專利名稱：一種采用溶劑萃取從海藻浸提液中提取分離多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從海藻的浸提水溶液中提取分離海藻多糖的方法，特別是涉及采用溶劑萃取從海藻的浸提水溶液中提取分離海藻多糖的方法。
海藻多糖具有獨特的生理活性，越來越多的研究結(jié)果已經(jīng)顯示出海藻多糖具有廣闊的開發(fā)應用前景，如重要的海洋經(jīng)濟藻類之一的褐藻，其所含的褐藻多糖所具有的生物活性及醫(yī)藥保健作用已被揭示。尤其是褐藻糖膠(fucoidan)，許多研究表明具有抗腫瘤、抗凝血、抗?jié)兗懊庖咴鰪姷茸饔谩：衷逯兴嗵侵饕ê衷迥z、褐藻糖膠及褐藻淀粉等。迄今能進行工業(yè)生產(chǎn)的褐藻多糖為褐藻膠。從海洋藻類植物提取多糖的過程主要包括破碎、浸提、分離、純化等。而浸提及從浸提液中提取分離多糖是影響過程回收率和經(jīng)濟效益以及產(chǎn)品質(zhì)量的主要環(huán)節(jié)。迄今從海藻浸提液中提取出具有生物活性的多糖的傳統(tǒng)方法主要是采用水溶性有機溶劑(如乙醇)沉淀法。
如文獻1海洋綠藻硬石莼的細胞壁多糖．提取和化學組成。(B.Ray and M.lahaye,Cell-Wall polysaccharides from the marine green alga Ulva“rigid”(Ulvales,Chlorophyta).Extraction and chemical composition.Carbohydrate.1995,274:251-261)中介紹將石莼(Ulva rigida)的草酸鈉和水提取液超濾后，加入3倍量95％乙醇沉淀多糖，沉淀物經(jīng)離心，依次用濃度為80％、95％乙醇及丙酮徹底洗滌，真空下用P2O5干燥，得多糖粗品A。
如文獻2鼠尾藻的抗腫瘤多糖級分.(H.Ito and M.Sugiura,AntitumorPolysaccharide Fraction from Sargassum thunbergii,Chem Pharm Bull,1976,24(5):1114-1115)中介紹從Sargassum thunbergii的酸性浸提液中經(jīng)透析和3倍量無水乙醇沉淀法得到多糖。
如文獻3(周慧萍，朱海燕，陳瓊?cè)A，滸苔多糖的分離、純化和分析，生物化學雜志，1995,11(1):91-93)從滸苔(Enteromorfha prolifera)的熱水浸提液中經(jīng)去蛋白、透析后用95％乙醇沉淀，得到滸苔多糖半純品。
如文獻4(張爾賢，俞麗君，肖湘等，鼠尾藻醇提取物的生理活性和生物化學研究，中國海洋藥物，1994,(3):1-10；趙季勛，徐建陽，姜世魁等，鼠尾藻多糖化學成分及抗?jié)冏饔玫难芯?，海洋藥物?987,(1):19-22)則從鼠尾藻的熱水浸提液通過乙醇沉淀法分離出鼠尾藻多糖。
如文獻5(周志剛，李朋富，劉志禮等，三種螺旋藻及其蛋白質(zhì)、多糖和脂類結(jié)合硒的研究，1997,28(4):363-370)用乙醇沉淀法分別從螺旋藻的培養(yǎng)液和藻體的浸提液分離出胞外和胞內(nèi)多糖。
