專利名稱：具有藥效的梅提取物及含有該提取物的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有藥效的梅提取物及含有該提取物的組合物。
背景技術：
迄今為止，為獲得食用梅栽種了大量梅樹。但是，目前的現(xiàn)狀是梅肉和青梅提取物以外的梅樹部分均作為工業(yè)廢棄物處理。例如，在梅樹的栽培過程中，每年秋季要剪去徒長的荒枝，這個量非常大，每年為數(shù)千至數(shù)萬噸。修剪的樹枝作為廢棄物燃燒處理。另外，即使采集青梅提取物和梅肉后的果殼，其大部分也廢棄了。因此，從有效利用資源和保護環(huán)境的觀點出發(fā)，這些均是不希望發(fā)生的。
另一方面，在藥物等領域中，來源于自然界生物的藥物(包括所謂中藥和生藥)比化學合成的藥物更能引起人們的注意。這是因為合成藥物盡管功效優(yōu)良，但仍存在副作用的問題。對此，可以認為從自然界存在的生物，特別是自古人們食用的生物分離得到的物質，據(jù)有較好的安全性。另外，由于生物生存環(huán)境是多種多樣的，這就隱藏著由它們分離得到的物質作為藥物的未知可能性，特別是梅自古以來被認為對人體的健康有益，并在宗教活動中也使用，是被視為神圣的植物，所以能夠特別引起人們的期待。因此，如果開發(fā)出針對目前特別成問題的疾病的藥物，也是對社會的貢獻。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種可能對梅的有效利用作出貢獻的具有藥效的梅提取物及含有該提取物的組合物。
發(fā)明公開本發(fā)明人為了實現(xiàn)上述目的，對梅各個部分的提取物的藥效進行了一系列悉心研究。結果得到了具有如下所示優(yōu)良藥效的梅提取物。
也就是說，本發(fā)明的第1種梅提取物是由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，是能夠作為抗氧化劑、胃粘膜損傷抑制劑、具有醛糖還原酶抑制活性的糖尿病性白內障預防劑、具有醛糖還原酶抑制活性的糖尿病性神經(jīng)疾病預防劑、血糖值上升抑制劑、酒精吸收抑制劑、血小板凝集促進劑、肝炎抑制劑、抗炎劑和具有酪氨酸酶抑制活性的黑色素生成抑制劑使用的梅提取物。
其中，由梅樹的葉和梅樹的莖中至少一方得到的提取物作為抗氧化劑、糖尿病性白內障預防劑、糖尿病性神經(jīng)疾病預防劑、血小板凝集促進劑、抗炎劑或黑色素生成抑制劑效果非常優(yōu)良，因而優(yōu)選。另外，梅樹的莖是指存在于樹葉和樹枝之間支撐樹葉的部分。以下，將樹葉和莖并稱為葉莖部。
上述第1種提取物作為胃粘膜損傷抑制劑或酒精吸收抑制劑使用時，梅提取物優(yōu)選從梅的果仁得到的提取物。這是由于該提取物的上述藥效優(yōu)良。
上述第1種提取物中，上述梅提取物作為血糖上升抑制劑或肝炎抑制劑使用時，梅的果仁和葉莖部中的任意一種提取物均顯示優(yōu)良的藥效。
上述第1種提取物優(yōu)選含有選自下述化學式(1)～(6)表示的6種物質中的至少一種。這是由于推測這些物質與上述各種藥效有關。(式1) (式2) (式3) (式4) (式5) (式6) 以下，分別將上述化學式(1)的物質稱為PM-1，將上述化學式(2)的物質稱為PM-2，將上述化學式(3)的物質稱為PM-3，將上述化學式(4)的物質稱為PM-4，將上述化學式(5)的物質稱為PM-5，將上述化學式(6)的物質稱為PM-6。另外，這些物質的名稱如下所示。PM-13β-羥基-12-夾竹桃(olean)-28-酸PM-22α，3β-羥基-12-烏森(ursen)-28-酸PM-33β，19α-二羥基-2-氧-12-烏森-28-酸PM-43β-羥基-12-烏森-28-酸PM-52α，3β-二羥基-12-夾竹桃-28-酸PM-62α，3β-二羥基-12-夾竹桃-28-酸其次，本發(fā)明的第2種提取物是從梅花得到的提取物，是能夠作為具有醛糖還原酶抑制活性的糖尿病性白內障預防劑、具有醛糖還原酶抑制活性的糖尿病性神經(jīng)疾病預防劑、抗炎劑、抗氧化劑、具有酪氨酸酶抑制活性的黑色素生成抑制劑和血小板凝集抑制劑使用的提取物。另外，本發(fā)明中，梅花是指梅的生殖器官，是由雌蕊、雄蕊、花瓣、萼片、花柄、花苞等構成的部分。
上述第2種提取物優(yōu)選含有選自下述化學式(7)～(14)表示的8種物質中的至少一種。這是由于推測這些物質與上述各種藥效有關。(式7) (式8) (式9) (式10) (式11) (式12) (式13) (式14) 以下，分別將上述化學式(7)的物質稱為PM-7，將上述化學式(8)的物質稱為PM-8，將上述化學式(9)的物質稱為PM-9，將上述化學式(10)的物質稱為PM-10，將上述化學式(11)的物質稱為PM-11，將上述化學式(12)的物質稱為PM-12，將上述化學式(13)的物質稱為PM-13，將上述化學式(14)的物質稱為PM-14。另外，這些物質的名稱如下所示。PM-7乙?；|香苷PM-8異鼠李醚3-鼠李糖苷PM-9蕓香苷PM-10櫟精3-O-鼠李吡喃糖苷基(1→6)半乳糖PM-11櫟精3-O-新橙皮苷PM-12丁子香基葡糖苷PM-13芐基吡喃萄糖苷PM-14芐醇木糖醇基(1→6)葡糖苷本發(fā)明中，上述梅提取物優(yōu)選有機溶劑提取物，特別優(yōu)選醇提取物。上述醇提取物優(yōu)選乙醇提取物和甲醇提取物中的至少一種，特別優(yōu)選甲醇提取物。另外，上述梅提取物優(yōu)選干餾提取物。
