專利名稱：一種甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的簡易制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有生物活性的寡糖的制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及能用于藥物的篩選的甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的簡易制備方法。
寡糖，多糖及糖綴合物(糖蛋白，糖脂)是生物體內(nèi)重要的信息物質(zhì)，參與所有細(xì)胞的接觸過程，細(xì)胞表面的寡糖在細(xì)胞之間的通訊，識別和相互作用，胚胎發(fā)生，轉(zhuǎn)移，在信號傳遞，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與黏附，以及病原與宿主細(xì)胞的相互作用方面起著重要作用。最新的研究表明，寡糖不僅以它們的綴合物在起作用，很多寡糖本身就有重要的生理功能，有的寡糖能激發(fā)植物的免疫系統(tǒng)，有的寡糖能誘導(dǎo)根瘤菌的固氮作用；有的寡糖可以與入侵的微生物上的糖蛋白相結(jié)合而阻止這些微生物對人體正常細(xì)胞的侵襲，而一些寡糖則具有肝素(haparin)的功能，血型決定族寡糖更是很有希望的防治癌癥的藥物。寡糖在農(nóng)業(yè)，醫(yī)藥業(yè)方面有廣泛的應(yīng)用前景。而寡糖和多糖直接做為藥物使用，去除疾病，增進(jìn)健康，將引起防治疾病觀念的更新，也是生命科學(xué)的一大進(jìn)展。新興的“糖工程”(以糖類為基礎(chǔ)的藥物研制)正處于蓬勃發(fā)展的新起點(diǎn)，據(jù)“生物工程新聞”(Biotech News)1995，14(4)，7報(bào)導(dǎo)，糖類藥物的市場份額將從1993年的13％增加至2000年的24％。
甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6都是存在于細(xì)胞壁多糖的成分，它們是多糖的活性部位，對某些皮膚病是關(guān)鍵的致病因子，合成它們并進(jìn)一步制備疫苗，就能制成醫(yī)治皮膚病或其它由念珠菌引起的病的新藥。
甘露多糖抗原因子4的結(jié)構(gòu)為α-D-Man-1→3-(α-D-Man-1→6)-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-D-Man而甘露多糖抗原因子6的結(jié)構(gòu)為α-D-Man-1→3-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-D-Man，至今尚未見這兩個(gè)抗原因子的合成的報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于采用全新的思路，提供一種步驟簡單，省時(shí)省力的、以糖的原酸酯為起始物的、制備這兩個(gè)抗原因子的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的以最簡單的溴代?；事短菫樵?，首先將其轉(zhuǎn)化為苯甲酰化的原酸酯，然后在三氟甲磺酸酯催化下縮合，得到1-2連接的雙糖，經(jīng)簡單的化學(xué)轉(zhuǎn)化使其轉(zhuǎn)化為四糖受體與三糖受體，前者與1-3連接的甘露雙糖供體偶聯(lián)，再脫保護(hù)即得到抗原因子6，而后者與3，6支化的甘露三糖供體偶聯(lián)，再脫保護(hù)即得到抗原因子4。本發(fā)明的合成方法在于以溴代乙?；事短?為原料，制備出甘露糖的原酸酯2，在甲醇鈉-甲醇中脫掉乙?；玫?，用吡啶-苯甲酰氯苯甲?；?，得到苯甲?；脑狨?。如下圖所示 4在三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)或三乙基硅三氟甲磺酸酯(TESOTf)作用下縮合，得到α1-2連接的雙糖5。如下圖所示 5選擇性脫掉1位R基，然后活化得到雙糖供體6，而5選擇性脫掉乙?；玫诫p糖受體7。如下圖所示 7與6偶聯(lián)，得到四糖8，而7與單糖供體9偶聯(lián)，得到三糖10。如下圖所示 8選擇性脫乙酰基得到四糖受體11；而10選擇性脫乙?；玫饺鞘荏w12。如下圖所示 上述結(jié)構(gòu)式中R＝烷基或芳基 Bz＝苯甲?