰胺的合成在該實施例中使用MBHA樹脂(0.5毫摩爾，Novabiochem，瑞士)。在ABI 430A儀器上通過標準Boc化學將序列Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-(SEQ ID NO1)(Johnson等，Chemistry & Biology，見上面)、接著將Boc-氨基乙酸偶聯(lián)到樹脂上。通過兩個30分鐘的用10毫升混合物[巰基乙醇(6ml)和DIEA(3ml)在DMF(21ml)中]的處理除去His側(cè)鏈的二硝基苯基。用DMF洗滌樹脂后，以標準方法用TFA除去Boc基團，然后通過兩次用水(2ml)和乙醇胺(2.4ml)在DMF(35.6ml)中的混合物(每次10ml)處理由色氨酸上除去甲酰基。樹脂用DMF充分清洗后，用DCM洗滌并接著用1∶1DCM∶MeOH洗滌，排出并高真空干燥。用HF裂解和去保護，如實施例2那樣進行產(chǎn)物分離。電子噴霧離子化質(zhì)譜分析表明產(chǎn)物具有所期待的NH2OCH2CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH2(SEQ ID NO1)的質(zhì)量(實測值2250.8，計算值2249.7)。
如下形成二硫鍵。將48毫克上述肽(約21.3微摩爾)溶解于48毫升水中并用氫氧化銨溶液將pH調(diào)節(jié)到7.0(玻璃電極)。加入25當量0.92M過氧化氫貯備液。室溫下30分鐘后，用0.5毫升乙酸酸化該溶液并立即注入制備反相HPLC中。二硫鍵的形成由損失兩個質(zhì)量單位證實實測值2247.8，計算值2247.7。
在該實施例中使用MBHA樹脂(0.5毫摩爾，Novabiochem，瑞士)。樹脂結(jié)合的氨基在標準條件下用Fmoc-Lys(Fmoc)酰化。去除Fmoc基后(20％哌啶的DMF溶液，20分鐘)，在實施例1的條件下增加兩個‘PEG’-succ循環(huán)。然后用Boc-Ser(Bzl)?；甈EG’基的端氨基。在用TFA除去Boc基并將樹脂洗滌和干燥后，用液體氟化氫處理樹脂并按實施例2的方法將產(chǎn)物分離。反相HPLC分析表明為單一主產(chǎn)物，其通過電子噴霧離子化質(zhì)譜鑒定為所期待的產(chǎn)物(實測質(zhì)量為1529.4，計算值為1528.8)H-Ser-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ-Lys(H-Ser-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ)-NH2。
產(chǎn)量為180mg純化產(chǎn)物。在Gaertner等人在BioconjugateChemistry 3262-268(1992)的所述條件下，將端絲氨酸殘基在咪唑緩沖劑(340mg咪唑溶于100ml水中，用6M HCl調(diào)節(jié)到pH 6.95)和乙腈的混合物7∶2(體積)中用高碘酸氧化。通過反相HPLC分離氧化(二醛)產(chǎn)物后，通過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)分別相應(yīng)于期待的二醛、二醛一水合物和二醛二水合物的質(zhì)量1466.9、1484.9和1502.9(計算值分別為1466.8、1484.8、1502.8)O＝CH-CO-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ-Lys(O＝CH-CO-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ)NH2在以0.1％TFA用0.1％TFA在90％乙腈中的梯度的制備HPLC分離后，通過在室溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收二醛至約10mM的濃度(所述氧化為定量氧化)。
二醛用兩倍過量的NH2OCH2CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH2(SEQ IDNO1)(具有二硫鍵)在室溫下肟化(按照Rose.，K.，1994)18小時而導致這種肽和二醛間的期待的二肟的形成。通過反相HPLC分離這種二肟并通過質(zhì)譜鑒定實測質(zhì)量為5926.0，計算值為5926.0。
實施例8H-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-H的合成在DMF中溶脹后，將Sasrin樹脂(0.3毫摩爾)用CDI(8毫摩爾于8毫升NMP中，NMP為0.5M的4-二甲基氨基吡啶溶液)活化30分鐘、排出并再次活化。將活化樹脂用‘PEG’氨解，然后用SA酰化并如前所述(除了洗滌步驟中用NMP代替DMF外)用于制備H-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-CO-O-CH2-C6H3(OCH2)-樹脂。用TFA裂解30分鐘從樹脂裂解出產(chǎn)物并用冷乙醚(在其冰點)沉淀。通過制備反相HPLC分離產(chǎn)物。電子噴霧質(zhì)譜顯示其質(zhì)量為2437.18±0.81。對于對稱的H-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-H來說其質(zhì)量計算值為2436.98。
實施例9H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)3-‘DAH’-succ-‘PEG’-H的合成除了在替換的氨解循環(huán)中使用‘DAH’代替‘PEG’外，該實施例與實施例8的步驟類似。這樣，在Sasrin樹脂上制得(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)3-‘DAH’-succ-‘PEG’。盡管當使用更親水的‘PEG’二胺工作時優(yōu)選DMF，但是當使用疏水二胺如DAH工作時，在實施例1和5-7的方法中使用NMP代替DMF是有益的。用TFA從樹脂裂解并用冷乙醚(在其冰點)沉淀后，通過反相HPLC將產(chǎn)物分離。電子噴霧質(zhì)譜顯示其質(zhì)量為1920.78±0.59。H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)3-‘DAH’-succ-‘PEG’-H的質(zhì)量計算值為1920.49。