本發(fā)明中，上述梅提取物的形態(tài)沒有特別的限定，例如可以是粉末狀，也可以是液體狀(包括糊狀)。
其次，本發(fā)明的組合物含有上述本發(fā)明的梅提取物。該組合物只要含有上述本發(fā)明的梅提取物作為主要成分或有效成分即可，對于其它成分并沒有特別限定，可以根據(jù)其用途適當確定。例如，組合物為藥物時，其劑型是以上述梅提取物作為主成分或有效成分，由固體或液體賦形劑構成，內服劑型通常包括散劑、片劑、膠囊劑、搽劑、顆粒劑、液體制劑(酒精劑、酊劑、流浸膏劑、糖漿劑等)的形式。另外還包括注射劑、軟膏劑、液體制劑、濕布劑、生藥、噴霧劑、滋養(yǎng)灌腸劑、乳劑等形式。上述賦形劑可以使用本領域公知的物質。散劑、顆粒劑、膠囊劑、片劑等內服粉末制劑的賦形劑例如乳糖、淀粉、糊精、磷酸鈣、碳酸鈣、合成或天然硅酸鋁、氧化鎂、干燥氫氧化鋁、硬脂酸鎂、碳酸氫鈉、干燥酵母等。另外，外用散劑的賦形劑例如氧化鋅、滑石、淀粉、カキリン、硼酸粉末、硬脂酸鋅、硬脂酸鎂、次沒食子酸鉍、硫酸鋁鉀粉末等。液體制劑中的賦形劑例如水、甘油、丙二醇、糖漿、乙醇、脂肪酸、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇等。軟膏中的賦形劑例如由脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蠟、木蠟、石蠟、液體石蠟樹脂、高級醇、塑料、醇類、水、表面活性劑等組合配制而成的疏水性基質或親水性基質(包括乳劑性基質、水溶性基質、懸濁性基質)。
另外，作為健康食品和食品添加劑使用上述本發(fā)明的上述組合物時，能夠以片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑等形式使用，優(yōu)選以能夠明顯區(qū)別于藥品的形式使用。另外，此時的賦形劑可以使用上述物質。
本發(fā)明的組合物中，梅提取物的含有比例相對于全部組合物為1～60重量％的范圍，優(yōu)選10～40重量％的范圍。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的梅提取物例如可以按照下述方式制備。
首先，用有機溶劑提取時，將梅樹的技或葉莖部加工成片狀。該加工過程，對于梅樹的干、枝、根等硬的部分，可以使用木材用切割器等進行，對于梅花或葉莖部等柔軟的部分，可以使用烹飪用刀或攪拌器等進行。
然后，將塊狀的梅樹的技等浸漬在有機溶劑中進行提取。上述有機溶劑如甲醇、乙醇、己烷、丙酮、乙酸乙酯、甘油、丙二醇、正丁醇等。其中如上所述優(yōu)選甲醇或乙醇，特別優(yōu)選甲醇。另外，這些有機溶劑可以只使用一種，也可以兩種以上并用。另外，有機溶劑的用量通常是使用上述片狀物的5～10倍體積量，優(yōu)選約5倍體積量。浸漬(提取處理)可以是1次，優(yōu)選進行2次以上。另外，提取優(yōu)選加熱回流。此時，提取所需要的時間通常為1小時～3小時，優(yōu)選約3小時，有機溶劑的溫度根據(jù)有機溶劑的種類適當決定，優(yōu)選提取溶劑產生回流的溫度，具體優(yōu)選約50～80℃的范圍。另外，室溫下進行提取時，提取時間優(yōu)選一晝夜。通過這種提取，從梅樹的枝、葉莖部、梅花等中將藥效成分提取到有機溶劑中。然后，用濾器等分離梅樹的枝等片狀物，回收提取液。
而且，上述提取液可以直接使用，也可以將有機溶劑蒸發(fā)(減壓干燥等)制成粉末或糊狀物使用。
其次，采用干餾時，首先與前述同樣將梅樹的枝或葉莖部等加工成片狀。然后隔絕空氣對其進行加熱處理(干餾)。此時的加熱溫度通常為90～300℃，加熱時間通常為1～3小時。這種干餾可以使用蒸餾釜和干餾用釜。以通過這種干餾流出的液體作為提取液與上述樹枝等分類回收。該干餾提取液可以直接使用，也可以干燥成粉末狀或糊狀使用。
本發(fā)明中使用梅的種類沒有特別的限定，例如可以使用南高梅、小粒南高、古城、改良內田、白加賀、養(yǎng)青、林州、驚宿、甲州小梅、紅さし、皆平等。