如文獻6(紀明侯，高洪峰，曹文達，范曉，用13C-NMR光譜法研究幾種紅藻含硫半乳聚糖的結(jié)構(gòu)特征，海洋與湖沼，1996,27(3):330-335)從紅藻的水浸提液中用3倍乙醇沉淀出含硫半乳聚糖。
如文獻7食用海藻的抗腫瘤活性從食用褐藻制備的粗褐藻糖膠級分的抗L-1210白血病的效果(I.Yamamoto et al,Antitumor activity of edible marine algae:Effect of crude fucoidanfractions preparedfrom edible brown seaweeds againstL-1210leukemia,Hydrobiologia,1984,116/117:145-148)介紹則采用乙醇分步沉淀法并結(jié)合CPC沉淀法來分級純化從Eisenia bicyclis中得到的粗褐藻糖膠。其過程為3克粗多糖溶于120毫升蒸餾水中，再往溶液中加入100毫升濃度為5％的氯化十六烷基吡啶，偶爾攪拌混合物，在室溫下放置2小時，然后離心。沉淀物用30毫升濃度為5％的氯化十六烷基吡啶溶液洗滌、離心后，溶于200毫升3mol/L CaCl2溶液，攪拌30分鐘?；旌衔镫x心，沉淀物溶于100毫升3mol/L CaCl2溶液，然后離心、過濾，濾液與前次離心的上清夜合并。合并混合液中加入乙醇使最終乙醇濃度為85％(體積/體積)。此溶液在室溫放置2小時，離心。沉淀物重新溶于100毫升3mol/LCaCl2溶液，攪拌30分鐘，然后離心。所得上清夜中加入乙醇使最終乙醇濃度為85％(體積/體積)，溶液室溫下放置過夜，然后離心。沉淀物用85％(體積/體積)乙醇洗滌幾次直至洗水無氯以及在波長260nm的吸收最大值消失，然后用乙醇和乙醚處理，在45℃干燥過夜。最終產(chǎn)物為淡褐色，產(chǎn)量0.44克，巖藻糖含量30.2％。
乙醇沉淀法的原理主要是通過降低水溶液的介電常數(shù)使多糖脫水從而產(chǎn)生沉淀來分離多糖，這一方法幾乎適用于所有水溶性多糖，雖然不同多糖可在不同濃度乙醇的條件下分步沉淀，但特異性不高，導致對所需多糖的分離選擇性較差，要提高多糖的純度需經(jīng)反復多次重沉淀，從而導致多糖損失大，降低了多糖的回收率。
多糖在化學上可分為酸性、中性及堿性多糖，因此如能根據(jù)多糖的化學性質(zhì)，相應采用不同性質(zhì)的非水溶性有機試劑和溶劑，通過有機試劑(萃取劑)與多糖間的結(jié)合而使不同性質(zhì)的多糖得到分離提取，就可以克服現(xiàn)有的乙醇分步沉淀法的不足。
本發(fā)明的目的在于為了克服目前采用水溶性有機溶劑(主要是乙醇)從海藻浸提液中提取分離海藻多糖的沉淀法所存在的產(chǎn)品收率低、純度不高的缺點，本發(fā)明采用非水溶性試劑和有機溶劑組成的萃取體系(有機相)，通過萃取劑與海藻浸提液中的多糖的作用，把原本不溶于有機溶劑的多糖提取進入有機相，從而與大部分水溶性雜質(zhì)分離，再使含有多糖的有機相與含常用無機鹽的水溶液接觸，多糖即重新進入鹽水溶液而使多糖進一步與非水溶性雜質(zhì)分離，這樣使多糖得到分離和富集，反萃后的有機相再返回萃取，循環(huán)使用，大大降低溶劑消耗，節(jié)約成本；從而提供一種從海藻浸提液中提取分離多糖的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明使用非水溶性試劑和溶劑組成有機相對海藻浸提液中海藻多糖進行萃取，使多糖進入有機相而與水溶性雜質(zhì)分離，萃入有機相的多糖用鹽水溶液反萃回水相，從而進一步與非水溶性雜質(zhì)分離并得到富集，有機相返回萃取，鹽水溶液中的多糖可用常法回收。