專利名稱：硫酸化藻聚糖寡糖的制作方法
技術領域：
本發(fā)明關于在糖工業(yè)領域非常有用的硫酸化藻聚糖寡糖、及其制備方法。
背景技術：
褐藻類中含有各種硫酸化多糖。這些多糖多總稱為巖藻依聚糖或巖藻多糖，但它們的結構多因來源海藻的不同而不同。例如，分別從墨角藻、海帶、沖繩海蘊(オキナワモズク)、海蘊、裙帶菜中提取的硫酸化多糖具有不同的結構。因此，為了使硫酸化多糖經過酶分解得到其寡糖、或規(guī)定它們的結構，有必要獲得使它們分解的酶。
作為硫酸化多糖的分子種，已知的有，硫酸化藻聚糖、硫酸化巖藻葡糖醛酸甘露聚糖(Sulfated fucoglucuronomannans)、硫酸化巖藻半乳聚糖等(Sulfated fucogalactans)，此外還有其它的各種分子種。硫酸化多糖一般多具有某些生物活性，例如有報道指出，硫酸化藻聚糖部分具有強抗凝血活性，硫酸化巖藻葡糖醛酸甘露聚糖部分具有對癌細胞的脫噬誘導活性。
硫酸化多糖作為醫(yī)藥品開發(fā)時，有必要規(guī)定其結構，如果使用分解這些硫酸化多糖的酶，則對規(guī)定其結構非常有利。不過，沒有市售的分解褐藻類硫酸化多糖的酶，而且褐藻類硫酸化多糖多因海藻種類而不同，所以為了決定一種硫酸化多糖的結構，對此硫酸化多糖進行特異分解的分解酶是非常必要的。目前有對來源于海帶目海藻的硫酸化多糖的結構的研究，這些只不過證明了多個分子種中的幾種結構。
發(fā)明概述由上述可知，目前需要結構均一的硫酸化藻聚糖寡糖，其是通過使用對來源于海帶目海藻的新的硫酸化多糖進行分解的酶、也就是特異分解硫酸化藻聚糖的酶而制得的。
即，本發(fā)明旨在提供使對來源于海帶目海藻的新的硫酸化多糖進行分解的硫酸化藻聚糖分解酶作用于硫酸化藻聚糖而得到的低分子化物，及其制造方法。
本發(fā)明的第1發(fā)明是關于硫酸化藻聚糖或其鹽，其特征在于，具有下述物理化學性質(1)組成糖含有巖藻糖，(2)以下述一般式(I)表示的硫酸化糖為組成糖的必須成分 (式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H、n為1以上的整數(shù))，(3)被來源于Alteromonas sp.SN-1009的硫酸化藻聚糖分解酶所低分子化，生成選自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)表示的化合物中一種以上的化合物 (全部式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
本發(fā)明的第2發(fā)明是關于硫酸化藻聚糖寡糖，其特征在于，下述一般式(I)中n為1～5 (式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
本發(fā)明的第3發(fā)明是關于制備硫酸化藻聚糖寡糖的方法，其特征在于，使來源于Alteromonas sp.SN-1009的硫酸化藻聚糖分解酶與本發(fā)明第1或第2發(fā)明中的硫酸化藻聚糖作用，收集其分解物。
在本發(fā)明第3發(fā)明中，上述硫酸化藻聚糖也可以來源于龍目(Kjellmaniella crassifolia)、海帶或巨藻黑(Lessonianigrescens)。
本發(fā)明的第4發(fā)明是關于用本發(fā)明第3發(fā)明的方法制備的硫酸化藻聚糖寡糖。
本發(fā)明的第5發(fā)明是關于具有選自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)的化學結構的硫酸化藻聚糖寡糖或其鹽 (全部式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
也就是說，本發(fā)明者們深入研究后，發(fā)現(xiàn)了用硫酸化藻聚糖分解酶分解來源于海帶目海藻的新的硫酸化多糖、從而制備可以用作糖工程用試劑的、結構均一的硫酸化藻聚糖寡糖的方法，并可以決定這些寡糖的結構，從而完成了本發(fā)明。發(fā)明詳述下面具體說明本發(fā)明。
本發(fā)明中沒有特別限制，例如可以使用來源于海帶目海藻的硫酸化藻聚糖。該多糖以硫酸基和巖藻糖為主要構成成分。此外，來源于海帶目海藻的硫酸化藻聚糖的主鏈由比一般的糖更不耐酸的L-巖藻糖組成，所以通過加熱和酸處理很容易低分子化。
本發(fā)明可以使用具備前述特征的硫酸化藻聚糖。其來源沒有特別限制，不過作為硫酸化藻聚糖含量多的原料，優(yōu)選例如龍目、海帶、或巨藻黑等每帶目海藻。
本發(fā)明的硫酸化藻聚糖分解酶，與硫酸化藻聚糖和硫酸化藻聚糖寡糖等作用將巖藻糖與巖藻糖之間的α-L-巖藻糖鍵從內部加水分解，生成還原性末端具有L-巖藻糖的寡糖。
本發(fā)明的硫酸化藻聚糖寡糖是使硫酸化藻聚糖與本發(fā)明的硫酸化藻聚糖分解酶作用所得的寡糖，其還原性末端糖是L-巖藻糖。
制備本發(fā)明所用的硫酸化藻聚糖時，首先得到褐藻類的水溶性部分提取液。此時為防止硫酸化藻聚糖的低分子化，優(yōu)選pH4～9、溫度100℃以下。此外，上述提取液中的氨基酸和低分子性的色素等可以通過超濾有效除去。用活性炭處理等還可以有效除去疏水性物質。
這樣可以得到褐藻類的硫酸化多糖部分。該部分可以作為硫酸化藻聚糖部分、例如作為本發(fā)明的硫酸化藻聚糖分解酶的底物使用。將此部分用陰離子交換柱分離可以得到純度更高的硫酸化藻聚糖。上述的硫酸化多糖部分和用陰離子交換柱精制后的硫酸化藻聚糖都可以用作制造本發(fā)明的硫酸化藻聚糖寡糖的原料。
本發(fā)明硫酸化藻聚糖的主骨架由下述一般式(I)表示。下述一般式中，n為1以上的整數(shù)，例如1～20,000的范圍，進一步優(yōu)選1～10,000范圍的包含在本發(fā)明的硫酸化藻聚糖中。此外，只要在上述范圍內，具有下述一般式(I)連續(xù)重復結構的、以及具有夾雜了其它結構、非連續(xù)地包含下述一般式(I)結構的，都可包含在本發(fā)明的硫酸化藻聚糖中。 (式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
生產本發(fā)明所用硫酸化藻聚糖分解酶的菌株，根據Bergey’sManual of Determinative Bacteriology，第9卷(1994)上記載的基本分類可以被分類為交替單胞菌屬細菌。不過，近年來對交替單胞菌屬細菌進行了再編，僅根據細菌學性質分類并不恰當。這里，規(guī)定了本菌株的16S rDNA的堿基序列，與已知的細菌進行了相同性的比較，相同性最高的細菌為Thalassomonas屬。不過，其遺傳距離為0.05(變化/平均核苷酸位置)以上，不能確定為同族。這里，本發(fā)明者們根據16S rDNA序列的相同性，確定本菌株為不屬于已知屬的新屬細菌，并將本菌株命名為藻聚糖菌屬SN-1009(fucanobacter lyticusSN-1009)。本說明書中交替單胞菌屬sp.SN-1009(Alteromonas sp.SN-1009)與藻聚糖菌屬SN-1009為相同物質。
此外，作為上述菌株，Alteromonas sp.SN-1009由305-8566日本茨城縣つくげ市東1-1-1中央第6、獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許生物保藏中心自平成8年2月13日(原保藏日)起作為FERMBP-5747保藏，根據布達佩斯條約自平成8年11月15日(移交保管日)起由國際保藏。序列表的序列號1中顯示了本菌株的16S rDNA序列。
因此，培養(yǎng)經16S rDNA序列判斷與藻聚糖菌屬SN-1009同族的細菌，可以制備本發(fā)明所用的硫酸化藻聚糖分解酶。此外，本發(fā)明中除了上述Alteromonas sp.SN-1009株以外，可以利用Alteromonas sp.SN-1009株的自然或人工變異株、以及其他屬于交替單胞菌屬、Thalassomonas屬的菌種等、具有產生本發(fā)明用硫酸化藻聚糖分解酶能力的微生物。
本發(fā)明的硫酸化藻聚糖寡糖可以通過使硫酸化藻聚糖分解酶與硫酸化藻聚糖含有物作用來制備。作為硫酸化藻聚糖含有物，優(yōu)選使用例如，硫酸化藻聚糖的部分精制品、來源于褐藻類的含硫酸化巖藻糖多糖部分、褐藻類水性溶劑提取物、或者褐藻類藻體。
制備本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖時，若使用通常方法溶解硫酸化藻聚糖、或硫酸化藻聚糖含有物的話比較好，溶液中本發(fā)明硫酸化藻聚糖、或硫酸化藻聚糖含有物也可以用其最高溶解濃度，不過一般考慮其操作性、反應中所用本發(fā)明硫酸化藻聚糖分解酶的量而定比較好。作為硫酸化藻聚糖溶解液，可以根據需要選擇水、緩沖液等。溶解液的pH通常為中性附近、酶反應通常在30℃附近進行。對反應所用本發(fā)明硫酸化藻聚糖分解酶的混合比例和使用量、反應液的組成、反應時間等進行調整，可以調整硫酸化藻聚糖寡糖的分子量。將這樣所得的本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖通過分子量分級或陰離子交換柱分級，可以進一步制備成具有均一分子量或均一電荷密度分布的本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖。分子量分級可以使用常用的方法，若使用例如凝膠過濾法和分子量分級膜比較好。低分子化物，根據需要可以進一步進行離子交換樹脂處理、活性炭處理等精制操作，根據需要還可以進行脫鹽處理、無菌處理、冷凍干燥處理。根據這些方法，后述可以得到的具有均一結構的本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖，其結構可以由NMR分析判定。