其次，說明本發(fā)明的實施例。另外，下述實施例中使用的梅是南高梅。(實施例1)本實施例是確認梅的果仁和葉莖部甲醇提取物的胃粘膜損傷抑制作用的實施例。(葉莖部提取物的制備)將細粉碎的梅的葉莖部5.1kg在其5倍體積量的甲醇中加熱回流3小時進行提取。過濾提取液后，與上述同樣再次用甲醇加熱回流對殘渣進行提取。然后合并得到的提取液，減壓干燥，得到338g的提取物。其物理性質如下所示。(外觀和性狀)黑褐色糊狀物，有少許特殊氣味。(薄層色譜法)(1)條件載體硅膠(60F254，メルルク公司制)展開溶劑氯仿∶甲醇∶水＝10∶3∶1的混合液(體積比)顯色在10％硫酸鈰和10％硫酸水溶液中加熱(2)Rf值斑點10.70(紅色)斑點20.63(茶色)(紅外吸收圖譜)(1)測定儀器Shimadzu FT-IR DR-8000 spectrometer(2)測定結果(單位cm-1)具有3432(羥基)、2936(甲基、亞甲基、甲烷基)、1736(羰基)、1655(不飽和鍵)、1383(甲基、亞甲基、甲烷基)、1109、1082、1037(羥基、醚鍵)、792、760(不飽和鍵)的特征吸收。其結果如圖3所示。(梅的果仁提取物的制備)將細粉碎的梅的果仁2.5kg在其5倍體積量的甲醇中加熱回流3小時進行提取。過濾提取液后，與前述同樣再次用甲醇加熱回流對殘渣進行提取。然后合并得到的提取液，減壓干燥，得到223g的提取物。其物理性質如下所示。(外觀和性狀)茶褐色糊狀物，有少許特殊氣味。(薄層色譜法)(1)條件同上(2)Rf值斑點10.10(茶色)斑點20.95(茶色)(紅外吸收圖譜)(1)測定儀器同上(2)測定結果(單位cm-1)具有3453(羥基)、2928(甲基、亞甲基、甲烷基)、2500～2000(酚性羥基、羧基)、1746(羰基)、1655(不飽和鍵)、1072、1051(羥基、醚鍵)的特征吸收。另外，其結果如圖4所示。(抑制胃粘膜損傷效果的確認)給SD雄性大鼠(體重約250g)斷食約24小時后，口服給與上述甲醇提取物。經(jīng)過1小時后，以1.5ml/只的比例口服給與甲醇，再經(jīng)過1小時后，摘除胃。用福爾馬林處理胃，求出胃腺發(fā)生損傷部分的最大直徑(損傷系數(shù)(mm))，并根據(jù)下述標準求出分值(0～9)。另外，作為對照，對于不給與上述甲醇提取物的大鼠同樣求出損傷系數(shù)(mm)和分值(0～9)。另外，按照下式求出抑制率(％)。其結果如下述表1所示。另外，在同一表中，值用平均值±標準誤差表示(顯著差異*P＜0.05、**P＜0.01)，其它表也同樣。
抑制率(％)＝100－〔(C/A)×100〕A給與甲醇提取物的大鼠的損傷系數(shù)C對照大鼠的損傷系數(shù)(分值)0無損傷1全長5mm以下、寬2mm以下的輕度損傷不足5個2全長5mm以下、寬2mm以下的輕度損傷在5個以上3全長5mm以上、寬2mm以下的中度損傷不足5個4全長5mm以上、寬2mm以下的中度損傷在5個以上5全長5mm以下、寬2mm以上的中度損傷出血點為1至3個6全長5mm以下、寬2mm以上的中度損傷出血點為4個以上7全長5mm以上、寬2mm以上的重度損傷出血點為1至3個8全長5mm以上、寬2mm以上的重度損傷出血點為4至6個9全長5mm以上、寬2mm以上的重度損傷出血點在7個以上(表1)梅提取物種類用量N損傷系數(shù) 抑制率 分值(mg/kg) (匹)(mm) (％)對照- 8173.4±16.9 - 7.8±0.2梅的葉莖部 250692.8±22.8**46.55.7±0.7*梅的葉莖部 500624.0±12.4**86.22.2±0.7**梅的果仁250646.1±4.4** 73.43.5±0.8**梅的果仁500625.8±11.7**85.11.7±0.7**(*P＜0.05、**P＜0.01)由上述表1可知，通過給與梅甲醇提取物能夠抑制胃粘膜損傷，這種效果梅的果仁一方優(yōu)良。(實施例2)本實施例是確認梅的葉莖部甲醇提取物的抗氧化作用的實施例。另外，葉莖部甲醇提取物的制備與實施例1同樣進行。(抗氧化作用的確認方法)利用穩(wěn)定游離基1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼基(DPPH)的乙醇溶液在517nm處有藍色吸收，如果加入游離基補充物質藍色吸收會根據(jù)添加量會退色這一性質。首先，混合乙醇1ml、上述提取物的乙醇溶液(濃度0～100μg/m1)1ml、0.2M乙酸緩沖液(pH5.5)2ml和DPPH溶液(2.0×10-7mol/ml乙醇溶液)1ml，放置30分鐘。然后測定該混合液在517nm處的吸光度。另一方面，以使用乙醇1ml代替DPPH溶液的混合液作為空白，與上述同樣測定其在517nm處的吸光度。然后，計算出吸光度達到1/2時所必需的上述提取物的量，將其作為抗氧化的指標。另外，作為比較例，用α-生育酚和綠茶代替上述提取物，考察其抗氧化能力。其結果如表12所示。(表2)樣品抗氧化能力梅的葉莖部提取10μga-生育酚 21μg綠茶 20μg(抗氧化能力捕捉1.0×10-7mol DPPH所需要的量)由上述表2可知，梅的葉莖提取物具有優(yōu)良的抗氧化能力，其強度是作為食品等的抗氧化劑使用的α-生育酚的2倍以上。(實施例3)本實施例是確認梅的果仁和葉莖部的血糖上升抑制作用的實施例。