專利名稱：白色念珠菌(C.Albicans)中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抗真菌物質(zhì)方法，其中真菌中，特別是白色念珠菌(Candida A1bicans，C.Albicans)中的必需基因，以及其它病原體真菌中的功能相似基因，或者相應(yīng)的編碼蛋白被用作靶。本發(fā)明也涉及特定的白色念珠菌基因。
已知真菌感染的范圍，從真菌侵蝕皮膚或者指甲到對(duì)內(nèi)臟器官潛在的真菌感染；這種感染和由其造成的疾病被稱為真菌病。
抗真菌物質(zhì)(抑真菌的或者殺真菌的)被用于治療真菌病。然而，直到現(xiàn)在，已知具有病理效果的這種物質(zhì)相對(duì)很少，例如，兩性霉素B(Amphotericin B)，制霉菌素(Nystatin)，匹馬霉素(Pimaricin)，灰黃霉素(Griseofulvin)，克霉唑，5-氟-胞嘧啶(5-fluoro-cytosine)和Batraphene。藥物治療真菌感染非常困難，特別是因?yàn)樗拗骷?xì)胞和真菌都是真核細(xì)胞。因此，基于已知的抗真菌物質(zhì)來(lái)用藥，經(jīng)常造成不希望有的副作用，例如，兩性霉素B具有腎毒性的作用。所以，強(qiáng)烈地需求可用于制造藥品的病理有效性物質(zhì)，這樣的藥品適用于預(yù)防治療免疫抑制狀態(tài)或者是治療已存在的真菌感染。另外，這種物質(zhì)應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出特定的作用譜，以選擇性的抑制真菌的生長(zhǎng)和繁殖而并不影響被治療的宿主生物。
本發(fā)明的目的是為了提供一種鑒別抗真菌物質(zhì)的方法，尤其是用于鑒別抗念球菌屬(Candida)物質(zhì)的方法。該方法的必要特征是把真菌的必需基因作為篩選的靶。
因此本方法涉及一種篩選抗真菌物質(zhì)的方法，其中該真菌的必需基因，或者是其它病原體真菌的功能相似基因，或者是相應(yīng)的編碼蛋白被用作靶，該必需基因選自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039。
根據(jù)本發(fā)明這一方法的一種實(shí)施方案，將以不同水平表達(dá)其必需基因或者是功能相似真菌基因的真菌細(xì)胞與被測(cè)試物質(zhì)一起保溫，并測(cè)定該物質(zhì)的生長(zhǎng)抑制效果。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，將該靶基因或者是該靶基因編碼的相應(yīng)蛋白，在體外與被測(cè)試物質(zhì)接觸并測(cè)定該物質(zhì)對(duì)于靶的效果。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，被篩選物質(zhì)部分或者完全地抑制該必需基因的功能表達(dá)或者其編碼蛋白的功能活性。
根據(jù)一種實(shí)施方案，被篩選物質(zhì)部分或者完全地抑制二氫蝶酸合酶(dihydropteroate synthase)(DHPS)和/或7，8-二氫-6-羥甲基蝶呤-焦磷酸激酶(HPPK)的活性。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，真菌的種選自擔(dān)子菌屬(Basidiomycetes)，子囊菌屬(Ascomycetes)和絲孢菌屬(Hyphomycetes)。
根據(jù)本發(fā)明這一方法的另一種實(shí)施方案，該功能相似基因是念珠菌屬的種(Candida Spp.)，特別是白色念珠菌的必需基因，或者是曲霉屬的種(Aspergillus Spp.)，特別是煙曲霉的必需基因。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，其同系物和其功能片斷，該多核苷酸具有SEQ ID No.2，SEQ ID No.4，SEQ ID No.6，SEQID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示的序列，優(yōu)選具有SEQ ID No.2，SEQ ID No.4，SEQ ID No.6，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示的序列。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種基因或其功能相似基因或其功能片段，該基因是CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039，優(yōu)選是CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102或者CaIR012。
根據(jù)這一實(shí)施方案，功能相似基因或者同源的多核苷酸，在核苷酸水平上，分別與CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039，有至少50％優(yōu)選為至少60％，最優(yōu)選為至少70％的序列同一性。其功能片斷是一種多核苷酸片斷，它保留了起始產(chǎn)物(核苷酸或基因)的功能性。一個(gè)實(shí)例就是CaOR110的剪接變體(它也與原始基因同源，具有大約90％的同一性)。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，功能相似基因，在氨基酸水平上，分別與CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039編碼的蛋白質(zhì)，有至少40％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
就同源性和相似性而言，這些對(duì)基因的描述，加以必要的修正后也適用于多核苷酸。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明包括分別由CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或CaJL039基因，或其功能相似基因編碼的蛋白質(zhì)或其功能性的多肽片段。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種分別含有CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或CaJL039基因，或其功能相似基因，或其功能片斷的質(zhì)粒。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種在1998年8月13日保藏于CNCM(巴斯德研究所，巴黎)的質(zhì)粒(含有該質(zhì)粒的細(xì)菌)，其編號(hào)為I-2065，I-2063和I-2064，分別對(duì)應(yīng)CaNL256，CaBR102和CaIR012基因。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種在1999年8月6日保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)的質(zhì)粒(含有該質(zhì)粒的細(xì)菌)，其編號(hào)為DSM12977，DSM12976，DSM12978和DSM12979，分別對(duì)應(yīng)CaDR325，CaOR110，CaOR110剪接變體和CaMR212。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒可用于診斷真菌感染，所述試劑盒中包括選自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039的基因，其功能相似基因，其功能片斷，相應(yīng)編碼蛋白或者其功能性多肽片斷。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體抗分別由CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039基因或其功能相似基因編碼的蛋白質(zhì)，或其多肽片斷。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸，該多核苷酸可通過(guò)包括以下步驟的方法獲得(i)從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中選擇一種必需基因；(ii)比較該基因的序列與白色念珠菌的基因組序列；(iii)推斷寡核苷酸同源區(qū)域；(iv)PCR擴(kuò)增如此獲得的寡核苷酸；(v)用步驟(iv)的擴(kuò)增引物探測(cè)感興趣的完整基因步驟(iv)的擴(kuò)增引物被用作探針，從白色念珠菌的基因組庫(kù)或者cDNA文庫(kù)中探測(cè)感興趣的完整基因；或者通過(guò)擴(kuò)增引物3’-和5’-末端的延伸，例如用一種PCR方法來(lái)獲得完整的基因。
根據(jù)本發(fā)明，第一步是鑒定所說(shuō)的必需基因，由這些基因出發(fā)，可以鑒定其它病原體真菌中的必需基因。為了應(yīng)用的目的，釀酒酵母中的必需基因被首先鑒定，由這些基因出發(fā)，得到其它病原體真菌，特別是念珠菌的必需基因。
于是，本發(fā)明公開(kāi)了白色念珠菌中必需基因的鑒定，以及這些基因在一種篩選抗真菌物質(zhì)，特別是抗念珠菌物質(zhì)的方法中的用途。
為了鑒定釀酒酵母中的必需基因，通過(guò)同源重組消除單個(gè)的基因組基因。如果這樣消除的DNA區(qū)斷涉及必需基因，那么這樣的缺失對(duì)于以單倍體形式存在的釀酒酵母細(xì)胞是致命的。
一種方法可以用于產(chǎn)生相應(yīng)的基因組缺失的釀酒酵母，并且可以確定含有缺失的釀酒酵母細(xì)胞，該方法中所研究的釀酒酵母基因被標(biāo)記基因所取代。
例如，顯性選擇性標(biāo)記(例如，卡那霉素抗性基因)或者營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可用作選擇性標(biāo)記。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，它可能使用編碼氨基酸或者核酸堿基合成的關(guān)鍵酶的基因。例如，下列釀酒酵母的基因可被用作選擇性標(biāo)記編碼亮氨酸代謝途徑的基因(例如，LEU2-基因)，編碼組氨酸代謝途徑的基因(例如，HIS3-基因)，或編碼色氨酸代謝途徑的基因(例如，TRP-1-基因)，或者編碼尿嘧啶核酸堿基代謝途徑的基因(例如，URA3-基因)。
釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株可以使用。這些營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株只能在含有相應(yīng)氨基酸或者核苷酸堿基的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。例如，所有含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)室釀酒酵母菌株都可以使用。當(dāng)使用雙倍體釀酒酵母菌株時(shí)，相應(yīng)的標(biāo)記基因必須被純合突變?？梢允褂镁闏EN.PK2或其同基因的衍生物。
沒(méi)有合適營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的菌株也可以使用，例如原養(yǎng)型釀酒酵母菌株。因而可以使用顯性選擇性標(biāo)記，例如象是卡那霉素抗性基因這樣的抗性基因。loxP-KanMX-loxP盒可方便地用于這一目的。
為了用同源重組替換釀酒酵母基因的整個(gè)DNA序列或其部分，使用了DNA片斷，其中，標(biāo)記基因在5’-和3’-末端與所研究的釀酒酵母基因的5’-和3’-末端同源序列側(cè)接。
可以使用不同的方法來(lái)制備相應(yīng)的DNA片斷，這些DNA片斷適用于缺失任何特定的釀酒酵母基因。一種線性DNA片斷被用于轉(zhuǎn)化合適的釀酒酵母菌株。這種片斷通過(guò)同源重組被整合到釀酒酵母基因組中。這種方法包括1.制備缺失盒的“傳統(tǒng)方法”(Rothstein，R.J.(1993)酶學(xué)方法，Vol.101，202-211)。
2.使用PCR技術(shù)的“傳統(tǒng)方法”(“經(jīng)過(guò)修改的傳統(tǒng)方法”)。
3.SFH(short flanking homology)-PCR方法(Wach，A.等(1994)酵母101793-1808；Gültner，U.等(1996)核酸研究242519-2524)。
1.在制備釀酒酵母基因組缺失盒的“傳統(tǒng)方法”中，待研究基因或者已經(jīng)存在于合適的載體中，或者被整合到這樣的載體中。用這種方法，任何pBR-，pUC-和pBluescript@-衍生物都可用于實(shí)例。靶基因的一段重要部分被從載體中缺失，例如使用合適的限制性性酶切位點(diǎn)，但是載體中要保存待研究基因的3’-和5’-末端區(qū)域。選出的標(biāo)記基因被整合到保留的區(qū)域之間。
2.在“經(jīng)過(guò)修改的傳統(tǒng)方法”中使用了PCR。這種方法可以擴(kuò)增所研究的釀酒酵母基因編碼序列3’-末端和5’-末端區(qū)域。這種方法可以選擇性地?cái)U(kuò)增所研究基因的兩個(gè)末端區(qū)域，因此，對(duì)每一個(gè)所研究基因，必須進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，一次擴(kuò)增5’-末端區(qū)域，一次擴(kuò)增3’-末端區(qū)域。擴(kuò)增末端DNA-片斷的長(zhǎng)度依賴于已存在的限制性酶切位點(diǎn)。被擴(kuò)增的所研究基因末端的通常長(zhǎng)度是50到5000堿基對(duì)(bp)，優(yōu)選長(zhǎng)度是500到1000bp。
釀酒酵母的基因組DNA或者野生型基因可被用作PCR反應(yīng)的模板。構(gòu)建引物對(duì)(有義引物和反義引物各一)，要使它們對(duì)應(yīng)與所研究釀酒酵母基因的3’-末端和5’-末端序列。為了通過(guò)合適的限制性酶切位點(diǎn)整合，尤其要選擇合適的引物。
pBR-pUC-，pBluescript-衍生物都可用作載體。已經(jīng)含有編碼選擇性標(biāo)記基因的載體是特別合適的。尤其是可以使用含有選擇性標(biāo)記HIS3，LEU2，TRP1或URA3基因的載體。
通過(guò)PCR獲得的所研究釀酒酵母基因的DNA區(qū)段，被整合到載體中選擇標(biāo)記的兩側(cè)，于是隨后，像在傳統(tǒng)方法中那樣，選擇標(biāo)記的兩端與所研究基因的同源DNA序列末端側(cè)接。
3.釀酒酵母中的同源重組以一種非常有效非常精確的方式進(jìn)行，實(shí)際上，與選擇性標(biāo)記基因側(cè)接的所研究釀酒酵母基因的同源DNA序列的長(zhǎng)度，可以比“修改的傳統(tǒng)方法”中的短許多。與所研究釀酒酵母基因同源的側(cè)翼末端所需的長(zhǎng)度只要大約20-60bp，優(yōu)選為30-45bp。SFH-PCR方法是非常優(yōu)越的，因?yàn)榭梢员苊馐褂觅M(fèi)力的克隆步驟。
PCR反應(yīng)在含有要用到的選擇性標(biāo)記基因的DNA模板上進(jìn)行，構(gòu)建引物，使有義引物的DNA序列與選擇性標(biāo)記序列的5’-末端同源，引物的5’-末端還要多出最好40個(gè)核苷酸，這些多出的核苷酸要與所研究釀酒酵母基因的5’-末端序列相對(duì)應(yīng)。反義引物以類似的方式構(gòu)建，即反義引物與選擇性標(biāo)記基因序列的3’-末端互補(bǔ)，其中，該引物在其5’-末端還要多出一段最好也是40個(gè)核苷酸的區(qū)域，這段區(qū)域要與所研究基因的3’-末端編碼序列的互補(bǔ)鏈相對(duì)應(yīng)。
含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因或者選擇性標(biāo)記基因的載體，可以用于通過(guò)SFH-PCR方法擴(kuò)增所研究的釀酒酵母基因。特別是質(zhì)粒pUG6可用作模板。這種質(zhì)粒含有一個(gè)loxP-KanMX-loxP盒(Gültner，U.等(1996)核酸研究242519-2524)。換句話說(shuō)就是，卡那霉素抗性基因側(cè)接在loxP序列(loxP-KanMX-loxP盒)的兩端。這種盒非常優(yōu)越，因?yàn)榭敲顾乜剐曰蚩梢酝ㄟ^(guò)將loxP-KanMX-loxP盒整合到所研究釀酒基因中，而最終從釀酒酵母基因組中除去。噬菌體P1的Cre-重組酶可用于這一目的。Cre-重組酶識(shí)別loxP序列并且通過(guò)同源重組過(guò)程誘導(dǎo)位于兩段loxP序列之間的DNA的消除。結(jié)果，只有一個(gè)loxP序列保留下來(lái)，并且發(fā)生了所謂的標(biāo)記再生，即釀酒酵母菌株可以用loxP-KanMX-loxP盒進(jìn)行再次轉(zhuǎn)化。當(dāng)為了得到致死表型，而至少要缺失兩個(gè)功能相似基因時(shí)，這一點(diǎn)便顯得特別有利。
對(duì)于PCR方法來(lái)說(shuō)，PCR反應(yīng)引物在3’-末端優(yōu)選有20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列，這段序列與位于loxP-KanMX-loxP盒左側(cè)或者右側(cè)的序列同源，而在5’-末端優(yōu)選有40個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列，這段序列與所研究基因的末端同源。
使用這三種方法，可以得到含有編碼選擇標(biāo)記基因的線性缺失盒，該盒兩端側(cè)接有所研究基因的源序列。缺失盒被用于轉(zhuǎn)化二倍體釀酒酵母菌株。二倍體釀酒酵母菌株CEN.PK2(Scientific Research&Development Gmbh，Oberursel)可用作這一目的的實(shí)例。CEN.PK2菌株用已知方法準(zhǔn)備并培養(yǎng)(Gietz，R.D.等(1992)核酸研究81425；Gültner，U.等(1996)核酸研究242519-2524)。
根據(jù)已知方法，用合適DNA數(shù)量的線性缺失盒轉(zhuǎn)化所用的釀酒酵母菌株的細(xì)胞(例如，Sambrook等1989)。之后，用一種新的所謂的選擇培養(yǎng)基替換培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，這種選擇培養(yǎng)基不含有相應(yīng)的氨基酸(例如，組氨酸，亮氨酸或者色氨酸)或者核苷堿基(例如，尿嘧啶)，或者當(dāng)使用含有卡那霉素抗性基因的缺失盒時(shí)，用含有遺傳霉素(G418)的培養(yǎng)基(例如，含有的遺傳霉素的完全培養(yǎng)基(YEPD))替換培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。另一種選擇是，把轉(zhuǎn)化的細(xì)胞接種到用相應(yīng)培養(yǎng)基制備的瓊脂平板上。從而，可以選擇出在其中發(fā)生了同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因?yàn)橹挥心切┘?xì)胞可以生長(zhǎng)在這種經(jīng)修飾的條件下。
然而，在大多數(shù)情況下，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，二倍體釀酒酵母菌株位于一對(duì)染色體的基因的兩個(gè)拷貝中，只有一個(gè)被DNA缺失盒取代，從而產(chǎn)生了雜合子二倍體釀酒酵母突變株，其中所研究基因的一個(gè)拷貝被選擇性標(biāo)記取代，而基因的另一個(gè)拷貝仍保留在基因組中。這就體現(xiàn)了一種優(yōu)越性，即因?yàn)榇嬖诒匦杌虻牡诙€(gè)拷貝，所以當(dāng)萬(wàn)一缺失了一個(gè)必需基因時(shí)，釀酒酵母突變體仍可以存活。
缺失盒DNA在預(yù)定染色體基因座(所研究基因的基因座)的適當(dāng)整合，可以通過(guò)Southern印跡分析(Southern，E.M.(1975)分子生物學(xué)雜志98503-517)或者使用特殊引物的診斷PCR分析(Gültner，U.等(1996)核酸研究242519-2524)來(lái)檢查。
單個(gè)二倍體細(xì)胞的遺傳分離可以通過(guò)四分體分析進(jìn)行監(jiān)控。為此，使用如氮貧乏的乙酸鉀平板這樣的已知方法，誘導(dǎo)二倍體細(xì)胞，特別是雜合子突變株，進(jìn)行減數(shù)分裂。(Sherman，F(xiàn).等(1986)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Guthrie，C.和Fink，G.R.(1991)酶學(xué)方法，Vol 194.Academic Press，San Diego，3-21；Ausubel，F(xiàn).M.等(1987)分子生物學(xué)最新方法John Wiley和Sons，Inc.，Chapter 13)。減數(shù)分裂造成只有四個(gè)子囊孢子的子囊(經(jīng)過(guò)分離的)，在用酶解酶部分酶解子囊壁后，可以通過(guò)顯微操作器(例如SINGER)得到單個(gè)的子囊孢子(Ausubel等(1987))。當(dāng)對(duì)一雜合子二倍體突變株進(jìn)行四分體分析時(shí)，該二倍體突變株一對(duì)染色體上的一個(gè)必需基因已經(jīng)經(jīng)同源重組被取代，只有兩個(gè)分離的子囊孢子，即那些攜帶有必需基因的可以存活。其余兩個(gè)分離的子囊孢子因?yàn)槿鄙僭摫匦杌蚨荒艽婊睢?br> 為了檢查通過(guò)這種方法研究的基因是否真的必需，以及同源重組是否導(dǎo)致一個(gè)必需基因的位置發(fā)生變化而與所研究基因的基因座相鄰，釀酒酵母雜合子二倍體突變株用含有該研究基因的著絲粒質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行四分體分析。當(dāng)?shù)玫剿膫€(gè)而不是兩個(gè)可存活分離子時(shí)，包含在著絲粒質(zhì)粒中的所研究基因，可以彌補(bǔ)那兩個(gè)不能存活的釀酒酵母單倍體細(xì)胞/突變株的缺陷，這就證明了所研究的釀酒酵母基因是必需的。
優(yōu)選用拷貝數(shù)比較少，例如每個(gè)細(xì)胞有一到兩個(gè)拷貝的質(zhì)粒作為著絲粒質(zhì)粒。例如質(zhì)粒pRS313，pRS314，pRS315和pRS316(Sijkorski，R.S.和Hieter，P.(1989)遺傳學(xué)12219-27)或者可用于這一目的的類似質(zhì)粒。所研究基因優(yōu)選是連同其3’-末端和5’-末端非編碼區(qū)一起整合到所說(shuō)的質(zhì)粒中。
序列全部或者部分已知的各個(gè)釀酒酵母基因可以用上述方法進(jìn)行研究。完整的釀酒酵母基因組序列于1996年4月24日通過(guò)WWW(國(guó)際互聯(lián)網(wǎng))對(duì)公眾公開(kāi)。
WWW上的釀酒酵母基因組DNA序列，可以通過(guò)不同的方式訪問(wèn)。
MIPS(慕尼黑蛋白質(zhì)序列信息中心)地址http//speedy.mips.biochem.mpq.de/mips/yeast/SGD(糖酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，斯坦福)地址speedy.mips.biochem.mpq.de/mips/yeast /YPD(酵母蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，冷泉港)地址speedy.mips.biochem.mpq.de/mips/yeast/
在歐洲(例如，在地址ftp.mips.embnet.org)，在美國(guó)(地址genome-ftp.stanford.edu)，在日本(地址ftp.nig.ac.jp)，完整的釀酒酵母DNA序列也可以通過(guò)FTP(file transfer protocol，文件傳輸協(xié)議)訪問(wèn)。
用這種方法已經(jīng)鑒定了7種釀酒酵母基因組必需基因YDR325w，YJL039c，YOR110w，YNL256w，YBR102c，YIR012W和YMR212c。
然后釀酒酵母的必需基因被用來(lái)鑒定其它真菌相應(yīng)的功能相似基因。
其它真菌中的功能相似基因，是指與所鑒定的釀酒酵母必需基因功能相似或相同的基因。其它真菌中的功能相似基因，可以但不是必須與相應(yīng)的釀酒酵母必需基因序列同源。其它真菌中的功能相似基因，在核苷酸水平上，可以只表現(xiàn)出與相應(yīng)的釀酒酵母必需基因中等程度的序列同源性。中等程度的序列同源，在本發(fā)明中是指，在核苷酸水平上要有至少50％的序列同一性，更優(yōu)選有至少60％的序列同一性，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
另外，其它真菌中的功能相似基因，可以但不是必須編碼與相應(yīng)的釀酒酵母必需基因編碼的蛋白質(zhì)序列同源的蛋白質(zhì)。其它真菌中的功能相似蛋白質(zhì)，可以只表現(xiàn)出與相應(yīng)的釀酒酵母必需基因編碼的蛋白質(zhì)中等程度的蛋白質(zhì)序列同源性。
中等程度的蛋白質(zhì)序列同源性，在本發(fā)明中是指，在氨基酸水平上要有至少40％的序列同一性，優(yōu)選有至少50％的序列同一性，更優(yōu)選有至少60％的序列同一性，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
序列同源基因可以通過(guò)已知方法分離，例如通過(guò)同源篩選(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約)，或者通過(guò)使用來(lái)自相應(yīng)真菌基因組文庫(kù)和/或cDNA文庫(kù)的特殊引物的PCR技術(shù)。
根據(jù)一種實(shí)施方案，從cDNA文庫(kù)中分離序列同源基因。為了找出其它真菌中的功能相似基因，根據(jù)已知方法從所研究真菌中分離出mRNA(Sambrook，等1989)，根據(jù)已知方法合成cDNA(Sambrook，等1989；或cDNA合成試劑盒，如STRATAGENE)。
制備的cDNA被定向整合到合適的表達(dá)載體中。
例如，考慮到表達(dá)載體的啟動(dòng)子，為了使隨后的克隆可以適當(dāng)?shù)亩ㄎ?，第一條cDNA鏈的合成可以在具有適當(dāng)限制性酶切位點(diǎn)的引物存在下進(jìn)行。任何已知的限制性酶切位點(diǎn)可以用作限制性酶切位點(diǎn)。關(guān)于引物，可以使用50個(gè)核苷酸長(zhǎng)的引物，例如以下引物5′-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTXXXXXXTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′序列(X)6表示適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，例如XhoI的限制性酶切位點(diǎn)。
合成完雙鏈之后，雙鏈cDNA的粘性末端被補(bǔ)平(鈍端)，然后cDNA末端用合適的DNA連接序列連接。DNA連接序列應(yīng)當(dāng)包含一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，該限制性酶切位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)與在合成第一條cDNA鏈時(shí)使用的引物中的限制性酶切位點(diǎn)不同。DNA連接序列可以包含例如互補(bǔ)的9或13聚體寡核苷酸，其末端代表限制性酶切位點(diǎn)的粘性末端。例如，這樣的末端可以是EcoRI-位點(diǎn)5′XXXXXGGCACGAG 3′3′XCCGTGCTC 5′連接序列中的單鏈X表示限制性酶切位點(diǎn)的粘性末端。
然后，用限制性內(nèi)切酶酶切具有相應(yīng)連接序列的cDNA，該限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)被使用在合成第一條cDNA鏈時(shí)使用的引物中，例如XhoI。根據(jù)這個(gè)實(shí)例，如此得到的cDNA具有3’-XhoI和5’-EcoRI突出末端，所以可以被定向整合到經(jīng)XhoI和EcoRI酶切的表達(dá)載體中。