本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖，沒有特別限制，例如具有選自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)的化學結構的硫酸化藻聚糖寡糖或其鹽 (全部式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖，其分子中有硫酸基，此基團與各種堿基反應形成鹽。本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖成鹽后的形態(tài)穩(wěn)定，通常被以鈉和/或鉀和/或鈣等的鹽的形態(tài)提供。這些物質的鹽可以通過Dowex50W等陽離子交換樹脂導入到游離的本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖。此外，根據需要可以進行已知慣用的鹽交換，交換成各種所需的鹽。
本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖的鹽，可以使用可藥用的鹽，例如可以舉出鈉、鉀等堿金屬、鈣、鎂、鋅等堿土金屬、銨等的鹽。
此外，本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖可以用作糖工程用試劑。例如，根據特公平5-65108號公報記載的方法進行2-氨基吡啶化(PA化)、制備該寡糖的PA-化物，可以得到可用作硫酸化藻聚糖寡糖的熒光標識標準物的、作為糖工程用試劑極為有用的物質。
實施例下面用實施例對本發(fā)明進行具體說明，不過本發(fā)明并不只限于以下實施例范圍。
本實施例中硫酸化藻聚糖寡糖的分子量為由質量分析結果算出的平均分子量。參考例1 制備來源于龍目的巖藻依聚糖將2kg養(yǎng)殖后的干燥龍目用安裝有孔徑1mm的篩子的切割機(增幸產業(yè)社制造)粉粹，在20升80％乙醇中懸濁后，在25℃攪拌3小時后，用濾紙過濾。將所得的殘渣在40升含100mM氯化鈉的30mM磷酸緩沖液(pH6.5)中懸濁，在95℃下處理2小時后，用孔徑106μm的不銹鋼篩子過濾。在所得濾液中添加200g活性炭、4.5升的乙醇、12,000U的藻酸裂解酶K(ナカゼ生化學工業(yè)社制造)，25℃下攪拌20小時后，離心分離。將所得上清液，用安裝有排除分子量10萬的中空纖維的超濾機濃縮成4升后，離心分離除去不溶物，5℃下放置24小時。離心分離除去生成的沉淀，所得上清液用超濾機在100mM氯化鈉中進行溶劑置換。此溶液在4℃以下冷卻后，用鹽酸調pH為2.0，離心分離除去生成的沉淀。用氫氧化鈉將所得上清液pH調為8.0，濃縮成4升后，用超濾機在20mM氯化鈉中進行溶劑置換。離心分離除去此溶液中的不溶物后，冷凍干燥，得到76g來源于龍目的巖藻依聚糖的干燥物。參考例2 制備硫酸化藻聚糖部分將7g參考例1中記載的巖藻依聚糖干燥物溶解在含有50mM氯化鈉和10％乙醇的700ml 20mM咪唑鹽酸緩沖液(pH8.0)中，離心分離除去不溶物。所得上清液倒入經相同緩沖液平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱(11.4×48cm)中，用相同緩沖液洗凈后，由50mM到1.95M的氯化鈉濃度梯度洗脫。洗脫液以每250ml分別取出。各部分的總糖量用苯酚硫酸法、糖醛酸量用咔唑硫酸法測定。按洗脫順序歸整43-49、50-55、56-67部分的部分，分別用電透析脫鹽后冷凍干燥，由43-49部分得到340mg，50-55部分得到870mg，56-67部分得到2.64g干燥物。以由56-67部分得到的部分作為硫酸化藻聚糖部分。參考例3 硫酸化藻聚糖分解酶活性測定方法12μl 2.5％的硫酸化藻聚糖部分的溶液與60μl 50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)、9μl 4M氯化鈉、6μl 1M氯化鈣、21μl水、12μl本發(fā)明硫酸化藻聚糖分解酶溶液混合，30℃下反應3小時后，將反應液在100℃處理10分鐘，離心分離后取100μl用HPLC分析，測定低分子化程度。作為對照，用HPLC對下列物質進行同樣的分析，即，用溶解酶溶液的緩沖液代替硫酸化藻聚糖分解酶溶液進行反應所得的物質以及用水代替硫酸化藻聚糖部分進行反應得到的物質。
1單位硫酸化藻聚糖分解酶活性為，上述反應體系中1分鐘內切斷1μmol硫酸化藻聚糖的巖藻糖鍵的酶的量。硫酸化藻聚糖分解酶活性由下式求出。
{(12×1000×2.5/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.012)}＝U/ml12×1000×2.5/100已添加的硫酸化藻聚糖部分(μg)MG底物硫酸化藻聚糖的平均分子量M反應生成物的平均分子量(MG/M)-1∶1分子的硫酸化藻聚糖被酶切斷部位數(shù)180反應時間(分鐘)0.012酶液量(ml)此外，HPLC條件如下，裝置L-6200型(日立制作所制造)，柱OHpak SB-806HQ(8×300mm、昭和電工社制造)，
洗脫液含5mM的迭氮化鈉的50mM氯化鈉，檢測視差折射率檢測器(Shodex RI-71、昭和電工社制造)，流速1ml/分，柱溫25℃。
為了測定反應生成物的平均分子量，將市售的分子量已知的支鏈淀粉(STANDARD P-82、昭和電工社制造)在與上述HPLC分析相同條件下進行分析，用曲線表示支鏈淀粉分子量與保留時間的關系，作為測定上述反應生成物分子量的標準曲線。此外，蛋白質的定量是通過測定酶液280nm處的吸光度來進行的。此時1mg/ml蛋白質溶液的吸光度按1.0計算。實施例1制備硫酸化藻聚糖分解酶將藻聚糖菌屬SN-1009接種到培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)24小時成為種培養(yǎng)液，其中此培養(yǎng)基為，將4ml由含有0.2％按參考例1方法制備的巖藻依聚糖和0.3％胨的pH8.2的人工海水(ジヤマリンラボラトリ-制造)所組成的培養(yǎng)基在120℃高壓滅菌處理20分鐘后所得。將600ml由含有0.25％葡萄糖、1％胨、0.05％酵母膏以及消泡劑(KM70、信越化學工業(yè)制造)的pH8.2的人工海水所組成的培養(yǎng)基放入到2升三角燒瓶中，120℃下高壓滅菌處理20分鐘，將上述種培養(yǎng)物接種到此處理后的培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)20小時，然后將此培養(yǎng)后的物質放入到另一培養(yǎng)基上、與對按參考例1方法制備的巖藻依聚糖在100℃下處理20分鐘后的物質混合，接種上述種培養(yǎng)物，其中上述另一培養(yǎng)基為，將20升由含有1％胨、0.02％酵母膏及消泡劑(KM70、信越化學工業(yè)制造)的pH8.2的人工海水所組成的培養(yǎng)基放入到30升廣口發(fā)酵缸中，120℃下高壓滅菌處理20分鐘后得到。培養(yǎng)在25℃進行28小時。培養(yǎng)結束后，離心分離培養(yǎng)液得到菌體和培養(yǎng)上清液。
所得培養(yǎng)上清液經裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾裝置濃縮后，在含有10mM氯化鈣和150mM氯化鈉的20mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH8.2)中進行溶劑置換，離心分離得到上清液。
將所得上清液裝在經相同緩沖液平衡化后的2升DEAE-Cellulofine-800的柱子中，用相同緩沖液洗凈后，經從150mM到400mM的氯化鈉濃度梯度洗脫，將洗脫液按每63ml分開，收集活性部分。
所得活性部分經裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾裝置濃縮后，在含有10mM氯化鈣和100mM氯化鈉的20mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH8.2)中進行溶劑置換。將此酶溶液裝在經相同緩沖液平衡化后的200ml DEAE-Cellulofine-800柱中，用相同緩沖液洗凈后，經從100mM到300mM的氯化鈉濃度梯度洗脫，將洗脫液按每19ml分開，收集活性部分。
所得活性部分經裝有排除分子量1萬的超濾膜的超濾裝置濃縮后，添加氯化鈉使其濃度達到4M，然后裝入經含有100mM氯化鈣和4M氯化鈉的20mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.0)平衡化后的苯基-瓊脂糖CL-4B的柱子中，用相同緩沖液洗凈后，經從4M到1M的氯化鈉濃度梯度洗脫，將洗脫液按每9.4ml分開。這樣得到硫酸化藻聚糖分解酶的精制物。實施例2 使用硫酸化藻聚糖分解酶的硫酸化藻聚糖寡糖的制備、精制以及結構分析-(1)(1)制備200g養(yǎng)殖后的龍目干燥物浸入10升含45mM氯化鈣、500mM氯化鈉、9％乙醇的18mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.0)中，添加30U硫酸化藻聚糖分解酶，室溫下攪拌2天后，用濾紙過濾，使用裝有排除分子量10萬的中空纖維的超濾機回收低分子部分，作為硫酸化藻聚糖寡糖部分1。(2)精制實施例2-(1)中所得的硫酸化藻聚糖寡糖部分1經脫鹽裝置(Micro Acilyzer G3、旭化成工業(yè)制造)脫鹽后，用旋轉蒸發(fā)器濃縮。向此硫酸化藻聚糖寡糖溶液1中添加咪唑、并使其濃度為10mM和添加氯化鈉、并使其濃度為300mM，然后裝入1升經含300mM氯化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.0)平衡化后的DEAE-CellulofineA-800柱子中，用相同緩沖液充分洗凈后經從300mM到1200mM的氯化鈉濃度梯度洗脫。歸總洗脫后的部分，用苯酚-硫酸法計算總糖量，咔唑-硫酸法計算總糖醛酸量。結果洗脫部分存在至少4個明顯峰，所以對各個峰部分進行了質量分析。此外查找各個峰的糖組成時，發(fā)現(xiàn)只含巖藻糖不含糖醛酸。由糖組成考慮的各質量寡糖被認為具有表1所示組成。
表1