本實施例中，梅的果仁甲醇提取物和梅的葉莖部甲醇提取物采用與實施例1同樣的方法制備。(抑制血糖上升作用的確認)將上述提取物(500mg/kg)口服給與斷食約20小時的Wistar系雄性大鼠(體重150～180g)，30分鐘后口服給與蔗糖(1.0g/kg)。30分鐘后、1小時后和2小時后由眼窩靜脈取血約0.2m1。以3000rpm的速率離心分離采集的血液，得到血清，按照使用市售試劑盒(葡萄糖CII試驗WCO，和光純藥公司制)的葡萄糖氧化酶法測定血糖值。另外，作為正常組，同樣測定未給與上述提取物和蔗糖的上述大鼠的血糖值，作為對照組，測定未給與上述提取物而只給與了蔗糖的上述大鼠的血糖值。結果如下述表3所示。另外，用于實驗的大鼠各個處理組均為6只。(表3)處理組血糖值(mg/100ml)0.5h 1.0h 2.0h正常組73.1±4.6** 81.9±6.8** 80.2±5.3**對照組182.0±5.7163.1±4.5109.4±3.5梅的果仁 172.7±4.8155.8±9.5107.8±4.4梅的葉莖部174.5±9.7157.5±4.5109.8±4.6由上述表3可知，通過給與梅的果仁和梅的葉莖部的提取物，能夠抑制血糖的上升。另外認為該效果在果仁與葉莖部之間沒有明顯差異。(實施例4)本實施例是確認梅的果仁甲醇提取物和葉莖部甲醇提取物的酒精吸收抑制作用的實施例。另外，上述各甲醇提取物與實施例1同樣制備。(抑制酒精吸收作用的確認)將上述提取物(500mg/kg)口服給與斷食約20小時的Wistar系雄性大鼠(體重約210～240g)，30分鐘后口服給與乙醇(20％(v/v)，5ml/kg)。30分鐘后、1小時后和2小時后由眼窩靜脈取血0.5ml，按照酶法(使用Belin garman him公司生產的市售測定試劑盒——血中酒精測試“BMY”)測定血中乙醇的濃度。另外，作為對照組，對未給與上述提取物而給與了乙醇大鼠同樣測定血液中乙醇的濃度。結果如下述表4所示。另外，用于實驗的大鼠各個處理組中均為5只。(表4)處理組血液中乙醇的濃度(mg/ml)0.5h1.0h2.0h對照組 0.825±0.0510.671±0.0220.337±0.003梅的果仁0.571±0.1540.586±0.0790.332±0.029葉莖部 0.783±0.1470.760±0.0860.512±0.067由上述表4可知，通過給與梅的果仁甲醇提取物和葉莖部甲醇提取物，能夠抑制酒精的吸收。另外，梅的果仁提取物一方效果優(yōu)良。(實施例5)本實施例是確認梅的果仁甲醇提取物和葉莖部甲醇提取物對來源于大鼠晶狀體的醛糖還原酶抑制活性的實施例。醛糖還原酶是與糖尿病性白內障和糖尿病性神經(jīng)疾病有關的酶。上述各甲醇提取物與實施例1同樣制備。(醛糖還原酶溶液的制備)在磷酸緩沖液(135mM，pH7.0，含有0.10mM巰基乙醇)20ml中，將Wistar系雄性大鼠(6周齡)的晶狀體5g均化，以100000xg離心分離30分鐘，將得到的上清液作為酶溶液使用。(抑制醛糖還原酶活性的確認)30℃下，將含有1mM DL-甘油醛、0.03mM NADPH、0.1M硫酸鋰、上述來源于大鼠晶狀體的醛糖還原酶溶液和上述提取物的DMSO溶液(濃度0～30μg/ml)的135mM磷酸緩沖液(pH7.0)培養(yǎng)30分鐘。反應通過加入NADPH開始，通過加入鹽酸停止。用強堿處理反應停止后的反應液之后，60℃下加熱10分鐘，放置至室溫。然后，測定上述反應液的熒光強度(激發(fā)波長360nm，放射波長460nm)。以使活性降低至50％的上述提取物的量(IC50(μg/ml))作為醛糖還原酶抑制活性進行評價。
結果，梅的葉莖部提取物的IC50為4.96μg/ml，極微量即顯示抑制活性。另外，梅的果仁提取物在30μg/ml的濃度下顯示29.3％的抑制活性。(實施例6)本實施例是確認梅的葉莖部甲醇提取物的血小板凝集促進作用的實施例。梅的葉莖部甲醇提取物與實施例1同樣制備。
首先，按照常規(guī)方法由日本白色種雄性兔的全血制備洗滌血小板(5×105cells/ml)，37℃、1ml Ca2+存在的條件下，用梅的葉莖部甲醇提取物(100μg/ml)刺激，測定此時光透過率的變化(血小板凝集計Model PAT-4A，二光生物科學公司制)。作為陽性對照，用血小板活化因子(PAF)代替上述提取物進行刺激，同樣測定光透過率的變化。然后，以上述陽性對照的凝集率為100％，用相對于它的相對比率表示梅的葉莖部甲醇提取物的血小板凝集促進作用。結果如

圖1所示。另外，該圖中Ca表示添加Ca2+時，S表示凝集刺激開始時。