；?X＝鹵素或三氯乙酰亞胺酯11與雙糖供體13偶聯(lián)，得到六糖14；而12與三糖供體15偶聯(lián)，得到六糖16。如下圖所示 上述結(jié)構(gòu)式中R＝烷基或芳基 R′＝酰基或烷基 Bz＝苯甲?；?X＝鹵素、?；蛉纫阴啺孵ビ贸Ｒ?guī)方法脫掉14的保護(hù)基，即得到甘露多糖抗原因子6(17)；用常規(guī)方法脫掉16的保護(hù)基，即得到甘露多糖抗原因子4(18)。如下圖所示 上述結(jié)構(gòu)式中R＝H、烷基或芳基所述的偶聯(lián)反應(yīng)在Lewis酸催化下進(jìn)行，所用的Lewis酸為銀鹽、三氟化硼、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、三乙基硅三氟甲磺酸酯(TESOTf)。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。
實(shí)施例1苯甲酰化的原酸酯4(3，4，6-tri-O-benzoyl-β-D-mannopyranose 1，2-allylorthoester)制備 溴代乙酰甘露糖(tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl bromide)(1，8220毫克，20毫摩爾)溶于40毫升烯丙醇(allyl alcohol)中，向此溶液中加入2，4-二甲基吡啶(2.3毫升，20毫摩爾)，反應(yīng)在室溫、攪拌下進(jìn)行，用薄層色譜分析監(jiān)測，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物濃縮致干得到粗產(chǎn)物2，將2懸浮于20毫升無水甲醇中，加入甲醇鈉(0.4毫升，2摩爾/升)，溶液在攪拌下室溫過夜，薄層色譜分析表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)液濃縮致干得到34.7克，產(chǎn)率90％，將3溶于30毫升吡啶中，慢慢滴加苯甲酰氯(8.2毫升，70毫摩爾)，反應(yīng)在攪拌、室溫下進(jìn)行，用薄層色譜分析監(jiān)測，3小時(shí)后完成，用常規(guī)方法對反應(yīng)物進(jìn)行處理，得到的殘余物用硅膠柱層析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作為淋洗液淋洗，收集相應(yīng)組分，得到純的糖原酸酯410克，產(chǎn)率97％。熔點(diǎn)142℃比旋度[α]D-12°實(shí)施例2α1-2連接的雙糖5(All 2-O-acetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制備 將4在真空下干燥2小時(shí)，然后溶于80毫升干燥的二氯甲烷中，在-40℃下，加入TMSOTf 100微升，反應(yīng)物在攪拌下自然恢復(fù)到室溫，1小時(shí)后，反應(yīng)完成，用三乙胺中和反應(yīng)液，減壓下濃縮，用硅膠柱層析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作為淋洗液淋洗，收集相應(yīng)組分，得到純的雙糖56.72克，產(chǎn)率66％。
實(shí)施例3雙糖供體6(2-O-Acetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate)的制備將5(2100毫克，2 mmol)加入到90％醋酸(20 mL)，再加入醋酸納590毫克(6毫摩爾)及PdCl20.18毫克(1毫摩爾)，反應(yīng)在室溫下攪拌12小時(shí)后完成，將混合物用60毫升二氯甲烷稀釋，用水和飽和碳酸氫納水溶液洗滌，有機(jī)相在減壓下蒸干，用硅膠柱層析法分離得到1位為游離羥基的雙糖2-O-acetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-D-mannopyranose(1820毫克)，將此雙糖溶于20毫升二氯甲烷中，然后加入CCl3CN 0.4ml(8毫摩爾)及DBU(56μL，0.72毫摩爾)，反應(yīng)在室溫下攪拌2小時(shí)后完成，濃縮反應(yīng)物，柱層析分離后得到結(jié)晶的雙糖供體6 1890毫克，兩步產(chǎn)率82％m.p139-142℃；[α]D-1.5°(c 1.1，CHCl3)實(shí)施例4雙糖受體7(Allyl 3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制備將雙糖5(2100毫克，2毫摩爾)加入到60mL無水甲醇中，向此溶液中在0℃下加入乙酰氯.1.8毫升，室溫下攪拌10小時(shí)，再加入乙酰氯1.2毫升，用TLC檢測反應(yīng)，直至反應(yīng)完成。