從而實現(xiàn)海藻多糖的提取分離。本發(fā)明的采用溶劑萃取從海藻的浸提水溶液中提取分離海藻多糖的方法，包括如下步驟(A)提供一種包括非水溶性試劑為季銨鹽(做為萃取劑)，其濃度為0.2％～30％(重量/體積)、和余量為有機溶劑(做為稀釋劑)組成的萃取體系(有機相)；(B)把步驟(A)制備好的有機相與海藻的浸提水溶液，按相比為1∶1-1∶50配料，將有機相與海藻的浸提水溶液放入通常的萃取裝置中，按通常的萃取工藝進行至少一次萃取，萃取過程在室溫下操作，平衡時間10-30分鐘；離心分相；(C)萃取入有機相的海藻多糖可用含常用無機鹽的水溶液反萃回水相并進一步得到富集，按反萃相比為1∶1-4∶1配料，取分相后的有機相與反萃溶液，其濃度為0.5-4.0mol/L含常用無機鹽的水溶液，在通常的萃取裝置中，按通常的反萃取工藝進行至少一次反萃，反萃過程可在室溫下操作，平衡時間10-30分鐘，進行離心分相。
其中非水溶性試劑為季銨鹽萃取劑，可以包括0～30％(體積/體積)的添加劑，添加劑為弱堿性的胺類，包括長鏈伯胺、仲胺和叔胺，它們的分子量在250-600之間。添加劑的加入或有利于改善相分離或有利于萃取和反萃。
其中非水溶性試劑季銨鹽為萃取劑，季銨鹽化合物結(jié)構(gòu)式為R1R2R3CH3N+Z-和R1R2(CH3)2N+Z-其中R1,R2,R3為烷基，其碳原子數(shù)既可相同也可不同，總碳數(shù)為16-36；Z-為組成鹽的陰離子，可以是Cl-或Br-。如國產(chǎn)的N263(主要含氯化三烷基(C7-C9)甲基銨的季銨鹽混合物)、和7401(主要含氯化三烷基(C8-C10)甲基銨的季銨鹽混合物)及國外的Aliquat336和Adogen464等。這些季銨鹽的萃取性能極為相似。
其中余下為有機溶劑如醇、酮、酯、烷烴及芳烴類有機溶劑。
其中所述的有機溶劑是乙酸戊酯、2-乙基己醇、甲基異丁基酮、煤油、甲苯、四氯化碳或上述溶劑互相組合而成的混合物，例如煤油與2-乙基己醇、乙酸戊酯與2-乙基己醇、煤油與甲苯、煤油與甲基異丁基酮、煤油與乙酸戊酯等。
本發(fā)明的效果本發(fā)明對采用溶劑萃取從海藻浸提液中提取分離海藻多糖的效率受萃取劑濃度、浸提液中鹽濃度等的影響，其優(yōu)點如下(1)多糖的萃取率幾乎不受浸提液pH的影響，在初始pH為1-12的范圍內(nèi)都可進行有效的萃取，這就對從不同pH的浸提液萃取多糖極為有利；(2)多糖的萃取效率幾乎不受相比的影響，在相比(O/A)為1∶1-1∶50的范圍內(nèi)都可實施有效萃取，這就可通過改變萃取相比使多糖達到高度富集；(3)在足量萃取劑的存在下，褐藻糖膠的萃取基本不受溫度的影響，從而對液溫的適應性較寬。
(4)本發(fā)明的方法與沉淀法比較分離程度高，多糖的萃取率高，從表1-3可以看出，最高可達99.8％；所得到的海藻多糖產(chǎn)品純度也高。
(5)本發(fā)明的方法與比離子交換和吸附法處理量大，比蒸餾法耗能少，并且對從海藻浸提液中提取分離海藻多糖的方法中使用的均是國產(chǎn)的萃取劑，大大地節(jié)約了外匯，降低成本，提高了經(jīng)濟效益。