實施例10聚酰胺穩(wěn)定性評價將實施例8和9生產(chǎn)的化合物以1mg/ml的濃度分別溶解于1％碳酸氫銨溶液中。在不同的試管中，將這些溶液用胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶(酶∶底物比率1∶100，37℃)處理。以一定間隔抽出等份試樣(20微升)并用HPLC分析。即使24小時后，也沒有消化發(fā)生，而在相同條件下胰島素用酶的對照培育表明只在4小時后就發(fā)生廣泛地消化。因此聚酰胺比多肽對蛋白酶的作用穩(wěn)定得多。相反，來自上面Terskikh等人所用的駱駝抗體的鉸鏈區(qū)的肽酰胺H-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Glu-Pro-Glu-NH2(SEQ ID NO5)盡管對糜蛋白酶和彈性蛋白酶穩(wěn)定，但它在24小時后就被胰蛋白酶深度消化。
實施例11A、EMP-二聚物(工業(yè)PEG)的合成和HPLC/質(zhì)譜分析此中稱為“工業(yè)EMP-二聚物”的EMP二聚物使用此中稱為“工業(yè)EMP二聚物”并表示為O＝CH-工業(yè)PEG-CH＝O的平均相對分子量3400的工業(yè)PEG二醛連接基(Shearwater Polymers)制備。攜帶AoA基的單體肽(Johnson等，Chemistry & Biology，同上)NH2OCH2CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO1)和二硫鍵通過Boc化學使用標準技術(shù)在MBHA樹脂(上述的Fields和上述的Rose，J.Am.Chem.Soc.和實施例7)上合成。然后將肽從樹脂裂解并用HF(含5％對甲苯酚，0℃ 60分鐘)去保護，用乙醚沉淀并通過制備HPLC純化。然后用工業(yè)PEG連接基進行肟化而得到二聚物酰胺-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH2ON＝CH-工業(yè)PEG-CH＝NOCH2CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO1的二聚物)。斜體字用于指示所示的是非常規(guī)取向(C到N端而非常規(guī)的N到C端)的一種肽。肟化如下進行將2.4mg EMP肽(1.06微摩爾；比醛基1.2倍過量)溶解于0.2ml水中并加入到溶解于0.45ml乙酸鹽緩沖液(0.15M，反離子鈉，6M鹽酸胍)的1.5mg(0.44微摩爾)PEG-二醛中。在室溫下暗處保存16小時后，通過制備HPLC進行產(chǎn)物分離并通過分析HPLC和MALDI-TOF質(zhì)譜進行鑒定。
這種EMP-二聚物的反相HPLC色譜圖和質(zhì)譜分析利用MAIDI-TOF技術(shù)(其產(chǎn)生單質(zhì)子化物質(zhì))，因為對于在電子噴霧四極儀(其生產(chǎn)多質(zhì)子化物質(zhì))上的譜圖分析太復雜。
前人用來自相同供應(yīng)商的PEG制備的這種二聚物的工作(Johnson等，Chemistry & Biology，同上)證實了在EPO決定的細胞增殖測定中的0.1nM的ED50值，這比所述肽單體低1000倍。盡管其具有純的色譜圖，但質(zhì)譜圖顯示有40個以上的組分，每個相差PEG重復單元-CH2CH2O-，即44amu的間隔。不可能通過HPLC分離各組分。在相應(yīng)于具78個-CH2CH2O-基的分子的分布的中心處(8024amu)的質(zhì)量峰與所宣稱的PEG的相對分子量(3400，即77個重復單元，231個鍵，發(fā)現(xiàn)這里為±20個重復單元或60個鍵)一致。
B、EMP-二聚物(精確長度PEG)的合成和HPLC/質(zhì)譜分析此中稱為“精確長度EMP-二聚物”的EMP二聚物使用此中稱為“精確長度EMP二聚物”的一種本發(fā)明的精確長度PEG基聚酰胺鏈制備。所述精確長度EMP-二聚物具有比工業(yè)EMP-二聚物更長的長度。
所述精確長度EMP-二聚物是基于對稱的聚酰胺連接基-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-并如下合成。
使用上述的技術(shù)在Sasrin樹脂(Bachem)上制備所述PEG聚酰胺連接基Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-OH。按樹脂生產(chǎn)商的建議用1％TFA的DCM溶液自所述樹脂上裂解所述物質(zhì)并用制備HPLC純化。攪拌下往Boc-Ser(Bzl)-(PEG-succ)6-OH(9.7毫克，4.4微摩爾)的NMP溶液中加入HATU試劑(1.6毫克，4.4微摩爾)和用NMP稀釋10倍的DIEA溶液(15微升，8.8微摩爾)。在相應(yīng)于羧酸基預活化5分鐘后，將活性酯用PEG基二胺(4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺，‘PEG’，用NMP稀釋100倍，24微升，1.15微摩爾)氨解過夜。得到的對稱Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser(Bzl)-Boc直接通過制備HPLC純化(產(chǎn)量7毫克，1.6微摩爾，73％)。用標準TFMSA裂解方法(300微升TFA 4分鐘，接著加入30微升TFMSA 25分鐘)去除兩個Boc基和芐基。產(chǎn)物用冷乙醚(在其熔點，存在少量固態(tài)醚)沉淀，用冷乙醚洗滌三次并在干燥器中干燥。將去保護連接基Ser-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser的Ser殘基如上面Rose，J.Am.Chem.Soc.中所述氧化成乙醛酰官能基(O＝CH-CO-)。第二個Ser被寫成斜體字以指示該連接基是對稱的第一個Ser為NH2-CH(CH2OH)CO-，第二個Ser為-CO-CH(CH2OH)-NH2，即指示非常規(guī)途徑循環(huán)。