接著收集形成各峰的部分，分別用蒸發(fā)器濃縮后在下述條件下精制。
柱YMC Pack Polyamine II(20×250mm、YMC社制造)流速8ml/分柱溫30℃平衡化溶液0.5M含有10％乙腈的磷酸二氫鈉洗脫溶液從0.5M含有10％乙腈的磷酸二氫鈉到1.5M含有10％乙腈的磷酸二氫鈉濃度梯度。不過對于峰號1-(4)，使用從787.5mM含有10％乙腈的磷酸二氫鈉到1462.5mM含有10％乙腈的磷酸二氫鈉濃度梯度。
收集每份4ml
檢測苯酚硫酸法對上述經柱色譜收集后的部分進行質量分析，作為主峰，分別由峰1-(1)得到質量1914的物質、由峰1-(2)得到質量2264的物質、由峰1-(3)得到質量2366的物質、由峰1-(4)得到質量為3460的物質。收集各峰部分，裝入經10％乙醇平衡化后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脫、脫鹽。這樣得到本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～(4)。(3)結構分析根據使用2-氨基吡啶的熒光標識法，對實施例2-(2)中所得本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～(4)進行還原末端糖和糖組成的分析，發(fā)現(xiàn)寡糖1-(1)～(4)的還原末端糖和糖組成都是巖藻糖。接著測定硫酸含量(利用氯化鋇比濁法)、糖醛酸含量(根據咔唑-硫酸法)。此外，使用JNMα-500型核磁共振裝置(日本電子社制造)進行NMR分析。根據規(guī)定方法用重水置換分析試樣后，進行結構分析。使用作為1H-異核檢測的檢測法的HMBC法分析組成糖的鍵。使用DQF-COSY法和HOHAHA法對1H-NMR進行歸屬，使用HSQC法對13C-NMR進行歸屬。
下面顯示寡糖1-(1)～(4)的物性。(a)寡糖1-(1)的物性質量分析和NMR分析的歸屬結果如下所示，本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的1H-NMR譜圖如