在其它載體中，大腸桿菌/釀酒酵母穿梭載體，即在大腸桿菌和釀酒酵母都可以使用的載體，是合適的表達(dá)載體。這種載體可以在例如大腸桿菌中擴(kuò)增。那些在釀酒酵母中具有高拷貝數(shù)的載體和具有低拷貝數(shù)的載體都可以用作表達(dá)載體。為了這一目的，例如，選自pRS423-pRS426(pRS423，pRS424，pRS425，pRS426)和/或pRS313-pRS316(pRS313，pRS314，pRS315，pRS316)(Sikorki，R.S.和Hieter，P.(1989)遺傳學(xué)12219-27；Christianson T.W.等(1992)基因110119-122)的載體都是適合的。
表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)含有合適的釀酒酵母啟動(dòng)子和終止子。萬(wàn)一這些載體不含有這些元件，那么相應(yīng)啟動(dòng)子和終止子的插入應(yīng)使得隨后仍可能摻入所產(chǎn)生的cDNA。釀酒酵母基因MET25，PGK1，TPI1，TDH3，ADHI，URA3的啟動(dòng)子特別合適作啟動(dòng)子。可以使用未修飾形式的野生型基因的啟動(dòng)子，也可以使用經(jīng)過(guò)除去某些激活子序列和/或阻抑蛋白序列方式而修飾過(guò)的啟動(dòng)子。例如，釀酒酵母基因MET25，PGK1，TPI1，TDH3，ADHI，URA3的終止子適合于作終止子。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，從基因組文庫(kù)中分離序列同源基因?？梢愿鶕?jù)已知方法制備真菌基因組DNA文庫(kù)(例如象在分子生物學(xué)最新方法，John Wiley和Sons，Inc中所描述的)。例如，可以通過(guò)已知的裂解酵母細(xì)胞和分離基因組DNA的方法制備真菌基因組DNA(例如Bio101，Inc的商品試劑盒)?；蚪MDNA可以用限制性酶，例如Sau3AI，進(jìn)行部分酶解，酶解片段用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小選擇。例如，5-10kb大小的DNA片段可以用經(jīng)典方法純化(例如使用Bio101的Gene Clean試劑盒)，并插入象是YEP24這樣的經(jīng)限制性酶切而具有匹配末端(例如，針對(duì)經(jīng)Sau3AI酶切的基因組DNA的BamHI)的大腸桿菌/釀酒酵母穿梭載體(例如Sanglard D.，Kuchler K.，Ischer F.，Pagani J-L.，Monod M.和Bille J.，抗微生物藥劑和化學(xué)療法，(1995)Vol.39 No11，P2378-2386所描述的)。
為了從所研究真菌中發(fā)現(xiàn)與釀酒酵母必需基因功能相似的基因，一個(gè)釀酒酵母必需基因被置于可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制下，或者作為整合基因(1)或者作為染色體外基因(2)。
1.為了把可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子整合到釀酒酵母基因組中，可以用可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子替換選定的必需基因的天然啟動(dòng)子，例如可以用PCR進(jìn)行同源重組(Güldener，U.等(1996)。用PCR進(jìn)行同源重組可以在例如二倍體釀酒酵母菌株CEN.PK2中進(jìn)行。是否成功地整合到染色體組中，可以通過(guò)在單倍體細(xì)胞中隨后進(jìn)行的四分體分析進(jìn)行檢測(cè)。
使用四分體分析可以得到四個(gè)存活的子囊孢子，在其中的兩個(gè)單倍體分離子中，選定必需基因在天然啟動(dòng)子的控制之下，而在其余兩個(gè)分離子中，必需基因在可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制之下。
最后提到的單倍體分離子被出現(xiàn)在重組載體中的cDNA或者基因組DNA轉(zhuǎn)化。
2.使用染色體外變體，選定釀酒酵母必需基因首先被插入合適的表達(dá)載體中，例如大腸桿菌/釀酒酵母穿梭載體。為此，可以通過(guò)PCR，由釀酒酵母基因組DNA的起始密碼子ATG開(kāi)始直到并包括終止密碼子來(lái)擴(kuò)增必需基因。用于此目的的引物，可以用以下方式構(gòu)建，使得它們包含適當(dāng)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，并有利于隨后插入后表達(dá)載體中可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制之下。
含有在可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制之下的釀酒酵母必需基因質(zhì)?？截惖闹亟M表達(dá)載體，隨后被用于相應(yīng)突變等位基因的反式互補(bǔ)。相應(yīng)突變等位基因可從雜合子二倍體突變株中選出，這些雜合子二倍體突變株是通過(guò)同源重組而部分或全部缺失以上所列舉并描述的真菌必需基因所得到的。
含有選定釀酒酵母必需基因的表達(dá)載體，被轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的雜合子二倍體突變株中，該突變株攜帶有選擇標(biāo)記基因，而不攜帶選定的釀酒酵母必需基因。轉(zhuǎn)化體通過(guò)所用表達(dá)載體中的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇分離。經(jīng)轉(zhuǎn)化的雜合子二倍體突變株隨后進(jìn)行四分體分析。可以得到四個(gè)存活的分離子。通過(guò)反向追蹤突變等位基因和表達(dá)載體的相應(yīng)標(biāo)記，轉(zhuǎn)化的野生型分離子可以與不含有必需基因基因組拷貝的分離子區(qū)分開(kāi)。不含有選定必需基因基因組拷貝的分離子，被指定為反式互補(bǔ)單倍體突變株。它們隨后被合適載體中的其它真菌的cDNA文庫(kù)或者基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化。
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或阻抑型啟動(dòng)子可以用作可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以由天然和/或人工排列的啟動(dòng)子序列組成。
例如，GAL1基因的啟動(dòng)子和相應(yīng)的啟動(dòng)子衍生物，比如缺失不同UAS(上游激活序列)元件的啟動(dòng)子(GALS，GALL；Mumberg，J.等(1994)核酸研究225767-5768)，可以用作可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。糖元異生基因的啟動(dòng)子，例如FBP1，PCK1，ICL1或者它們的部分，比如它們的激活序列(UAS1和/或UAS2)或者阻抑序列(URS，上游阻抑序列)(Niederacher等(1992)，Curr.Genet.22636-670；Proft等(1995)Mol.Gen.Gent.246367-373；Schller等(1992)EMBOJ；11107-114；Guarente等(1984)細(xì)胞36503-511)，也可以用作可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。
以這種方式修飾的釀酒酵母突變株，可以在可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子被激活的生長(zhǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，使得釀酒酵母必需基因得以表達(dá)。接著，用含有所研究真菌cDNA或者基因組DNA的典型數(shù)量的文庫(kù)轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子將表達(dá)額外的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的編碼序列存在于重組載體中。
本方法希望，為了抑制控制著選定必需基因的可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，生長(zhǎng)條件可以進(jìn)行修改。特別是，可以通過(guò)更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基來(lái)改變生長(zhǎng)條件。例如，當(dāng)使用GAL1啟動(dòng)子或其衍生物時(shí)，可以用含葡萄糖的培養(yǎng)基(抑制狀態(tài))替換含半乳糖的培養(yǎng)基(誘導(dǎo)狀態(tài))。
對(duì)于其重組載體中不含有所研究真菌的功能相似基因組DNA或cDNA的釀酒酵母細(xì)胞，這種經(jīng)過(guò)修改的條件是致命的。相反的，其重組載體表達(dá)所研究真菌的功能相似編碼序列的釀酒酵母細(xì)胞可以存活，因?yàn)樵谶@些細(xì)胞中，功能相似基因編碼的蛋白質(zhì)彌補(bǔ)了致命的代謝缺陷。
本方法希望，使用已知的方法(Strathern，J.N.和Higgins，D.R.(1991).Plasmids are recovered from yeast into Escherichiacoli shuttle vectors inGuthrie，C.and Fink，G.R.酶學(xué)方法，Volume 194.酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南.Academic Press，SanDiego，319-929)從存活的轉(zhuǎn)化子中分離重組載體(質(zhì)粒)，使用象是DNA測(cè)序(Singer等(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467)這樣的DNA分析方法來(lái)分析cDNA和基因組DNA。
這樣，釀酒酵母必需基因就可以用于鑒定其它病原體真菌中的功能相似基因和/或序列同源基因，特別是鑒定人類、動(dòng)物、植物的病原體真菌中的功能相似必需基因和/或序列同源必需基因。為此，可以使用例如藻狀菌綱或者真菌綱的真菌，特別是擔(dān)子菌(basidiomycetes)亞綱，子囊菌(ascomycetes)亞綱，尤其是mehiascomycetales(酵母)和plectascales(霉菌)和gymnascales(皮膚和毛發(fā)真菌)，或者h(yuǎn)yphomycetes綱的真菌，特別是conidiosporales亞綱(皮膚真菌)和thallosporales亞綱(芽殖或出芽真菌)，尤其是毛霉菌屬(mucor)，根霉屬(rhizopus)，球孢子菌屬(coccidioides)，副球孢子菌屬(paracoccidioides)巴西芽生菌(blastomyces brasiliensis)，內(nèi)孢霉屬(endomyces)(芽生菌屬)，曲霉屬(aspergillus)，青霉屬(penicilium)，毛癬菌屬(trichophyton(ctenomyces))，帚霉屬(表皮癬菌屬)，小孢子菌屬(microsporon)，毛孢子菌屬(piedraia)，單孢枝霉屬(hormodendron)，瓶霉屬(phialophora)，孢子絲菌屬(sporotrichon)，隱球酵母屬(cryptococcus)，念珠菌屬(candida)，地霉屬(geotrichum)和絲孢酵母屬(trichosporon)。
特別感興趣的是使用以下真菌，念珠菌屬的種(Candida Spp.)，特別是白色念珠菌(Candida Albicans)，Candida glabrata，曲霉屬的種(Aspergillus Spp.)，特別是煙曲霉(Aspergillusfumigatus)，粗球孢菌(Coccidioides immitis)，新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)，莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，Paracoccidioides brasiliens和Sporotrix schenckii。
從根據(jù)上述方法鑒定的釀酒酵母基因開(kāi)始，申請(qǐng)人使用以下方法從白色念珠菌中克隆出了相應(yīng)必需基因，即CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039。
首先，為了擴(kuò)增白色念珠菌的相應(yīng)片段，從釀酒酵母基因序列或者白色念珠菌同源序列中選擇寡核苷酸?？寺≈?，所得片段(序列長(zhǎng)度大約為幾百bp)被用作探針篩選白色念珠菌(基因組)DNA文庫(kù)。篩選可以包括下面幾步把克隆涂布到平皿上，用交聯(lián)有DNA的濾紙覆蓋，與濾紙雜交，檢測(cè)出陽(yáng)性克隆。對(duì)選出的克隆進(jìn)行測(cè)序。
本方法希望，用真菌必需基因鑒定可以部分或者全部抑制這些必需基因的功能表達(dá)和/或編碼蛋白的功能活性的物質(zhì)?？梢杂眠@種方式鑒定這些物質(zhì)，這些物質(zhì)可以抑制真菌生長(zhǎng)，并可用作抗真菌劑，例如用于制備藥物。
本發(fā)明特別包括一種篩選這種抑制物質(zhì)的方法，其中選自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039的白色念珠菌必需基因或者其它病原體真菌的功能相似基因，或者相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)被用作靶。
其它病原體真菌的功能相似基因，是指與已鑒定的白色念珠菌必需基因功能相似或一致的基因。其它病原體真菌的功能相似基因，可以但不必與相應(yīng)的白色念珠菌必需基因序列同源。其它病原體真菌的功能相似基因，在核酸水平上，可以只表現(xiàn)出與相應(yīng)的白色念珠菌必需基因中等程度的序列同源性。中等程度的序列同源性，在本發(fā)明中是指，在核苷酸水平上要有至少50％的序列同一性，優(yōu)選有至少60％的序列同一性，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
另外，其它病原體真菌中的功能相似基因，可以但不是必須編碼與白色念珠菌必需基因編碼的蛋白質(zhì)序列同源的蛋白質(zhì)。其它真菌中的功能相似蛋白質(zhì)，可以只表現(xiàn)出與白色念珠菌必需基因編碼的蛋白質(zhì)中等程度的蛋白質(zhì)序列同源性。
中等程度的蛋白質(zhì)序列同源性，在本發(fā)明中是指，在氨基酸水平上要有至少40％的序列同一性，優(yōu)選有至少50％的序列同一性，更優(yōu)選有至少60％的序列同一性，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
本方法的一個(gè)特征是，使用真菌必需基因或者相應(yīng)的編碼蛋白質(zhì)作為靶來(lái)篩選物質(zhì)。本方法希望，白色念珠菌必需基因，以及其它病原體真菌的功能相似基因和/或序列同源基因，或者相應(yīng)的編碼蛋白質(zhì)，可以用作靶。
根據(jù)本發(fā)明篩選方法的一種實(shí)施方案，要提供含有用作靶的必需基因的真菌細(xì)胞，并將其與被測(cè)物質(zhì)一同保溫。用這種方法來(lái)測(cè)定這種物質(zhì)對(duì)于必需靶基因的生長(zhǎng)抑制效果。
使用以不同程度表達(dá)必需靶基因的真菌細(xì)胞，將這些細(xì)胞與被測(cè)物質(zhì)一同保溫，測(cè)定這種物質(zhì)的生長(zhǎng)抑制效果。
本方法包括，使用兩種或兩種以上的真菌細(xì)胞，或其衍生菌株，衍生菌株的不同在于，它們表達(dá)必需靶基因的程度不同。
例如，對(duì)于二種、三種、四種、五種、十種或者更多的真菌細(xì)胞或者相應(yīng)的真菌菌株，可以比較分析被測(cè)物質(zhì)在測(cè)定濃度下對(duì)它們的生長(zhǎng)抑制效果?？拐婢镔|(zhì)可以通過(guò)這種表達(dá)程度系列與細(xì)胞毒性物質(zhì)或者非活性物質(zhì)區(qū)分開(kāi)。
本方法的一種特殊實(shí)施方案，包括使用單倍體真菌細(xì)胞/菌株進(jìn)行篩選，特別是單倍體釀酒酵母細(xì)胞/菌株。
本方法希望，選作靶的必需基因要整合到合適的表達(dá)載體中。
例如，大腸桿菌/釀酒酵母穿梭載體是一種合適的表達(dá)載體。尤其是可以使用在每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)不同的載體。所以，可以使用在經(jīng)轉(zhuǎn)化的釀酒酵母細(xì)胞中有高拷貝數(shù)的載體，也可以使用低拷貝數(shù)的載體。一種實(shí)施方案，包括使用允許把靶基因整合到釀酒酵母基因組中去的表達(dá)載體。
例如，載體pRS423，pRS424，pRS425，pRS426，pRS313，pRS314，pRS315，pRS316，pRS303，pRS304，pRS305，pRS306(Sijkorski和Hieter，1989；Christianson等1992)適合作為表達(dá)載體。
pRS423-pRS426系列載體具有高拷貝數(shù)，大約50-100拷貝/細(xì)胞。相反的，pRS313-pRS316系列載體具有低拷貝數(shù)(1-2拷貝/細(xì)胞)。當(dāng)使用這兩個(gè)系列的表達(dá)載體時(shí)，靶基因以染色體外拷貝形式出現(xiàn)。使用pRS303-pRS306系列載體，可以把靶基因整合到基因組中。使用這三種不同類型的表達(dá)載體，可以逐步表達(dá)所研究的功能相似必需基因。
本方法包括，通過(guò)使用例如單細(xì)胞中拷貝數(shù)不同的表達(dá)載體，來(lái)比較測(cè)定物質(zhì)對(duì)于真菌細(xì)胞/菌株的生長(zhǎng)抑制效果。
這種細(xì)胞可以以不同程度表達(dá)必需的靶基因，并且可以對(duì)所說(shuō)的物質(zhì)發(fā)生逐步的反應(yīng)。
本方法也包括，通過(guò)在表達(dá)載體上的所選釀酒酵母特殊啟動(dòng)子和終止子之間插入靶基因，可以在不同真菌細(xì)胞中得到目的基因不同強(qiáng)度的表達(dá)。(可調(diào)控的過(guò)量表達(dá))以不同強(qiáng)度組成型表達(dá)的釀酒酵母啟動(dòng)子是合適的。這種啟動(dòng)子的實(shí)例有，釀酒酵母基因MET25，PGK1，TPI1，TDH3，ADHI，URA3，TRP1的天然啟動(dòng)子，以及它們的相應(yīng)衍生物，例如沒(méi)有特殊激活序列和/或阻抑序列的啟動(dòng)子衍生物。
可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子也適合用于靶基因的逐漸過(guò)量表達(dá)。GAL1基因的天然啟動(dòng)子和/或其相應(yīng)衍生物，例如已經(jīng)缺失了不同UAS元件的啟動(dòng)子(GALS，GALL；Mumberg等(1994)核酸研究225767-5768)，以及糖元異生基因的啟動(dòng)子，例如啟動(dòng)子FBP1，PCK1，ICL1或其部分，比如它們的激活(UAS1或UAS2)序列或者阻抑(URS)序列，可以用于相應(yīng)的非激活和/或非阻抑試驗(yàn)啟動(dòng)子(Schüller等(1992)EMBO J；11107-114；)Guarente等(1984)細(xì)胞36503-511；Niederacher等(1992)Curr.Genet.22363-370；Proft等(1995)Mol.Gen.Gent.246367-373；)。
例如釀酒酵母基因MET25，PGK1，TPI1，TDH3，ADHI，URA3的終止子序列，可以用作表達(dá)載體的終止子。
本方法包括，通過(guò)靈巧地使用所選類型的表達(dá)載體和/或制備合適的表達(dá)載體，并最終使用不同強(qiáng)度或者受不同調(diào)控的啟動(dòng)子，可以構(gòu)建一系列表達(dá)載體，這些表達(dá)載體都含有相同的靶基因，但是它們表達(dá)靶基因的程度不同。
本方法包括，在釀酒酵母單倍體野生型細(xì)胞中表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化。這樣得到的釀酒酵母細(xì)胞/菌株，在含有不同濃度被測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，比較分析這種物質(zhì)對(duì)于以不同程度表達(dá)靶基因的細(xì)胞/菌株的生長(zhǎng)行為的效果。本方法也包括，將經(jīng)各種不含有靶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的釀酒酵母單倍體細(xì)胞/菌株，用作對(duì)照。
本方法包括，使用可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，特別是GAL1啟動(dòng)子及其衍生物(GALS和GALL)在不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行所說(shuō)物質(zhì)的篩選，因?yàn)楦鞣N培養(yǎng)基的選擇在很大程度上影響表達(dá)的程度。因此，GAL1啟動(dòng)子的表達(dá)程度以下述方式減少2％半乳糖＞1％半乳糖＋1％葡萄糖＞2％甘油＞2％葡萄糖。
該物質(zhì)抑制釀酒酵母野生型細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可以通過(guò)其它真菌的功能相似基因的過(guò)量表達(dá)得以部分或者全部的彌補(bǔ)。
根據(jù)一種實(shí)施方案，篩選抗真菌物質(zhì)的方法在體外進(jìn)行，將必需基因或者功能相似基因，或者相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)，與被測(cè)試物質(zhì)接觸，并且測(cè)定該物質(zhì)對(duì)靶的效果?？梢允褂萌魏斡糜诖_定兩個(gè)分子相互作用的體外試驗(yàn)，例如雜交試驗(yàn)或者功能試驗(yàn)(例如，Bergmeyer H.U.，酶分析法，VCH Publishers中所述的酶促試驗(yàn))。如果使用編碼蛋白質(zhì)作為靶進(jìn)行篩選，相應(yīng)必需基因通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的技術(shù)，例如使用一套含有合適限制性酶切位點(diǎn)的引物的PCR擴(kuò)增，(最新分子生物學(xué)方法，John Wiley和Sons，Inc)，被插入到表達(dá)系統(tǒng)中，例如大腸桿菌，桿狀病毒或者酵母，然后用本領(lǐng)域已知的方法完全或部分地純化表達(dá)蛋白質(zhì)。任何合適的純化表達(dá)蛋白質(zhì)的純化方法都可以使用，例如親和層析。如果靶蛋白功能已知，那么可以進(jìn)行功能試驗(yàn)測(cè)定抗真菌物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)功能的效果。如果靶蛋白功能未知，可以測(cè)定與靶蛋白相互作用的物質(zhì)，例如結(jié)合到編碼蛋白質(zhì)上的物質(zhì)。在這種情況下，可以進(jìn)行諸如保護(hù)蛋白質(zhì)不被合適的酶酶解這樣的試驗(yàn)。
根據(jù)一種具體的實(shí)施方案，篩選抗真菌物質(zhì)的方法相當(dāng)于一種酶促分析，其中要測(cè)定二氫蝶酸合酶(DHPS)和/或7，8-二氫-6-羥甲基蝶呤-焦磷酸激酶(HPPK)的活性；酶促分析可以象在“BergmeyerH.U.，酶分析法，VCH Publishers”中公開(kāi)的那樣。
二氫蝶酸合酶(DHPS)催化6-羥甲基-7，8-二氫蝶呤焦磷酸與對(duì)-氨基苯甲酸縮合，形成7，8-二氫蝶酸，這與從6-羥甲基-7，8-二氫蝶呤產(chǎn)生7，8-二氫葉酸的三步途徑的第二步一致。7，8-二氫-6-羥甲基蝶呤-焦磷酸激酶(HPPK)催化焦磷酸結(jié)合到6-羥甲基-7，8-二氫蝶呤上，形成6-羥甲基-7，8-二氫蝶呤焦磷酸，這與產(chǎn)生7，8-二氫葉酸的三步途徑的第一步一致。所有的生物體都需要還原葉酸輔因子，以合成各種代謝物。大多數(shù)微生物必須從頭合成葉酸，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙俑叩燃棺祫?dòng)物細(xì)胞的活性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，這種活性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)使得這些高等生物可以使用食物中的葉酸。所以，與葉酸生物合成相關(guān)的酶也就成為各種抗微生物藥劑的靶。因此，這種酶活性對(duì)于微生物是必需的，而人體中并不存在。
本方法也包括鑒定與來(lái)自人類、動(dòng)物或者植物的白色念珠菌的必需基因功能相似和/或序列同源的基因。在本方法中，相應(yīng)的人類、動(dòng)物或者植物的基因，可以選擇性地用作靶基因，以檢測(cè)抗真菌物質(zhì)對(duì)于這些靶基因是否有作用。
本方法的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)是，以這種方式，可以鑒定出有效抑制真菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，也可以確定這些物質(zhì)對(duì)來(lái)自人類、動(dòng)物或者植物的白色念珠菌必需基因相應(yīng)的功能相似基因和/或序列同源基因的影響。
本方法也包括，例如通過(guò)檢驗(yàn)已確定的真菌必需基因或其部分與數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的人類、動(dòng)物或者植物基因序列的同源性。來(lái)檢驗(yàn)人類、動(dòng)物或者植物中與相應(yīng)真菌必需基因功能相似的基因和/或序列同源基因存在的可能性，用這種方法，根據(jù)目的，可以在早期就從已鑒定真菌必需基因中篩選出特定基因，例如與人類基因沒(méi)有功能相似和/或序列同源的基因。
因此，本方法提供了多種選擇性鑒定具有抗真菌效果而對(duì)人體無(wú)害的物質(zhì)的可能性。
例如，可能鑒定出一些物質(zhì)，這些物質(zhì)可以用于制備治療真菌病藥劑或者制備在免疫抑制狀態(tài)下進(jìn)行預(yù)防的藥劑。
例如，這些物質(zhì)可以用于生產(chǎn)用于治療真菌感染的藥劑，真菌感染常在諸如艾滋病或者糖尿病等疾病發(fā)生期間發(fā)生。也可以鑒定可用于生產(chǎn)殺真菌劑的物質(zhì)，特別是對(duì)人類和動(dòng)物無(wú)害的殺真菌劑。
另外，本方法提供了鑒定抗真菌物質(zhì)的可能性，這些抗真菌物質(zhì)可以選擇性地只抑制特殊真菌的生長(zhǎng)。
本篩選方法具有特殊的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)這種方法可以充分識(shí)別基因是否是必需的，而不需要與必需基因功能有關(guān)或者與其編碼蛋白的功能有關(guān)的多余信息。另外，其它真菌的許多這種基因的DNA序列尚未獲得，其中的與釀酒酵母必需基因功能相似基因的鑒定便具有特殊的優(yōu)越性。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體抗分別由CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039基因或其功能相似基因編碼的蛋白質(zhì)，或其多肽片斷。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括單克隆抗體和多克隆抗體。所說(shuō)的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備，例如公開(kāi)在“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Ed.Harbow和David Lane.冷泉實(shí)驗(yàn)室，1988中的那些方法。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷真菌感染的試劑盒，該試劑盒包括一種基因，該基因選自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039，其功能相似基因，其功能片段，包括相應(yīng)的編碼蛋白質(zhì)，其功能多肽片段或者包括抗體或，該抗體抗由CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039，或其功能相似基因編碼的蛋白質(zhì)或其多肽片段。這種試劑盒可以用任何本領(lǐng)域已知的合適方法制備。
