專(zhuān)利名稱(chēng)：脫髓鞘病或海綿狀病的診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物和人脫髓鞘疾病和海綿狀腦病的診斷，尤其涉及人BSE以及類(lèi)似或相關(guān)疾病的診斷。
在我們共同申請(qǐng)待審的國(guó)際申請(qǐng)WO97/02667中，我們公開(kāi)了一種新的哺乳動(dòng)物海綿狀腦病和其它脫髓鞘病癥的診斷實(shí)驗(yàn)。公開(kāi)于我們?cè)谙壬暾?qǐng)中的上述實(shí)驗(yàn)基于一種適用于在人和其他動(dòng)物中出現(xiàn)的多種形式的病理狀況的發(fā)生模型。對(duì)于牛海綿狀疾病，該模型提供了一種對(duì)基于形成蛋白感染素的目前理論的替換。簡(jiǎn)單地說(shuō)，該新模型基于分子模擬現(xiàn)象，按照該模型，哺乳動(dòng)物接觸某些具有模擬髓磷脂肽序列的細(xì)菌后，會(huì)產(chǎn)生一種自動(dòng)免疫反應(yīng)。在涉及產(chǎn)生自動(dòng)免疫反應(yīng)的細(xì)菌中，最重要的是不動(dòng)桿菌種，尤其是乙酸鈣不動(dòng)桿菌。基于這種新模型的該診斷實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)了早期治療這類(lèi)感染的可能性，例如，通過(guò)應(yīng)用一種適當(dāng)?shù)目股胤乐惯M(jìn)一步的自動(dòng)-免疫攻擊動(dòng)物自身髓磷脂。
在我們的國(guó)際申請(qǐng)WO99/47932種，我們已經(jīng)確證在患多發(fā)性硬化(MS)和Creutzfeld-Jacob癥(CJD)的患者血清中不動(dòng)桿菌IgA抗體水平升高。
在我們的在先申請(qǐng)UK 9825948.4中，我們描述了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)確證在死于BSE的牛血清中存在抗牛髓磷脂和抗牛髓磷脂神經(jīng)微絲的抗體。這些抗體屬于IgA型。在患MS和CJD的患者血清中也得到相似結(jié)果。這些結(jié)果證實(shí)了上述模型的有效性，并可得出這樣的結(jié)論，即我們發(fā)現(xiàn)了在脊椎動(dòng)物包括人和其它例如家畜飼養(yǎng)場(chǎng)中的家畜中發(fā)生或可能發(fā)生的相似疾病的起源的通用模型。我們的最近研究結(jié)果還提供了早期證實(shí)這些疾病，尤其是牛初始BSE的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。這些進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)可以是對(duì)基于檢測(cè)針對(duì)不動(dòng)桿菌種，例如乙酸鈣不動(dòng)桿菌的IgA抗體實(shí)驗(yàn)的替代或補(bǔ)充。
本發(fā)明因此包括診斷脊椎動(dòng)物海綿狀疾病或脫髓鞘疾病，包括BSE、MS和CJD的方法，其包括分析生物樣品中的抗體，尤其是IgA抗體，該抗體結(jié)合髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲或其抗原(免疫原)部分，包括下文說(shuō)明的肽成分。
本發(fā)明優(yōu)選包括分析針對(duì)脊椎動(dòng)物例如?；蛉祟?lèi)髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲的抗體。然而，可以選擇使用來(lái)自其它物種的、經(jīng)評(píng)價(jià)與結(jié)合抗體的?；蛉祟?lèi)的髓磷脂和髓磷脂神經(jīng)微絲具有足夠同源性的那些髓磷脂和髓磷脂神經(jīng)微絲。
在實(shí)施該方法中，陽(yáng)性結(jié)果表示抗體水平在對(duì)照樣品的抗體水平之上至少約兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
本發(fā)明還包括一種檢測(cè)脊椎動(dòng)物海綿狀疾病或脫髓鞘疾病的診斷試劑盒，包括例如實(shí)驗(yàn)抗原、髓磷脂或髓磷脂神經(jīng)微絲或其抗原(免疫原)部分。
前面描述方法中使用的實(shí)驗(yàn)抗原和診斷試劑盒可以是髓磷脂或髓磷脂神經(jīng)微絲的肽成分，例如具有序列ID Nos1-8的下列序列之一，即，1.NEALEK2.LKKVHEE3.EALEKQL4.ELEDKQN5.EALEKQL 6.KKVHEE 7.EIRDLR 8.EQEIRDLR上述序列已經(jīng)從蛋白質(zhì)信息資源(Protein Information Resource)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取出來(lái)，釋放號(hào)為44。