由圖1可以看出，如果添加梅的葉莖部甲醇提取物，立即引起血小板凝集，1分鐘后，相對凝集率上升至約45％。(實施例7)本實施例是確認梅的果仁甲醇提取物和葉莖部甲醇提取物的肝炎抑制作用的實施例。上述各種甲醇提取物與實施例1同樣制備。(抑制D-半乳糖胺/LPS誘發(fā)性急性肝炎的確認)以1000mg/kg的比例將上述梅提取物口服給與斷食約20小時的ddY系雄性小鼠(10只，體重25～30g)，1小時后，分別以350mg/kg和10μg/kg的比例腹腔內給與D-半乳糖胺、脂多糖(LPS)。10小時后，取血，通過離心分離(3000rpm，10分鐘，4℃)得到血清，使用市售試劑盒(STI試驗WCO)測定血清中的轉氨酶(s-GPT、s-GOT)活性。另外，除不給與上述梅提取物以外同樣進行處理的小鼠(10只)作為對照組。然后，計算出給與上述梅提取物的小鼠的上述轉氨酶活性相對于該對照組的比例作為抑制率(％)。結果如下述表5所示。(表5)s-GPTs-GOT抑制率(％)26.6±15.832.6±11.7(大鼠原代培養(yǎng)肝細胞中D-半乳糖胺誘發(fā)急性肝炎的抑制作用)將采用膠原酶灌流法由Wistar系雄性大鼠(體重120～150g)采集的肝實質細胞懸濁在含有10％幼牛血清(CG)的William’s培養(yǎng)基中，以4×104cells/ml播種在96孔平底微孔板上，培養(yǎng)4小時。接著，將上述培養(yǎng)基更換為含有1mM D-半乳糖胺和上述梅提取物(濃度3，10，30，100，300μg/ml)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)44小時后，分別添加5mg/ml 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)10μl，培養(yǎng)4小時。其次，除去培養(yǎng)基，用含有0.04NHCl的2-丙醇提取甲，測定其吸光度(測定波長570nm，參比波長655nm)。另外，除不向培養(yǎng)基中加入上述梅提取物以外與上述同樣進行操作的組作為對照。然后，計算出添加上述梅提取物時的測定值相對于上述對照的比例作為抑制率(％)。結果如下述表6所示。(表6)提取物濃度(μg/ml)3 1030 100 300抑制率(％) 5.2±0.5 9.4±0.8 15.4±1.0 7.9±0.72.8±0.2由上述表5和表6可知，通過給與梅提取物，能夠抑制急性肝炎。(實施例8)本實施例是確認梅的葉莖部甲醇提取物的炎癥抑制作用的實施例。梅的葉莖部甲醇提取物與實施例1同樣制備。(炎癥抑制作用的確認)考察LPS(10μg/ml)刺激引起的小鼠腹腔內巨噬細胞的NO產生，評價炎癥抑制作用。(巨噬細胞的NO的測定)將由ddY系雄性小鼠(體重約30g)的腹腔采集的巨噬細胞懸濁在含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以5×105cells/ml接種到96孔平底微孔板上，培養(yǎng)14時(37℃，5％CO2)。接著，將上述培養(yǎng)基更換為含有10μg/ml LPS和上述梅提取物(濃度3，10，30，100，300μg/ml)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)20小時。由于NO不穩(wěn)定，難以直接測定，所以使用格里斯(Griess)試劑定量NO的代謝產物——NO2(Griess法)。也就是說，將上述培養(yǎng)上清液和等量的格里斯試劑(1％磺酰胺/0.1％ N-1-萘基乙二胺/5％磷酸)混合，室溫下放置10分鐘后，測定吸光度(測定波長570nm，參比波長655nm)，將用上述培養(yǎng)基稀釋的NaNO2作為標準進行定量。另外，除不加入上述梅提取物以外與上述同樣進行操作的組作為對照。然后，計算出添加上述梅提取物時的測定值相對于該對照的比例作為抑制率(％)。結果如下述表7所示。(表7)提取物濃度(μg/ml)3 1030100300抑制率(％) 26.8±2.2 2.7±1.7 5.7±1.6 13.5±1.4 30.5±0.9由上述表7可知，通過給與梅提取物，能夠抑制炎癥。(實施例9)本實施例是確認梅的葉莖部甲醇提取物的黑色素生成抑制作用的實施例。梅的葉莖部甲醇提取物與實施例1同樣制備。(抑制黑色素生成作用的確認)通過對來源于蘑菇的酪氨酸酶的抑制活性進行評價。也就是說，向40mM磷酸緩沖液含有上述梅提取物(濃度30、100、300μg/ml)和底物(L-多巴)的混合液(1.9ml)中加入0.25mg/ml酪氨酸酶(來源于蘑菇)0.1ml，25℃下培養(yǎng)5分鐘。然后，測定475nm處的吸光度。另外，除不加入上述梅提取物以外與上述同樣進行操作的組作為對照。然后，計算出添加上述梅提取物時的測定值相對于該對照的比例作為抑制率(％)。結果如下述表8所示。(表8)提取物濃度(μg/ml) 30 100 300抑制率(％)3.410.534.3由上述表8可知，通過給與梅提取物，能夠抑制黑色素的生成。(實施例10)本實施例是對于推測對上述各種藥效有用的物質進行精制的實施例。