圖1、13C-NMR如圖2、質譜圖如圖3所示。圖1、圖2中縱軸表示信號強度、橫軸表示化學位移值(ppm)。此外，圖3中縱軸表示相對強度(％)、橫軸表示m/z值。
分子量；1914MS m/z 455.0[M-4Na+]4-、614.8[M-3Na+]3-、933.8[M-2Na+]2-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表2和表3中。
表2

表3

糖組成 僅L-巖藻糖(6分子)硫酸基 10分子鈉 10分子此外1H-NMR與13C-NMR中峰歸屬序號按照下式(IV)。 (b)寡糖1-(2)的物性質量分析和NMR分析的歸屬結果如下所示，本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的1H-NMR譜圖如圖4、13C-NMR如圖5、質譜圖如圖6所示。圖4、圖5中縱軸表示信號強度、橫軸表示化學位移值(ppm)。此外，圖6中縱軸表示相對強度(％)、橫軸表示m/z值。
分子量；2264MS m/z 354.2[M-6Na+]6-、429.8[M-5Na+]5-、543.0[M-4Na+]4-、731.6[M-3Na+]3-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表4和表5中。
表4

典型工作電位(伏)表1

注意上表中，括號中所示為優(yōu)選條件。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，在給柵或P阱兩者的任一個或這兩者上加斜坡電壓或階梯電壓進行擦期間，浮柵29和P阱30間維持恒定電場。例如，P阱電壓可以是+3～+7伏的斜坡電壓或階梯電壓，和/或柵上電壓為-5～-9伏的斜坡電壓。這種技術有利于在進行較快擦除的同時對要擦除位進行慢擦除。這有助于擦除時間分布的緊湊，同時可以減小誘生漏電流造成的擦除應力。還有利于消除對擦除驗證操作的需求。
這里稱作“擦除-2”的附加擦除操作可以進行用P阱電壓的源邊緣擦除，以抑制帶-帶隧穿電流。還可以減少窗關閉。這種擦除可減少擦除期間的功耗，通過減少在源-柵區(qū)的邊緣產生的熱空穴可以增強器件的耐久性。類似的編程操作稱之謂“編程-2”。
分子量；2366MS m/z 371.4[M-6Na+]6-、450.3[M-5Na+]5-、568.6[M-4Na+]4-、765.7[M-3Na+]3-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表6和表7中。
表6