實(shí)施例實(shí)施例1CaNL256Stanford國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)(http//candida.stanford.edu)提供了白色念珠菌基因組的初級(jí)序列。其中一個(gè)序列與釀酒酵母基因YNL256同源。為了擴(kuò)增白色念珠菌相應(yīng)片段，從這個(gè)序列中選出了兩個(gè)寡核苷酸(5’-ATTCATCCCATCAGTGCAGAAAG-3’和5’-ATTGACCAATAGCTCTAATTAATG-3’)。克隆之后，我們得到了一段與預(yù)期序列(SEQ ID NO1)相近的399bp的序列。推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)與YNL256的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，證明有53％的相似性，43％的同一性(

圖1)。白色念珠菌的這段399bp的序列，被用作探針篩選白色念珠菌基因組文庫(kù).白色念珠菌基因組文庫(kù)是通過(guò)用Sau3AI部分酶解白色念珠菌基因組DNA，然后在BamHI位點(diǎn)克隆到Y(jié)EP24載體中得到的。然后，文庫(kù)的克隆以每平皿2000個(gè)克隆的濃度進(jìn)行涂布。每個(gè)平皿用硝酸纖維素濾膜覆蓋，然后進(jìn)行以下連續(xù)處理NaOH，0.5M，5分鐘；Tris，1M，pH7.7，5分鐘；Tris，0.5M，pH7.7，NaCl，1.25M，5分鐘。濾膜干燥之后，在80℃放置2小時(shí)。預(yù)雜交和雜交在以下緩沖液中進(jìn)行40％甲酰胺，5xSSC，20mM Tris pH7.7 1xDenhardt 0.1％SDS。探針使用Amersham UK的RediPrim試劑盒和dCTP進(jìn)行32P標(biāo)記。雜交在42℃進(jìn)行17個(gè)小時(shí)以上。然后，用1xSSC，0.1％SDS在室溫清洗濾膜三次，每次5分鐘，接著在60℃清洗濾膜二次，每次30分鐘，放射自顯影過(guò)夜。所得斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的菌落，用低密度重新涂布的方法再分離，然后再次雜交。這樣得到了三個(gè)克隆(從40,000個(gè)克隆中得到)，這三個(gè)克隆用ABI377儀器進(jìn)行測(cè)序。序列用ABI軟件編輯，接著用GCG軟件包分析。結(jié)果這三個(gè)克隆中的一個(gè)，含有與所用探針相對(duì)應(yīng)的全部編碼序列；這個(gè)基因稱作CaNL256，其序列描述在SEQ IDNO2中。CaNL256與釀酒酵母基因YNL256有52％的核苷酸一致。編碼區(qū)在N末端更短。事實(shí)上，當(dāng)翻譯成氨基酸時(shí)，白色念珠菌中的CTG密碼子翻譯為絲氨酸(CaNL256中有3個(gè)CTG密碼子)。推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)與釀酒酵母YNL256有40％的氨基酸同一性，與Pneomocystis courinii的FAS(葉酸合酶)有41％的氨基酸同一性。用Blast軟件查詢數(shù)據(jù)庫(kù)，表明CaNL256蛋白質(zhì)的兩個(gè)部分分別與下列蛋白質(zhì)有同源性細(xì)菌流感嗜血桿菌，出血性葡萄球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，肺炎鏈球菌，枯草芽孢桿菌，丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌，大腸桿菌，麻瘋分枝桿菌的二氫蝶酸合酶(EC 2.5.1.15)(DHPS)(P值小于e-28)，以及枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌的7，8-二氫-6-羥甲基蝶呤-焦磷酸激酶(EC 2.7.6.3)(HPPK)(P值小于e-20)。DHPS與HPPK的單位特征也可以在CaNL256中發(fā)現(xiàn)。
實(shí)例2CaBR102Stanford國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)(http//candida.stanford.edu)提供了白色念珠菌基因組的初級(jí)序列。其中一個(gè)序列與釀酒酵母基因YBR102同源。為了擴(kuò)增白色念珠菌相應(yīng)片段，從這個(gè)序列中選出了兩個(gè)寡核苷酸(5’-AGTATTCAATTGGGTATTCC-3’和5’-CCGGCATCATCAGTAACTCC-3’)?？寺≈?，我們得到了一段647bp的序列(SEQ ID NO3)。推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)與YNL102的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，證明有35％相似，26％一致(圖2)。這一片段用Pfu聚合酶(Stratagene)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化(High Pure PCR ProductPurification Kit，Boehringer Mannheim)后，用作篩選白色念珠菌基因組DNA文庫(kù)的探針。白色念珠菌基因組DNA文庫(kù)是通過(guò)用SauIIIA部分酶解白色念珠菌基因組DNA，然后在BamHI位點(diǎn)克隆到Y(jié)EP-24TRP1載體中得到的。然后，文庫(kù)的40,000個(gè)克隆以每平皿2000個(gè)克隆的濃度進(jìn)行涂布。每個(gè)平皿用硝酸纖維素濾膜(MembraneHybond N+，Amersham)覆蓋，然后進(jìn)行以下連續(xù)處理1.5M NaCl/0.5M NaOH，5分鐘；1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl pH7.2/1mM EDTA，3分鐘，2次；DNA交聯(lián)到濾膜上(Amersham Life Science，ultraviolet crosslinker)。探針(100ng)使用RediPrim試劑盒和dCrP(Amersham Life Science)進(jìn)行32P標(biāo)記。雜交在以下緩沖液中42℃進(jìn)行16個(gè)小時(shí)30％甲酰胺，5xSSC，5％Denhart’s溶液，1％SDS，100μg/ml鮭精濃度為DNA，濃度為106cpm/ml的探針。用2xSSC/0.1％SDS在室溫清洗濾膜三次，每次5分鐘，接著用1xSSC/0.1％SDS在60℃清洗濾膜三次，每次20分鐘。然后把濾膜暴露在X射線膠片下過(guò)夜。陽(yáng)性克隆所對(duì)應(yīng)的菌落，用相同的方法進(jìn)行第二次篩選分離。最終得到了兩個(gè)陽(yáng)性克隆，這兩個(gè)克隆用ABI 377儀器進(jìn)行測(cè)序。序列用ABI軟件編輯，接著用GCG軟件包分析。這兩個(gè)克隆的核苷酸序列是一致的，含有與所用探針相對(duì)應(yīng)的全部編碼序列，這個(gè)基因稱作Ca BR102，其序列描述在SEQ ID NO4中。考慮到在白色念珠菌中，CTG密碼子被翻譯為絲氨酸(CaNL256中有3個(gè)CTG密碼子)這一事實(shí)，這一核苷酸序列的翻譯經(jīng)過(guò)了檢驗(yàn)。推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)與釀酒酵母基因YBR102有24％的同一性。
實(shí)例3CaIR012使用BI0101的Yeast Cell Lysis prep Kit和Genome DNA Kit，分離了白色念珠菌菌株Caf2-1的染色體DNA。使用寡核苷酸引物CaYIR012-5’(5’-GACGTCGTAGACGATACTCAAGAAG-3’)和CaYIR012-3’(5’-CTGCAGTAAACCCTCCAGATATAACAG-3’)，PowerScript DNA聚合酶(PAN System GmbH)，通過(guò)熱啟動(dòng)(hot start)技術(shù)擴(kuò)增出了一段343bp的白色念珠菌基因組DNA片段(SEQ ID NO5)。根據(jù)制造商說(shuō)明，用瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物，并用熒光素(Gene imagerandom prime labeling module，Amersham Life Science)進(jìn)行標(biāo)記。使用制造商推薦的Qiagen柱，從大腸桿菌中分離出質(zhì)粒DNA。根據(jù)制造商說(shuō)明(Stratagene Ltd.)，進(jìn)行白色念珠菌λZAPII cDNA文庫(kù)篩選。從15000pfu/平板的LB平板(150mm)上拿起尼龍濾膜(Schleicher&Schuell)，在1.5M NaCl，0.5M NaOH中變性5分鐘，在1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH8.0中中和3分鐘，在0.2MTris-HCl pH7.5，2xSSC中清洗3分鐘，DNA交聯(lián)到濾膜上(Stratagene UV crosslinker)。濾膜在60℃預(yù)雜交4小時(shí)，用熒光素標(biāo)記的DNA探針在60℃雜交過(guò)夜。用抗-熒光素AP綴合物(FluorImager的信號(hào)放大組件，Amersham LIFE SCIENCE)進(jìn)行檢測(cè)，20小時(shí)后用Fluorimager分析(Storm 860，MolecularDynamics)。挑選出陽(yáng)性噬斑，并培養(yǎng)在0.5ml SM緩沖液(100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl pH7.5，0，01％明膠)中。挑選的克隆被稀釋，用宿主細(xì)胞XLl-Blue滴定，并用相同的方法進(jìn)行第二次篩選純化。最終，根據(jù)Stratagene方案，用ExAssist Helper Phage系統(tǒng)挑選含有感興趣DNA插入的pBluescript SK(-)噬粒。從總共75000個(gè)篩選噬斑中，鑒定出3個(gè)陽(yáng)性克隆。分離出pBluescript SK(-)噬粒DNA，用T3和T7引物進(jìn)行測(cè)序，用常規(guī)合成的寡核苷酸引物擴(kuò)增序列。用Gene Data軟件包(Gene Data AG，BaselSwitzerland)分析核苷酸序列。用Blast程序(Gish，Warren和David J.States(1993).通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)相似性檢索鑒定蛋白質(zhì)編碼區(qū)。Nat.Genet.3266-72.)對(duì)Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性檢索。結(jié)果這三個(gè)克隆中的一個(gè)，含有與所用探針相對(duì)應(yīng)的全部編碼序列；這個(gè)基因稱作CaIR1012，其序列描述在SEQ ID NO6中。
實(shí)例4CaJL039CaJL039序列描述在SEQ ID NO7中。
基于公開(kāi)的Stanford白色念珠菌序列數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的基因片段數(shù)據(jù)，克隆出CaJL039基因。
(a)鑒定一段表現(xiàn)出與釀酒酵母基因YJL039c有同源性的片段，其序列在SEQ ID NO 8中給出。
通過(guò)使用在實(shí)施例3中公布的方法，用寡核苷酸引物對(duì)(Ca039sTAG CTC AAC CTA CCA CCA ATC/Ca039rATC ACA AGA CTGTCA ATG TAA AT)，擴(kuò)增了一段短的PCR片段，用于篩選白色念珠菌cDNAλZAP II文庫(kù)(Alistair Brown，Aberdeen惠贈(zèng))。
得到了三個(gè)陽(yáng)性克隆的3’編碼區(qū)域(#21t7，11t3，21t3)。
(b)使用引物步行法3’-和5’-延伸內(nèi)部片段使用Yep24載體作構(gòu)架的Sanglard白色念珠菌基因組DNA文庫(kù)進(jìn)一步擴(kuò)增3’-和5’-編碼序列。通過(guò)使用下列載體特異性的寡核苷酸引物和CaJL039片段特異的寡核苷酸引物，進(jìn)行擴(kuò)增cggaattcctatcgactacgcgatcatggYEp24for(載體特異)gcgaattccgatataggcgccagcaacYEp24ba(載體特異)caattgctttgactcgggtgttattaagtCa039-51(CaJL0395′釣取)tcttggcacaacttgataagaatctgtCa039-52(`)taggtgtacgcgaaagccaagtagaacCa039-53(`)ttgttaatcgtacacctaaggtgttgacCa039-31(CaJL0393`釣取)ttgcagattgatgctagcaatgtatttgCa039-32(`)使用引物步行技術(shù)，可以擴(kuò)增全部5’-序列(克隆14b-1-1和克隆17b-3-4)。
缺失的3’-序列可從GTC PathoGenome Release 5.0，重疊群#2830中獲得。
已經(jīng)鑒定了一種相互作用的蛋白質(zhì)(C82，酵母RNA聚合酶III的組分)。
實(shí)例5CaOR1105.1.CaOR110CaOR110序列描述在SEQ ID NO9中。
基于公開(kāi)的Stanford白色念珠菌序列數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的基因片段數(shù)據(jù)，克隆出CaOR110。
(a)Sc0R110同源的一個(gè)小片段被用于雜交試驗(yàn)，來(lái)鑒定白色念珠菌cDNAλZAP II文庫(kù)(來(lái)自Alistair Brown)中的CaOR110克隆。白色念珠菌CaOR110序列與所用雜交片段的序列對(duì)比在圖3中給出。同源片段序列在SEQ ID NO.17中給出。
(b)內(nèi)部片段的3’-和5’-延伸使用Yep24載體作構(gòu)架的Sanglard白色念珠菌基因組DNA文庫(kù)(來(lái)自RMV)擴(kuò)增3’-和5’-編碼和非編碼序列。通過(guò)使用下列載體特異性的寡核苷酸(直接針對(duì)插入物)和CaOR110片段特異性的寡核苷酸(直接針對(duì)載體側(cè)翼序列)進(jìn)行擴(kuò)增cggaattcctatcgactacgcgatcatggYEP24forgcgaattccgatataggcgccagcaacYEP24bacgggatccggtaaccaattggatctataaccgtg110-ba-150gcggatcctggtgcccttggtggtgaatgCaYOR110AgcggatccctcacaatatgacgattgaaactCaYOR110BggcgtcgactcaggcgccagttttacgtacttcaaattcatcCaYOR110CtgtgaattcttgacacagggtgaCaYOR110DcaaaccttcagcacaactccaCaYOR110E通過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)了最終裝配的序列，其中也包括3’-和5’-非編碼序列的序列。編碼區(qū)域被亞克隆到p414RSGALL載體中。
圖譜在圖4中描述。
酵母同源的ORF(YOR110w)，被描述為在TFIIIC聚合酶復(fù)合物中與TFC1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子亞單位TFC7(Manaud等，1998，分子細(xì)胞生物學(xué)18；3191-3200)。
5.2.CaOR110剪接變體鑒定了CaOR110另外的剪接變體。從白色念珠菌cDNA文庫(kù)中獲得該CaOR110剪接變體的克隆。
序列描述在SEQ ID NO.10中。
該剪接變體在CaOR110原始序列的第907位處使用“gtacgt”供體位點(diǎn)。受體位點(diǎn)在第1047位。圖譜公布在圖5中。
原始CaOR110與剪接變體的序列對(duì)比在圖6中給出。
實(shí)例6CaMR212CaMR212序列描述在SEQ ID NO.11中。
(a)基于公開(kāi)的Stanford白色念珠菌序列數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的基因片段數(shù)據(jù)，克隆出CaMR212基因。
表現(xiàn)出與釀酒酵母基因YMR212c有同源性(Blast檢索)的片段，其序列在SEQ ID 12中給出。
基于這些數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)以下寡核苷酸用于從白色念珠菌基因組DNA中擴(kuò)增該片段(490 bp的片段)。
寡核苷酸CaYMR212for5′-cacctgtgaacaacccaccatc-3′CaYMR212back5′-gaatatcctttttaactcaagag-3′(b)3’-和5’-延伸該CaMR212內(nèi)部片段為此，使用了來(lái)自Dominique Sanglard的白色念珠菌基因組DNA文庫(kù)(來(lái)自RMV)。該文庫(kù)Yep24構(gòu)架被用于PCR擴(kuò)增3’-和5’-編碼和非編碼序列。通過(guò)使用以下對(duì)CaMR212的490bp片段具有特異性的寡核苷酸(直接針對(duì)載體側(cè)翼序列)和對(duì)載體具有特異性的寡核苷酸(直接針對(duì)插入物)，進(jìn)行擴(kuò)增。
寡核苷酸YEP24for(載體特異)5′-cggaattcctatcgactacgcgatcatggYEP24ba(載體特異)5′-gcgaattccgatataggcgccagcaac引物Yep24for和CaMR212for給出了一段編碼CaMR212的5’-UTR和5’編碼區(qū)的500bp的片段。
使用Yep24 for和CaMR212back擴(kuò)增出一段1400bp的CaMR212片段。利用這段1400bp片段序列，設(shè)計(jì)了以下對(duì)這一片段具有特異性的新引物寡核苷酸
Ca212-15′-gctttcccagcaggataacattgCa212-25′-tgagttataatgcagctgttggCa212-35′-catctcgtgtgaacatgattgg引物Yep24for和Ca212-3給出了一段編碼3’-編碼區(qū)和3’-UTS區(qū)的1600bp的片段。
用這三個(gè)PCR片段裝配出了2900bp的序列(包括3’-和5’-編碼區(qū)序列和非編碼區(qū)序列)。通過(guò)使用以下新引物，從基因組DNA中擴(kuò)增出編碼序列，并將其克隆到p413GALL載體中。
擴(kuò)增編碼區(qū)的寡核苷酸Ca212for 5′-agtttcttcaacttccagatccaagCa212back5′-gtatatttgcaactgtctctctctc酵母同系物YMR212c在細(xì)胞壁功能中起作用，因?yàn)樗那贸梢栽?M山梨糖醇中得到挽救。另外，GAL啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下的YMR212c，表現(xiàn)出對(duì)剛果紅(Congo Red)和Calcofluor White增強(qiáng)的敏感性。YMR212c是一種膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，位于質(zhì)膜上(經(jīng)YMR212-GFP融合蛋白質(zhì)的顯微分析和生化分析證明)。
實(shí)例7CaDR325CaDR325序列描述在SEQ ID 13中。
基于公開(kāi)的Stanford白色念珠菌序列數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的基因片段數(shù)據(jù)，克隆出CaDR325基因。
(a)表現(xiàn)出與釀酒酵母基因YDR325有同源性的三個(gè)片段得到了鑒定，其序列公開(kāi)在SEQ ID 14，15，16中。
基于這些數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)以下寡核苷酸，用于確認(rèn)數(shù)據(jù)庫(kù)序列，并從基因組DNA中擴(kuò)增一段大約2200bp的CaDR325內(nèi)部片段。
cgagcatctacttgttcaaccachybCaYDR325ba Oligogaatctctggctcgctc 325-juls Oligogaccgagatacacgagaat325-julr OligoggttaaatgatcgtgatgaatCa325r OligocaacctcactgacaaatacttCa325s Oligo最后亞克隆的2200bp的內(nèi)部片段，通過(guò)聯(lián)合使用hybCaYDR325ba+325-julr寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。
(c)3’-和5’-延伸該CaMR212內(nèi)部片段使用Yep24載體作構(gòu)架的Sanglard白色念珠菌基因組DNA文庫(kù)(來(lái)自RMV)，擴(kuò)增3’-和5’-編碼和非編碼序列。通過(guò)使用下列載體特異性的寡核苷酸(直接針對(duì)插入物)和CaDR325 2200bp片段特異性的寡核苷酸(直接針對(duì)載體側(cè)翼序列)，進(jìn)行擴(kuò)增cggaattcctatcgactacgcgatcatggYEP24for(載體特異)gcgaattccgatataggcgccagcaac YEP24ba(載體特異)acgcttccaatgtattattctcgOligo 1-10-A backggatgccaatttccctga Oligo 1-10-B forcatccagaagatataacggct Oligo 1-10-C fortgcataatctactcagcgaca Oligo 1-l0-D backgtggttgaacaagtagatgctcgOllgo 1-l0-E forgcgcttgaaaccactagtgaattg Ca325Klon_2_Focaattcactagtggtttcaagcgc Ca325Klon_3_Ba通過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)了最終裝配的4700bp的序列，其中也包括3’-和5’-非編碼序列的序列。編碼區(qū)被亞克隆到p413RSGALL載體中。
圖譜在圖7中描述。
在序列表的130區(qū)，確定了序列數(shù)目。
序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID01<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>399<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述探針<400>1attcatccca tcagtgcaga aagtttgcat agccatttac aacaattaat aaatgataaa 60cctcaagaga cagtacaaga atcgtctgat ttattacaat ttatcccagt ctctagatta 120cctgtcaaag ataatatttt gaaatttgat caaattaatc ataaatctcc tactttgatt 180atgggtatat tgaatatgac tcctgattca tttagtgatg gtgggaaaca ttttggaaaa 240gaactagata atattgtgaa gcaggcagag aaattagtca gtgagggtgc tacgattatt 300gacattggag gagtttccac acgaccagga agtgttgaac ccactgagga agaagaattg 360gaacgtgtga ttccattaat tagagctatt cgtcaatca399序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID02<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2367<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(2364)<220><221>基因<222>(1)..