由于IgA抗體在免疫反應(yīng)中的較高特異性，可以得出這樣的結(jié)論，即不動(dòng)桿菌感染機(jī)制是經(jīng)機(jī)體粘膜途徑，原始部位為腸道或鼻腔。可能鼻腔是感染部位，由于吸入由干燥污水或動(dòng)物糞便形成的攜帶不動(dòng)桿菌的灰塵導(dǎo)致。該機(jī)制提示有必要改善家畜飼養(yǎng)工作中的衛(wèi)生狀況。實(shí)驗(yàn)對(duì)前面提到的生物體的分析在前面提到的我們共同申請(qǐng)待審的申請(qǐng)中描述，因此其內(nèi)容被參考插入本文。用髓磷脂蛋白或神經(jīng)微絲作為實(shí)驗(yàn)抗原進(jìn)行的類(lèi)似分析程序如下描述。ELISA實(shí)驗(yàn)(1)吸取200ul抗原懸浮液A或B，置于96孔平底硬聚苯乙烯微滴板中在4℃下過(guò)夜。(抗原A是牛髓磷脂，來(lái)自Sigma Chemical Company，F(xiàn)ancy Road，Poole，Dorset，BH12 4XA，UK，濃度為5ug/ml，抗原B是牛神經(jīng)微絲，同樣來(lái)自Sigma，濃度為5ug/ml)。(2)然后用含0.1％(v/v)Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗3次。(3)向各孔中加入300ul在PBS中的封閉液(0.2％w/v卵清蛋白，0.1％v/v Tween)，然后在37℃保溫1小時(shí)。(4)然后用PBS.Tween 20沖洗平板三次。(5)取200ul血清樣品(實(shí)驗(yàn)或?qū)φ?用PBS以1/200的比例稀釋。加入Tween，然后在37℃保溫2小時(shí)。(6)然后用PBS.Tween 20沖洗平板三次。(7)取200ul結(jié)合兔抗-牛IgA(alpha鏈)的過(guò)氧化物酶用PBS以1/4000的比例稀釋。(8)然后用PBS.Tween 20沖洗平板三次。(9)每孔加入200ul 0.5mg/ml(2，2’-連氮雙(3-乙基芐-噻唑啉-6-磺酸)的含0.98mM過(guò)氧化氫的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH4.1)，在室溫下保持20分鐘，形成比色分析的顏色。(10)然后用100ul 2mg/ml氟化鈉中止反應(yīng)，用微量-ELISA平板讀數(shù)儀在波長(zhǎng)630nm處測(cè)定光密度。(11)所有分析均在編號(hào)的情況下進(jìn)行，以便實(shí)驗(yàn)者清楚進(jìn)行研究的血清的來(lái)源(實(shí)驗(yàn)或?qū)φ?。(12)所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次。
上述實(shí)驗(yàn)程序可以應(yīng)用人髓磷脂或髓磷脂神經(jīng)微絲或來(lái)源于它們的肽以同樣方式進(jìn)行。
該分析是診斷患牛海綿狀腦病的牛和患MS和CJD的人的新方法，其中描述了一個(gè)能夠測(cè)定?；蛉搜逯锌箖煞N腦抗原的抗體的實(shí)驗(yàn)。任何比健康對(duì)照高出2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的讀數(shù)表示為陽(yáng)性反應(yīng)。而且，實(shí)驗(yàn)對(duì)于兩種抗原(A)牛髓磷脂蛋白和(B)牛神經(jīng)微絲將都是陽(yáng)性的(高2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
這是描述測(cè)定BSE感染牛和患MS和CJD患者中，抗腦抗原的自動(dòng)抗體的的首次分析。
對(duì)于BSE的結(jié)果在附

圖1和2中顯示。
對(duì)于MS和CJD的結(jié)果在附圖3中顯示。
在我們的前面提到的國(guó)際申請(qǐng)中描述的實(shí)驗(yàn)可以與本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組合起來(lái)。該組合實(shí)驗(yàn)特別適用于檢測(cè)BSE的應(yīng)用。該組合實(shí)驗(yàn)也可以被稱(chēng)為“MAN實(shí)驗(yàn)”，其基于抗牛髓磷脂(腦白質(zhì))和抗牛神經(jīng)微絲(腦灰質(zhì))的自動(dòng)抗體以及抗腐生細(xì)菌乙酸鈣不動(dòng)桿菌的特定抗體的分別測(cè)定。