表7

糖組成 僅L-巖藻糖(7分子)硫酸基 13分子鈉 13分子此外1H-NMR與13C-NMR中信號歸屬序號按照下式(VI)。 (d)寡糖1-(4)的物性質量分析的結果如下所示，本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的1H-NMR譜圖如圖10、13C-NMR如圖11、質譜圖如圖12所示。圖10、圖11中縱軸表示信號強度、橫軸表示化學位移值(ppm)。此外，圖12中縱軸表示相對強度(％)、橫軸表示m/z值。
分子量；3460MS m/z 409.6[M-8Na+]8-、471.4[M-7Na+]7-、553.8[M-6Na+]6-、669.3[M-5Na+]5-、842.3[M-4Na+]4-、1130.8[M-3Na+]3-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表8～表10中。
表8

表9

表10

糖組成 僅L-巖藻糖(11分子)
硫酸基 18分子鈉 18分子此外1H-NMR與13C-NMR中信號歸屬序號按照下式(VII)。 實施例3 使用硫酸化藻聚糖分解酶的硫酸化藻聚糖寡糖的制備、精制以及結構分析-(2)(1)制備養(yǎng)殖后的龍目干燥物用裝有孔徑1mm篩子的切割機(增幸產業(yè)制造)作成片。將250g龍目片在5升80％乙醇中懸濁，室溫下攪拌2小時后，過濾。用此80％乙醇重復4次洗凈，得到龍目洗凈物。將250g此龍目洗凈物在5升含有125mM氯化鈣、250mM氯化鈉和10％乙醇的17mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.5)中懸濁，室溫下攪拌24小時后，過濾，離心分離，得到龍目巖藻依聚糖溶液。在1升此提取液中添10U硫酸化藻聚糖分解酶，室溫下攪拌3天后，用濾紙過濾，離心分離濾液，得到上清液，用裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾機，回收低分子部分，作為硫酸化藻聚糖寡糖部分2。(2)精制實施例3-(1)中所得的硫酸化藻聚糖寡糖部分2，裝入1升經含100mM氯化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.5)平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液充分洗凈后，經從100mM到1M的氯化鈉濃度梯度洗脫。歸總洗脫后的部分，用苯酚-硫酸法計算總糖量，咔唑-硫酸法計算總糖醛酸量。結果洗脫部分形成2個峰，所以對各個峰部分進行了質量分析。此外查找各個峰的糖組成時，發(fā)現(xiàn)只含巖藻糖不含糖醛酸。根據糖組成考慮的各質量寡糖被認為具有表11所示組成。
表11

接著收集形成各峰的部分，分別用蒸發(fā)器濃縮后在與實施例2-(2)相同的條件下精制。
對用YMC Pack Polyamine II柱進行柱色譜分別取得的部分進行質量分析，作為主峰，分別由峰2-(1)得到質量1914和2016的物質、由峰2-(2)得到質量3110的物質。
收集含有質量1914、2016和3110的物質峰附近的部分，裝入經10％乙醇平衡化后的Cellulofine GCL-25柱子中，用10％乙醇洗脫、脫鹽。這樣得到本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-1、2-(1)-2和2-(2)。(3)結構分析根據使用2-氨基吡啶的熒光標識法，對實施例3-(2)中所得本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-1、2-(1)-2和2-(2)進行還原性末端糖和糖組成的分析，發(fā)現(xiàn)還原性末端糖和糖組成都是巖藻糖。接著測定硫酸含量(使用氯化鋇比濁法)、糖醛酸含量(根據咔唑-硫酸法)。此外，使用JNMα-500型核磁共振裝置(日本電子社制造)進行NMR分析。根據規(guī)定方法用重水置換分析試樣后，進行結構分析。使用作為1H-異核檢測的檢測法的HMBC法對組成糖的鍵進行分析。使用DQF-COSY法和HOHAHA法對1H-NMR進行歸屬，使用HSQC法對13C-NMR進行歸屬。
下面顯示寡糖2-(1)-1、2-(1)-2和2-(2)的物性。(a)硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-1的物性。
上述分析結果表明，硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-1與本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)為相同物質。(b)硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-2的物性。
質量分析和NMR分析的歸屬結果如下所示，1H-NMR譜圖如圖13、13C-NMR如圖14、質譜圖如圖15所示。圖13、圖14中縱軸表示信號強度、橫軸表示化學位移值(ppm)。此外，圖15中縱軸表示相對強度(％)、橫軸表示m/z值。
分子量；2016MS m/z 313.1[M-6Na+]6-，380.3[M-5Na+]5-，481.1[M-4Na+]4-，649.1[M-3Na+]3-，985.0[M-2Na+]2-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表12和表13中。
表12

表13

糖組成 僅L-巖藻糖(6分子)硫酸基 11分子鈉 11分子此外1H-NMR與13C-NMR中信號歸屬序號按照下式(VIII)。 (c)寡糖2-(2)的物性質量分析結果如下所示，本發(fā)明硫酸化藻聚糖寡糖2-(2)的1H-NMR譜圖如圖16、13C-NMR如圖17、質譜圖如圖18所示。圖16、圖17中縱軸表示信號強度、橫軸表示化學位移值(ppm)。此外，圖18中縱軸表示相對強度(％)、橫軸表示m/z值。
分子量；3111MS m/z 365.8[M-8Na+]8-、421.4[M-7Na+]7-、495.2[M-6Na+]6-、599.1[M-5Na+]5-、755.0[M-4Na+]4-、1013.7[M-3Na+]3-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表14～表16中。
表14