首先，與實施例1同樣制備梅的葉莖部甲醇提取物(338.0g)。然后，用乙酸乙酯(AcOEt)10升和蒸餾水(H2O)10升分液萃取該提取物326.7g，分離成AcOEt可溶性部分(93.4g)和水可溶性部分(233.3g)。然后，使用硅膠柱色譜法將AcOEt可溶性部分(80.0g)分成8個部分(Fr.1～Fr.8)。對于這些部分，最初使用己烷(Hex)-AcOEt的混合液(體積比，10∶1→5∶1→3∶1)，接著使用CHCl3-甲醇(MeOH)的混合液(體積比，10∶1→5∶1→3∶1)，最后使用MeOH液。結果Fr.4(CHCl3∶MeOH＝10∶1)的部分中，得到了PM-1(49mg)、PM-2(61mg)、PM-3(25mg)和PM-4(81mg)，另外，F(xiàn)r.5(CHCl3∶MeOH＝5∶1)的部分中，得到了PM-5(38mg)和PM-6(20mg)。另外，其精制過程如圖2所示。(實施例11)本實施例是確認梅花的甲醇提取物對來源于大鼠晶狀體的醛糖還原酶抑制活性的實施例。醛糖還原酶是與糖尿病性白內障和糖尿病性神經(jīng)疾病有關的酶。上述梅花的甲醇提取物可以按照下述方法制備，并按照下述方法用其研究醛糖還原酶抑制活性。(梅花甲醇提取物的制備)將細粉碎的梅花3.0kg在其5倍體積量的甲醇中加熱回流3小時進行提取。過濾提取液后，與上述同樣再次用甲醇加熱回流對殘渣進行提取。然后合并得到的提取液，減壓干燥，得到250.1g的提取物。其物理性質如下所示。(外觀和性狀)黑褐色粉末狀物，有少許特殊氣味。(薄層色譜法)(1)條件載體硅膠(60F254，メルルク公司制)展開溶劑氯仿∶甲醇∶水＝10∶3∶1的混合液(體積比)顯色在10％硫酸鈰和10％硫酸水溶液中加熱(2)Rf值斑點10.70(黃色)斑點20.63(黃色)(醛糖還原酶溶液的制備)在磷酸緩沖液(135mM，pH7.0，含有0.10mM巰基乙醇)20ml中，將Wistar系雄性大鼠(6周齡)的晶狀體5g均化，以100000xg離心分離30分鐘，將得到的上清液作為酶溶液使用。(抑制醛糖還原酶活性的確認)混合1mM DL-甘油醛、0.03mM NADPH、0.1M硫酸鋰、上述來源于大鼠晶狀體的醛糖還原酶溶液和上述提取物的DMSO溶液(濃度1、3、10、30g/ml)、135mM磷酸緩沖液(pH7.0)，30℃下培養(yǎng)30分鐘。反應通過加入NADPH開始，通過加入鹽酸停止。用強堿處理反應停止后的反應液之后，60℃下加熱10分鐘后，通過熒光法(激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長460nm)定量生成的NADP，將得到的值代入下式計算醛糖還原酶的抑制率。結果如下述表9所示。
抑制率(％)＝〔(A－B)/A〕× 100A未添加提取物時NADP的產量C添加提取物時NADP的產量(表9)提取物濃度(μg/ml) 1 3 10 30抑制率(％)29.951.276.889.6由上述表9可知，梅花的甲醇提取物具有優(yōu)良的醛糖還原酶抑制活性(IC50＝3μg/ml)。(實施例12)本實施例是確認梅花甲醇提取物的炎癥抑制作用的實施例。梅花甲醇提取物與實施例11同樣制備。(炎癥抑制作用的確認)考察LPS(10μg/ml)刺激引起的小鼠腹腔內巨噬細胞的NO產生評價炎癥抑制作用。(巨噬細胞的NO的測定)將由ddY系雄性小鼠(體重約30g)的腹腔采集的巨噬細胞懸濁在含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以5×105cells/ml播種至96孔微孔板上，培養(yǎng)1小時(37℃，5％CO2)。接著，將上述培養(yǎng)基更換為含有10μg/ml LPS和上述梅提取物(濃度3，10，30，100，300μg/ml)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)20小時。由于NO不穩(wěn)定，難以直接測定，所以使用格里斯(Griess)試劑定量NO的代謝產物——NO2(Griess法)。也就是說，將上述培養(yǎng)上清液和等量的格里斯試劑(1％磺酰胺/0.1％ N-1-萘基乙二胺/5％磷酸)混合，室溫下放置10分鐘后，測定吸光度(測定波長570nm，參比波長655nm)，將用上述培養(yǎng)基稀釋的NaNO2作為標準進行定量。另外，除不加入上述梅提取物以外與上述同樣進行操作的組作為對照。然后，計算出添加上述梅提取物時的測定值相對于該對照的比例作為抑制率(％)。結果如下述表10所示。(表10)提取物濃度 3 1030100 300(μg/ml)抑制率(％) 8.04±4.5 1.7±4.8 5.0±3.8 51.6±6.0* 94.8±1.2*由上述表10可知，梅花甲醇提取物顯示優(yōu)良的炎癥抑制效果(IC50＝100μg/ml)。(實施例13)本實施倒是確認梅花甲醇提取物的黑色素生成抑制作用的實施例。梅花甲醇提取物與實施例11同樣制備。(抑制黑色素生成作用的確認)通過對來源于蘑菇的酪氨酸酶的抑制活性進行評價。