將得到的二醛連接基再通過HPLC純化。將具有形成的二硫鍵的氨基氧基乙?；?EMP肽衍生物溶液(96微升，21.3mM/0.1M乙酸鹽緩沖液，pH 4.0，反離子鈉；比醛基1.5倍過量)與二醛(200微升，3.5mM/水)混合并讓其在室溫下反應(yīng)48小時。通過反相HPLC分離二聚產(chǎn)物酰胺-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH2ON＝CH-CO-(‘PEG’-succ)12-‘PEG’-CH＝NOCH2CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(一種SEQ ID NO1的二聚物)，產(chǎn)量為1.2毫克(20％收率)，并且通過分析HPLC和電子噴霧離子化質(zhì)譜鑒定。斜體字用于指示所示的是非常規(guī)取向(C到N端而非常規(guī)的N到C端)的一種肽。
盡管所述精確長度EMP-二聚物具有比工業(yè)EMP-二聚物更多的鍵(243比231)和42個-CH2CH2O-單元，但所述精確長度EMP-二聚物均勻得多。在質(zhì)譜圖上沒有具太少-CH2CH2O-重復(44個質(zhì)量單位)物質(zhì)的信號。只稍微比主信號強的信號是由于鈉和鉀的陽離子化，而這種陽離子化是電子噴霧離子化質(zhì)譜的常見特征。其實測質(zhì)量(8417)非常接近于8420的理論值。它證明了可以制備具有更長和更短的鏈16和4個-‘PEG’-succ-重復單元的二聚物。使用上至-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-的間隔基獲得了優(yōu)良的色譜圖和質(zhì)譜圖。
實施例12在細胞培養(yǎng)測定(人類白血病的UT-7 EPO依賴性細胞系)中測定具不同長度連接基的精確長度EMP-二聚物的EPO活性。重組EPO和EMP單體肽包括其中作為對照，所述單體在表1中表示為“mono”。
在所述精確長度EMP-二聚物中的短連接基(在表1中表示為“s”)為-(‘PEG’-succ)2-‘PEG’-(succ-‘PEG’)2-。中度連接基(在表1中表示為“m”)為-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-，而長連接基(在表1中表示為“1”)為-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-。
表1每個肽樣品的平均OD濃度(μM)OD OD OD ODm s l mono1×10-1.884 .930 .891 .8783.33×10-2.902 .925 .890 .6731.11×10-2.876 .935 .906 .3733.70×10-3.888 .919 .931 .2101.24×10-3.916 .798 .838 .0784.12×10-4.805 .756 .848 .0781.37×10-4.760 .534 .835 .0894.57×10-5.637 .299 .695 .0891.52×10-5.597 .194 .632 .0895.08×10-6.712 .171 .525 .0891.69×10-6.641 .298 .614 .0895.65×10-7.469 .163 .547 .0891.88×10-7.363 .117 .502 .0896.27×10-8.350 .114 .356 .0892.09×10-8.287 .088 .231 .0896.97×10-9.280 .089 .193 .0892.32×10-9.246 .083 .217 .0897.74×10-10----- .099 .194 .0892.58×10-10----- .129 .170 .089陰性對照.089 .076 .074 .090
表2重組EPO樣品的平均ODEPO(ng/ml) OD50 .91716.7 .9205.56 .8851.85 .878.617 .650.206 .362.0686.179.0229.124.00762 .108.00254 .101陰性對照 .078從上面的結(jié)果明顯可以看出表3所示的ED50(產(chǎn)生50％最大響應(yīng)的有效劑量)值。
表3物質(zhì) ED50(pM)EMP單體 20000重組EPO25EMP-s(短二聚物) 100EMP-m(中二聚物)1EMP-l(長二聚物) 0.1表3表明連接了中和長聚酰胺鏈的EMP二聚物在細胞測定中比重組蛋白質(zhì)標準具有高得多的活性。
實施例13下面實驗探索分支結(jié)構(gòu)的用途，在其構(gòu)建中使用了非PEG的聚合物。
本發(fā)明的PEG基聚酰胺被用于合成此中被稱為“化學體”的peptabody的化學變體(Terskikh等人，同上)。通過標準技術(shù)(上面所述的Fields的技術(shù)和上面的Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的技術(shù))在Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA樹脂(0.5mmol)上合成帶一個AoA基團的單體肽H-ADGACRNPWC-(‘PEG’-succ)8-Lys(AoA)-酰胺(SEQ ID NO6)。簡要地說，去除Fmoc保護，進行PEG’-succ的8個循環(huán)，然后將Boc-Cys(4-MeBzl)偶聯(lián)到端氨基上。去除Mtt保護(進行多輪的1％TFA/DCM處理直到溶液不再發(fā)黃)并將氨基用Fmoc-OSu(2mmol在5ml具作為堿的N-甲基嗎啉的DMF中)?；Ｍㄟ^Boc化學反應(yīng)將肽鏈延伸到N-端。用10％哌啶/DMF處理7分鐘去除Fmoc保護，因為更強的條件導致在Asp-Gly處形成琥珀酰亞胺。這種哌啶處理從Trp吲哚上去除了甲?；Ｗo。氨基用Boc-AoA-OSsu(0.6mmol在5ml含作為堿的N-甲基嗎啉的無水DMSO中，沒有更強的條件或Trp的酰化或Boc-NHOCH2CO-的N的?；l(fā)生)酰化。從樹脂裂解并用HF去保護后，通過HPLC純化，如對于EMP肽所述用過氧化氫形成二硫鍵，通過HPLC分離產(chǎn)物并通過分析HPLC和電子噴霧離子化質(zhì)譜鑒定實測質(zhì)量為3709.1，理論質(zhì)量為3709.4。