表15

表16

糖組成 僅L-巖藻糖(10分子)硫酸基 16分子鈉 16分子此外1H-NMR與13C-NMR中信號歸屬序號按照下式(IX)。 實施例4 使用硫酸化藻聚糖分解酶的海帶硫酸化藻聚糖寡糖的制備、精制以及結構分析-(3)(1)制備養(yǎng)殖后的海帶干燥物用裝有孔徑1mm篩子的切割機(增幸產業(yè)制造)作成片。將500g海帶片在4.5升80％乙醇中懸濁，室溫下攪拌24小時后，過濾。用此80％乙醇重復3次洗凈，得到海帶片洗凈物。將全部此海帶片洗凈物在10升含有50mM氯化鈣、200mM氯化鈉和10％乙醇的、50mM pH8.0咪唑鹽酸緩沖液中懸濁，向其中添加2U硫酸化藻聚糖分解酶，室溫下攪拌5天后，用濾紙過濾，離心分離濾液，得到上清液，用裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾機，回收低分子部分，作為海帶硫酸化藻聚糖寡糖部分1。(2)精制向上述(1)中所得的海帶硫酸化藻聚糖寡糖部分1中添加10％乙醇，使其與下述平衡化用緩沖液具有相同的電導率，裝入500ml經含200mM氯化鈉和10％乙醇的20mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.5)平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液洗凈后，經從200mM到1.2M的氯化鈉濃度梯度洗脫。洗脫時使用4.5升緩沖液，收集時每份50ml。歸總洗脫后的部分，用苯酚-硫酸法計算總糖量，咔唑-硫酸法計算總糖醛酸量。結果洗脫部分形成3個峰。收集第2個峰附近的部分(44-48)，用蒸發(fā)器濃縮成40ml后，裝入經10％乙醇平衡化后的4.1×90cm Cellulofine GCL-25柱子中，用10％乙醇洗脫。歸總洗脫的部分，用苯酚-硫酸法計算總糖量，咔唑-硫酸法計算總糖醛酸量。收集被檢出糖的部分，用蒸發(fā)器濃縮成8.4ml后，在下述條件下精制。
柱YMC Pack Polyamine II(20×250mm、YMC社制造)
流速8ml/分柱溫30℃平衡化溶液875mM含有10％乙腈的磷酸二氫鈉洗脫溶液從875mM含有10％乙腈的磷酸二氫鈉到1.4M含有10％乙腈的磷酸二氫鈉濃度梯度。
分取每根4ml檢出苯酚硫酸法收集上述經柱色譜分級的部分(分3次，第50-59部分附近)，用排除分子量3500的透析管相對于10％乙醇進行透析，用蒸發(fā)器濃縮成約40ml后，裝入經10％乙醇平衡化后的Cellulofine GCL-25柱子中，用10％乙醇洗脫。
歸總洗脫的部分，用苯酚硫酸法測定總糖量。收集主峰的附近，同樣再用Cellulofine GCL-25精制。收集本洗脫部分的主峰，用SpeedVac濃縮后，冷凍干燥，得到海帶硫酸化藻聚糖寡糖1。(3)結構分析用實施例2中記載的方法進行寡糖的結構分析，發(fā)現(xiàn)海帶硫酸化藻聚糖寡糖1的結構與實施例2中記載的硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)相同。實施例5 巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖的制備、精制和結構分析(1)制備按照參考例1中記載的方法由巨藻黑的干燥片制備來源于巨藻黑的巖藻依聚糖。
即，將10g來源于巨藻黑的巖藻依聚糖溶解在2升含有50mM氯化鈣、300mM氯化鈉和10％乙醇的、50mM pH8.0咪唑-鹽酸緩沖液中，向其中添加1U硫酸化藻聚糖分解酶，室溫下攪拌40小時后，用裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾機，回收低分子部分，作為巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖部分1。(2)精制上述(1)中所得的巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖部分1，裝入1000ml經含200mM氯化鈉和10％乙醇的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.0)平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液洗凈后，經從200mM到700mM的氯化鈉濃度梯度洗脫。洗脫時使用5升的緩沖液，收集時每份56ml。歸總洗脫后的部分，用苯酚-硫酸法計算總糖量，咔唑-硫酸法計算總糖醛酸量。結果洗脫部分形成7個峰。收集各峰附近的部分，用蒸發(fā)器濃縮成40ml后，(下面將其稱為巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～1-(7))裝入經10％乙醇平衡化后的4.1×90cmCellulofine GCL-25柱子中，用10％乙醇洗脫。歸總洗脫的部分，用苯酚-硫酸法計算總糖量，咔唑-硫酸法計算總糖醛酸量。收集被檢出糖的部分，用蒸發(fā)器濃縮后，在下述條件下精制。
柱YMC Pack Polyamine II(20×250mm、YMC社制造)流速8ml/分柱溫30℃平衡化溶液對于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)、(2)、(3)，使用含有10％乙腈的90mM磷酸二氫鈉。對于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)、(5)，使用含有10％乙腈的630mM磷酸二氫鈉。對于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(6)，使用含有10％乙腈的720mM磷酸二氫鈉。對于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)，使用含有10％乙腈的900mM磷酸二氫鈉。
洗脫對于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)、(2)、(3)，使用從含有10％乙腈的90mM磷酸二氫鈉到含有10％乙腈的900mM磷酸二氫鈉濃度梯度。對于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)、(5)，使用從含有10％乙腈的630mM磷酸二氫鈉到含有10％乙腈的1260mM磷酸二氫鈉濃度梯度。對于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(6)，使用從含有10％乙腈的720mM磷酸二氫鈉到含有10％乙腈的1440mM磷酸二氫鈉濃度梯度。對于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)，使用從含有10％乙腈的900mM磷酸二氫鈉到含有10％乙腈的1620mM磷酸二氫鈉濃度梯度。
收集每份4ml檢測苯酚硫酸法在巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～1-(7)的上述經柱色譜分級的部分中，收集各自的糖洗脫部分，用蒸發(fā)器濃縮成約40ml后，裝入經10％乙醇平衡化后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脫。
歸總洗脫的部分，用苯酚硫酸法測定總糖量。收集主峰的附近，同樣再用Cellulofine GCL-25精制。不過，對于，巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)，由于認為其有2個主峰，所以分別記為巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-1和1-(7)-2。收集各個洗脫部分的主峰，用Speed Vac濃縮后，冷凍干燥，得到巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～1-(7)-2。(3)結構分析用實施例2中記載的方法進行寡糖的結構分析。
下面顯示了巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～1-(7)-2的物性。(a)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的物性質量分析和NMR分析的歸屬結果如下所示，1H-NMR譜圖如圖19、13C-NMR如圖20、質譜圖如圖21所示。圖19、圖20中縱軸表示信號強度、橫軸表示化學位移值(ppm)。此外，圖21中縱軸表示相對強度(％)、橫軸表示m/z值。
分子量；718MS m/z 216.5[M-3Na+]3-，336.0[M-2Na+]2 -，695.0[M-Na+]-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表17中。
表17