溶液用Et3N中和至中性，濃縮至干，柱層析分離得到7(1870毫克，93％)熔點(diǎn)147-150℃；[α]D-3.6°(c 1.4，CHCl3)；實(shí)施例5四糖8(Allyl 2-O-aeetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制備將雙糖供體6(1150毫克，1毫摩爾)及雙糖受體7(1010毫克，1毫摩爾)在真空下一起干燥2小時(shí)，然后溶于60毫升無水二氯甲烷中，向此溶液在-42℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)、攪拌下加入.TMSOTf(20微升，0.10毫摩爾)，反應(yīng)進(jìn)行3小時(shí)，并自然升溫，TLC顯示反應(yīng)完成，溶液用Et3N中和至中性，濃縮至干，柱層析分離得到8(1700毫克，85％)熔點(diǎn)140-145℃；[α]D-2.2°(c 1.3，CHCl3)；13C NMRδ168.96，，166.25，166.18，166.00，165.69，165.61，165.44，165.36，165.29，165.23，165.18，165.10，164.93，117.89，100.74，100.46，99.22，98.02，77.18，76.27，70.91，70.83，70.71，69.65，69.58，69.38，69.35，69.15，68.88，68.68，67.76，67.29，67.13，67.13，63.75，63.75，63.54，62.95；實(shí)施例6三糖10(Allyl 2-O-acetyl-3，46-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制備按6與7縮合的條件，進(jìn)行單糖供體2-O-acetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate(9，747毫克，1.1毫摩爾)與雙糖受體7(980毫克，1毫摩爾)的縮合，得到10 1217毫克，產(chǎn)率88％。
實(shí)施例7四糖受體11(Allyl 3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-mannopyranoside)的制備按由5制備7的條件，由四糖8(1000毫克，0.5毫摩爾)制得四糖受體11 890毫克，產(chǎn)率91％m.p137-141℃；[α]D-0.4°(c 1.2，CHCl3)；實(shí)施例8三糖受體12(Allyl 3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制備按由5制備7的條件，由三糖10(1220毫克，0.5毫摩爾)制得三糖受體12 1112mg，86％熔點(diǎn)132-134C；[α]D-1.7°(c 1.0，CHCl3)；實(shí)施例9雙糖供體13(2，3，4，6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-，2，4，6-tri-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate)的制備由2，3，4，6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate(1290毫克，2毫摩爾，其制備見R.R.Schmidt，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.，Vol 50，1994，21-124)與4，6-O-benzylidene-1，2-O-ethylidene-β-D-mannopyranose(560毫克，2毫摩爾，其制備見王為 孔繁祚Carbohydr.Res.