(2364)<223>基因CaNL256<400>1atg ttg aaa aac gat acc gtt ttc act aaa gat att tct tgt acg gcg 48Met Leu Lys Asn Asp Thr Val Phe Thr Lys Asp Ile Ser Cys Thr Ala1 5 10 15ata act ggt aaa gat gcc tgg aat cgg cca aca cca caa cca atc act 96Ile Thr Gly Lys Asp Ala Trp Asn Arg Pro Thr Pro Gln Pro Ile Thr20 25 30ata tca tta tct ttc aat act gat ttc cat aag gca tcg gaa ttg gat 144Ile Ser Leu Ser Phe Asn Thr Asp Phe His Lys Ala Ser Glu Leu Asp35 40 45aat ttg aaa tac tca att aat tat gct gtt att acc aga aat gta act 192Asn Leu Lys Tyr Ser Ile Asn Tyr Ala Val Ile Thr Arg Asn Val Thr50 55 60gaa ttt atg aaa tca aat gag cat tta aat ttc aag tca tta gga aat 240Glu Phe Met Lys Ser Asn Glu His Leu Asn Phe Lys Ser Leu Gly Asn65 70 75 80att gct caa gca att agt gat att gga tta gat caa tct aga ggt ggt 288Ile Ala Gln Ala Ile Ser Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Arg Gly Gly85 90 95gga tct att gtg gat gtg acg ata aaa agt ttg aaa tca gaa ata aga 336Gly Ser Ile Val Asp Val Thr Ile Lys Ser Leu Lys Ser Glu Ile Arg100 105110gct gaa agt gtc gaa tat aaa att aat aga aac act ttg ggt caa ccc 384Ala Glu Ser Val Glu Tyr Lys Ile Asn Arg Asn Thr Leu Gly Gln Pro115120 125gtt cca tta gat att ttc caa gtt aat aaa ttg aga tta ttg acg att 432Val Pro Leu Asp Ile Phe Gln Val Asn Lys Leu Arg Leu Leu Thr Ile130 135 140att gga gtt ttc aca ttt gaa aga tta caa aaa caa ata gtt gat gtt 480Ile Gly Val Phe Thr Phe Glu Arg Leu Gln Lys Gln Ile Val Asp Val145 150 155 160gat ttg caa ttt aaa att gaa cct aat tcc aat tta tat ttc cat caa 528Asp Leu Gln Phe Lys Ile Glu Pro Asn Ser Asn Leu Tyr Phe His Gln165 170 175ata att gct gat att gtt tca tac gtg gaa tca tct aat ttc aaa act 576Ile Ile Ala Asp Ile Val Ser Tyr Val Glu Ser Ser Asn Phe Lys Thr180 185 190gta gaa gca ttg gtg tct aag att ggt caa ttg aca ttt cag aaa tat 624Va1 Glu Ala Leu Val Ser Lys Ile Gly Gln Leu Thr Phe Gln Lys Tyr195 200 205gac gga gta gct gaa gtt gtt gct act gtc act aaa ccg aat gca ttt 672Asp Gly Val Ala Glu Val Val Ala Thr Val Thr Lys Pro Asn Ala Phe210 215 220agt cat gtt gaa ggt gtt gga gta tca tct acc atg gtc aaa gac aat 720Ser His Val Glu Gly Val Gly Val Ser Ser Thr Met Val Lys Asp Asn225 230 235 240ttc aaa gat atg gaa cca gtt aaa ttt gaa aac aca att gct caa act 768Phe Lys Asp Met Glu Pro Val Lys Phe Glu Asn Thr Ile Ala Gln Thr245 250 255aat aga gca ttc aat tta cct gtt gaa aat gag aaa act gag gat tat 816Asn Arg Ala Phe Asn Leu Pro Val Glu Asn Glu Lys Thr Glu Asp Tyr260 265 270acc ggg tac cac act gca ttt att gcc ttt gga tcc aat act gga aat 864Thr Gly Tyr His Thr Ala Phe Ile Ala Phe Gly Ser Asn Thr Gly Asn275280 285caa gta gaa aat att acc aat tca ttc gaa ttg ttg caa aaa tat gga 912Gln Val Glu Asn Ile Thr Asn Ser Phe Glu Leu Leu Gln Lys Tyr Gly290 295 300atc acc ata gaa gca act tca tca ttg tac att tct aaa cca atg tat 960Ile Thr Ile Glu Ala Thr Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Lys Pro Met Tyr305 310 315 320tac ttg gat caa cca gat ttt ttc aat gga gta att aaa gtg aat ttc 1008Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Phe Phe Asn Gly Val Ile Lys Val Asn Phe325 330 335caa aac att tca cct ttc cag ttg ttg aaa att cta aaa gat att gaa 1056Gln Asn Ile Ser Pro Phe Gln Leu Leu Lys Ile Leu Lys Asp Ile Glu340 345 350tat aaa cat tta gaa agg aaa aaa gac ttt gat aat ggg ccc aga tca 1104Tyr Lys His Leu Glu Arg Lys Lys Asp Phe Asp Asn Gly Pro Arg Ser355 360 365ata gat ttg gat att ata cta tat gac gat tta caa tta aat acc gag 1152Ile Asp Leu Asp Ile Ile Leu Tyr Asp Asp Leu Gln Leu Asn Thr Glu370 375 380aat cta att att cca cat aaa tca atg tta gaa aga aca ttt gta tta 1200Asn Leu Ile Ile Pro His Lys ser Met Leu Glu Arg Thr Phe Val Leu385 390395 400caa cca tta tgt gaa gta ttg ccc cct gat tat att cat ccc atc agt 1248Gln Pro Leu Cys Glu Val Leu Pro Pro Asp Tyr Ile His Pro Ile Ser405 410 415gca gaa agt ttg cat agc cat tta caa caa tta ata aat gat aaa cct 1296Ala Glu Ser Leu His Ser His Leu Gln Gln Leu Ile Asn Asp Lys Pro420 425 430caa gag aca gta caa gaa tcg tct gat tta tta caa ttt arc cca gtc 1344Gln Glu Thr Val Gln Glu Ser Ser Asp Leu Leu Gln Phe Ile Pro Val435 440 445tct aga ttg cct gtc aaa gat aat att ttg aaa ttt gat caa att aat 1392Ser Arg Leu Pro Val Lys Asp Asn Ile Leu Lys Phe Asp Gln Ile Asn450 455 460cat aaa tct cct act ttg att atg ggt ata ttg aat atg act cct gat 1440His Lys Ser Pro Thr Leu Ile Met Gly Ile Leu Asn Met Thr Pro Asp465 470 475 480tca ttt agt gat ggt ggg aaa cat ttt gga aaa gaa cta gat aat act 1488Ser Phe Ser Asp Gly Gly Lys His Phe Gly Lys Glu Leu Asp Asn Thr485 490 495gtg aag cag gca gag aaa tta gtc agt gag ggt gct acg att att gac 1536Val Lys Gln Ala Glu Lys Leu Val Ser Glu Gly Ala Thr Ile Ile Asp500 505 510att gga gga gtt tcc aca cgc cca gga agt gtt gaa ccc act gag gaa 1584Ile Gly Gly Val Ser Thr Arg Pro Gly Ser Val Glu Pro Thr Glu Glu515 520 525gaa gaa ttg gaa cgt gtg att cca tta att aaa gct att cgt caa tca 1632Glu Glu Leu Glu Arg Val Ile Pro Leu Ile Lys Ala Ile Arg Gln Ser530 535 540ctg aac cct gat tta ctg aag gtg ttg att tcg gtt gat act tat cgt 1680Leu Asn Pro Asp Leu Leu Lys Val Leu Ile Ser Val Asp Thr Tyr Arg545 550 555 560agg aac gtt gct gaa caa agt tta ctt gtg ggt gct gac ata atc aac 1728Arg Asn Val Ala Glu Gln Ser Leu Leu Val Gly Ala Asp Ile Ile Asn565 570 575gat atc tca atg ggc aaa tat gat gaa aaa ata ttt gat gtg gtt gct 1776Asp Ile Ser Met Gly Lys Tyr Asp Glu Lys Ile Phe Asp Val Val Ala580 585 590aaa tac gga tgt cct tat atc atg aat cat act cga gga tca cct aaa 1824Lys Tyr Gly Cys Pro Tyr Ile Met Asn His Thr Arg Gly Ser Pro Lys595 600 605acc atg tct aaa ttg acc aat tat gaa tca aat aca aat gat gat att 1872Thr Met Ser Lys Leu Thr Asn Tyr Glu Ser Asn Thr Asn Asp Asp Ile610 615 620atc gaa tat ata att gat cct aaa tta gga cat caa gaa ttg gat ttg 1920Ile Glu Tyr Ile Ile Asp Pro Lys Leu Gly His Gln Glu Leu Asp Leu625 630 635 640tca cct gaa atc aag aat tta ctc aat gga atc agt cgt gaa ttg agt 1968Ser Pro Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asn Gly Ile Ser Arg Glu Leu Ser645 650 655tta caa atg ttt aaa gcc atg gct aaa gga gtg aaa aaa tgg caa att 2016Leu Gln Met Phe Lys Ala Met Ala Lys Gly Val Lys Lys Trp Gln Ile660 665 670att ttg gat cct ggt att gga ttt gct aaa aat ttg aat caa aat tta 2064Ile Leu Asp Pro Gly Ile Gly Phe Ala Lys Asn Leu Asn Gln Asn Leu675 680 685gca gtt att cgt aat gcc tcg ttt ttt aaa aaa tat tct att caa att 2112Ala Val Ile Arg Asn Ala Ser Phe Phe Lys Lys Tyr Ser Ile Gln Ile690 695 700aat gaa cgt gtt gat gat gtg aca atc aaa cat aaa tat tta agt ttt 2160Asn Glu Arg Val Asp Asp Val Thr Ile Lys His Lys Tyr Leu Ser Phe705 710 715 720aat ggt gct tgt gtt ttg gtg ggg aca tca aga aag aag ttt ttg ggg 2208Asn Gly Ala Cys Val Leu Val Gly Thr Ser Arg Lys Lys Phe Leu Gly725 730 735aca tta act ggt aat gaa gtg cct ctg gat cga gta ttt ggc act ggt 2256Thr Leu Thr Gly Asn Glu Val Pro Leu Asp Arg Val Phe Gly Thr Gly740 745 750gca aca gtg tct gcg tgt att gaa caa aac act gat att gta aga gtt 2304Ala Thr Val Ser Ala Cys Ile Glu Gln Asn Thr Asp Ile Val Arg Val755 760 765cat gat gtt aaa gaa atg aaa gat gta gta tgt ata agt gat gca att 2352His Asp Val Lys Glu Met Lys Asp Val Val Cys Ile Ser Asp Ala Ile770 775 780tat aaa aat gta taa 2367Tyr Lys Asn Val785<210>2<211>788<212>PRT<213>白色念珠菌<400>2Met Leu Lys Asn Asp Thr Val Phe Thr Lys Asp Ile Ser Cys Thr Ala1 5 10 15Ile Thr Gly Lys Asp Ala Trp Asn Arg Pro Thr Pro Gln Pro Ile Thr20 25 30Ile Ser Leu Ser Phe Asn Thr Asp Phe His Lys Ala Ser Glu Leu Asp35 40 45Asn Leu Lys Tyr Ser Ile Asn Tyr Ala Val Ile Thr Arg Asn Val Thr50 55 60Glu Phe Met Lys Ser Asn Glu His Leu Asn Phe Lys Ser Leu Gly Asn65 70 75 80Ile Ala Gln Ala Ile Ser Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Arg Gly Gly85 90 95Gly Ser Ile Val Asp Val Thr Ile Lys Ser Leu Lys Ser Glu Ile Arg100 105 110Ala Glu Ser Val Glu Tyr Lys Ile Asn Arg Asn Thr Leu Gly Gln Pro115 120 125Val Pro Leu Asp Ile Phe Gln Val Asn Lys Leu Arg Leu Leu Thr Ile130 135 140Ile Gly Val Phe Thr Phe Glu Arg Leu Gln Lys Gln Ile Val Asp Val145 150 155 160Asp Leu Gln Phe Lys Ile Glu Pro Asn Ser Asn Leu Tyr Phe His Gln165 170 175Ile Ile Ala Asp Ile Val Ser Tyr Val Glu Ser Ser Asn Phe Lys Thr180 185 190Val Glu Ala Leu Val Ser Lys Ile Gly Gln Leu Thr Phe Gln Lys Tyr195 200 205Asp Gly Val Ala Glu Val Val Ala Thr Val Thr Lys Pro Asn Ala Phe210 215 220Ser His Val Glu Gly Val Gly Val Ser Ser Thr Met Val Lys Asp Asn225 230 235 240Phe Lys Asp Met Glu Pro Val Lys Phe Glu Asn Thr Ile Ala Gln Thr245 250 255Asn Arg Ala Phe Asn Leu Pro Val Glu Asn glu Lys Thr Glu Asp Tyr260 265 270Thr Gly Tyr His Thr Ala Phe Ile Ala Phe Gly Ser Asn Thr Gly Asn275 280 285Gln Val Glu Asn Ile Thr Asn Ser Phe Glu Leu Leu Gln Lys Tyr Gly290 295 300Ile Thr Ile Glu Ala Thr Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Lys Pro Met Tyr305 310 315 320Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Phe Phe Asn Gly Val Ile Lys Val Asn Phe325 330 335Gln Asn Ile Ser Pro Phe Gln Leu Leu Lys Ile Leu Lys Asp Ile Glu340 345 350Tyr Lys His Leu Glu Arg Lys Lys Asp Phe Asp Asn Gly Pro Arg Ser355 360 365Ile Asp Leu Asp Ile Ile Leu Tyr Asp Asp Leu Gln Leu Asn Thr Glu370 375 380Asn Leu Ile Ile Pro His Lys Ser Met Leu Glu Arg Thr Phe Val Leu385 390 395 400Gln Pro Leu Cys Glu Val Leu Pro Pro Asp Tyr Ile His Pro Ile Ser405 410 415Ala Glu Ser Leu His Ser His Leu Gln Gln Leu Ile Asn Asp Lys Pro420 425 430Gln Glu Thr Val Gln Glu Ser Ser Asp Leu Leu Gln Phe Ile Pro Val435 440 445Ser Arg Leu Pro Val Lys Asp Asn Ile Leu Lys Phe Asp Gln Ile Asn450 455 460His Lys Ser Pro Thr Leu Ile Met Gly Ile Leu Asn Met Thr Pro Asp465 470 475 480Ser Phe Ser Asp Gly Gly Lys His Phe Gly Lys Glu Leu Asp Asn Thr485 490 495Val Lys Gln Ala Glu Lys Leu Val Ser Glu Gly Ala Thr Ile Ile Asp500 505 510Ile Gly Gly Val Ser Thr Arg Pro Gly Ser Val Glu Pro Thr Glu Glu515 520 525Glu Glu Leu Glu Arg Val Ile Pro Leu Ile Lys Ala Ile Arg Gln Ser530 535 540Leu Asn Pro Asp Leu Leu Lys Val Leu Ile Ser Val Asp Thr Tyr Arg545 550 555 560Arg Asn Val Ala Glu Gln Ser Leu Leu Val Gly Ala Asp Ile Ile Asn565 570 575Asp Ile Ser Met Gly Lys Tyr Asp Glu Lys Ile Phe Asp Val Val Ala580 585 590Lys Tyr Gly Cys Pro Tyr Ile Met Asn His Thr Arg Gly Ser Pro Lys595 600 605Thr Met Ser Lys Leu Thr Asn Tyr Glu Ser Asn Thr Asn Asp Asp Ile610 615 620Ile Glu Tyr Ile Ile Asp Pro Lys Leu Gly His Gln Glu Leu Asp Leu625 630 635 640Ser Pro Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asn Gly Ile Ser Arg Glu Leu Ser645 650 655Leu Gln Met Phe Lys Ala Met Ala Lys Gly Val Lys Lys Trp Gln Ile660 665 670Ile Leu Asp Pro Gly Ile Gly Phe Ala Lys Asn Leu Asn Gln Asn Leu675 680 685Ala Val Ile Arg Asn Ala Ser Phe Phe Lys Lys Tyr Ser Ile Gln Ile690 695 700Asn Glu Arg Val Asp Asp Val Thr Ile Lys His Lys Tyr Leu Ser Phe705 710 715 720Asn Gly Ala Cys Val Leu Val Gly Thr Ser Arg Lys Lys Phe Leu Gly725 730 735Thr Leu Thr Gly Asn Glu Val Pro Leu Asp Arg Val Phe Gly Thr Gly740 745 750Ala Thr Val Ser Ala Cys Ile Glu Gln Asn Thr Asp Ile Val Arg Val755 760 765His Asp Val Lys Glu Met Lys Asp Val Val Cys Ile Ser Asp Ala Ile770 775 780Tyr Lys Asn Val785序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID03<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>647<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述探針<400>1agtattcaat tgggtattcc cagtaataaa aagaaagatc gatcatcaat tatggtgctt 60aaaaaaatgt gggattctca attacaatca ttatttaaac atgttgacgg tgcatcaaaa 120tttgtgcaac cattacccaa tagacacatt gtcgcggaaa gtggacgatg gtttgaagtt 180aatgtgggga attggaaacc aagttatcca actcatttat ttatatttaa tgatttaatt 240ttaattgccg ttaaaaaatc atcatctagt agtcaggaac ctactacagg gggaagtaat 300ggtggttcaa aatcgagatt acaagcggtt caatgttggc ccttaactca agtatcatta 360caacaaatca aatcaccgaa aaaagatgac gataagatgt attttatcaa tcttaaatcc 420aaatctttaa gttatgtata cctgacggat cgttatgatc attttgtgaa agttacggaa 480gcatttaata aaggtagaaa tgaaatgatt caaagtgaaa gattattaga ttcaagactt 540tcatctcctt caaataataa tggagattct aaagaagaga aacgacaatt acgggaatca 600ttaagaaact caggcaatta taaagaagga gttactgatg atgccgg 647序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID04<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2373<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(2373)<220><221>基因<222>(1)..(2373)<223>基因CaBR102<400>1atg gat aat ctt gat ccc aat tct agt tta caa gta gag aaa tta cga 48Met Asp Asn Leu Asp Pro Asn Ser Ser Leu Gln Val Glu Lys Leu Arg15 10 15aac agg aaa agc agg gct gta tgg cag aat aac aac act tct act cat 96Asn Arg Lys Ser Arg Ala Val Trp Gln Asn Asn Asn Thr Ser Thr His20 25 30aat aat cct tat gct aat tta agc act ggt gaa aaa agt agg agt cgc 144Asn Asn Pro Tyr Ala Asn Leu Ser Thr Gly Glu Lys Ser Arg Ser Arg35 40 45cat aac act ggt agt tct tat gtt tct cca tat ggc ggc ggt aat gga 192His Asn Thr Gly Ser Ser Tyr Val Ser Pro Tyr Gly Gly Gly Asn Gly50 55 60gag gag aat gct tat act ggg aat aac aac aaa tca aat act agt ggt 240Glu Glu Asn Ala Tyr Thr Gly Asn Asn ASn Lys Ser Asn Thr Ser Gly65 70 75 80aat tta tta caa gtt cct gga gca gga gga gga gga gat ttg aat tct288Asn Leu Leu Gln Val Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Leu Asn Ser85 90 95aat aag aaa caa agt cga aga atg agt att cat gta tca gct cgt caa336Asn Lys Lys Gln Ser Arg Arg Met Ser Ile His Val Ser Ala Arg Gln100 105 110cat gga aga tca ttt tca caa act ggt cca att gat atg gca aat tta384His Gly Arg Ser Phe Ser Gln Thr Gly Pro Ile Asp Met Ala Asn Leu115 120 125ccg gca tta cct aaa ata ggt ggt gtt act act agt ggt gtt ggc ggt432Pro Ala Leu Pro Lys Ile Gly Gly Val Thr Thr Ser Gly Val Gly Gly130 135 140gct ggt ggt gat gtt atg aca agg act ggg gga ttg acg ata gaa caa480Ala Gly Gly Asp Val Met Thr Arg Thr Gly Gly Leu Thr Ile Glu Gln145 150 155 160aaa ata ttc aaa gaa tta agt caa gga tca gca gct gaa gtt gat gat528Lys Ile Phe Lys Glu Leu Ser Gln Gly Ser Ala Ala Glu Val Asp Asp165 170 175tat tac aag aca tta ttg aaa cag aaa aat tta atc act cgt gac att576Tyr Tyr Lys Thr Leu Leu Lys Gln Lys Asn Leu Ile Thr Arg Asp Ile180 185 190aag gat aat att aat cag aat caa aaa aat att tta caa tta aca aaa624Lys Asp Asn Ile Asn Gln Asn Gln Lys Asn Ile Leu Gln Leu Thr Lys195 200 205gac ttg aaa gag acc caa gaa gaa ttg att gaa ttg aga gga acc act672Asp Leu Lys Glu Thr Gln Glu Glu Leu Ile Glu Leu Arg Gly Thr Thr210 215 220aaa gaa tta tat gaa gtt tta ggt tat ttc aaa gaa tca gct caa cgt720Lys Glu Leu Tyr Glu Val Leu Gly Tyr Phe Lys Glu Ser Ala Gln Arg225 230 235 