專利名稱：聚天冬酰－l－精氨酸,它的制備,以及在醫(yī)學中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及DL-天冬氨酸經(jīng)脫水生成聚丁二酰亞胺，進一步與L-精氨酸反應，得到聚天冬酰-L-精氨酸；涉及用包括色譜及質(zhì)譜在內(nèi)的分析方法表征聚天冬酰精氨酸的分子量分布；涉及聚天冬酰-L-精氨酸經(jīng)口服給藥作為抗血栓劑的應用。
申請者在L-精氨酸相關的藥物研究中，曾經(jīng)把L-精氨酸共價鍵結(jié)合到丙二?；投《；?，制備血管擴張劑(Gu Mingdi，PengShiqi，Jiang Xiurong，Guo Xueqing，Cai Mengshen，EDRF-like actions ofhomoarginine.Progress in Natural Science.1993，3(2)155～159)；曾經(jīng)把L-精氨酸衍生物共價鍵結(jié)合到L-賴氨酸上，制備抗敗血性休克劑(Zhao Ming，Wang Chao，Gu Mingdi，Peng Shiqi，Studies on thesynthesis of NG-nitro-L-Arginine derivatives and their effects on septicshock.Prep.Biochem And Biotechnol.2000，30(30)241～246)；曾經(jīng)根據(jù)血小板Gp IIb/IIIa受體胞漿區(qū)的天冬氨酸殘基和精氨酸殘基之間形成的鹽橋的穩(wěn)定性(Hughest P，Dia-Conzalez F，Brea-King theintegrin hinge，J Biol Chem.1990，2716571～6574)，把L-精氨酸與L-天冬氨酸鹽成鹽，制備抗血栓劑(王銀葉、王景燕、付逸龍、王超、彭師奇，L-精氨酸L-門冬氨酸鹽對血小板功能的抑制，生理學報。2001，53(4)303～306)。這些研究結(jié)果表明，L-精氨酸通過合理組裝，可以顯示期待的心血管活性。
在實施方案中，本發(fā)明按

圖1所示的操作，將DL-天冬氨酸聚合，生成聚丁二酰亞胺。DL-天冬氨酸與85％磷酸及蒸餾水混合后，在180℃空氣浴下減壓2.5h，可順利地轉(zhuǎn)化為聚丁二酰亞胺，收率為93.4％；DL-天冬氨酸在四氫萘中回流100h，轉(zhuǎn)化為聚丁二酰亞胺，收率為44％；DL-天冬氨酸在200℃熔融反應3h，轉(zhuǎn)化為聚丁二酰亞胺，收率為16.7％。在L-精氨酸存在下，按三種途徑制得的聚丁二酰亞胺都可以開環(huán)，高收率地轉(zhuǎn)化為通式(1)的聚天冬酰-L-精氨酸，產(chǎn)率分別為95％、35％和76％。本發(fā)明采用色譜法和液質(zhì)連用儀測定了通式(1)的分子量分布，從不同的角度表征它的分子量構(gòu)成。其中凝膠過濾色譜測得按三種條件制備得聚丁二酰亞胺與L-精氨酸反應制備得聚天冬酰-L-精氨酸得分子量分別為117,600、30,200和30,000。如本領域中技術(shù)人員已知的那樣，通過控制反應條件(例如改變反應溫度、反應時間等)，可以將本發(fā)明的聚合物聚合成不同的分子量。
本發(fā)明以大鼠半體內(nèi)血小板聚集模型評價聚天冬酰-L-精氨酸的抗血小板聚集作用。在15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg劑量下，一次口服本發(fā)明的化合物，可顯著降低ADP、膠原和凝血酶誘導的血小板最大聚集率。在15mg/kg劑量下，一次口服本發(fā)明的化合物，1～6小時內(nèi)，可顯著抑制ADP誘導的大鼠血小板聚集作用。采用大鼠動靜脈旁路插管抗栓模型，在15mg/kg、60mg/kg和120mg/kg劑量下，3次/日口服本發(fā)明的化合物，可顯著抑制大鼠的血栓形成。采用大鼠頸動脈抗栓模型，在15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg劑量下，一次口服本發(fā)明的化合物，可顯著抑制FeCl3刺激的頸動脈血栓形成。在10mg/kg劑量下，靜脈給予本發(fā)明的化合物，可明顯抑制電刺激誘導的大鼠頸動脈血栓形成。在15mg/kg至60mg/kg劑量下，本發(fā)明的化合物可明顯延長大鼠出血時間。
在30mg/kg劑量下，本發(fā)明的化合物給大鼠一次灌胃，大鼠血漿中TXA2和PGI2的水平無明顯變化，而作為陽性對照的同劑量阿司匹林，則可促大鼠血漿中的TXA2和PGI2水平顯著降低。本發(fā)明的化合物的這種性質(zhì)，為它不具備引起胃腸道局部組織壞死的副作用奠定了基礎。
實施例1 加熱減壓法制備聚丁二酰亞胺將5g研細的DL-天冬氨酸于250mL圓底燒瓶中，加入2ml 85％磷酸及2mL蒸餾水，徹底混勻。在180℃空氣浴下，減壓反應2.5小時，趁熱加入20ml DMF，待產(chǎn)物完全溶解后，將反應液滴入100ml蒸餾水中，洗滌沉淀至中性，在紅外燈下烘烤24hr，得產(chǎn)物3.4g.產(chǎn)率為93.4％.元素分析(C4H3NO2)nC46.76，H3.35，N13.64.