以Fmoc-半胱胺-Sasrin樹脂(Bachem)為起始并偶聯(lián)兩輪的Fmoc-Lys(Fmoc)以及隨后偶聯(lián)Boc-Ser(t-Bu)，通過標準技術(shù)制備四價拷貝Ser-Lys(Ser)-Lys(Ser-Lys(Ser))-NHCH2-CH2SH。去保護和裂解(270mg樹脂，2.7ml TFA，30mim，過濾，在氮氣流下蒸發(fā)到小體積，用冷乙醚沉淀)后，產(chǎn)物通過HPLC純化。將該硫羥如下進行烷基化往磷酸鹽緩沖溶液(2.5ml，0.25M磷酸鹽，pH 7.0，1mM EDTA)中首先混入1ml純化的拷貝(10mM水溶液)并立即混入5-碘乙酰氨基熒光素(Fluka，1ml，10mM/DMF)。暗處放置90分鐘后，將熒光素標記的拷貝用HPLC純化，得到7.8mg產(chǎn)物，66％的收率。將Ser殘基氧化并通過HPLC分離后，將四乙醛酰基熒光素標記的拷貝(28μl，3.4mM/水)在室溫下用H-ADGACRNPWC-(‘PEG’-succ)8-Lys(AoA)-酰胺(SEQID NO6)(二硫化物形式，66μl，6mM/0.1M乙酸鹽緩沖液，pH4.0，反離子鈉，比每個存在的醛基1.04倍過量)肟化48小時。產(chǎn)物通過HPLC純化并用分析HPLC和電子噴霧離子化質(zhì)譜鑒定[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-熒光素，其中所述“肽”為-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)。
與上面Terskikh等人的peptabody類似，這種四聚產(chǎn)物被稱為四聚化學體。這種四聚化學體的HPLC色譜圖和質(zhì)譜圖顯示結(jié)合到BCL1腫瘤細胞系(Terskikh等人，同上)的源于噬菌體的肽ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)的四個拷貝(具有半胱氨酸間的二硫鍵)。與具有五個肽、72個鍵的連接基長度和沒有報道基團的85000相對分子量的Terskikh peptabody相比，所述的化學體具有4個結(jié)合肽、167個鍵的PEG-聚酰胺間隔基長度和一個熒光素報道基團和15858(實測值；接近15839的理論值)的相對分子量。在質(zhì)量15521處的一個小信號相應(yīng)于一個存在缺失32的一個單-“PEG”-succ-重復單元的非常小的組分。
這種缺失在固相肽合成中是常見的，由于采用了標準肽化學方法，期待偶合步驟的優(yōu)化(更高的濃度、更長的時間、更高的溫度、更好的溶劑、添加劑諸如4，4’-二甲基氨基吡啶)來產(chǎn)生更長的鏈，特別是由于用這些無位阻且非常易溶的化合物，應(yīng)不存在難以用肽建立并通常伴隨著β-結(jié)構(gòu)形成的序列。
噬菌體源的肽因此可在生物相容的鏈的端點顯示在整個合成分子上，而不會有重組表達和重折疊的問題。通過上述方法，化學體可容易地用ADGACRNPWC(SEQ ID NO6)以及用噬菌體肽SVWRWLPYDKYE(SEQ ID NO3)制備，而具有相應(yīng)序列的相應(yīng)peptabodies不能以可溶形式產(chǎn)生(Terskikh等人，同上)。寬范圍的精確制備的二聚物和多價結(jié)構(gòu)諸如化學體現(xiàn)可容易地通過此中所述的方法合成。
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序列表<110>Gryphon Sciences<120>精確長度的聚酰胺鏈<130>GRFN-029/03WO<140><141><150>60/124，266<151>1999-03-11<150>60/105，261<151>1998-10-22<150>60/098，351<151>1998-08-28<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>1Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln1 5 10 15Pro Leu Arg Gly20<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>2Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr1 5 10<210>3<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>3Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr Glu1 5 10<210>4<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>4Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr Glu Lys1 5 10<210>5<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>5Pro Gln Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Lys1 5 10 15Pro Gln Pro Lys Pro Glu Pro Glu20<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>6Ala Asp Gly Ala Cys Arg Asn Pro Trp Cys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種具有精確數(shù)目重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈，所述鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；和Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在。