240aga tta gaa ttg gaa ttt gaa cca gaa aca caa aaa gaa ctt cat ctg768Arg Leu Glu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Thr Gln Lys Glu Leu His Leu245 250 255cct caa aaa agt aat caa ttg ggt att cct agt aat aaa aag aaa gat816Pro Gln Lys Ser Asn Gln Leu Gly Ile Pro Ser Asn Lys Lys Lys Asp260 265 270cga tca tca att atg gtg ctt aaa aaa atg tgg gat tct caa tta caa864Arg Ser Ser Ile Met Val Leu Lys Lys Met Trp Asp Ser Gln Leu Gln275 280 285tca tta ttt aaa cat gtt gac ggt gca tca aaa ttt gtc caa cca tta912Ser Leu Phe Lys His Val Asp Gly Ala Ser Lys Phe Val Gln Pro Leu290 295 300ccc aat aga cac att gtc gcg gaa agt gga cga tgg ttt gaa gtt aat960Pro Asn Arg His Ile Val Ala Glu Ser Gly Arg Trp Phe Glu Val Asn305 310 315 320gtg ggg aat tgg aaa cca agt tat cca act cat tta ttt ata ttt aat1008Val Gly Asn Trp Lys Pro Ser Tyr Pro Thr His Leu Phe Ile Phe Asn325 330 335gat tta att tta att act gtt aaa aaa tca tca tct agt agt cag gaa1056Asp Leu Ile Leu Ile Thr Val Lys Lys Ser Ser Ser Ser Ser Gln Glu340 345 350cct act aca ggg gga agt aat ggt ggt tca aaa tcg aga tta caa gcg1104Pro Thr Thr Gly Gly Ser Asn Gly Gly Ser Lys Ser Arg Leu Gln Ala355 360 365gtt caa tgt tgg ccc tta act caa gta tca tta caa caa atc aaa tca1152Val Gln Cys Trp Pro Leu Thr Gln Val Ser Leu Gln Gln Ile Lys Ser370 375 380ccg aaa aaa gat gac gat aag atg tat ttt atc aat ctt aaa tcc aaa1200Pro Lys Lys Asp Asp Asp Lys Met Tyr Phe Ile Asn Leu Lys Ser Lys385 390 395 400tct tta agt tat gta tac ctg acg gat cgt tat gat cat ttt gtg aaa1248Ser Leu Ser Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Arg Tyr Asp His Phe Val Lys405 410 415gtt acg gaa gca ttt aat aaa ggt aga aat gaa atg att caa agt gaa1296Val Thr Glu Ala Phe Asn Lys Gly Arg Asn Glu Met Ile Gln Ser Glu420 425 430aga tta tta gat tca aga ctt tca tct cct tca aat aat aat gga gat1344Arg Leu Leu Asp Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Asn Asn Asn Gly Asp435 440 445tct aaa gaa gag aaa cga caa tta cgg gaa tca tta aga aac tca ggc1392Ser Lys Glu Glu Lys Arg Gln Leu Arg Glu Ser Leu Arg Asn Ser Gly450 455 460aat tat aaa gaa gga gtt act gat gat gcc ggt gga gct gca act ggt 1440Asn Tyr Lys Glu Gly Val Thr Asp Asp Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly465 470 475 480ggt ggt agg aaa agt gcc ggt act cct aat aga aat agt act gat tac 1488Gly Gly 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Lys Leu Lys Ile Lys Asn Arg Lys Glu Asn Val Ser Asn Gly595 600 605tta ata ttt gat tta caa cat aat ata gct aaa ctt aaa caa gat gat 1872Leu Ile Phe Asp Leu Gln His Asn Ile Ala Lys Leu Lys Gln Asp Asp610 615 620att gat aat att ttg acg tta ttt gat aat tta gag caa tta gat cga 1920Ile Asp Asn Ile Leu Thr Leu Phe Asp Asn Leu Glu Gln Leu Asp Arg625 630 635 640ggg gtt caa gga tat ttg gat tca atg tca gct tat tta tca act aca 1968Gly Val Gln Gly Tyr Leu Asp Ser Met Ser Ala Tyr Leu Ser Thr Thr645 650 655gta tca aaa tta att gtt ggt tta caa gga tca acg aaa atc gat gtt 2016Val Ser Lys Leu Ile Val Gly Leu Gln Gly Ser Thr Lys Ile Asp Val660 665 670gtt aat tat ctt tcc aat tta atg gtt att aat gta tcg att gtg aaa 2064Val Asn Tyr Leu Ser Asn Leu Met Val Ile Asn Val Ser Ile Val Lys675 680 685cgt aca att caa act tat gaa caa ata att gct cca att tta aaa cgt 2112Arg Thr Ile Gln Thr Tyr Glu Gln Ile Ile Ala Pro Ile Leu Lys Arg690 695 700cat ggt gat gtt gat tca agt gga ttg att aat tgg tgt att gat gaa 2160His Gly Asp Val Asp Ser Ser Gly Leu Ile Asn Trp Cys Ile Asp Glu705 710 715 720ttt act aaa ctt tgt aaa caa att aaa aaa cat ttg tat gga aca ttg 2208Phe Thr Lys Leu Cys Lys Gln Ile Lys Lys His Leu Tyr Gly Thr Leu725 730 735ttg ata tct tct ggg att aat atg gaa act gat gaa cca att tat aaa 2256Leu Ile Ser Ser Gly Ile Asn Met Glu Thr Asp Glu Pro Ile Tyr Lys740 745 750gtt aaa gaa aga aaa tta tat gat aat ttc ttg aag att atg caa cca 2304Val Lys Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Asn Phe Leu Lys Ile Met Gln Pro755 760 765caa ttg gaa gaa tta aaa ctg gtg gga tta aat gtt gat tat ata ttt 2352Gln Leu Glu Glu Leu Lys Leu Val Gly Leu Asn Val Asp Tyr Ile Phe770 775 780gag tct ata tta aat ctt gaa 2373Glu Ser Ile Leu Asn Leu Glu785 790<210>2<211>791<212>PRT<213>白色念珠菌<400>2Met Asp Asn Leu Asp Pro Asn Ser Ser Leu Gln Val Glu Lys Leu Arg1 5 10 15Asn Arg Lys Ser Arg Ala Val Trp Gln Asn Asn Asn Thr Ser Thr His20 25 30Asn Asn Pro Tyr Ala Asn Leu Ser Thr Gly Glu Lys Ser Arg Ser Arg35 40 45His Asn Thr Gly Ser Ser Tyr Val Ser Pro Tyr Gly Gly Gly Asn Gly50 55 60Glu Glu Asn Ala Tyr Thr Gly Asn Asn Asn Lys Ser Asn Thr Ser Gly65 70 75 80Asn Leu Leu Gln Val Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Leu Asn Ser85 90 95Asn Lys Lys Gln Ser Arg Arg Met Ser Ile His Val Ser Ala Arg Gln100 105 110His Gly Arg Ser Phe Ser Gln Thr Gly Pro Ile Asp Met Ala Asn Leu115 120 125Pro Ala Leu Pro Lys Ile Gly Gly Val Thr Thr Ser Gly Val Gly Gly130 135 140Ala Gly Gly Asp Val Met Thr Arg Thr Gly Gly Leu Thr Ile Glu Gln145 150 155 160Lys Ile Phe Lys Glu Leu Ser Gln Gly Ser Ala Ala Glu Val Asp Asp165 170 175Tyr Tyr Lys Thr Leu Leu Lys Gln Lys Asn Leu Ile Thr Arg Asp Ile180 185 190Lys Asp Asn Ile Asn Gln Asn Gln Lys Asn Ile Leu Gln Leu Thr Lys195 200 205Asp Leu Lys Glu Thr Gln Glu Glu Leu Ile Glu Leu Arg Gly Thr Thr210 215 220Lys Glu Leu Tyr Glu Val Leu Gly Tyr Phe Lys Glu Ser Ala Gln Arg225 230 235 240Arg Leu Glu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Thr Gln Lys Glu Leu His Leu245 250 255Pro Gln Lys Ser Asn Gln Leu Gly Ile Pro Ser Asn Lys Lys Lys Asp260 265 270Arg Ser Ser Ile Met Val Leu Lys Lys Met Trp Asp Ser Gln Leu Gln275 280 285Ser Leu Phe Lys His Val Asp Gly Ala Ser Lys Phe Val Gln Pro Leu290 295 300Pro Asn Arg His Ile Val Ala Glu Ser Gly Arg Trp Phe Glu Val Asn305 310 315 320Val Gly Asn Trp Lys Pro Ser Tyr Pro Thr His Leu Phe Ile Phe Asn325 330 335Asp Leu Ile Leu Ile Thr Val Lys Lys Ser Ser Ser Ser Ser Gln Glu340 345 350Pro Thr Thr Gly Gly Ser Asn Gly Gly Ser Lys Ser Arg Leu Gln Ala355 360 365Val Gln Cys Trp Pro Leu Thr Gln Val Ser Leu Gln Gln Ile Lys Ser370 375 380Pro Lys Lys Asp Asp Asp Lys Met Tyr Phe Ile Asn Leu Lys Ser Lys385 390 395 400Ser Leu Ser Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Arg Tyr Asp His Phe Val Lys405 410 415Val Thr Glu Ala Phe Asn Lys Gly Arg Asn Glu Met Ile Gln Ser Glu420 425 430Arg Leu Leu Asp Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Asn Asn Asn Gly Asp435 440 445Ser Lys Glu Glu Lys Arg Gln Leu Arg Glu Ser Leu Arg Asn Ser Gly450 455 460Asn Tyr Lys Glu Gly Val Thr Asp Asp Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly465 470 475 480Gly Gly Arg Lys Ser Ala Gly 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Lys Arg690 695 700His Gly Asp Val Asp Ser Ser Gly Leu Ile Asn Trp Cys Ile Asp Glu705 710 715 720Phe Thr Lys Leu Cys Lys Gln Ile Lys Lys His Leu Tyr Gly Thr Leu725 730 735Leu Ile Ser Ser Gly Ile Asn Met Glu Thr Asp Glu Pro Ile Tyr Lys740 745 750Val Lys Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Asn Phe Leu Lys Ile Met Gln Pro755 760 765Gln Leu Glu Glu Leu Lys Leu Val Gly Leu Asn Val Asp Tyr Ile Phe770 775 780Glu Ser Ile Leu Asn Leu Glu785 790序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID05<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>343<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述探針<400>1ctgcagtaaa ccctccagat ataacagact ctttatgtcc agtgatttcg ccaacaaatc 60ttggtggttg ggtgtgtgtg gtccataagt atgccgtgtt gtcaccaccc ccagtcaata 120ccattggcaa tttaggatgt gaaaaaatag taaatatact atcggtatgt ttatcaaaat 180aagtccatga attgttggac atgtcaattt ctaaagtctc atgctcatca tctaattcca 240tctcctcatc ttcttcatcg ggtggcgctt gatcatcatc tgcaacttcc tcagccactt 300cattaacatt gatatattct tcttgagtat cgtctacgac gtc 343序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID06<140><141><160>2<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>1248<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(1245)<220><222>基因<222>(1)..(1245)<223>基因CaIR012<400>1atg tca cac caa caa gaa gac gtc gta gac gat act caa gaa gaa tat 48Met Ser His Gln Gln Glu Asp Val Val Asp Asp Thr Gln Glu Glu Tyr1 5 10 15atc aat gtt aat gaa gtg gct gag gaa gtt gca gat gat gat caa gcg 96Ile Asn Val Asn Glu Val Ala Glu Glu Val Ala Asp Asp Asp Gln Ala20 25 30cca ccc gat gaa gaa gat gag gag atg gaa tta gat gat gag cat gag 144Pro Pro Asp Glu Glu Asp Glu Glu Met Glu Leu Asp Asp Glu His Glu35 40 45act tta gaa att gac atg tcc aac aat tca tgg act tat ttt gat aaa 192Thr Leu Glu Ile Asp Met Ser Asn Asn Ser Trp Thr Tyr Phe Asp Lys50 55 60cat acc gat agt ata ttt act att ttt tca cat cct aaa ttg cca atg 240His Thr Asp Ser Ile Phe Thr Ile Phe Ser His Pro Lys Leu Pro Met65 70 75 80gta ttg act ggg ggt ggt gac aac acg gca tac tta tgg acc aca cac 288Val Leu Thr Gly Gly Gly Asp Asn Thr Ala Tyr Leu Trp Thr Thr His85 90 95acc caa cca cca aga ttt gtc ggc gaa atc act gga cat aaa gag tct 336Thr Gln Pro Pro Arg Phe Val Gly Glu Ile Thr Gly His Lys Glu Ser100 105 110gtt ata tct gga ggg ttt act gca gac ggc aag ttt gtt gtt act gca 384Val Ile Ser Gly Gly Phe Thr Ala Asp Gly Lys Phe Val Val Thr Ala115 120 125gac atg aat gga tta att caa gtt ttc aaa gcc aca aaa gga ggt gaa 432Asp Met Asn Gly Leu Ile Gln Val Phe Lys Ala Thr Lys Gly Gly Glu130 135 140cag tgg gtg aaa ttt ggt gaa ttg gac gaa gtt gaa gaa gtg ttg ttt 480Gln Trp Val Lys Phe Gly Glu Leu Asp Glu Val Glu Glu Val Leu Phe145 150 155 160gtt act gtg cat cca aca tta cca ttc ttt gcc ttt ggt gct acc gat 528Val Thr Val His Pro Thr Leu Pro Phe Phe Ala Phe Gly Ala Thr Asp165 170 175gga tct ata tgg gtc tac caa ata gac gaa tcc agt aaa ctg cta gtg 576Gly Ser Ile Trp Val Tyr Gln Ile Asp Glu Ser Ser Lys Leu Leu Val180 185 190caa att atg tct ggg ttc tca cac aca tta gaa tgt aat ggt gct gta 624Gln Ile Met Ser Gly Phe Ser His Thr Leu Glu Cys Asn Gly Ala Val195 200 205ttt ata caa gga aaa gat gaa aat gat ttg aca ttg gtc tct ata agt 672Phe Ile Gln Gly Lys Asp Glu Asn Asp Leu Thr Leu Val Ser Ile Ser210 215 220gaa gat ggt act gtg gtg aac tgg aac tgt ttt aca gga caa gtg aat 720Glu Asp Gly Thr Val Val Asn Trp Asn Cys Phe Thr Gly Gln Val Asn225 230 235 240tat aaa ttg caa cct cat gat gac ttt aaa gga gtt gaa agt ccg tgg 768Tyr Lys Leu Gln Pro His Asp Asp Phe Lys Gly Val Glu Ser Pro Trp245 250 255gtc acg gtc aaa gta cat ggt aat ctt gtg gcc att ggt ggc aga gat 816Val Thr Val Lys Val His Gly Asn Leu Val Ala Ile Gly Gly Arg Asp260 265 270ggc cag cta tca att gtg aac aat gac act ggt aaa atc gtt cat act864Gly Gln Leu Ser Ile Val Asn Asn Asp Thr Gly Lys Ile Val His Thr275 280 285ctt aaa aca ttg gat aat gtc gac gac att gca Gaa ctc tca att gag912Leu Lys Thr Leu Asp Asn Val Asp Asp Ile Ala Glu Leu Ser Ile Glu290 295 300gca ttg agt tgg tgt gaa agc aaa aat att aac ctc ttg gca gtg ggt960Ala Leu Ser Trp Cys Glu Ser Lys Asn Ile Asn Leu Leu Ala Val Gly305 310 315 320ttg gtt tct ggt gac gtt tta tta ttt gat act cag caa tgg aga ttg1008Leu Val Ser Gly Asp Val Leu Leu Phe Asp Thr Gln Gln Trp Arg Leu325 330 335aga aag aac ttg aaa gtt gac gat gcc atc acc aaa tta caa ttt gtt1056Arg Lys Asn Leu Lys Val Asp Asp Ala Ile Thr Lys Leu Gln Phe Val340 345 350ggc gaa acc ccc att ttg gtg gga agt agt atg gat ggt aaa att tac1104Gly Glu Thr Pro Ile Leu Val Gly Ser Ser Met Asp Gly Lys Ile Tyr355 360 365aaa tgg gac gct aga act ggt gaa gag ttg ttt gct ggt gtg gga cac1152Lys Trp Asp AlaArg Thr Gly Glu Glu Leu Phe Ala Gly Val Gly His370375 380aac atg gga gta ttg gac ttt gct att tta gat gga ggt aaa aag ttg1200Asn Met Gly Val Leu Asp Phe Ala Ile Leu Asp Gly Gly Lys Lys Leu385 390 395 400gtt act gct ggt gat gaa ggt gtt tca ttg gtc ttt gta cat gaa tag1248Val Thr Ala Gly Asp Glu Gly Val Ser Leu Val Phe Val His Glu405 410 415<210>2<211>4l5<212>PRT<213>白色念珠菌<400>2Met Ser His Gln Gln Glu Asp Val Val Asp Asp Thr Gln Glu Glu Tyr1 5 10 15Ile 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Gly Gln Val Asn225 230 235 240Tyr Lys Leu Gln Pro His Asp Asp Phe Lys Gly Val Glu Ser Pro Trp245 250 255Val Thr Val Lys Val His Gly Asn Leu Val Ala Ile Gly Gly Arg Asp260 265 270Gly Gln Leu Ser Ile Val Asn Asn Asp Thr Gly Lys Ile Val His Thr275 280 285Leu Lys Thr Leu Asp Asn Val Asp Asp Ile Ala Glu Leu Ser Ile Glu290 295 300Ala Leu Ser Trp Cys Glu Ser Lys Asn Ile Asn Leu Leu Ala Val Gly305 310 315 320Leu Val Ser Gly Asp Val Leu Leu Phe Asp Thr Gln Gln Trp Arg Leu325 330 335Arg Lys Asn Leu Lys Val Asp Asp Ala Ile Thr Lys Leu Gln Phe Val340 345 350Gly Glu Thr Pro Ile Leu Val Gly Ser Ser Met Asp Gly Lys Ile Tyr355 360 365Lys Trp Asp Ala Arg Thr Gly Glu Glu Leu Phe Ala Gly Val Gly His370 375 380Asn Met Gly Val Leu Asp Phe Ala Ile Leu Asp Gly Gly Lys Lys Leu385 390 395 400Val Thr Ala Gly Asp Glu Gly Val Ser Leu Val Phe Val His Glu405 410 415序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID07<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5544<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(5541)<220><221>基因<222>(1)..