(6)本發(fā)明的方法易于連續(xù)化操作和可自動化生產(chǎn)。
現(xiàn)結(jié)合附圖和實施例詳細地對本發(fā)明進行說明附

圖1為褐藻糖膠的萃取率與溶液初始pH值的關(guān)系。圖中曲線分別表示不同濃度(重量/體積)的N263(曲線1-0.5％,2-2.0％,3-4.0％)為萃取劑。實驗條件為初始水相褐藻糖膠濃度1g/L,NaCl濃度為0.4mol/L，室溫約15℃，相比(0/A)=1/1，溶劑為乙酸戊酯。
附圖2為褐藻糖膠的萃取率與溫度的關(guān)系。圖中曲線分別表示不同濃度(重量/體積)的N263(曲線1-0.5％,2-1.0％,3-2.0％,3-4.0％)為萃取劑。實驗條件為初始水相褐藻糖膠濃度1g/L，相比(0/A)=1/5，溶劑為乙酸戊酯。
附圖3為不同相比下褐藻糖膠萃取率與萃取劑濃度間的關(guān)系。圖中曲線分別表示不同的相比(曲線1-1∶2∶2-1∶4,3-1∶10)。實驗條件為初始水相褐藻糖膠濃度1g/L，溶劑為乙酸戊酯。
附圖4為不同溶劑(或溶劑混合物)為稀釋劑時褐藻糖膠萃取率與萃取劑濃度的關(guān)系。圖中曲線分別表示不同的溶劑或溶劑混合物(□-乙酸戊酯，●-CCl4,o-2-乙基己醇，-甲苯，◇-甲基異丁基酮，Δ-煤油+2-乙基己醇)為稀釋劑。實驗條件為初始水相褐藻糖膠濃度1g/L，溫度為20℃，相比=1/5。
附圖5為褐藻糖膠濃度與其萃取率的關(guān)系。圖中曲線分別表示不同的相比(曲線1-1∶4,2-1∶10)。實驗條件為N263濃度4％，溶劑為乙酸戊酯。
實施例1褐藻糖膠的萃取富集表1為不同相比、不同萃取劑濃度及不同料液褐藻糖膠濃度時的萃取實施例。
采用N263為萃取劑，乙酸戊酯為溶劑組成有機相，按表1中所示相比，取一定體積的有機相及含多糖的水溶液于離心杯中，在室溫下電磁攪拌10分鐘，離心分相后，取平衡水相測定褐藻糖膠濃度，以此計算萃取率，萃取結(jié)果列于表1。從表1可知，在不同相比下，不同濃度的褐藻糖膠可通過改變有機相萃取劑濃度而達到萃取褐藻糖膠的目的，且褐藻糖膠在有機相中得到高度富集。
表1褐藻糖膠的萃取(萃取劑N263，溶劑乙酸戊酯)
注糖濃度為g/L；萃取劑濃度為(體積)％；相比為體積比。
實施例2褐藻糖膠的鹽反萃的實例表2為萃入有機相的褐藻糖膠用鹽水溶液反萃的實施例。
采用N263為萃取劑，乙酸戊酯為溶劑組成有機相，取一定體積的有機相及含多糖的水溶液于離心杯中，在室溫下電磁攪拌10分鐘，離心分相后，測定平衡水相中的褐藻糖膠濃度，以此計算有機相中的褐藻糖膠濃度，取此負荷有機相于離心管中，以表2所示反萃相比，往試管中加入一定體積含常用無機鹽的水溶液，室溫下手搖混合約1分鐘，離心分相，取鹽水溶液分析其中褐藻糖膠濃度，以此計算反萃率，結(jié)果列于表2。從表2中所列出的數(shù)據(jù)可知，萃取入有機相的褐藻糖膠可用含鹽水溶液反萃回水相并進一步得到富集，但反萃效率隨有機相中褐藻糖膠的濃度增加而降低。
表2褐藻糖膠的反萃
其中表中糖濃度為g/L。
實施例3實際海藻浸提液中的萃取與反萃表3為實際海藻浸提液中褐藻糖膠的萃取及反萃實施例。