，151，1999，117-226)按標(biāo)準(zhǔn)條件縮合得到雙糖2，3，4，6-Tetrα-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-4，6-O-benzylidene-1，2-O-ethylidene-β-D-mannopyranose 1570毫克，產(chǎn)率90％m.p 128-132℃；[α]D-1.5°(c 1.0，CHCl3)；，將得到的雙糖1310毫克(1.5毫摩爾)用90％F3CCOOH(5毫升)在室溫下處理1小時(shí)，將反應(yīng)液濃縮，殘余物用吡啶(5mL)、乙酸酐(3mL)在室溫下，2小時(shí)完成乙酰化，按常規(guī)方法處理反應(yīng)液，將得到的殘余物與碳酸鉀(207毫克，1.5毫摩爾)溶于10毫升DMF中，在室溫下攪拌12小時(shí)，用常規(guī)方法處理反應(yīng)液，有機(jī)相濃縮，柱層析分離，所得到的1位為游離羥基的雙糖粗產(chǎn)物溶于二氯甲烷(20毫升)中，然后加入CCl3CN(0.3毫升，3毫摩爾)及DBU(42微升，0.3毫摩爾)。反應(yīng)混合物在室溫下交班小時(shí)后完成，濃縮反應(yīng)物，柱層析分離得到雙糖供體13 960毫克，四步總產(chǎn)率62％m.p125-127℃；[α]D-0.9°(c 1.2，CHCl3)；實(shí)施例10全保護(hù)的抗原因子6六糖14的制備按6與7縮合的條件，使雙糖供體13(103毫克，0.1毫摩爾)與四糖受體11(195毫克，0.1毫摩爾)縮合，得到抗原因子六糖14，212mg，產(chǎn)率75％mp142-146℃；[α]D-2.9°(c 1.1，CHCl3)；1H NMRδ8.05-7.26，6.34，6.29，6.14，6.00-5.70，5.62，5.56，5.48，5.30，5.28，5.23，5.15，5.13，5.05，4.92，4.75-4.70，4.68-4.50，4.48，4.45，4.42-4.26，3.88-3.84，3.69-3.64，3.59-3.55，2.35，2.24，2.04.
實(shí)施例11全保護(hù)的抗原因子4六糖16的制備首先用已知的方法(王為 孔繁祚Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，38，1999，1247-1249.)由1，2-乙叉基甘露糖和苯甲?；母事短荢chmidt試劑制備出3，6支化的甘露三糖(2，3，4，6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl(1-3)-[2，3，4，6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl[1-6]]-1，2-O-ethylidene-β-D-mannopyranose)其熔點(diǎn)為141-144℃；[α]D-1.4°(c 1.1，CHCl3)；將這樣得到的三糖1毫克分子用90％三氟乙酸在室溫下處理2小時(shí)，除去乙叉基，然后用吡啶-乙酸酐定量乙?；龠x擇性脫除1位乙?；?，然后用三氯乙睛-DBU活化，得到了三糖供體15(2，3，4，6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl(1-3)-[2，3，4，6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl[1-6]]-2，4-di-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate)1048毫克，對四步反應(yīng)總產(chǎn)率68％mp125-127℃；[α]D-2.2°(c 1.1，CHCl3)；1H NMRδ8.97，8.07-7.26，6.37，6.22，6.13，5.89，5.80，5.69，5.64，5.54，5.52，5.42，5.11，4.69-4.65，4.64-4.60，4.52-4.47，4.26-4.22，4.02-3.98，3.77-3.74，2.38，2.30.
按6與7縮合的方法，使三糖供體15(313毫克，0.2毫摩爾)與三糖受體12(29l毫克，0.2毫摩爾)縮合，得到抗原因子六糖16437毫克，產(chǎn)率77％mp126-129℃；[α]D-3.8°(c 1.1，CHCl3)；1H NMRδ8.08-7.24，6.36，6.12，6.00-5.68，5.61，5.48，5.41，5.09，5.08，5.06，4.98，4.85-4.79，4.61-4.40，4.32-4.27，4.25，4.13，4.02-3.98，3.92，3.85-3.81，3.72-3.68，3.62-3.58，2.27，2.04.