也就是說，25℃下，將含有上述梅提取物的DMSO溶液(濃度1、3、10、30、100、300、1000μg/ml)、0.1mg/ml的L-多巴和500U/ml酪氨酸酶(來源于蘑菇)的40mM磷酸緩沖液(pH6.8)培養(yǎng)5分鐘。然后，測定475nm處的吸光度。另外，除不加入上述梅提取物以外與上述同樣進行操作的組作為對照。然后，計算出添加上述梅提取物時的測定值相對于該對照的比例作為抑制率(％)。結果如下述表11所示。(表11)提取物濃度 131030 100 300 1000(μg/ml)抑制率(％) 2.3 7.5 11.3 24.1 46.3 63.5 77.5由上述表11可知，通過給與梅提取物，能夠抑制黑色素的生成。(實施例14)本實施例是確認梅花甲醇提取物的抗氧化作用的實施例。梅花的甲醇提取物與實施例11同樣制備。(抗氧化作用的確認方法)混合0.1M乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.5)1.0ml、乙醇0.5ml、2.0×10-4M的DPPH乙醇溶液0.5ml和梅花甲醇提取物的乙醇溶液0.5ml，室溫下放置30分鐘后，測定517nm的吸光度。由得到的值計算出使2.0×10-7M的DPPH游離基減少50％所必需的上述提取物的量。結果使上述DPPH游離基減少50％所必需的上述提取物的量為44μg。根據(jù)該結果可以說梅花提取物具有優(yōu)良的抗氧化能力。(實施例15)本實施例是確認梅花甲醇提取物的血小板凝集抑制作用的實施例。梅花的甲醇提取物與實施例11同樣制備。
首先，由日本白色種雄性兔的耳緣動脈采集全血后，通過離心分離得到多血小板血漿。將其用含有0.4mM EGTA的Tyrode-Hepes溶液洗滌，制備洗滌血小板(5×105cells/ml)。然后，在梅花乙醇提取物存在的條件下，用0.05U/ml的凝血酶刺激5分鐘，用上述血小板凝集計測定此時光透過率的變化。將該測定值代入下式計算血小板凝集的抑制率(％)。結果如下述表12和圖5所示。
抑制率(％)＝〔(A－B)/A〕×100A未添加提取物時的最大凝集率C添加提取物時的最大凝集率而且，用乙酸乙酯和水將上述梅花甲醇提取物分液，用上述方法考察乙酸乙酯相和水相的血小板凝集抑制作用。結果如下述表12和圖6所示。然后，再使上述水相轉移至正丙醇中，用上述方法考察正丙醇相的血小板凝集抑制作用。結果如下述表12和圖7所示。另外，圖5、圖6和圖7中，標明樣品的位置表示加入上述提取物或各相的時間點，標明凝血素的位置表示加入凝血酶的時間點。(表12)濃度(μg/ml)1030100(抑制率(％))甲醇提取物 0 1028乙酸乙酯相 - - 5水相112789正丁醇相968796由上述表12和圖5、圖6和圖7可以確認梅花甲醇提取物具有抑制血小板凝集的作用。另外，將該甲醇提取物用乙酸乙酯和水分液時，確認乙酸乙酯相無血小板凝集抑制作用，并可確認水相具有顯著的抑制血小板凝集的作用。另外，用正丁醇提取上述水相時，可以看到正丙醇相匯集了活性。另一方面，梅花的甲醇提取物幾乎不抑制血小板活性因子(PAF)引起的血小板凝集(無圖示)。由以上結果可以確認，梅花的提取物特異地抑制凝血酶凝集。根據(jù)該結果可以說梅花提取物對心肌梗塞或腦梗塞等血栓引起的病癥具有預防、改善效果。(實施例16)本實施例是對梅花甲醇提取物中上述各種物質進行精制的實施例。(梅花甲醇提取物的制備)將細粉碎的梅花3.0kg在其5倍體積量的甲醇中加熱回流3小時進行提取。過濾提取液后，與上述同樣再次用甲醇加熱回流對殘渣進行提取，過濾。然后合并得到的濾液，進行減壓干燥，制得梅花的甲醇提取物250.1g。然后，用乙酸乙酯(AcOEt)10升、丁醇(BuOH)10升和蒸餾水(H2O)10升分液萃取該提取物250.1g，分成AcOEt可溶性部分(39.2g)、BuOH可溶性部分(51.2g)和水可溶性部分(150.0g)。然后，使用正向硅膠柱色譜法將BuOH可溶性部分(25.1g)分成16個部分(Fr.1～Fr.16)。對于這些部分，作為溶劑最初使用氯仿(CHCl3)-MeOH的混合液(體積比，10∶1→5∶1)，接著使用CHCl3-MeOH-H2O的混合液(體積比，6∶4∶1)，最后使用MeOH液。結果，F(xiàn)r.7(CHCl3∶MeOH＝5∶1)的部分中，得到PM-12(丁子香基萄糖苷)和PM-13(芐基吡喃萄糖苷54mg)，F(xiàn)r.10(CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1)的組分中，得到PM-7(2”’-O-乙?；|香苷)、PM-8(異鼠李醚36mg)、PM-10(櫟精3-O-鼠李吡喃糖苷基(1→6)半乳糖苷48mg)和PM-14(芐醇木糖基(1→6)萄糖苷14mg)，F(xiàn)r.12(CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1)的部分中，得到PM-9(蕓香苷20mg)和PM-11(櫟精3-O-新橙皮苷69mg)。另外，其精制過程如圖8所示。