糖組成 僅L-巖藻糖(2分子)硫酸基 4分子鈉 4分子此外1H-NMR與13C-NMR中信號歸屬序號按照下式(X)。

(b)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的物性質量分析和NMR分析的歸屬結果如下所示，1H-NMR譜圖如圖22、13C-NMR如圖23、質譜圖如圖24所示。圖22、圖23中縱軸表示信號強度、橫軸表示化學位移值(ppm)。此外，圖24中縱軸表示相對強度(％)、橫軸表示m/z值。
分子量；966MS m/z 459.9[M-2Na+]2-，942.9[M-Na+]-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表18中。
表18

糖組成 僅L-巖藻糖(3分子)硫酸基 5分子鈉 5分子此外1H-NMR與13C-NMR中信號歸屬序號按照下式(XI)。 (c)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的物性質量分析和NMR分析的歸屬結果如下所示，1H-NMR譜圖如圖25、13C-NMR如圖26、質譜圖如圖27所示。圖25、圖26中縱軸表示信號強度、橫軸表示化學位移值(ppm)。此外，圖27中縱軸表示相對強度(％)、橫軸表示m/z值。
分子量；1068MS m/z 332.9[M-3Na+]3-，511.0[M-2Na+]2 -，1045.0[M-Na+]-1H-NMR與13C-NMR的分析結果示于表19中。
表19

糖組成 僅L-巖藻糖(3分子)硫酸基 6分子鈉 6分子此外1H-NMR與13C-NMR中信號歸屬序號按照下式(XII)。 (d)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的物性用實施例2中記載的方法進行結構分析，發(fā)現(xiàn)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的結構與實施例2中記載的硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)相同。(e)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(5)的物性用實施例2中記載的方法進行結構分析，發(fā)現(xiàn)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(5)的結構與實施例2中記載的硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)相同。(f)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(6)的物性本發(fā)明巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(6)的質量分析結果如下所示。
分子量；3461MS m/z 361.5[M-9Na+]9-，409.62[M-8Na+]8 -，471.42[M-7Na+]7-，553.81[M-6Na+]6-，669.31[M-5Na+]5-，842.32[M-4Na+]4-，1130.83[M-3Na+]3-糖組成 僅L-巖藻糖(11分子)硫酸基 18分子鈉 18分子(g)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-1的物性本發(fā)明巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-1的質量分析結果如下所示。
分子量；4659MS m/z 442.82[M-10Na+]10-，494.72[M-9Na+]9-，559.32[M-8Na+]8-，642.62[M-7Na+]7 -，753.52[M-6Na+]6-，908.82[M-5Na+]5-，1141.43[M-4Na+]4-糖組成 僅L-巖藻糖(15分子)硫酸基 24分子鈉 24分子(h)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-2的物性本發(fā)明巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-2的質量分析結果如下所示。
分子量；3564MS m/z 373.12[M-9Na+]9-，422.52[M-8Na+]8-，486.32[M-7Na+]7-，571.01[M-6Na+]6-，689.61[M-5Na+]5-，868.02[M-4Na+]4-，1164.93[M-3Na+]3-糖組成 僅L-巖藻糖(11分子)硫酸基 19分子鈉 19分子實施例6使用硫酸化藻聚糖分解酶的硫酸化藻聚糖寡糖的制備、精制以及結構分析-(3)(1)制備10g參考例1中記載的、來源于養(yǎng)殖后的龍目的巖藻依聚糖溶解在4.8升含125mM氯化鈣、250mM氯化鈉、10％乙醇的17mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.5)中，添加10U硫酸化藻聚糖分解酶，室溫下攪拌72小時后，得到龍目巖藻依聚糖寡糖溶液。使用裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾機，回收低分子部分，作為硫酸化藻聚糖寡糖部分3。(2)分析上述(1)中所得的硫酸化藻聚糖寡糖部分3，裝入1升經含100mM氯化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.5)平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱子中，用相同緩沖液充分洗凈后，經從100mM到1M的氯化鈉濃度梯度洗脫。歸總洗脫后的部分，用苯酚-硫酸法計算總糖量，咔唑-硫酸法計算總糖醛酸量。結果洗脫部分形成2個峰，所以對各個峰部分進行了質量分析。此外查找各個峰的糖組成時，發(fā)現(xiàn)只含巖藻糖不含糖醛酸。根據糖組成考慮的各質量寡糖被認為具有表20所示組成。
表20