抗牛髓磷脂和牛神經(jīng)微絲的自動(dòng)抗體和抗不動(dòng)桿菌的抗體按照以前描述的方法，針對(duì)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)定。然后按照下列運(yùn)算法則，通過(guò)乘光密度得到MAN指數(shù)＝髓磷脂IgA自動(dòng)抗體x不動(dòng)桿菌抗體x神經(jīng)微絲自動(dòng)抗體，即M×A×N的乘積。
附圖4顯示了該實(shí)驗(yàn)與健康“生物體”對(duì)照或患其他疾病的對(duì)照(CVL)(CVL＝中心脊椎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(Central Veterinary Laboratory，UK，從那兒得到患其他疾病的動(dòng)物血清)比較之后的結(jié)果。
MAN實(shí)驗(yàn)針對(duì)“生物體”大田對(duì)照校準(zhǔn)，所述對(duì)照是來(lái)自飼料僅由青草和干草構(gòu)成的大田動(dòng)物。MAN實(shí)驗(yàn)是一種經(jīng)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)，如果僅實(shí)驗(yàn)健康牛，得到非常低的MAN指數(shù)值。
當(dāng)實(shí)驗(yàn)懷疑有BSE的牛血清時(shí)，當(dāng)MAN指數(shù)比對(duì)照值高3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)，認(rèn)定為陽(yáng)性反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種診斷脊椎動(dòng)物海綿狀病或脫髓鞘病，包括BSE，MS和CJD的方法，該方法包括分析生物樣品中結(jié)合髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲或結(jié)合一種或多種髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲的抗原(免疫原)部分的抗體。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中抗體是IgA抗體。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中分析是針對(duì)結(jié)合脊椎動(dòng)物髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲或其部分的抗體。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中脊椎動(dòng)物是?；蛉恕?br> 5.按照權(quán)利要求4的方法，其中實(shí)驗(yàn)抗原是選自具有上文中說(shuō)明的序列ID Nos.1-8的序列的一種肽。
6.按照權(quán)利要求1-5之一的方法，其中陽(yáng)性結(jié)果表示抗體水平比對(duì)照樣品的抗體水平至少高約兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
7.一種權(quán)利要求1-6之一的方法與分析抗不動(dòng)桿菌種抗體的方法組合的方法。
8.一種檢測(cè)脊椎動(dòng)物海綿狀病或脫髓鞘病的診斷試劑盒，包括作為實(shí)驗(yàn)抗原的髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲和/或一種或多種髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲的一部分。
9.按照權(quán)利要求8的診斷試劑盒，其中實(shí)驗(yàn)抗原是一種具有選自上文說(shuō)明的序列ID Nos.1-8序列的肽。
10.按照權(quán)利要求8或9的診斷試劑盒，其中含有作為實(shí)驗(yàn)抗原的髓磷脂、髓磷脂神經(jīng)微絲、和乙酸鈣不動(dòng)桿菌。
全文摘要
一種診斷脊椎動(dòng)物海綿狀病或脫髓鞘病,包括BSE、MS和CJD的方法,該方法包括分析生物樣品中結(jié)合髓磷脂和/或神經(jīng)微絲或結(jié)合一種或多種其抗原(免疫原)部分的抗體。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1338053SQ9981369
公開(kāi)日2002年2月27日 申請(qǐng)日期1999年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月26日
發(fā)明者艾倫·埃布林格 申請(qǐng)人:倫敦皇家學(xué)院