采用7401(或TOA)為萃取劑，配(或不配)以添加劑TOA，乙酸戊酯為溶劑組成有機相，以表3中所示萃取相比和配比，取一定體積的有機相及鼠尾藻或海帶的熱酸水浸提液或超聲浸提液于離心杯中，在室溫下電磁攪拌10分鐘，離心分相后，測定平衡水相中的巖藻糖濃度，以此計算萃取率，有機相中的巖藻糖濃度以差減法計算。反萃取此負荷有機相于離心管中，以表3中所示反萃相比，往試管中加入一定體積含鹽水溶液，室溫下手搖混合約1分鐘，離心分相，取出鹽水溶液(1)；重復以上步驟，得鹽水溶液(2)，分析鹽水溶液(1)、(2)中的巖藻糖濃度，以此計算反萃率。
表3的結(jié)果表明弱堿性胺類三辛胺(TOA)作為萃取劑的萃取能力較低，但作為添加劑，則有利于萃取和反萃，其他弱堿性胺類也與TOA的作用類似。結(jié)果還表明從超聲浸提液中的萃取優(yōu)于從熱酸水浸提液中的萃取。
表3.實際海藻浸提液中褐藻糖膠的萃取及反萃實施例
其中例1～3為鼠尾藻熱酸水浸提液；例4為海帶熱酸水浸提液；例5～10為海帶超聲浸提液。
實施例4從鼠尾藻浸提液中乙醇沉淀法與萃取法多糖純度的比較取鼠尾藻浸提液200ml，加熱濃縮至50ml，攪拌下加無水乙醇至30％(體積/體積)，離心后棄去沉淀，上清液中繼續(xù)加無水乙醇至60％(體積)，混合物置冰箱中過夜，離心后取沉淀，經(jīng)洗滌、干燥得粗多糖，經(jīng)分析含巖藻糖為19.3％。
另取鼠尾藻浸提液200ml，用40ml含7401為5％(重量/體積)的乙酸戊酯溶液萃取，有機相用2mol/L CaCl2溶液反萃，反萃液中加無水乙醇至60％(體積/體積)，混合物置冰箱中過夜，離心取沉淀(1)，上清液中繼續(xù)加乙醇至80％，放置3小時后，離心取沉淀(2)。沉淀(1)和(2)經(jīng)洗滌、干燥得到固體多糖，經(jīng)分析，分別含巖藻糖為20.4％和43.1％?？梢姡腿》ㄋ枚嗵羌兌纫哂谝掖挤植匠恋矸ǖ募兌?。
實施例5從海帶浸提液中乙醇分步沉淀法與萃取法多糖收率和純度的比較取海帶浸提液400ml，加熱濃縮至130ml，冷卻后攪拌下加無水乙醇至30％(體積/體積)，離心后棄去沉淀，上清液中繼續(xù)加無水乙醇至60％(體積/體積)，混合物置冰箱中過夜，離心后取沉淀，經(jīng)洗滌、干燥得粗多糖0.5157g，經(jīng)分析含巖藻糖為33.7％，以巖藻糖計，產(chǎn)量為0.1738g。
另取相同海帶浸提液400ml，用80ml含7401為3％(重量/體積)的乙酸戊酯溶液萃取，有機相用2mol/L CaCl2溶液反萃2次，反萃液(1)中加入1倍體積無水乙醇，置冰箱中過夜，離心取沉淀(1)，上清液中繼續(xù)加入3倍體積(以反萃液體積計)無水乙醇，放置2小時后，離心取沉淀(2)。反萃液(2)加熱濃縮至約一半體積，冷卻后加入4倍體積無水乙醇，置冰箱中過夜，離心取沉淀(3)。沉淀(1)、(2)和(3)經(jīng)洗滌、干燥得到固體多糖分別為0.3367g、0.0592g和0.0983g。經(jīng)分析，含巖藻糖分別為45.0、27.2％和38.4％，以巖藻糖計，產(chǎn)量為0.2053g?？梢?，以巖藻糖計，萃取法的產(chǎn)量(0.2053g)及多糖純度(平均含量為41.5％)都要高于乙醇分步沉淀法的產(chǎn)量(0.1738g)及多糖純度(33.7％)。
權(quán)利要求