2.權(quán)利要求1的鏈，其中一個或多個X和Y取代基為對稱基團。
3.權(quán)利要求1的鏈，其中X和Y取代基的至少一個包含1到5個-CH2CH2O-基團。
4.權(quán)利要求1的鏈，其中所述二價有機基團選自取代、未取代、分支和線性、脂族和芳族基團，并可任選含有雜原子。
5.權(quán)利要求4的鏈，其中所述二價有機基團選自苯基、C1-C10亞烷基部分、C1-C10烷基基團，任選含雜原子，或其組合。
6.權(quán)利要求5的鏈，其中所述二價有機基團選自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
7.權(quán)利要求1的鏈，具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-。
8.權(quán)利要求7的鏈，具有下式-{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n--{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}-。
9.權(quán)利要求7的鏈，具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}z--NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-其中z為一個1到49的整數(shù)。
10.權(quán)利要求1的鏈，具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-。
11.權(quán)利要求10的鏈，具有下式-{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
12.權(quán)利要求10的鏈，具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
13.權(quán)利要求10的鏈，具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
14.具有精確重復單元數(shù)目的水溶性有機聚酰胺基組成，所述組成具有下式[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；q為一個1到10的整數(shù)；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；V選自其性質(zhì)有待修飾或增強并且具有任選的二價間隔基或連接基的一價或多價目標分子；具有多價連接基的報道基團；反應(yīng)性基團；和具有多價連接基的端基，所述端基選自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-載體，其Z為二價間隔基諸如-NH-、-O-或可不存在，Q為連接基或目標分子，所述載體為固相、基體或表面；和U選自其性質(zhì)有待修飾或增強并且具有任選的二價間隔基或連接基的目標分子；端基；肽鏈；保護基；載體和反應(yīng)性基團。
15.權(quán)利要求14的組成，其中X和Y取代基的一個或多個是對稱基團。
16.權(quán)利要求14的組成，其中X和Y取代基的至少一個包含1到5個-CH2CH2O-基團。
17.權(quán)利要求14的組成，其中所述二價有機基團選自取代、未取代、分支和線性、脂族和芳族基團，并可任選含有雜原子。
18.權(quán)利要求17的組成，其中所述二價有機基團選自苯基、C1-C10亞烷基部分、C1-C10烷基基團，任選含雜原子，或其組合。
19.權(quán)利要求18的組成，其中所述二價有機基團選自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
20.權(quán)利要求14的組成，具有下式[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}]q-V。
21.權(quán)利要求20的組成，具有下式[U-{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n--{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}]q-V。
22.權(quán)利要求20的組成，具有下式[U-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}z--NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH]q-V其中z為一個1到49的整數(shù)。
23.權(quán)利要求14的組成，具有下式[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n]q-V。
24.權(quán)利要求23的組成，具有下式[U-{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n]q-V。
25.權(quán)利要求23的組成，具有下式[U-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO}n]q-V。