產(chǎn)品的代號為PD1。
實施例2 共沸除水法制備聚丁二酰亞胺將50g研細的DL-天冬氨酸單體懸浮于500ml化學純的四氫萘中，回流100小時，于沸點除去生成的水，冷卻至室溫，過濾，濾渣先用乙醚洗，然后用飽和的碳酸氫鈉水溶液洗三次，每次100ml，反復研磨使球狀產(chǎn)物呈針刺狀，先用水反復洗，高速離心，分離，再用1％鹽酸洗，最后用水再反復洗，高速離心分離，直到用硝酸銀檢驗不含氯離子，得干燥亮黃色聚丁二酰亞胺約16g。產(chǎn)率43.9％元素分析(C4H3NO2)nC45.24，H3.85，N13.30。
產(chǎn)品的代號為PD2。
實施例3 熔融法制備聚丁二酰亞胺將30g研細的DL-天冬氨酸均勻平鋪于表面皿中，200℃加熱反應3小時，反應產(chǎn)物呈橙紅色.用飽和的碳酸氫鈉水溶液洗三次，每次100ml，反復研磨使球狀產(chǎn)物呈針刺狀，先用水反復洗，高速離心，分離，烘干，得產(chǎn)物5g.元素分析(C4H3NO2)nC46.63，H3.33，N13.63。收率16.7％。
氨基酸組成分析天冬氨酸∶精氨酸＝0.9∶0.6產(chǎn)品的代號為PD3。
實施例4 聚天冬酰-L-精氨酸的制備在蒸餾水中，將等摩爾L-精氨酸與聚丁二酰亞胺(按天冬酰亞胺分子量作為單元計算)室溫攪拌，反應終點由兩個指標判定①水溶液中有過量的聚丁二酰亞胺存在；②水溶液呈中性。反應完成后過濾，濾液減壓濃縮至干，得到標題化合物。由PD1得到的產(chǎn)物代號為PDR1，收率為95％；由PD2得到的產(chǎn)物代號為PDR2，收率為35％。由PD3得到的產(chǎn)物代號為PDR3，收率為76％。
實施例5 聚天冬酰-L-精氨酸的分子量表征水溶性GPC條件及參數(shù)儀器美國Hewlett-Packard公司HP1100高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器(DAD)和自動進樣器。
色譜柱Alltech Macrosphere GPC 100A 7u 250mmx4.6mm SeralNo.00110393.2Agilent Zorbax BIO SERIES GF-250，4.6mmID×250mm
PART NO.884973701(Agilent公司提供)Diol guard column，No820777.901(Agilent公司提供)流動相0.2M磷酸氫二鉀溶液，pH7.0校正標準甲狀腺球蛋白(MW670000)，IgG標準(MW150000)，牛血清白蛋白(MW67000)，卵清白蛋白(MW43000)，溶菌酶(MW14300)分子量測定方法分別用上述標準蛋白質(zhì)的洗脫體積對相應化合物分子量作標準曲線，同時測定待測化合物的洗脫體積，通過計算機程序計算出待測化合物分子量。流速0.4ml/min柱溫40℃檢測波長216nm，230nm，275nm結(jié)果相對分子量MnPDR1117,600 PDR230,200 PDR330,000。
實施例6 聚天冬酰-L-精氨酸的穩(wěn)定性a，取500ug PDR兩份，分別用1ml去離子水和生理鹽水溶解，室溫下每隔20小時進樣20ul，用HPLC法測定聚天冬酰-L-精氨酸的主峰面積。結(jié)果表明，在120小時內(nèi)，峰面積無明顯改變。
b，配置濃度為5mg/ml的PDR，加入2mol/L鹽酸或2mol/L NaOH，室溫下每隔20小時進樣20ul，用HPLC法測定聚天冬酰-L-精氨酸的主峰面積。結(jié)果表明，在120小時內(nèi)，峰面積無明顯改變。
實施例7 聚天冬酰-L-精氨酸對大鼠的半體內(nèi)抗血小板聚集作用動物Wistar大鼠，一級，雄性，270±50g雄性大鼠，220-320g，按體重平均隨機分為五組溶媒對照組、陽性藥(ASA)對照組、化合物PDR 15、30、60mg/kg三個給藥劑量組。實驗前禁食過夜。給藥1hr后，以戊巴比妥鈉溶液40mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，以1/10體積的3.8％枸櫞酸鈉溶液抗凝，1200rpm離心10min制備PRP，轉(zhuǎn)移上清PRP，繼續(xù)以3000rpm離心10min制備PPP分別以ADP、稀釋的膠原、凝血酶為聚集誘導劑，以比濁法測定血小板聚集程度，作組間比較。
