專利名稱：枳椇的不溶于低級醇的提取物和從中分離的多糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有保護(hù)肝臟和消除宿醉活性的不溶于低級醇的枳椇(Hovenia dulcis Thunb)的提取物，從其中分離的多糖，和包含其的藥物組合物或保健食品。
背景技術(shù)：
肝炎折磨著世界上越來越多的人，且因為缺乏有效的治療藥物，經(jīng)?？砂l(fā)展為慢性肝炎，肝硬化，或癌癥。當(dāng)病人受到多種因素，比如壓力，過量消費(fèi)乙醇和/或肝毒性物質(zhì)的影響時，可能發(fā)展各種類型的肝炎。
被認(rèn)為是典型的肝毒性物質(zhì)的有CCl4，D-半乳糖胺，脂多糖(LPS)，溴苯，和醛類如被認(rèn)為是乙醇代謝途徑中間體的乙醛。因此，尋找新的可以保護(hù)肝臟免受肝毒性物質(zhì)傷害或者在受到此類傷害后可恢復(fù)肝臟功能的藥物的嘗試很多。
例如，從枳椇的種子和果實中分離的三萜糖苷被認(rèn)為抑制人體組胺的釋放和乙醇的吸收(Yoshikawa，K.T.等，(1995)Chem.Pharm.Bull.Tokyo，43(3)，第532-534頁)；枳椇的果實被發(fā)現(xiàn)可抑制由四氯化碳或D-半乳糖胺/脂多糖引起的對肝臟的傷害(Hase K.等，(1997)Chem.Pharm.Bull.Tokyo，20(4)，第381-385頁)。上述和其它現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)描述了毛枳椇(日本品種)和枳椇(中國品種)的果實或種子的多種提取物的藥理學(xué)活性；但是，卻沒有關(guān)于枳椇的醇不溶性提取物或從中分離的多糖在保護(hù)肝臟和消除宿醉中的應(yīng)用的報告。
發(fā)明概述因此本發(fā)明的一個目的就是提供一種從枳椇中提取的藥物活性物質(zhì)，該物質(zhì)顯示肝臟保護(hù)和宿醉消除活性。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種從枳椇中分離所述物質(zhì)的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的藥物組合物，該組合物包含藥用載體和上述從枳椇中分離的物質(zhì)。
本發(fā)明另一目的是提供一種用于防止或抑制肝臟相關(guān)疾病并可治療宿醉的藥物組合物，其包含藥用載體和從枳椇中分離的多糖。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種包含所述物質(zhì)和/或來源于枳椇的多糖的保健食品。
依照本發(fā)明的一個方面，提供一種用低級醇處理干枳椇的熱水提取物獲得的低級醇不溶性級分。
依照本發(fā)明的另一個方面，還提供一種從所述低級醇不溶性級分中分離的具有有效的肝臟保護(hù)活性的多糖。
附圖簡述當(dāng)結(jié)合附圖時，本發(fā)明的上述及其它目的和特征將從本發(fā)明的下列描述中變得明顯，這些附圖分別表示

圖1枳椇的果梗提取物的甲醇不溶性級分和從中分離的多糖的制備流程示意圖；圖2甲醇不溶性級分的DSC掃描；圖3甲醇不溶性級分的MALLS譜；圖4甲醇不溶性級分的IR光譜；圖5甲醇不溶性級分的UV光譜；圖6甲醇不溶性級分的GC譜；圖7甲醇不溶性多糖MALLS譜；圖8甲醇不溶性級分的IR光譜；圖9甲醇不溶性級分的NMR譜；圖10甲醇不溶性級分對四氯化碳誘導(dǎo)的肝臟切片培養(yǎng)物的體外蛋白合成活性；圖11甲醇不溶性級分對半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)的肝臟切片培養(yǎng)物的體外蛋白合成活性；
圖12甲醇不溶性級分對溴苯誘導(dǎo)的肝臟切片培養(yǎng)物的體外蛋白合成活性；圖13甲醇不溶性級分對溴苯誘導(dǎo)的肝臟切片培養(yǎng)物的LDH釋放抑制活性；圖14圖7中顯示的多糖對溴苯誘導(dǎo)的肝臟切片培養(yǎng)物的體外蛋白合成活性；圖15甲醇不溶性級分和圖7中顯示的多糖降低血液中乙醇濃度的活性；和圖16甲醇不溶性級分和圖7中顯示的多糖的乙醇脫氫酶活性。
發(fā)明詳述本發(fā)明中枳椇的熱水提取物的不溶于低級醇的級分可以通過兩步制備。首先，干枳椇的熱水提取物是用高壓提取方法獲得的，然后不溶性級分用低級醇處理如此獲得的熱水提取物來獲得。
在第一步中，將枳椇的果梗切片并在陰涼處干燥。向枳椇果梗的干燥切片中加入適量水，所得的混合物保存在溫度110-150℃，優(yōu)選120-125℃，1-3atm，優(yōu)選1.5atm的壓力下15分鐘-48小時，優(yōu)選30分鐘-12小時的時期。然后將混合物冷卻至室溫并過濾，濾液依照常規(guī)凍干方法凍干以獲得熱水提取物。