26.權(quán)利要求23的組成，具有下式[U-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n]q-V。
27.權(quán)利要求14的組成，其中所述目標分子選自蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸、脂質(zhì)體和治療劑。
28.權(quán)利要求14的組成，其中所述目標分子是一種選自-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)的肽。
29.具有精確重復單元數(shù)目的水溶性有機聚酰胺基均一組成，所述組成具有下式[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；q為一個1-10的整數(shù)；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；V選自為少于50個氨基酸殘基的肽并且具有任選的二價間隔基或連接基的目標分子；具有多價連接基的報道基團；反應(yīng)性基團；和具有多價連接基的端基，所述端基選自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-載體，其中Z為二價間隔基諸如-NH-、-O-或不存在，Q為連接基或目標分子，所述載體為固相、基體或表面；和U選自為少于50個氨基酸殘基的肽并且具有任選的二價間隔基或連接基的目標分子；端基；肽鏈；保護基；載體和反應(yīng)性基團；其中U或V中的至少一個是目標分子。
30.權(quán)利要求29的組成，其中所述二價有機基團選自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3-]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
31.權(quán)利要求29的組成，其中所述任選的二價連接基為-COCH2ON＝CH-CO-。
32.權(quán)利要求29的組成，其中所述目標分子選自-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)。
33.權(quán)利要求29的組成，其具有下式(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-肟-(肽)，其中所述肽具有序列-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQID NO1)；肟為-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-；n為12或16。
34.權(quán)利要求29的組成，其具有下式肽-Lys(NH2OCH2CO- (‘PEG’-succ)8)-NH2，其中所述肽具有序列-SVWRWLPYDKYE-(SEQID NO3)；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
35.權(quán)利要求29的組成，其具有下式(肽)-肟-(‘PEG’-succ)2-Lys((肽)-肟-(‘PEG’-succ)2)酰胺，其中所述肽具有序列-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；肟為-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
36.權(quán)利要求29的組成，其具有下式(肽)-(‘PEG’-succ)8-Lys(氨基氧基乙?；?-酰胺，其中所述肽具有序列-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
37.權(quán)利要求29的組成，其具有下式[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-熒光素，其中所述肽具有序列-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)；肟為-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
38.一種水溶性有機聚酰胺基均一組成，其具有下式(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-肟-(肽)，其中所述肽具有序列-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；肟為-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-；n為12或16。
39.一種水溶性有機聚酰胺基均一組成，其具有下式肽-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8)-NH2，其中所述肽具有序列-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
40.一種水溶性有機聚酰胺基均一組成，其具有下式(肽)-肟-(‘PEG’-succ)2-Lys((肽)-肟-(‘PEG’-succ)2)酰胺，其中所述肽具有序列-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；肟為-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
41.一種水溶性有機聚酰胺基均一組成，其具有下式(肽)-(‘PEG’-succ)8-Lys(氨基氧基乙?；?-酰胺，其中所述肽具有序列-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
42.一種水溶性有機聚酰胺基均一組成，其具有下式[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-熒光素，其中所述肽具有序列-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)；肟為COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