PDR 30或60mg/kg胃腸道給藥后1.5h，使ADP、膠原或凝血酶誘導的半體內(nèi)血小板聚集率顯著下降，表明PDR可明顯抑制這些誘導劑引起的大鼠血小板聚集，其作用強度與同劑量的ASA相近(見表1)。
表1.PDR(P.O.)對大鼠半體內(nèi)血小板聚集的作用(n＝10)
與對照組相比**P＜0.01；***P＜0.001實施例8 聚天冬酰-L-精氨酸對家兔半體內(nèi)抗血小板聚集的作用雄性家兔(2.5Kg左右)試驗前禁食過夜，以3.8％枸櫞酸鈉抗凝，耳中動脈取血，制備PRP、PPP。以ADP為誘導劑測定給藥前血小板聚集率。以30mg/kg PDR口服單次給藥，分別在給藥后1小時、2小時、4小時、6小時取血，以給藥前相同的條件測定不同時刻血小板聚集程度，按下式計算血小板抑制百分率，繪制時效曲線。
I％＝(給藥前聚集率-給藥后聚集率)/給藥前聚集率×100PDR 30 mg/kg口服給家兔后1h、2h、4h、6h對ADP誘導的血小板聚集均有明顯的抑制作用(見表2)。
表2.PDR(P.O.)對ADP誘導的家兔半體內(nèi)血小板聚集的作用(n＝8)
與對照組相比**P＜0.01；***P＜0.001實施例9 聚天冬酰-L-精氨酸對大鼠頸動脈血栓形成的影響雄性Wistar大鼠(220～320g)按體重平均分為五組溶媒對照組、陽性藥(ASA)對照組，化合物PDR 15、30、60mg/kg三個劑量給藥組。實驗前動物禁食過夜，灌胃給藥1小時后，以戊巴比妥40mg/kg，腹腔注射麻醉，仰臥位固定。分離右頸總動脈，襯以長條塑料紙，白棉布條(4×0.5cm)滴加300μl FeCl3溶液浸潤后，包裹動脈，15min后，用動脈夾夾住近心端，剪下刺激處血管，在硫酸紙上剖開，刮下血栓，室溫干燥24hr，稱血栓重量，作組間比較。
PDR15、30或60mg/kg胃腸道給藥，可顯著抑制FeCl3誘導的頸動脈血栓形成(見表3)。表3.PDR(P.O.)對大鼠頸動脈血栓形成的作用(n＝10)
與對照組相比*P＜0.05；**P＜0.01實施例10聚天冬酰-L-精氨酸對大鼠動靜脈旁路血栓形成的影響雄性Wistar大鼠(300～350g)按體重平均分為五組，溶媒對照組(H2O)、陽性藥(ASA)對照組、7.5mg/kg、30mg/kg、120mg/kg PDR三個給藥劑量組。灌胃給藥3次，1次/12h。試驗前禁食過夜。最后一次給藥1.25h后，以戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉。仰臥位固定，分離右頸總動脈及左頸外靜脈，在聚乙烯管中放一跟長6cm已稱重的絲線，以肝素生理鹽水溶液(50μ/ml)充滿聚乙烯管。將聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后，向管中準確注入肝素(50μ/kg)抗凝，然后再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈。于給藥后2小時打開動脈夾，血流從右頸總動脈至聚乙烯管內(nèi)，再返回左頸外靜脈。開放血流15分鐘后中斷，迅速取出絲線稱重，總重量減去絲線重即得血栓濕重。各組進行組間分析。
PDR 30或120mg/kg連續(xù)3次胃腸道給藥(次/12h)，可明顯抑制動靜脈旁路血栓形成(見表4)。表4.PDR對大鼠動靜脈旁路血栓形成的影響(n＝10)
與對照組相比*P＜0.05；***P＜0.001實施例11 靜脈注射聚天冬酰-L-精氨酸對大鼠頸動脈血栓形成的影響SD大鼠(體重270～330g，雄性)，烏拉坦麻醉(ip，1.5g/kg)，分離左側(cè)頸總動脈，安置好刺激電極和熱敏探頭，舌靜脈注射PDR或NS(0.5ml/100g)，5分鐘后，以3mA電流刺激3分鐘，記錄血栓形成時間。