工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明提供具有上述各種藥效的梅提取物。因此，按照本發(fā)明有助于實現(xiàn)梅的有效利用，同時還可以提供對成為社會問題的疾病有用的藥品。
權利要求
1.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，作為抗氧化劑使用。
2.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，作為胃粘膜損傷抑制劑使用。
3.由選自梅樹的干、梅樹的技、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，具有醛糖還原酶抑制活性，作為糖尿病性白內障預防劑使用。
4.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，具有醛糖還原酶抑制活性，作為糖尿病性神經(jīng)疾病預防劑使用。
5.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，作為血糖值上升抑制劑使用。
6.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，作為酒精吸收抑制劑使用。
7.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，作為血小板凝集促進劑使用。
8.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，作為肝炎抑制劑使用。
9.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，作為抗炎劑使用。
10.由選自梅樹的干、梅樹的枝、梅樹的葉、梅樹的莖、梅樹的根、梅肉、梅的果殼和梅的果仁中至少一種提取的具有藥效的梅提取物，具有酪氨酸激酶抑制活性，作為黑色素生成抑制劑使用。
11.根據(jù)權利要求1、3、4、5、7、8、9或10所述的梅提取物，梅提取物是由梅樹的葉和梅樹的莖中至少一種得到的提取物。
12.根據(jù)權利要求2、5、6或8所述的梅提取物，梅提取物是從梅的果仁得到的提取物。
13.根據(jù)權利要求1～10中任意一項所述的梅提取物，梅提取物含有選自下述化學式(1)～(6)表示的6種物質中的至少一種物質。(式1) (式2) (式3) (式4) (式5) (式6)
14.從梅花提取的具有藥效的梅提取物，具有醛糖還原酶抑制活性，作為糖尿病性白內障預防劑使用。
15.從梅花提取的具有藥效的梅提取物，具有醛糖還原酶抑制活性，作為糖尿病性神經(jīng)疾病預防劑使用。
16.從梅花提取的具有藥效的梅提取物，作為抗炎劑使用。
17.從梅花提取的具有藥效的梅提取物，作為抗氧化劑使用。
18.從梅花提取的具有藥效的梅提取物，具有酪氨酸激酶抑制活性，作為黑色素生成抑制劑使用。
19.從梅花提取的具有藥效的梅提取物，作為血小板凝集抑制劑使用。
20.根據(jù)權利要求14～19中任意一項所述的梅提取物，梅提取物含有選自下述化學式(7)～(14)表示的8種物質中的至少一種物質。(式7) (式8) (式9) (式10) (式11) (式12) (式13) (式14)
21.根據(jù)權利要求1～10和權利要求14～19中任意一項所述的梅提取物，梅提取物為有機溶劑提取物。
22.根據(jù)權利要求21所述的梅提取物，有機溶劑提取物為醇提取物。
23.根據(jù)權利要求22所述的梅提取物，醇提取物為乙醇提取物和甲醇提取物中至少一種提取物。
24.根據(jù)權利要求22所述的梅提取物，醇提取物為甲醇提取物。
25.根據(jù)權利要求1～10和權利要求14～19中任意一項所述的梅提取物，梅提取物為干餾提取物。
26.根據(jù)權利要求1～10和權利要求14～19中任意一項所述的梅提取物，梅提取物的形態(tài)為粉末狀。
27.根據(jù)權利要求1～10和權利要求14～19中任意一項所述的梅提取物，梅提取物的形態(tài)為液體狀。
28.含有權利要求1～10和權利要求14～19中任意一項所述的梅提取物的組合物。
全文摘要
使用5倍體積量的甲醇,由梅的葉莖部、梅的果仁和梅花制備提取物。該提取物具有抗氧化作用、胃粘膜損傷抑制作用、醛糖還原酶抑制作用、血糖值上升抑制作用、血小板凝集促進作用、酒精吸收抑制作用、抗炎作用等。
文檔編號C07H15/203GK1335881SQ99816328
公開日2002年2月13日 申請日期1999年12月24日 優(yōu)先權日1998年12月25日
發(fā)明者吉川雅之, 林輝明, 東善彥 申請人:株式會社東農園, 吉川雅之, 林輝明