(5541)<223>基因CaJLO39<400>1atg agt ggc ata ttt aat tgg tcg ctg gat gtg ttt gcc gat att tat 48Met Ser Gly Ile Phe Asn Trp Ser Leu Asp Val Phe Ala Asp Ile Tyr1 5 10 15aac acc ctc aag ttt gag tcc aat ata gat ttg gat aca atc gac ttc 96Asn Thr Leu Lys Phe Glu Ser Asn Ile Asp Leu Asp Thr Ile Asp Phe20 25 30acc agc atc aag aat gat ctt gca aat gtt ttg att aca cca gtc cct 144Thr Ser Ile Lys Asn Asp Leu Ala Asn Val Leu Ile Thr Pro Val Pro35 40 45ctg gat caa tca cgt agc aaa ctt gga gac gca tca aaa cca gtg gcg 192Leu Asp Gln Ser Arg Ser Lys Leu Gly Asp Ala Ser Lys Pro Val Ala50 55 60ttg ccc agt gga gat gag gtg aaa ttg aat caa gca tca att gaa att 240Leu Pro Ser Gly Asp Glu Val Lys Leu Asn Gln Ala Ser Ile Glu Ile65 70 75 80act gga gtt tta tca aat gaa ttg gat tta gat gaa cta aat aca gca 288Thr Gly Val Leu Ser Asn Glu Leu Asp Leu Asp Glu Leu Asn Thr Ala85 90 95gag ttg tta tat aac gca agt gac ttg agc tac aag aag 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Lys155515601565Cys Phe Glu Arg Glu Ser Phe Leu Lys Gln Val Met His Ile Ile Lys157015751580Ser Val Asp Lys Lys Phe Phe Gln Val Ile Cys Asn Asp Ala Ile Tyr565159015951600Ser Glu Gly Pro Ser Arg Ile Thr Ser Thr Leu Phe Leu Glu Ser Leu160516101615Val His Leu Gly Thr Leu Val Lys Val Asp Phe Ile Leu Asn Ala Leu162016251630Ile Lys Asn Asn Ala Leu Leu Leu Leu Val Arg Ser Val Lys Arg Thr163516401645Asp Ala Met Ile Lys Leu Cys Gln Glu Lys Asn Ser Gly Val Thr Leu165016551660Asp His Phe Ile Phe Asp Leu Met Ala Phe Lys Ala Thr Leu Tyr Phe665167016751680Phe Val Arg Val Ala Lys Ser Lys Asn Gly Ala Leu Gln Leu Ile Gln168516901695Asn Glu Leu Phe Ser Ile Leu His Gln Ser Lys Phe Leu Gln Ile Asp170017051710Pro Asp Ile Gly Leu Ser Leu Arg Ile Glu Glu Val Gln Asp His Lys171517201725Thr Val Asn Val Asn Val Leu Leu Asp Thr Pro Leu Ser Ile Thr Asp173017351740Leu Val Asp Pro Tyr Lya Leu Arg Ser Glu Asn Thr Ile Ser Tyr Phe745175017551760Glu phe Leu Val Pro Ile Phe Gln Leu Leu Thr Thr Val Leu Leu Ser176517701775Met Gly Pro Asn Tyr Gln Pro Ala Ile Ile Gln Thr Arg Glu Leu Met178017851790Lys Ser Val Asn Arg Leu Val Val Gly Val Met Lys Arg Asp Phe Leu179518001805Val Glu Thr Lys Gln Ile Gly Gln Gly Leu Tyr Lys Glu Glu Ser His181018151820Glu Leu Val Ser Leu Lys Glu Leu Val Lys Leu Phe Ile Leu Ile Asp825183018351840Ser Leu Ala His Tyr Ser Val1845序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID08<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<2l0>1<211>575<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YJL039c的同源片段<400>1gtttggtgac tcaacctacc accaatcgat ttacactctt cataagttct ctagtttgaa 60taattgcagg ttgataattt ggtcccattg acaataacac tgttgtaagt agctgaaata 120ttggtacaag gaactcaaaa tatgatatag tgttttcact tcgcaacttg tatggatcca 180ccaagtcagt tatcgaaagt ggagtatcta gcaaaacatt tacattgaca gtcttgtgat 240cttgaacttc ttcaattcgt aaacttaaac caatatctgg atcaatctgc aaaaacttcg 300actgatgcaa aattgaaaac aattcatttt ggaatcannn nnanaantna aaaaaaatat 360atattntntt tttttttttt ttntttnttt tttattttat cttacannac accccaacac 420aacacccaac ccnaaaacac ccaacacctc catcttgtcc cgcttttctc tcacattttt 480tctctactac tatcacacaa tctataaaac atacaccccc tcaacccctc ctccccaaca 540aacctacctc cctcaactcc tatttcctcc cttcc575序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID09<140><141><160>2<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>921<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(918)<220><221>基因<222>(1)..(918)<223>基因CaOR110<400>1atg acg att gaa act att tat atc gca aga cac ggt tat aga tcc aat 48Met Thr Ile Glu Thr Ile Tyr Ile Ala Arg His Gly Tyr Arg Ser Asn1 5 10 15tgg tta cca cca cca cac cca cca aat cct act ggt att gac agt gac 96Trp Leu Pro Pro Pro His Pro Pro Asn Pro Thr Gly Ile Asp Ser Asp20 25 30ccg gct tta gca cca cat ggt gtt gaa caa gcc caa cag tta gct gcc 144Pro Ala Leu Ala Pro His Gly Val Glu Gln Ala Gln Gln Leu Ala Ala35 40 45tat ctt aca tca ttacct aca cat gaa aag cct gaa ttt att att gct192Tyr Leu Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Lys Pro Glu Phe Ile Ile Ala50 55 60tca cct ttt tat cgt tgt ata gaa acg tcg aga ccc att gcc gaa atg 240Ser Pro Phe Tyr Arg Cys Ile Glu Thr Ser Arg Pro Ile Ala Glu Met65 70 75 80ttg gac ttg aag att gct tta gaa aga gga gtt ggt gaa tgg ttt cgt288Leu Asp Leu Lys Ile Ala Leu Glu Arg Gly Val Gly Glu Trp Phe Arg85 90 95aaa aat aga gat acc aaa cca gtt ccc ggt gat tac aca caa ttg aga336Lys Asn Arg Asp Thr Lys Pro Val Pro Gly Asp Tyr Thr Gln Leu Arg100 105 110aca ttt ttc gat aaa tta ttg atc gat gaa gat act tgg cca aga gat384Thr Phe Phe Asp Lys Leu Leu Ile Asp Glu Asp Thr Trp Pro Arg Asp115 120 125aac tta aat gtt ata cct aat att gaa gga gaa gat tat gat gaa atc432Asn Leu Asn Val Ile Pro Asn Ile Glu Gly Glu Asp Tyr Asp Glu Ile130 135 140tac gat cgt gcc aaa ttg ttt tgg aaa aag ttt att cct gaa ttt gaa480Tyr Asp Arg Ala Lys Leu Phe Trp Lys Lys Phe Ile Pro Glu Phe Glu145 150 155 160aag aaa ttc ccc gaa att aaa aat gtg ttg ata gtt aca cat gca gca528Lys Lys Phe Pro Glu Ile Lys Asn Val Leu Ile Val Thr His Ala Ala165 170 175acg aaa att gct tta gga tca gct tta tta cag tta aaa tca gtt act576Thr Lys Ile Ala Leu Gly Ser Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Val Thr180 185 190gat gtt ata gat gat aat caa act gtg tta cgt gct ggt gca tgt tea624Asp Val Ile Asp Asp Asn Gln Thr Val Leu Arg Ala Gly Ala Cys Ser195 200 205tta tcc aaa ttt gtt aga gat ggc gaa gat aaa acc aat cat act att672Leu Ser Lys Phe Val Arg Asp Gly Glu Asp Lys Thr Asn His Thr Ile210 215 220caa tgg aaa att gtc atg aat ggt aat tgt gaa ttc ttg aca cag ggt720Gln Trp Lys Ile Val Met Asn Gly Asn Cys Glu Phe Leu Thr Gln Gly225 230 235 240gaa gaa atg aac tgg gat ttc cgt cgt ggt gtt gaa gcc ggg tca get768Glu Glu Met Asn Trp Asp Phe Arg Arg Gly Val Glu Ala Gly Ser Ala245 250 255gaa gat ata gcg caa aga aag gca gca gca gaa gca gaa gca aaa gca816Glu Asp Ile Ala Gln Arg Lys Ala Ala Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala260 265 270ttg aag aaa aat gaa caa acc aaa tcc gat ggt ccc atc act gaa tct864Leu Lys Lys Asn Glu Gln Thr Lys Ser Asp Gly Pro Ile Thr Glu Ser275 280 285gcc act ggg gca gaa ata gat ggg aat gaa gat gaa ttt gaa gta cgt912Ala Thr Gly Ala Glu Ile Asp Gly Asn Glu Asp Glu Phe Glu Val Arg290 295 300aaa act tga921Lys Thr305<210>2<211>306<212>PRT<213>白色念珠菌<400>2Met Thr Ile Glu Thr Ile Tyr Ile Ala Arg His Gly Tyr Arg Ser Asn1 5 10 15Trp Leu Pro Pro Pro His Pro Pro Asn Pro Thr Gly Ile Asp Ser Asp20 25 30Pro Ala Leu Ala Pro His Gly Val Glu Gln Ala Gln Gln Leu Ala Ala35 40 45Tyr Leu Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Lys Pro Glu Phe Ile Ile Ala50 55 60Ser Pro Phe Tyr Arg Cys Ile Glu Thr Ser Arg Pro Ile Ala Glu Met65 70 75 80Leu Asp Leu Lys Ile Ala Leu Glu Arg Gly Val Gly Glu Trp Phe Arg85 90 95Lys Asn Arg Asp Thr Lys Pro Val Pro Gly Asp Tyr Thr Gln Leu Arg100 105 110Thr Phe Phe Asp Lys Leu Leu Ile Asp Glu Asp Thr Trp Pro Arg Asp115 120 125Asn Leu Asn Val Ile Pro Asn Ile Glu Gly Glu Asp Tyr Asp Glu Ile130 135 140Tyr Asp Arg Ala Lys Leu Phe Trp Lys Lys Phe Ile Pro Glu Phe Glu145 150 155 160Lys Lys Phe Pro Glu Ile Lys Asn Val Leu Ile Val Thr His Ala Ala165 170 175Thr Lys Ile Ala Leu Gly Ser Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Val Thr180 185 190Asp Val Ile Asp Asp Asn Gln Thr Val Leu Arg Ala Gly Ala Cys Ser195 200 205Leu Ser Lys Phe Val Arg Asp Gly Glu Asp Lys Thr Asn His Thr Ile210 215 220Gln Trp Lys Ile Val Met Asn Gly Asn Cys Glu Phe Leu Thr Gln Gly225 230 235 240Glu Glu Met Asn Trp Asp Phe Arg Arg Gly Val Glu Ala Gly Ser Ala245 250 255Glu Asp Ile Ala Gln Arg Lys Ala Ala Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala260 265 270Leu Lys Lys Asn Glu Gln Thr Lys Ser Asp Gly Pro Ile Thr Glu Ser275 280 285Ala Thr Gly Ala Glu Ile Asp Gly Asn Glu Asp Glu Phe Glu Val Arg290 295 300Lys Thr305序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID10<140><141><160>2<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>1454<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(1452)<223>基因CaOR110前切變體<220><223>人工序列描述前切變體<400>1atg acg att gaa act att tat atc gca aga cac ggt tat aga tcc aat 48Met Thr Ile Glu Thr Ile Tyr Ile Ala Arg His Gly Tyr Arg Ser Asn1 5 10 15tgg tta cca cca cca cac cca cca aat cct act ggt att gac agt gac 96Trp Leu Pro Pro Pro His Pro Pro Asn Pro Thr Gly Ile Asp Ser Asp20 25 30ccg gct tta gca cca cat ggt gtt gaa caa gcc caa cag tta gct gcc 144Pro Ala Leu Ala Pro His Gly Val Glu Gln Ala Gln Gln Leu Ala Ala35 40 45tat ctt aca tca tta cct aca cat gaa aag cct gaa ttt att att gct 192Tyr Leu Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Lys Pro Glu Phe Ile Ile Ala50 55 60tca cct ttt tat cgt tgt ata gaa acg tcg aga ccc att gcc gaa atg 240Ser Pro Phe Tyr Arg Cys Ile Glu Thr Ser Arg Pro Ile Ala Glu Met65 70 75 80ttg gac ttg aag att gct tta gaa aga gga gtt ggt gaa tgg ttt cgt 288Leu Asp Leu Lys Ile Ala Leu Glu Arg Gly Val Gly Glu Trp Phe Arg85 90 95aaa aat aga gat acc aaa cca gtt ccc ggt gat tac aca caa ttg aga 336Lys Asn Arg Asp Thr Lys Pro Val Pro Gly Asp Tyr Thr Gln Leu Arg100 105 110aca ttt ttc gat aaa tta ttg atc gat gaa gat act tgg cca aga gat 384Thr Phe Phe Asp Lys Leu Leu Ile Asp Glu Asp Thr Trp Pro Arg Asp115 120 125aac tta aat gtt ata cct aat att gaa gga gaa gat tat gat gaa atc 432Asn Leu Asn Val Ile Pro Asn Ile Glu Gly Glu Asp Tyr Asp Glu Ile130 135 140tac gat cgt gcc aaa ttg ttt tgg aaa aag ttt att cct gaa ttt gaa 480Tyr Asp Arg Ala Lys Leu Phe Trp Lys Lys Phe Ile Pro Glu Phe Glu145 150 155 160aag aaa ttc ccc gaa att aaa aat gtg ttg ara gtt aca cat gca gca 528Lys Lys Phe Pro Glu Ile Lys Asn Val Leu Ile Val Thr His Ala Ala165 170 175acg aaa att gct tta gga tca gct tta tta cag tta aaa tca gtt act 576Thr Lys Ile Ala Leu Gly Ser Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Val Thr180 185 190gat gtt ata gat gat aat caa act gtg tta cgt gct ggt gca tgt tca 624Asp Val Ile Asp Asp Asn Gln Thr Val Leu Arg Ala Gly Ala Cys Ser195 200 205tta tcc aaa ttt gtt aga gat ggc gaa gat aaa acc aat cat act att 672Leu Ser Lys Phe Val Arg Asp Gly Glu Asp Lys Thr Asn His Thr Ile210 215 220caa tgg aaa att gtc atg aat ggt aat tgt gaa ttc ttg aca cag ggt 720Gln Trp Lys Ile Val Met Asn Gly Asn Cys Glu Phe Leu Thr Gln Gly225 230 235 240gaa gaa atg aac tgg gat ttc cgt cgt ggt gtt gaa gcc ggg tca gct 768Glu Glu Met Asn Trp Asp Phe Arg Arg Gly Val Glu Ala Gly Ser Ala245 250 255gaa gat ata gcg caa aga aag gca gca gca gaa gca gaa gca aaa gca 816Glu Asp Ile Ala Gln Arg Lys Ala Ala Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala
260 265 270ttg aag aaa aat gaa caa acc aaa tcc gat ggt ccc atc act gaa tct864Leu Lys Lys Asn Glu Gln Thr Lys Ser Asp Gly Pro Ile Thr Glu Ser275 280 285gcc act ggg gca gaa ata gat ggg aat gaa gat gaa ttt gaa aca ttt912Ala Thr Gly Ala Glu Ile Asp Gly Asn Glu Asp Glu Phe Glu Thr Phe290 295 300tat gta acc atc gat ata cct tca att tcg aat aaa atc gac aat gaa960Tyr Val Thr Ile Asp Ile Pro Ser Ile Ser Asn Lys Ile Asp Asn Glu305 310 315 320gaa gaa cca cca tca agg aca ggt caa gct cca aaa ttc aaa aac aat1008Glu Glu Pro Pro Ser Arg Thr Gly Gln Ala Pro Lys Phe Lys Asn Asn325 330 335att atc aag cct tca gca caa ctc caa ttt act gat tta aaa gaa gat1056Ile Ile Lys Pro Ser Ala Gln Leu Gln Phe Thr Asp Leu Lys Glu Asp340 345 350cat cca tta gta aaa ata tcg aac aat act ata tct gct caa ggc tcg1104His Pro Leu Val Lys Ile Ser Asn Asn Thr Ile Ser Ala Gln Gly Ser355 360 365tcg tcg tcg tcg tta tca gcg tcg aaa aat gga ttt aat agt cat act1152Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Lys Asn Gly Phe Asn Ser His Thr370 375 380cac aat tca gga gtc att gat cca tca gca ctt ata gat ggg aaa att1200His Asn Ser Gly Val Ile Asp Pro Ser Ala Leu Ile Asp Gly Lys Ile385 390 395 400tat cag act gat tgg aat caa tta caa ggt act gaa cta ata ttt gat1248Tyr Gln Thr Asp Trp Asn Gln Leu Gln Gly Thr Glu Leu Ile Phe Asp405 410 415gaa aat ggt caa ttt ata ggc aag gtt aag gaa cat ttg act tgc aat1296Glu Asn Gly Gln Phe Ile Gly Lys Val Lys Glu His Leu Thr Cys Asn420 425 430aat aac aca aaa ttc aca tta aaa aag gca gaa gaa gta gaa caa ctt1344Asn Asn Thr Lys Phe Thr Leu Lya Lys Ala Glu Glu Val Glu Gln Leu435 440 445cgt tca gca gat gat tct atc atg gat ata gat caa gac tca caa gga1392Arg Ser Ala Asp Asp Ser Ile Met Asp Ile Asp Gln Asp Ser Gln Gly
450 455 460caa caa cca gct aga agt cag ttc tta aaa aga gca att gtg gct gct 1440Gln Gln Pro Ala Arg Ser Gln Phe Leu Lys Arg Ala Ile Val Ala Ala465 470 475 480aga gcc aaa ggt aa1454Arg Ala Lys Gly<210>2<211>484<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述前切變體<400>2Met Thr Ile Glu Thr Ile Tyr Ile Ala Arg His Gly Tyr Arg Ser Asn1 5 10 15Trp Leu Pro Pro Pro His Pro Pro Asn Pro Thr Gly Ile Asp Ser Asp20 25 30Pro Ala Leu Ala Pro His Gly Val Glu Gln Ala Gln Gln Leu Ala Ala35 40 45Tyr Leu Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Lys Pro Glu Phe Ile Ile Ala50 55 60Ser Pro Phe Tyr Arg Cys Ile Glu Thr Ser Arg Pro Ile Ala Glu Met65 70 75 80Leu Asp Leu Lys Ile Ala Leu Glu Arg Gly Val Gly Glu Trp Phe Arg85 90 95Lys Asn Arg Asp Thr Lys Pro Val Pro Gly Asp Tyr Thr Gln Leu Arg100 105 110Thr Phe Phe Asp Lys Leu Leu Ile Asp Glu Asp Thr Trp Pro Arg Asp115 120 125Asn Leu Asn Val Ile Pro Asn Ile Glu Gly Glu Asp Tyr Asp Glu Ile130 135 140Tyr Asp Arg Ala Lys Leu Phe Trp Lys Lys Phe Ile Pro Glu Phe Glu145 150 155 160Lys Lys Phe Pro Glu Ile Lys Asn Val Leu Ile Val Thr His Ala Ala