結果表明上表所示的各種硫酸化藻聚糖寡糖包含在硫酸化藻聚糖寡糖部分3中。實施例7使用硫酸化藻聚糖分解酶的硫酸化藻聚糖寡糖的制備、精制、結構分析以及生理活性。(1)除了實施例2-(2)中所得的DEAE-Cellulofine柱色譜中的4個明顯峰以外，還發(fā)現(xiàn)了用更高鹽濃度洗脫所得的寬峰，以其作為寡糖4收集，用與實施例2同樣的方法進行NMR分析。結果得到與硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)幾乎相同的譜圖。由此可推知，寡糖4具有多個分子寡糖1-(2)相結合的結構。所以，將寡糖4用實施例1記載的硫酸化藻聚糖分解酶分解，對分解物進行HPLC分析時，發(fā)現(xiàn)反應生成物大部分在與硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)相同位置洗脫。
使用以支鏈淀粉作為標準物的凝膠過濾法測定上述寡糖4的分子量，結果表明寡糖(4)的分子量是寡糖1-(2)的3倍左右。
此外，通過對寡糖4的1H-NMR譜圖的詳細研究，發(fā)現(xiàn)7糖殘基的重復結合位置是用α-(1→3)鍵連接在式(IV)中的F6的巖藻糖的3位上。
進一步根據上述方法，由硫酸化多糖的分解物中得到(I)表示的硫酸化糖的1～5量體，即下述一般式(I)中n＝1～5表示的硫酸化糖 (式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
由上可知，由龍目等褐藻類得到的含硫酸化藻聚糖多糖用硫酸化藻聚糖分解酶處理、低分子化后，得到硫酸化多糖，此多糖以上述一般式表示的硫酸化糖為組成糖必須成分的。此外，用凝膠過濾法測定此硫酸化多糖的分子量，當提取條件為pH6～8、95℃、約2小時時，所得平均分子量為約20萬。(2)測定上述(1)所得的硫酸化糖的生理活性。對式(1)所示的硫酸化糖，用國際公開第00/62785號文本、實施例1-(2)中記載的方法測定HGF產生誘導活性，結果表明，其具有此活性。此外，對式(1)的硫酸化糖，用國際公開第99/41288號文本、實施例8和實施例9中記載的方法測定保濕性，結果發(fā)現(xiàn)其非常有用。
本發(fā)明提供了使用硫酸化藻聚糖分解酶的、制備作為糖工程試劑非常有用的、各種分子量的硫酸化藻聚糖寡糖的方法。此外本發(fā)明還提供了可知其結構的各種硫酸化藻聚糖寡糖。
序列表<110>寶生物工程株式會社<120>硫酸化藻聚糖寡糖<130><160>1<210>1<211>1506<212>DNA<213>Fucanobacterlyticus<400>1agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc 60ggaaacgaga atagcttgct attcggcgtc gagcggcgga cgggtgagta atgcttggga 120atatgcctaa tggtggggga caacagttgg aaacgactgc taataccgca taatgtctac 180ggaccaaagg aggggattct tcggaacctt tcgccatttg attagcccaa gtgagattag 240ctagtaggta aggtaatggc ttacctaggc gacgatctct agctggtttg agaggatgat 300cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt 420gtaaagcact ttcagcgagg aggaaagggt gtagattaat actctgcatc tgtgacgtta 480ctcgcagaag aagcaccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aggggtgcaa 540gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg tgcgtaggtg gtttgttaag caagatgtga 600aagccccggg ctcaacctgg gaactgcatt ttgaactggc aaactagagt tttgtagagg 660gtagtggaat ttccagtgta gcggtgaaat gcgtagagat tggaaggaac atcagtggcg 720aaggcggcta cctggacaga gactgacact gaggcacgaa agcgtgggga gcaaacagga 780ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact agccgtctgt agacttgatc 840tgtgggtggc gtagctaacg cgctaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa 900aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc 960aacgcgaaga accttaccat cccttgacat cctactaagt tactagagat agtttcgtgc 1020cttcgggaaa gtagtgacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg 1080ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttatttg ctagcgcgta atggcgagaa 1140ctctaaggag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg 1200gcccttacgg gatgggctac acacgtgcta caatggcaag tacagagggc agcaataccg 1260cgaggtggag cgaatcccac aaagcttgtc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact 1320ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag atcagaatgc tacggtgaat acgttcccgg 1380gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caaaagaagt ggctagttta 1440acccttcggg gaggacggtc accactttgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag 1500gtagcc1506附圖的簡要說明圖1為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的1H-NMR譜圖。
圖2為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的13C-NMR譜圖。
圖3為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的質量分析譜圖。
圖4為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的1H-NMR譜圖。
圖5為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的13C-NMR譜圖。
圖6為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的質量分析譜圖。
圖7為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的1H-NMR譜圖。
圖8為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的13C-NMR譜圖。
圖9為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的質量分析譜圖。
圖10為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的1H-NMR譜圖。
圖11為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的13C-NMR譜圖。
圖12為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的質量分析譜圖。
圖13為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-2的1H-NMR譜圖。
圖14為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-2的13C-NMR譜圖。
圖15為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-2的質量分析譜圖。
圖16為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(2)的1H-NMR譜圖。
圖17為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(2)的13C-NMR譜圖。
圖18為本發(fā)明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(2)的質量分析譜圖。
圖19為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的1H-NMR譜圖。
圖20為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的13C-NMR譜圖。
圖21為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的質量分析譜圖。
圖22為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的1H-NMR譜圖。
圖23為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的13C-NMR譜圖。
圖24為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的質量分析譜圖。
圖25為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的1H-NMR譜圖。
圖26為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的13C-NMR譜圖。
圖27為本發(fā)明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的質量分析譜圖。
權利要求
1.硫酸化藻聚糖或其鹽，其特征在于具有下列物理化學性質，(1)組成糖含有巖藻糖，(2)以下述一般式(I)表示的硫酸化糖為組成糖的必須成分 (式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H、n為1以上的整數(shù))，(3)被來源于Alteromonas sp.SN-1009的硫酸化藻聚糖分解酶所低分子化，生成選自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)表示的化合物中一種以上的化合物 (全部式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
2.硫酸化藻聚糖寡糖，其特征在于下述一般式(I)中n為1～5 (式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
3.制備硫酸化藻聚糖寡糖的方法，其特征在于，使來源于Alteromonas sp.SN-1009的硫酸化藻聚糖分解酶與權利要求1或2中的硫酸化藻聚糖作用，收集其分解物。
4.根據權利要求3的制備硫酸化藻聚糖寡糖的方法，其中硫酸化藻聚糖來源于龍目、海帶或巨藻黑。
5.硫酸化藻聚糖寡糖，其用權利要求3的方法制備。
6.硫酸化藻聚糖寡糖或其鹽，其具有選自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)的化學結構 (全部式中，R為H或SO3H、R的至少一個為SO3H)。
全文摘要
使對來源于海帶目海藻的新的硫酸化多糖進行分解的硫酸化藻聚糖分解酶作用于硫酸化藻聚糖而得到的低分子化物，及其制造方法。
文檔編號C08B37/00GK1421533SQ02147139
公開日2003年6月4日 申請日期2002年10月24日 優(yōu)先權日2001年10月24日
發(fā)明者酒井武, 余目眸, 河合高志, 児島薰, 中一夫, 豬飼勝重, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社