實(shí)施例12抗原因子6六糖苷17、抗原因子6六糖17a及抗原因子4六糖苷18的制備14(1410毫克，0.5毫摩爾)或16(1432毫克，0.5毫摩爾)溶于用氨飽和的甲醇15毫升中，室溫下反應(yīng)6天，將溶劑在減壓下抽干，用乙酸乙酯洗滌殘余物，由14得到乳白色粉末狀的抗原因子6六糖苷17410毫克，產(chǎn)率79％[α]D＋75°(c 1.l，D2O)；1HNMRδ5.90，5.42，5.34，5.10；質(zhì)譜分析m/z對C39H66O31理論值1030；實(shí)測值m/z1053(M＋鈉)；由16得到乳白色粉末狀的抗原因子4六糖苷18 414毫克，產(chǎn)率80％[α]D＋62°(c 2.3，D2O)；1H NMRδ5.20，4.98，3.41；質(zhì)譜分析m/z對C39H66O31理論值1030；實(shí)測值m/z 1053(M＋鈉)。
將14(1410毫克，0.5毫摩爾)加入到90％醋酸(10毫升)，再加入醋酸納150毫克(1.4毫摩爾)及PdCl20.06g(0.3毫摩爾)，反應(yīng)在室溫下攪拌12小時(shí)后完成，脫除掉了1位的烯丙基，將反應(yīng)混合物用20毫升二氯甲烷稀釋，用水和飽和碳酸氫納水溶液洗滌，有機(jī)相在減壓下蒸干，用硅膠柱層析法分離得到1位為游離羥基的六糖，將其溶于用氨飽和的甲醇15毫升中，室溫下反應(yīng)6天，將溶劑在減壓下抽干，用乙酸乙酯洗滌殘余物，得到乳白色粉末狀的游離的六糖17a 362毫克，產(chǎn)率73％質(zhì)譜分析m/z對C36H62O31理論值990；實(shí)測值m/z1013(M＋鈉)
權(quán)利要求
1.一種甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的簡易制備方法，其特征在于(1)以溴代乙?；事短?為原料，制備出甘露糖的原酸酯2，在甲醇鈉-甲醇中脫掉乙?；玫?，用吡啶-苯甲酰氯苯甲?；?，得到苯甲?；脑狨?。如下圖所示 (2)4在三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)或三乙基硅三氟甲磺酸酯(TESOTf)作用下縮合，得到α1-2連接的雙糖5。如下圖所示 (3)5選擇性脫掉1位R基，然后活化得到雙糖供體6，而5選擇性脫掉乙酰基得到雙糖受體7。如下圖所示 (4)7與6偶聯(lián)，得到四糖8，而7與單糖供體9偶聯(lián)，得到三糖10。如下圖所示 (5)8選擇性脫乙酰基得到四糖受體11；而10選擇性脫乙?；玫饺鞘荏w12。如下圖所示 上述結(jié)構(gòu)式中R＝烷基或芳基 Bz＝苯甲?；?X＝鹵素或三氯乙酰亞胺酯(6)11與雙糖供體13偶聯(lián)，得到六糖14；而12與三糖供體15偶聯(lián)，得到六糖16。如下圖所示 上述結(jié)構(gòu)式中R＝烷基或芳基 R′＝?；蛲榛?Bz＝苯甲?；?X＝鹵素、?；蛉纫阴啺孵?7)用常規(guī)方法脫掉14的保護(hù)基，即得到甘露多糖抗原因子6(17)；用常規(guī)方法脫掉16的保護(hù)基，即得到甘露多糖抗原因子4(18)。如下圖所示 上述結(jié)構(gòu)式中R＝H、烷基或芳基
2.如權(quán)利要求1所述的一種甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的簡易制備方法，其特征在于所述的偶聯(lián)反應(yīng)在Lewis酸催化下進(jìn)行，所用的Lewis酸為銀鹽、三氟化硼、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、三乙基硅三氟甲磺酸酯(TESOTf)。
全文摘要
本發(fā)明涉及甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的簡易制備。以甘露糖的原酸酯為原料,將其縮合可直接得到α1－2連接的甘露雙糖,由此雙糖可制備出α1－2連接的四糖及三糖,前者與α1－3連接甘露雙糖偶聯(lián)即得到甘露多糖抗原因子4,后者與3,6支化的甘露三糖偶聯(lián)即得到甘露多糖抗原因子6。
文檔編號C08B37/00GK1336378SQ00120950
公開日2002年2月20日 申請日期2000年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月2日
發(fā)明者孔繁祚, 朱玉亮 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心