1．一種采用溶劑萃取從海藻浸提液中分離提取海藻多糖的方法，包括如下步驟(A)提供一種包括非水溶性試劑為季銨鹽萃取劑，其濃度為0.2％～30％(重量/體積)、和余量為有機溶劑組成的有機相；(B)把步驟(A)制備好的有機相與海藻的浸提水溶液，按相比為1∶1-1∶50配料，將有機相與海藻的浸提水溶液放入通常的萃取裝置中，按通常的萃取工藝進行至少一次萃取，萃取過程在室溫下操作，平衡時間10-30分鐘；離心分相；(C)萃取入有機相的海藻多糖可用含鹽水溶液反萃回水相并進一步得到富集，按反萃相比為1∶1-4∶1配料，取分相后的有機相與反萃溶液，其濃度為0.5-4.0mol/L的鹽的水溶液，在通常的萃取裝置中，按通常的反萃取工藝進行至少一次反萃，反萃過程可在室溫下操作，平衡時間10-30分鐘，進行離心分相。
2．按權(quán)利要求1所述的采用溶劑萃取從海藻浸提液中分離提取海藻多糖的方法，其特征在于所述的非水溶性試劑季銨鹽化合物結(jié)構(gòu)式為R1R2R3CH3N+Z-和R1R2(CH3)2N+Z-其中R1,R2,R3為烷基，其碳原子數(shù)相同或不同，總碳數(shù)為16-36；Z-為組成鹽的陰離子，可以是Cl-或Br-。
3．按權(quán)利要求1所述的采用溶劑萃取從海藻浸提液中分離提取海藻多糖的方法，其特征在于所述的非水溶性試劑中還包括添加0～30％(體積/體積)的添加劑。
4．按權(quán)利要求1所述的采用溶劑萃取從海藻浸提液中分離提取海藻多糖的方法，其特征在于所述的非水溶性試劑中添加的添加劑為弱堿性的胺類，包括長鏈伯胺、仲胺和叔胺，其分子量在250-600之間。
5．按權(quán)利要求1所述的采用溶劑萃取從海藻浸提液中分離提取海藻多糖的方法，其特征在于所述的有機溶劑包括醇、酮、酯、烷烴、氯代烷烴類及芳烴類或所述溶劑的組合而成的混合物。
6．按權(quán)利要求5所述的采用溶劑萃取從海藻浸提液中分離提取海藻多糖的方法，其特征在于所述的醇類有機溶劑是2-乙基己醇；所述的酯類有機溶劑是乙酸戊酯；所述的烷烴類有機溶劑是甲苯、煤油；所述的氯代烷烴類有機溶劑是四氯化碳；所述的酮類有機溶劑是甲基異丁基酮。
7．按權(quán)利要求1所述的采用溶劑萃取從海藻浸提液中分離提取海藻多糖的方法，其特征在于所述的非水溶性試劑季銨鹽濃度為1％-10％(重量/體積)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用溶劑萃取從海藻浸提液中分離提取海藻多糖的方法。該方法使用非水溶性試劑和溶劑組成有機相對海藻浸提液中海藻多糖進行萃取,使多糖進入有機相而與水溶性雜質(zhì)分離,有機相的多糖用鹽水溶液反萃回水相從而進一步與非水溶性雜質(zhì)分離并得到富集,有機相返回萃取,鹽水溶液中的多糖可用常法回收。本發(fā)明分離提取多糖的方法與已有方法相比多糖的回收率及純度更高。該方法中使用的均是國產(chǎn)的萃取劑,大大地節(jié)約了外匯,降低成本,提高了經(jīng)濟效益。
文檔編號C08B37/00GK1318566SQ00105700
公開日2001年10月24日 申請日期2000年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
發(fā)明者伍志春, 歐陽藩, 房燕麗, 趙兵 申請人:中國科學院化工冶金研究所