165 170 175Thr Lys Ile Ala Leu Gly Ser Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Val Thr180 185 190Asp Val Ile Asp Asp Asn Gln Thr Val Leu Arg Ala Gly Ala Cys Ser195 200 205Leu Ser Lys Phe Val Arg Asp Gly Glu Asp Lys Thr Asn His Thr Ile210 215 220Gln Trp Lys Ile Val Met Asn Gly Asn Cys Glu Phe Leu Thr Gln Gly225 230 235 240Glu Glu Met Asn Trp Asp Phe Arg Arg Gly Val Glu Ala Gly Ser Ala245 250 255Glu Asp Ile Ala Gln Arg Lys Ala Ala Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala260 265 270Leu Lys Lys Asn Glu Gln Thr Lys Ser Asp Gly Pro Ile Thr Glu Ser275 280 285Ala Thr Gly Ala Glu Ile Asp Gly Asn Glu Asp Glu Phe Glu Thr Phe290 295 300Tyr Val Thr Ile Asp Ile Pro Ser Ile Ser Asn Lys Ile Asp Asn Glu305 310 315 320Glu Glu Pro Pro Ser Arg Thr Gly Gln Ala Pro Lys Phe Lys Asn Asn325 330 335Ile Ile Lys Pro Ser Ala Gln Leu Gln Phe Thr Asp Leu Lys Glu Asp340 345 350His Pro Leu Val Lys Ile Ser Asn Asn Thr Ile Ser Ala Gln Gly Ser355 360 365Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Lys Asn Gly Phe Asn Ser His Thr370 375 380His Asn Ser Gly Val Ile Asp Pro Ser Ala Leu Ile Asp Gly Lys Ile385 390 395 400Tyr Gln Thr Asp Trp Asn Gln Leu Gln Gly Thr Glu Leu Ile Phe Asp405 410 415Glu Asn Gly Gln Phe Ile Gly Lys Val Lys Glu His Leu Thr Cys Asn
420 425 430Asn Asn Thr Lys Phe Thr Leu Lys Lys Ala Glu Glu Val Glu Gln Leu435 440 445Arg Ser Ala Asp Asp Sar Ile Met Asp Ile Asp Gln Asp Ser Gln Gly450 455 460Gln Gln Pro Ala Arg Ser Gln Phe Leu Lys Arg Ala Ile Val Ala Ala465 470 475 480Arg Ala Lys Gly序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID11<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2877<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(2874)<220><221>基因<222>(1)..(2874)<223>基因caMR212<400>1atg aat ttg ttt caa cat aaa cat caa aaa tta ata tta caa tgt tat 48Met Asn Leu Phe Gln His Lye His Gln Lys Leu Ile Leu Gln Cys Tyr1 5 10 15cct gct ggg aaa gca gtg gac aaa aaa ccc aac tcg tcc gag tta agt 96Pro Ala Gly Lys Ala Val Asp Lys Lys Pro Asn Ser Ser Glu Leu Ser20 25 30tat tta tta tac tat gca tcc act cgt aga gtc aaa tta gaa aag gtg 144Tyr Leu Leu Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Arg Val Lys Leu Glu Lys Val35 40 45att aat ttt ttg aaa gat aaa act cat cat gat gtt ggt aga aac cgt 192Ile Asn Phe Leu Lys Asp Lys Thr His His Asp Val Gly Arg Asn Arg50 55 60act ggt aat tta caa gtc aca tta gcc att att cag gaa tta atc aaa 240Thr Gly Asn Leu Gln Val Thr Leu Ala Ile Ile Gln Glu Leu Ile Lys65 70 75 80aaa tgt agt gaa aac ttg aat gtt ttt gcc ttt caa gtg tgc tat atc288Lys Cys Ser Glu Asn Leu Asn Val Phe Ala Phe Gln Val Cys Tyr Ile85 90 95ttg caa ctg att gcc aac act aag gat ctt gcc ttg tgt aaa aat gtt336Leu Gln Leu Ile Ala Asn Thr Lys Asp Leu Ala Leu Cys Lys Asn Val100 105 110gtc aaa aca ttt ggt gtt ttg tgt gaa aac ttg gat ggt ggg ttg ttc384Val Lys Thr Phe Gly Val Leu Cys Glu Asn Leu Asp Gly Gly Leu Phe115 120 125aca ggt gat aag gag ttt ata aag att ttc act gaa gtt ttc caa aca432Thr Gly Asp Lys Glu Phe Ile Lys Ile Phe Thr Glu Val Phe Gln Thr130 135 140tta gtt tcc ttt ggt aag gac aga tcg ggt gtt act cag tat gat tgg480Leu Val Ser Phe Gly Lys Asp Arg Ser Gly Val Thr Gln Tyr Asp Trp145 150 155 160cag atg att tct tta atg gct ata aat gat ata tcc agt tgt ttg agt528Gln Met Ile Ser Leu Met Ala Ile Asn Asp Ile Ser Ser Cys Leu 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285acc gat ttg gag tgg gga gtc tca ttc ttg gaa tta tgt att act tgg 912Thr Asp Leu Glu Trp Gly Val Ser Phe Leu Glu Leu Cys Ile Thr Trp290 295 300att cca gtt caa tta cgt ttt gtc agt ttg tcc acc ttg ttg gcc act 960Ile Pro Val Gln Leu Arg Phe Val Ser Leu Ser Thr Leu Leu Ala Thr305 310 315 320tta ggt aga att aat att gaa ggt aac acc aaa tcc aat tac aac atg 1008Leu Gly Arg Ile Asn Ile Glu Gly Asn Thr Lys Ser Asn Tyr Asn Met325 330 335caa ttc cag tat gct cgt tac ttg tta gga tta ctt tca tct cgt gtg 1056Gln Phe Gln Tyr Ala Arg Tyr Leu Leu Gly Leu Leu Ser Ser Arg Val340 345 350aac atg att ggg tta tca gtt tca gat att att caa cag ttg tta tcg 1104Asn Met Ile Gly Leu Ser Val Ser Asp Ile Ile Gln Gln Leu Leu Ser355 360 365ttg caa gct gat ttg att ttg aag gca agt gat ttg gac aaa agt gaa 1152Leu Gln Ala Asp Leu Ile Leu Lys Ala Ser Asp Leu Asp Lys Ser Glu370 375 380att tca att tta aca gac att tat tct gac tgt att tgt agt ttg act 1200Ile Ser Ile Leu Thr Asp Ile Tyr Ser Asp Cys Ile Cys Ser Leu Thr385 390 395 400aca cat ata tat tac ttt gat caa gtc ccg gac tcg att caa gaa atc 1248Thr His Ile Tyr Tyr Phe Asp Gln Val Pro Asp Ser Ile Gln Glu Ile405 410 415tta atc sag att gat tac att tta gas agc agt ttt gtg gaa gat aat 1296Leu Ile Lys Ile Asp Tyr Ile Leu Glu Ser Ser Phe Val Glu Asp Asn420 425 430aac att acg tcc act gga gaa caa att caa gat ttg att atc caa ttg 1344Asn Ile Thr Ser Thr Gly Glu Gln Ile Gln Asp Leu Ile Ile Gln Leu435 440 445ttg gat aac att tcg aag att ttt tta att ttg aag aat aaa tca agc 1392Leu Asp Asn Ile Ser Lys Ile Phe Leu Ile Leu Lys Asn Lys Ser Ser450 455 460tca att aat cgt aac cat gtg aat ttg gaa cat tgg gat atc agt tta 1440Ser Ile Asn Arg Asn His Val Asn Leu Glu His Trp Asp Ile Ser Leu465 470 475 480gga tta ttg gct cca caa ggc gac cat gat gat aac aga aaa atg att 1488Gly Leu Leu Ala Pro Gln Gly Asp His Asp Asp Asn Arg Lys Met Ile485 490 495att tct acg aca caa ctt atc aat atc caa gcc agg tac ttg aaa gtg 1536Ile Ser Thr Thr Gln Leu Ile Asn Ile Gln Ala Arg Tyr Leu Lys Val500 505 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735tgt ggt aac aac ttt ttg att gta tgg tta cat ccc caa aaa caa tta2256Cys Gly Asn Asn Phe Leu Ile Val Trp Leu His Pro Gln Lys Gln Leu740 745 750ctc act gaa att gaa aaa tca caa gtc agt act cat atg agc aca ttc2304Leu Thr Glu Ile Glu Lys Ser Gln Val Ser Thr His Met Ser Thr Phe755 760 765aat aat gat tct aga aac aca aat atg aca gtg ata atg gat caa gga2352Asn Asn Asp Ser Arg Asn Thr Asn Met Thr Val Ile Met Asp Gln Gly770 775 780tca ctg gca cta agt gga ggt gca gac cat gga ggt cac ttt gtt ccg2400Ser Leu Ala Leu Ser Gly Gly Ala Asp His Gly Gly His Phe Val Pro785 790 795 800cca cct gaa ttt gtt aac cac acc ggt ttg tct tct gaa tct gcg tca2448Pro Pro Glu Phe Val Asn His Thr Gly Leu Ser Ser Glu Ser Ala Ser805 810 815tca aac tca gag aaa ggt ttg tat act ggt tta gga ttg ggt act gct2496Ser Asn Ser Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Gly Leu Gly Leu Gly Thr Ala820 825 830ggt gat att act atg att cat tct gaa ata tta caa tac agt caa cat2544Gly Asp Ile Thr Met Ile His Ser Glu Ile Leu Gln Tyr Ser Gln His835 840 845ttc caa gaa aga ggt tta cct cat ggt aat ggg ttt gct act att tta 2592Phe Gln Glu Arg Gly Leu Pro His Gly Asn Gly Phe Ala Thr Ile Leu850 855 860cga act gtc gat agt gtt aac agt act aat gat ggg tta att tat act 2640Arg Thr Val Asp Ser Val Asn Ser Thr Asn Asp Gly Leu Ile Tyr Thr865 870 875 880tat gat agt aaa tat ttg cag tca cca aga gta agt gat ttg aaa gat 2688Tyr Asp Ser Lys Tyr Leu Gln Ser Pro Arg Val Ser Asp Leu Lys Asp885 890 895gcc atg tca aca cat agg ggt ata agg tta tct aaa cca aat ttt ggt 2736Ala Met Ser Thr His Arg Gly Ile Arg Leu Ser Lys Pro Asn Phe Gly900 905 910ggt gcc aat gga act gct aat atg acg gat tct gct tct aca tcc aat 2784Gly Ala Asn Gly Thr Ala Asn Met Thr Asp Ser Ala Ser Thr Ser Asn915 920 925gga tct gtg ttg aat aaa aat atg caa act aca gat gtt gat tca att 2832Gly Ser Val Leu Asn Lys Asn Met Gln Thr Thr Asp Val Asp Ser Ile930 935 940tta agt ggt ctt gaa agt gaa gac gaa gct gcg ttt gtt gtt taa 2877Leu Ser Gly Leu Glu Ser Glu Asp Glu Ala Ala Phe Val Val945 950 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565 570 575Ile Ser His Phe Leu Met Tyr Ile Asp Lys Phe Phe Glu Asn Tyr Asp580 585 590Ser Pro Asn Thr Gln Ser Val Leu Leu Leu Val Thr Val Leu Lys Asp595 600 605Met Met Asn Ile Leu Gly Leu Asn Phe Leu Ser Asn Phe Ile Pro Phe610 615 620Phe His His Trp Val Met Lys Val Asn Arg Ala Ser Asn Phe Thr Gln625 630 635 640Arg Gln Lys Phe Lys Asp Thr Phe Ala His Ile Ile Leu Tyr Tyr Met645 650 655Leu Lys Asp Leu Asp Glu Gln Tyr Ser His Asp Leu Gln Asn Tyr Cys660 665 670Lys Ser Ser Lys Leu Phe Lys Gln Ile Leu Asp Ala Val Glu Tyr Arg675 680 685Lys Met Gln Lys Phe Trp Val His Gly Ile Asp Pro Ser Pro Ser Asp690 695 700Leu Glu Asn Thr Lys Gly Asp Arg Thr Ile Pro Thr Asp Ala Asn Gly705 710 715 720Asn Tyr Ile Ala Ile Arg Ile Lys Pro Glu Asn Ile Glu Glu Phe Ala725 730 735Cys Gly Asn Asn Phe Leu Ile Val Trp Leu His Pro Gln Lys Gln Leu740 745 750Leu Thr Glu Ile Glu Lys Ser Gln Val Ser Thr His Met Ser Thr Phe755 760 765Asn Asn Asp Ser Arg Asn Thr Asn Met Thr Val Ile Met Asp Gln Gly770 775 780Ser Leu Ala Leu Ser Gly Gly Ala Asp His Gly Gly His Phe Val Pro785 790795 800Pro Pro Glu Phe Val Asn His Thr Gly Leu Ser Ser Glu Ser Ala Ser805 810 815Ser Asn Ser Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Gly Leu Gly Leu Gly Thr Ala
820 825 830Gly Asp Ile Thr Met Ile His Ser Glu Ile Leu Gln Tyr Ser Gln His835 840 845Phe Gln Glu Arg Gly Leu Pro His Gly Asn Gly Phe Ala Thr Ile Leu850 855 860Arg Thr Val Asp Ser Val Asn Ser Thr Asn Asp Gly Leu Ile Tyr Thr865 870 875 880Tyr Asp Ser Lys Tyr Leu Gln Ser Pro Arg Val Ser Asp Leu Lys Asp885 890 895Ala Met Ser Thr His Arg Gly Ile Arg Leu Ser Lys Pro Asn Phe Gly900 905 910Gly Ala Asn Gly Thr Ala Asn Met Thr Asp Ser Ala Ser Thr Ser Asn915 920 925Gly Ser Val Leu Asn Lys Asn Met Gln Thr Thr Asp Val Asp Ser Ile930 935 940Leu Ser Gly Leu Glu Ser Glu Asp Glu Ala Ala Phe Val Val945 950 955序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQIDl2<140><141><160>1<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>594<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YMR212c的同源片段<400>1atcacctgtg aacaacccac catccaagtt ttcacacaaa acaccaaatg ttttgacaac 60atttttacac aaggcaagat ccttagtgtt ggcaatcagt tgcaagatat agcacacttg 120aaaggcaaaa acattcaagt tttcactaca ttttttgatt aattcctgaa taatggctaa 180tgtgacttgt aaattaccag tacggtttct accaacatca tgatgagttt tatctttcaa 240aaaattaatc accttttcta atttgactct acgagtggat gcatagtata ataaataact 300taactcggac gagttgggtt ttttgtccac tgctttccca gcaggataac attgtaatat 360taacttttga tgtttatgtt gaaacaaatt cattcttgga tctggaagtt gaagaaacta 420ttgaatcaaa acaggattta attaaccaat agaaaagaag taactcttga gttaaaaagg 480atattcttga tgaaaaaaag gagaaaaaag gggaaagaag actctgaaaa tgaattaaag 540aaacaagaaa aaagtgatca aatgattgaa taaatgaaag taggtaaaaa atga 594序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID13<140>
<141>
<160>2<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>3771<212>DNA<213>白色念珠菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(3771)<220>
<221>基因<222>(1)..(3771)<223>基因CaDR325<400>1atg gat ata cca cca aaa cca act ctt aag gca att aag aaa ttt aga 48Met Asp Ile Pro Pro Lys Pro Thr Leu Lys Ala Ile Lys Lys Phe Arg1 5 10 15act ttg gat gaa ata aaa tat gcc atg aaa cat gtt ttc caa gat gct 96Thr Leu Asp Glu Ile Lys Tyr Ala Met Lys His Val Phe Gln Asp Ala20 25 30caa tta ggt tta gca gga cat aga aaa tta gtg gta att ttg aaa aat 144Gln Leu Gly Leu Ala Gly His Arg Lys Leu Val Val Ile Leu Lys Asn35 40 45gta ttt aaa aaa gcc att gaa tta aat caa att aat ttc ttt gcc atg 192Val Phe Lys Lys Ala Ile Glu Leu Asn Gln Ile Asn Phe Phe Ala Met50 55 60tgt ttt act aaa ttg tta tct aaa gta tta cct ttg aaa aga gga gtt 240Cys Phe Thr Lys Leu Leu Ser Lys Val Leu Pro Leu Lys Arg Gly Val65 70 75 80ttg gca ggt gat aga ata gtc aaa ttt tgt tat ctg ttt gtt aat ggt288Leu Ala Gly Asp Arg Ile Val Lys Phe Cys Tyr Leu Phe Val Asn Gly85 90 95ctt gta aaa gat gcc aat gaa gaa aaa cgt tcc aaa gaa gaa gaa aaa336Leu Val Lys Asp Ala Asn Glu Glu Lys Arg Ser Lys Glu Glu Glu 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220gaa ttt agt att gaa ggt gat act gga gaa ttt gag gat gaa tta ata720Glu Phe Ser Ile Glu Gly Asp Thr Gly Glu Phe Glu Asp Glu Leu Ile225 230 235 240tca agt aac caa att cag aat aaa ttg ata aat tcc att caa aat gat768Ser Ser Asn Gln Ile Gln Asn Lys Leu Ile Asn Ser Ile Gln Asn Asp245 250 255gat agt cca gaa gtc aga cgt gca gca tta atg aat ttg gtt aaa aca816Asp Ser Pro Glu Val Arg Arg Ala Ala Leu Met Asn Leu Val Lys Thr260 265 270caa gat aca ata ccg att tta ctt gaa cga gcc aga gat tcc aat tct864Gln Asp Thr Ile Pro Ile Leu Leu Glu Arg Ala Arg Asp Ser Asn Ser275 280 285att aat aga aga ttg gtt tat tct aaa ata gct cgt gaa tta ata act912Ile Asn Arg Arg Leu Val Tyr Ser Lys Ile Ala Arg Glu Leu Ile Thr290 295 300gat ttg gat gat ctt gaa ttt gaa gat agg gaa ttt tta tta aaa tgg960Asp Leu Asp Asp Leu Glu Phe Glu Asp Arg Glu Phe Leu Leu Lys Trp305 310 315 320ggg tta aat gat cgt gat gaa act gtt aaa gca gcc gcc act aaa atg1008Gly Leu Asn Asp Arg Asp Glu Thr Val Lys Ala Ala Ala Thr Lys Met325 330 335ctt acc att tat tgg tat caa tct gtc aat gaa gat tta tta gaa tta1056Leu Thr Ile Tyr Trp Tyr Gln Ser Val Asn Glu Asp Leu Leu Glu Leu340 345 350att gat caa tta aat gtc aag agt gct ata gct gaa cag gcc ata tta1104Ile Asp Gln Leu Asn Val Lys Ser Ala Ile Ala Glu Gln Ala Ile Leu355 360 365gca ttt ttt aaa aat aaa cca gaa gtt ctt gaa act att aaa att gat1152Ala Phe Phe Lys Asn Lys Pro Glu Val Leu Glu Thr Ile Lys Ile Asp370 375 380gaa