43.合成具有精確數(shù)目重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈的方法，這種鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；和Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；該方法包括下面的步驟(a)用摩爾過量的試劑L-CO-L’，其中L和L’為離去基團并且相同或不同，?；絑-Q載體化合物的氨基或羥基，其中Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；所述載體為一固相、基體或表面；(b)用摩爾過量的式NH2-Y’-NH2的二胺氨解步驟(a)的產(chǎn)物；(c)用摩爾過量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物?；襟E(b)的產(chǎn)物；(d)活化步驟(c)產(chǎn)物的游離羧基；(e)用摩爾過量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步驟(d)的產(chǎn)物；和(f)任選使用式HOOC-X-COOH的二酸衍生物和式NH2-Y-NH2的二胺重復步驟(c)-(e)，其中所述X和Y取代基與在任何前面所述氨解和?；襟E中所用的X和Y取代基相同或不同。
44.權(quán)利要求43的方法，其中Q為含可裂解部分的連接基或通過含可裂解部分的連接基與載體結(jié)合的目標分子，所述方法還包括裂解所述可裂解部分而從載體上釋放精確長度的水溶性有機聚酰胺基鏈。
45.權(quán)利要求43的方法，其中X和Y取代基中的一個或多個為對稱基團。
46.權(quán)利要求43的方法，其中X和Y取代基中的至少一個包含1到5個-CH2CH2O-基團。
47.權(quán)利要求43的方法，其中所述二價有機基團選自取代、未取代、分支和線性、脂族和芳族基團，并可任選含有雜原子。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述二價有機基團選自苯基、C1-C10亞烷基部分、C1-C10烷基基團，任選含雜原子，或其組合。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述二價有機基團選自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
50.權(quán)利要求43的方法，其中所述鏈具有下式-{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n--{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}-。
51.權(quán)利要求43的方法，其中所述鏈具有下式-[{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO]--{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}]z--NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-其中z為一個1-49的整數(shù)。
52.權(quán)利要求43的方法，其中所述游離羧基用一種活化劑活化，所述活化劑選自碳酰二咪唑、二琥珀酰亞胺基碳酸酯和O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽。
53.合成具有精確數(shù)目重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈的方法，這種鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-式中n為1-100的整數(shù)；和X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；該方法包括下面的步驟(a)用摩爾過量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物?；絑-O載體化合物的氨基或羥基，其中Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；所述載體為固相、基體或表面；(b)活化步驟(a)產(chǎn)物的游離羧基；(c)用摩爾過量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步驟(b)的產(chǎn)物；和(d)任選使用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重復步驟(a)-(c)，其中所述X和Y取代基與在任何前面所述的?；桶苯獠襟E中所用的X和Y取代基相同或不同。
54.權(quán)利要求53的方法，其中Q為含可裂解部分的連接基或通過含可裂解部分的連接基與載體結(jié)合的目標分子，所述方法還包括裂解所述可裂解部分而從載體上釋放精確長度的水溶性有機聚酰胺基鏈。
55.權(quán)利要求53的方法，其中X和Y取代基中的一個或多個為對稱基團。
56.權(quán)利要求53的方法，其中X和Y取代基中的至少一個包含1到5個-CH2CH2O-基團。
57.權(quán)利要求53的方法，其中所述二價有機基團選自取代、未取代、分支和線性、脂族和芳族基團，并可任選含有雜原子。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述二價有機基團選自苯基、C1-C10亞烷基部分、C1-C10烷基基團，任選含雜原子，或其組合。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述二價有機基團選自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