PDR 10mg/kg一次靜脈給藥，可顯著延長電刺激大鼠頸動脈血栓形成時間，其作用強度與ASA相近(見表5)表5 PDR(單次，iv)對大鼠電刺激頸總動脈血栓形成的影響
與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01實施例12 聚天冬酰-L-精氨酸對小鼠尾出血時間的影響昆明小鼠(20～25g)按體重隨機分為五組溶媒對照組、陽性藥(肝素)對照組、化合物PDR 15、30、60mg/kg三個劑量給藥組。除肝素組外，連續(xù)灌胃7次(2次/d)，實驗前禁食12h，末次灌胃50min后，陽性對照組動物舌靜脈注射肝素(200u/kg)，10min后，所有動物距尾尖3mm處斷尾，計時，每隔30sec用濾紙輕蘸斷尾處血滴，記錄從切斷尾尖至濾紙上不出現(xiàn)血跡的時間，為出血時間，超過15min的，按15min計算。
PDR 15、30或60mg/kg似可延長小鼠出血時間(見表6)表6.PDR對小鼠出血時間的作用(n＝10)
與對照組相比*P＜0.05實施例13 聚天冬酰-L-精氨酸對大鼠血漿TXB2和PGI2水平的影響大鼠按體重平均分為3組溶媒對照組、陽性藥(ASA)組和30mg/kg PDR組，動物給藥前禁食12h，給藥后2h戊巴比妥鈉麻醉，檸檬酸鈉抗凝，取血，制備血漿。用放免法測定血漿中TXA2和PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2和PG F1α的濃度。放免試劑盒為東雅生物技術(shù)所產(chǎn)品。
PDR 30mg/kg給藥后1h，對血漿TXB2和6-keto-PGF1α水平無明顯影響，而ASA 30mg/kg可顯著降低二者的血漿水平(見表7)。提示PDR的抗血栓作用機制可能不同于ASA。
表7.PDR對大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α濃度的影響(n＝10)
與對照組相比**P＜0.0權(quán)利要求
1.通式(1)的聚天冬酰-L-精氨酸 其中n＝10-2000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的聚天冬酰-L-精氨酸，其中n＝50-1000。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的聚天冬酰-L-精氨酸，其中n＝70-400。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的聚天冬酰-L-精氨酸的制備方法，包括將DL-天冬氨酸脫水生成聚丁二酰亞胺，進一步與L-精氨酸反應，得到聚天冬酰-L-精氨酸。
5.權(quán)利要求4的制備方法，其中將DL-天冬氨酸脫水生成聚丁二酰亞胺是通過DL-天冬氨酸在磷酸的存在下，在150-250℃空氣浴下的減壓反應來實現(xiàn)的。
6.權(quán)利要求4的制備方法，其中將DL-天冬氨酸脫水生成聚丁二酰亞胺是通過DL-天冬氨酸在四氫萘中回流來實現(xiàn)的。
7.權(quán)利要求4的制備方法，其中將DL-天冬氨酸脫水生成聚丁二酰亞胺是通過DL-天冬氨酸的熔融反應來實現(xiàn)的。
8.權(quán)利要求1-3中任一項的聚天冬酰-L-精氨酸在醫(yī)學中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的聚天冬酰-L-精氨酸在制備抗血栓劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(1)的聚天冬酰－L－精氨酸，其中n=10－2000;以及涉及其制備方法和作為抗血栓劑的應用。
文檔編號C08G69/00GK1385417SQ02120900
公開日2002年12月18日 申請日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日
發(fā)明者彭師奇, 趙明, 王超, 秦旸, 王銀葉, 呂渭川, 劉江元 申請人:華北制藥集團有限責任公司