tca tat tgg aaa aat cta act aca gaa aag gca ttc ttg atg agg1200Glu Ser Tyr Trp Lys Asn Leu Thr Thr Glu Lys Ala Phe Leu Met Arg385 390 395 400acg ttt tat caa tat tgt aat gag aat caa tta cat gct tta atg gat1248Thr Phe Tyr Gln Tyr Cys Asn Glu Asn Gln Leu His Ala Leu Met Asp405 410 415gcc aat ttc cct gaa tta ctt gat ttg tca ata aca tta gaa aag tat1296Ala Asn Phe Pro Glu Leu Leu Asp Leu Ser Ile Thr Leu Glu Lys Tyr420 425 430ttg tca gtg agg ttg aaa act ata aat gaa aat gaa aat tta gtt aag1344Leu Ser Val Arg Leu Lys Tht Ile Asn Glu Asn Glu Asn Leu Val Lys435 440 445aca tgg gaa act tat aat gcc aag att gac gaa tta gat gat caa ata1392Thr Trp Glu Thr Tyr Asn Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Asp Gln Ile450 455 460ttt agt ctt gaa aac cag att tcc aga ata aat act gat gcc gat aat 1440Phe Ser Leu Glu Asn Gln Ile Ser Arg Ile Asn Thr Asp Ala Asp Asn465 470 475 480ttc cgt aaa agt tta tct aac att gaa gaa gat att att gaa atc aat 1488Phe Arg Lys Ser Leu Ser Asn Ile Glu Glu Asp Ile Ile Glu Ile Asn485 490 495att gct aag gat ttg ttc aaa aag aga att aaa caa ttg aaa aac aac 1536Ile Ala Lys Asp Leu Phe Lys Lys Arg Ile Lys Gln Leu Lys Asn Asn500 505 510agt ggg aat cta gaa gat ttg att act gaa gaa aat caa gag att gct 1584Ser Gly Asn Leu Glu Asp Leu Ile Thr Glu Glu Asn Gln Glu Ile Ala515 520 525gat caa atc aag gat ttc ctg atg gaa gat ttg caa caa caa ttg gaa 1632Asp Gln Ile Lys Asp Phe Leu Met Glu Asp Leu Gln Gln Gln Leu Glu530 535 540gat atc aat aaa aat ctt gat gaa att gaa cat cat cca gaa gat ata 1680Asp Ile Asn Lys Asn Leu Asp Glu Ile Glu His His Pro Glu Asp Ile545 550 555 560acg gct aaa tta gaa gaa ctt caa aca aaa tat gat tct tgt att agg 1728Thr Ala Lys Leu Glu Glu Leu Gln Thr Lys Tyr Asp Ser Cys Ile Arg565 570 575gcg ctt gaa acc act agt gaa ttg aaa att cag act gtt caa atc ttt 1776Ala Leu Glu Thr Thr Ser Glu Leu Lys Ile Gln Thr Val Gln Ile Phe580 585 590gaa caa gaa cat gaa aat gat tgt atc ccc ttt gta gat gct ttg aaa 1824Glu Gln Glu His Glu Asn Asp Cys Ile Pro Phe Val Asp Ala Leu Lys595 600 605gaa tta gaa ttc att att aat caa tta tta tta att gtt aaa gat ttt 1872Glu Leu Glu Phe Ile Ile Asn Gln Leu Leu Leu Ile Val Lys Asp Phe610 615 620gat tat gga gat gaa atg gca aga aga aaa ttg tta cat ata ata aga 1920Asp Tyr Gly Asp Glu Met Ala Arg Arg Lye Leu Leu His Ile Ile Arg625 630 635 640atg aca tta act gaa gat aaa tta cct gat gcg tta ata tca gtg gca 1968Met Thr Leu Thr Glu Asp Lys Leu Pro Asp Ala Leu Ile Ser Val Ala645 650 655ctt aga gta tta cga gca ctt tct ata aat gaa aaa gat ttt gtt tcc 2016Leu Arg Val Leu Arg Ala Leu Ser Ile Asn Glu Lys Asp Phe Val Ser660 665 670atg gcg gta gaa ata att act gat att cgt gat tct cga gat gat gaa 2064Met Ala Val Glu Ile Ile Thr Asp Ile Arg Asp Ser Arg Asp Asp Glu675 680 685gag ttc cat tct gct gcc gct aca ttt gat gat gat gat gat gat att 2112Glu Phe His Ser Ala Ala Ala Thr Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ile690 695 700ttg gga aat ggt gat gat gaa tct caa caa tca tca tca ctc agt gca 2160Leu Gly Asn Gly Asp Asp Glu Ser Gln Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala705 710 715 720gta aca aag aag cga aga att gaa cca gat atg cca cca gat gat att 2208Val Thr Lys Lys Arg Arg Ile Glu Pro Asp Met Pro Pro Asp Asp Ile725 730 735gtg tta aga tgt ctt acc atg aca caa tat gta ttg gaa gta att act 2256Val Leu Arg Cys Leu Thr Met Thr Gln Tyr Val Leu Glu Val Ile Thr740 745 750cat agt ttg gat gat cat ctt tca ttg agt tct att tac agt ggt att 2304His Ser Leu Asp Asp His Leu Ser Leu Ser Ser Ile Tyr Ser Gly Ile755 760 765gtc aat tat gct att cag aat gaa tcg aaa aag aaa tta tat ctt gct 2352Val Asn Tyr Ala Ile Gln Asn Glu Ser Lys Lys Lys Leu Tyr Leu Ala770 775 780ggg tta act tgt 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800Arg Ile Ala Thr Thr Thr Leu Leu Leu Ala Met Arg Ser Asn Gly Glu805 810 815Glu Val Lys Glu Ile Gly Met Lys Ala Ile Val Asp Ile Leu Ala Ile820 825 830Tyr Gly Met Ser Ile Leu Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Lys Tyr Ser Arg835 840 845Met Phe Phe Lys Val Leu Asn Ser Phe Asp Ala Pro Lys Leu Gln Cys850 855 860Ile Val Ala Glu Gly Leu Cys Lys Leu Phe Leu Ala Asp Ile Leu Tyr865 870 875 880Lys Thr Asp Lys Arg Ser Leu Phe Gly Asn Ala Ile Gln Gly Gly Gly885 890 895Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asp Asp Pro Thr Thr Thr Asn Asp Asp Glu900 905 910Thr Glu Glu Glu Thr Asp Arg Glu His Glu Lya His Leu Phe Glu Ala915 920 925Ile Val Leu Ile Tyr Phe Asn Pro Asn Thr Lys Ser Asn Gln Glu Leu930 935 940Gln Gln Ile Leu Ser Phe Cys Ile Pro Val Tyr Ala Phe Ser His Ile945 950 955 960Asn His Gln Ile Asn Leu Ala Ala Val Ser Gly Asp Val Ile Tyr Arg965 970 975Leu Phe Thr Glu Thr Glu Thr Glu Leu Ser Pro Ser Val Ile Ile Pro980 985 990Gln Leu Ile Ser Trp Cys Asp Pro Arg Asn Leu Val Lys Leu Ser Asn99510001005Glu Glu Ile Asn Gln Ala Thr Ser His Leu Trp Gln Cys Val Tyr Leu1010 1015 1020Leu Gln Val Val Glu Gln Val Asp Ala Arg Asn Val Lys Arg Cys Ile025103010351040Ile Asn Asn Leu Asn Lys Phe His Ile Thr Glu Glu Leu Glu Ser Asn104510501055Gln Leu Gln Ala Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ala Thr Val Glu Leu Phe106010651070Thr Asn Asn Glu Asp Asn Pro Asn Phe Ile Leu Asp Lys Pro Thr Lys107510801085Lys Asn Phe Asp Thr Phe Ile Glu Ser Ile Lys Asn Lys Leu Glu Ile109010951100Ala Gln Lys Arg Glu Glu Asn Glu Leu Ile Lys Ser Gly Thr Asn Ser105111011151120Ile Leu His Glu Leu Asp Asp Leu Asp Ile Gly Thr Gly Glu Ser Ser112511301135Gln Ile Ser Ile Lys Ser Glu Thr Lys Arg Arg Asp Leu Asp Arg Ser114011451150Leu Gln Val Ser Lys Thr Thr Ser Pro Glu Thr Ser Glu Asn Glu Asp115511601165Glu Glu Asp Asp Asn Glu Glu Glu Glu Gln Glu Lys Lys Lys Ser Phe117011751180Thr Asp Gly Lys Asn Lys Leu Glu Leu Lys Ala Asp Lys Pro Ile Thr185119011951200Phe Lys Ala Glu Asp Lys Arg Glu Gly Ser Val Glu Thr Asp His Gly12 12101215Gln Glu Gln Val Leu Val Glu Ser Lys Lys Val Ile Asp Ser Asn Val122012251230Glu Asp Ser Leu Glu Asp Ile Asp Lys Phe Leu Glu Glu Ala Asp Asp123512401245Val Asp Tyr Gly Asp Ile Ser Met Asp12501255序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQIDl4<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>603<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YDR325的同源片段<400>1ctgtttgtta atggtcttgt aaaagatgcc aatgaagaaa aacgttccaa agaagaagaa 60aaagaagaga aagacaaaga caaagacaaa gatacgaatg aaagtgataa aaatgaagaa 120gatcaggaag atcaagaagg agaaggagat caagaaactc caatttcgga attcatatca 180tatttgataa aatatttatt gagtgggata gaggctaaag ataaactggt tcgttatcgt 240gttgtacaaa cattagcata cttggttgaa ttcttgaccg agatacacga gaataataca 300ttggaagcgt tatatacttt attaagtaat aggctacaag ataaagagct gtcgatacgt 360attcaagctg ttgtggcatt atcacatttt caattatttg aatttagtat tgaaggtgat 420actggagaat ttgaggatga attaatatca agtaaccaaa ttcagaataa attgataaat 480tccattcaaa atgatgatag tccagaagtc agacgtgcag cattaatgaa tttggttaaa 540acacaagata caataccgat tttacttgag cgagccagag attccaattc tattaataga 600aga 603序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID15<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>581<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YDR325的同源片段<400>1ggggttaaat gatcgtgatg aatctgttaa agcagccgcc tttaaaatgc taaccattta 60ttggtatcaa tctgtcaatg aagatttatt agaattaatt gatcaattaa atgtcagaag 120tgctatagct gaacaggcca tattagcatt ttttaaaaat aaaccagaag ttcttgcaac 180tattaaaatt gatgaatcat attggaaaaa tctaactaca gaaaaggcat tcttgatgag 240gacgttttat caatattgta atgagaatca attacatgct ttaatggatg ccaatttccc 300tgaattactt gatttgtcaa taacattaga aaagtatttg tcagtgaggt tgaaaacaat 360aaatgaaaat gaaaatttaa ttaagacatg ggaaacttat aatgccaaga ttgacgaatt 420agatgatcaa atatttagtc ttgaaaacca gatttccaga ataaatactg atgccgataa 480tttccgtaaa agtttatcta acattgaaga agatattatt gaaatcaata ttgctaagga 540tttgttcaaa aagagaatta aacaattgaa aaactgagca c 581序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID16<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>662<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YDR325的同源片段<400>1tggtgactca attcatttga tgcaccaaaa ttacaatgca ttgtcgctga gtagattatg 60caaattgttt ttagccgata ttttgtacaa gactgacaaa cggatttatt tggaaatgct 120attcaaggtg gtggtggtgg tgatgatcca actaccacca atgacgatga aactgaagaa 180gaaacagatc gagagcatga aaagcattta tttgaagcga ttgtacttat ttatttcaac 240cccaacacca aatcaaatca agaattacaa caaattttgt cattttgtat tccagtttat 300gccttttctc atataaatca tcaaatcaat ttagctgcag ttagtggtga tgttatttat 360cgacttttca ctgaaacaga aacagaatta tcaccaagtg ttataatccc tcaattaata 420tcatggtgtg atcctcgaaa tttagttaaa ttatcgaatg aggaaataaa tcaagcaaca 480tcacatttat ggcaatgtgt ttatttatta caagtggttg aacaagtaga tgctcgtaat 540gttaaaagat gcatcattaa caatttgaat aaatttcata taacggaaga attagaatca 600aatcaattac aagctttaat taaagctctt gatgctacag ttgaattatt tactaataat 660ga662序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用該基因篩選抗真菌物質(zhì)的方法<130>SEQID17<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>231<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YOR110的同源片段<400>1atatgtgttg atagttacac atgcagcaac gaaaattgct ttaggatcag ctttattaca 60gttaaaatca gttactgatg ttatagatga taatcaaact gtgttacgtg ctggtgcatg 120ttcattatcc aaatttgtta gagatggcga agataaaacc aatcatacta ttcaatggaa 180aattgtcatg aatggtaatt gtgaattctt gacacagggt gaagaaatga a 23權(quán)利要求
1.具有在SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.13所示序列的多核苷酸，其同系物及其功能片段。
2.如權(quán)利要求1所述的只有SEQ ID NO2.，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10或者SEQ ID NO.11所述序列的多核苷酸，其同系物及其功能片段。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaNL256，其同系物及其功能片段。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaBR102，其同系物及其功能片段。
5.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaIR012，其同系物及其功能片段。
6.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaMR212，其同系物及其功能片段。
7.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaDR325，其同系物及其功能片段。
8.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaOR110，其同系物及其功能片段。
9.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaJL039，其同系物及其功能片段。
10.如權(quán)利要求3到9中任一權(quán)利要求所述的基因，其中的功能相似基因，在核苷酸水平上，有至少50％的序列同一性，優(yōu)選有至少60％的序列同一性，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
11.如權(quán)利要求3到9中任一權(quán)利要求所述的基因，其中，功能相似基因，在氨基酸水平上，與編碼蛋白質(zhì)要有至少40％的序列同一性，優(yōu)選有至少50％的序列同一性，更優(yōu)選有至少60％的序列同一性，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
12.如權(quán)利要求1到11中任一權(quán)利要求所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其功能性多肽片段。
13.含有如權(quán)利要求3到9中任一權(quán)利要求所述的基因的質(zhì)粒。
14.保藏在CNCM中編號(hào)為I-2065的質(zhì)粒。
15.保藏在CNCM中編號(hào)為I-2063的質(zhì)粒。
16.保藏在DSMZ中編號(hào)為DSM12977的質(zhì)粒。
17.保藏在DSMZ中編號(hào)為DSM12976的質(zhì)粒。
18.保藏在DSMZ中編號(hào)為DSM12978的質(zhì)粒。
19.保藏在DSMZ中編號(hào)為DSM12979的質(zhì)粒。
20.可用包括以下步驟的方法得到的多核苷酸，其同系物及其功能片段(i)從釀酒酵母中挑選一個(gè)必需基因；(ii)比較該基因序列與白色念珠菌基因組序列；(iii)推斷同源寡核苷酸區(qū)域；(iv)PCR擴(kuò)增這樣得到的寡核苷酸；(v)使用步驟(iv)的擴(kuò)增引物檢測(cè)感興趣的完整基因。
21.如權(quán)利要求20所述的多核苷酸，其中步驟(v)包括使用步驟(iv)的擴(kuò)增引物作為探針，從白色念珠菌基因組文庫(kù)中檢測(cè)感興趣的完整基因的步驟。
22.如權(quán)利要求20所述的多核苷酸，其中步驟(v)包括使用步驟(iv)的擴(kuò)增引物作為探針，從白色念珠菌cDNA文庫(kù)中檢測(cè)感興趣的完整基因的步驟。
23.如權(quán)利要求20所述的多核苷酸，其中步驟(v)包括使用PCR方法延伸擴(kuò)增引物的3’和5’端的步驟。
24.一種抗如權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)或其功能多肽片段的抗體。
25.一種篩選抗真菌物質(zhì)的方法，其中真菌中的一種必需基因或者其它真菌中的功能相似基因或者相應(yīng)的編碼蛋白質(zhì)，被用作靶，其中的必需基因如權(quán)利要求3到9中任一權(quán)利要求所述。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中將以不同水平表達(dá)必需基因或者功能類似真菌基因的真菌細(xì)胞，與被測(cè)試物質(zhì)一起保溫，并且測(cè)定該物質(zhì)的生長(zhǎng)抑制效果。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中將所說(shuō)的靶基因或者相應(yīng)靶所編碼的蛋白質(zhì)，與被測(cè)試物質(zhì)在體外接觸，并且測(cè)定該物質(zhì)對(duì)于靶的作用。
28.如權(quán)利要求25到27中任一權(quán)利要求所述的方法，其中被篩選物質(zhì)部分或全部抑制必需基因的功能表達(dá)，或者部分或全部抑制所編碼蛋白質(zhì)的功能活性。
29.如權(quán)利要求25到28中任一權(quán)利要求所述的方法，其中被篩選物質(zhì)部分或全部抑制二氫蝶酸合酶(DHPS)和/或7，8-二氫-6-羥甲基蝶呤-焦磷酸激酶(HPPK)的活性。
30.如權(quán)利要求25到29中任一權(quán)利要求所述的方法，其中真菌選自擔(dān)子菌屬(Basidiomycetes)，子囊菌屬(Ascomycetes)和絲孢菌屬(Hyphomycetes)。
31.如權(quán)利要求25到30中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所說(shuō)的功能相似基因是念珠菌屬的種(Candida Spp.)或者曲霉屬的種(Aspergillus Spp.)的必需基因。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所說(shuō)的功能相似基因是白色念珠菌(candida albicans)或者煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的必需基因。
33.如權(quán)利要求25到32中任一權(quán)利要求所述的方法，其中的功能相似基因與相應(yīng)必需基因，在核苷酸水平上，有至少50％的序列同一性，優(yōu)選有至少60％的序列同一性，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
34.如權(quán)利要求25到33中任一權(quán)利要求所述的方法，其中的功能相似基因編碼的蛋白質(zhì)與相應(yīng)必需基因編碼的蛋白質(zhì)，在氨基酸水平上，要有至少40％的序列同一性，優(yōu)選有至少50％的序列同一性，更優(yōu)選有至少60％的序列同一性，最優(yōu)選有至少70％的序列同一性。
35.一種診斷真菌感染的試劑盒，其中包括選自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039，其功能相似基因，其功能片段的基因，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)或其功能多肽片段，或者一種抗體，該抗體抗選自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039或其功能相似基因編碼的蛋白質(zhì)或其多肽片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及白色念珠菌(C.A1bicans)中的必需基因及用該基因在篩選抗真菌物質(zhì)的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/37GK1331753SQ99813209
公開(kāi)日2002年1月16日 申請(qǐng)日期1999年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月11日
發(fā)明者J·－L·拉蘭尼, C·羅徹爾, N·查爾瓦茨斯, T·萊烏, D·馬格里, A·尼特舍, J·雷恩哈德－魯普 申請(qǐng)人:艾文蒂斯藥品公司