60.權(quán)利要求53的方法，其中所述鏈具有下式-{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
61.權(quán)利要求53的方法，其中所述鏈具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
62.權(quán)利要求53的方法，其中所述鏈具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
63.權(quán)利要求53的方法，其中所述游離羧基用一種活化劑活化，所述活化劑選自碳酰二咪唑、二琥珀酰亞胺基碳酸酯和O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽。
64.一種可用于合成具有精確數(shù)量重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈的試劑盒，所述鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；所述試劑盒包括(a)Z-Q-載體，其中Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；并且所述載體為固相、基體或表面；(b)具有下式HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物；和(c)具有下式NH2-Y-NH2的二胺。
65.權(quán)利要求64的試劑盒，包括至少一種具有下式HOOC-X-COOH的其它二酸，其中X取代基與第一種二酸或其衍生物的X取代基不同。
66.權(quán)利要求64的試劑盒，包括至少一種具有下式NH2-Y-NH2的其它二胺，其中Y取代基與第一種二胺中的Y取代基不同。
67.權(quán)利要求64的試劑盒，還包括一種選自碳酰二咪唑、二琥珀酰亞胺基碳酸酯和O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽的活化劑。
68.一種用于增強或修飾目標分子的試劑盒，包括(a)用于合成具有精確數(shù)量重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈的試劑，所述鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；和Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；包括(i)Z-Q-載體，其中Z為H2N-或HO-；Q為連接基或目標分子；并且所述載體為固相、基體或表面；(ii)具有下式HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物，其中X為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；和(iii)具有下式NH2-Y-NH2的二胺，其中Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；和(b)其性能有待修飾或增強，并且具有任選的二價間隔基或連接基的目標分子。
69.權(quán)利要求68的試劑盒，其包括至少一種具有下式HOOC-X-COOH的其它二酸，其中X取代基與第一種二酸或其衍生物的X取代基不同。
70.權(quán)利要求68的試劑盒，其還包括至少一種具有下式NH2-Y-NH2的其它二胺，其中Y取代基與第一種二胺的Y取代基不同。
71.權(quán)利要求68的試劑盒，其還包括一種選自碳酰二咪唑、二琥珀酰亞胺基碳酸酯和O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽的活化劑。
72.權(quán)利要求68的試劑盒，其中所述目標分子選自蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸、脂質(zhì)體和治療劑。
73.權(quán)利要求72的試劑盒，其中所述目標分子是一種選自-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)的肽。
74.一種用于增強或修飾目標分子的試劑盒，其包括(a)具有精確數(shù)量重復單元的水溶性有機聚酰胺基鏈，所述鏈具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n為1-100的整數(shù)；n’為0或1；X和Y為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在并相同或不同，并且隨每個所述重復單元可各不相同；和Y’為無反應(yīng)性官能基的二價有機基團或者不存在；和(b)其性能有待修飾或增強，并且具有任選的二價間隔基或連接基的目標分子。
75.權(quán)利要求74的試劑盒，其中所述目標分子選自蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸、脂質(zhì)體和治療劑。
76.權(quán)利要求75的試劑盒，其中所述目標分子是一種選自-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)的肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了精確長度的鏈及其制備方法。這些鏈通過二酸的衍生物和二胺在載體上以分步方式反應(yīng)形成。所述反應(yīng)劑之一包含水溶性低聚物,優(yōu)選聚乙二醇。這些鏈然后可用于化學修飾目標大分子諸如生物學上重要的多肽。
文檔編號C07K17/08GK1330675SQ99812465
公開日2002年1月9日 申請日期1999年8月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月28日
發(fā)明者K·羅斯 申請人:格萊風科學公司