熱水提取物在室溫下進(jìn)一步干燥，在一個減壓下如-1.5atm下蒸發(fā)，用低級醇，優(yōu)選甲醇，乙醇或丁醇，最優(yōu)選100％的甲醇提取，以去除其中的低級醇可溶解的級分獲得想要的低級醇不溶性級分。
上述枳椇選自Hovenia dulcis Thunb.var.Koreana NAKAI，Hoveniadulcis Thunb.var.tomentella Makino和Hovenia dulcis Thunb。
如此得到的低級醇不溶性級分具有以下特征凝膠滲透層析(GPC)的峰值在平均分子量為1,330,000道爾頓(Da)，142,800 Da，70,540 Da和102,400 Da處；IR(KBr，nm)吸收帶在1000-1300nm(醚，酚，亞砜，乙烯基的峰)；UV吸收在200-300nm(環(huán)狀環(huán)的峰)處。
一種具有高肝臟保護(hù)和宿醉消除活性的多糖可以通過以下步驟從低級醇不溶性級分中分離出來。
將低級醇不溶性級分溶解在蒸餾水中，將所得溶液填充離子交換柱，用具有0-5M漸增NaCl濃度的溶液逐步洗脫多糖組分洗脫，透析，濃縮并凍干(見圖1)。
在進(jìn)行離子交換的過程中，可以使用陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂?？杀挥米鞔四康牡慕粨Q樹脂的例子有強(qiáng)酸性離子交換樹脂如AG50W-x8，Amberlite IR-120和Dowex 50W-x8；弱酸性離子交換樹脂如Amberlite IRC-50，Bio-Rex 70和Duolite-436；弱堿性離子交換樹脂如Amberlite IRA-67和Dowex 3-x4A；強(qiáng)堿性離子交換樹脂如AG 2x8，Amberlite IRA-400和Dowex 2-x8；改性的纖維素陽離子交換樹脂如CM-Cellulose和SE-Cellulose；一種改性的纖維素陰離子交換樹脂如DEAE纖維素；陽離子交聯(lián)葡聚糖類型的樹脂如G-25和G-50珠類型的交聯(lián)葡聚糖樹脂；和由瓊脂糖制備的改性的珠類型的離子交換樹脂如CepharoseCL，Biogel A Cepharose樹脂，F(xiàn)ractogels和Toyopearl。。優(yōu)選ToyopearlDEAE類型的交換樹脂，最優(yōu)選Toyoprearl DEAE-650C類型的交換樹脂。
按照上述的分離方法可獲得多種多糖級分，用0.2M NaCl溶液洗脫的一種多糖顯示最高的肝臟保護(hù)活性。按照上述步驟從韓國本土的枳椇中獲得的多糖表現(xiàn)出以下的特性它由甘露糖，葡萄糖，半乳糖，鼠李糖(rhamanose)和阿拉伯糖組成，其比例為1∶2.51∶12.53∶187∶13.43；絕對分子量為114,500 Da；IR(KBr，nm)光譜在3550-3450 Da(寬，OH)，1660-1600 Da (C＝C)，和1290-1420 Da(＝CH-OH)處顯示峰；1H-NMR(600MHz，D2O)的峰值在4.4-4.8ppm(糖峰)處。此外，在中國本土的枳椇中獲得的多糖表現(xiàn)出以下特性它由包含半乳糖，鼠李糖，葡糖醛酸，半乳糖醛酸，木糖，甘露糖和葡萄糖組成，其比例為1∶0.84∶1.05∶0.87∶0.89∶2.05。
各種實驗清楚地說明低級醇不溶性級分和從其中分離的多糖具有高肝臟保護(hù)和消除宿醉活性，并對預(yù)防和治療肝病和宿醉有效。
因此，本發(fā)明中的低級醇不溶性級分和多糖可以被用作預(yù)防或治療肝毒性和肝病如肝炎，脂肪肝和肝硬化的保健食品和藥劑。
因此，本發(fā)明還提供了一種抑制乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的藥物組合物，該組合物包含與藥用賦形劑、載體或稀釋劑相結(jié)合的枳椇的低級醇不溶性級分或者從甲醇不溶性級分中的級分3中分離出的多糖作為活性成分。
此外，本發(fā)明提供了一種包含上述提取物和/或多糖的保健食品。
同樣，本發(fā)明也提供了一種預(yù)防和治療肝病及宿醉的藥物組合物，該組合物包含與藥用賦形劑、載體或稀釋劑相結(jié)合的枳椇的低級醇不溶性級分和從中分離的多糖作為活性成分。此外，本發(fā)明提供了一種包含上述提取物和/或多糖的保健食品。
本發(fā)明的藥物制劑可以按照任何常規(guī)方法制備。在制備制劑的過程中，活性組分優(yōu)選和載體混合或稀釋，或者被包封在載體里，該載體可以是膠囊，藥囊或其它容器的形式。當(dāng)載體用作稀釋劑時，它可以是作為活性成分的載體、賦形劑或介質(zhì)的固體、半固體或液體物質(zhì)。因此，該制劑可以是片劑、丸劑、散劑、藥囊、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿、氣霧劑、軟膠囊和硬膠囊，無菌注射液，無菌包裝散劑等。
適當(dāng)?shù)妮d體，賦形劑或稀釋劑的例子為乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。該制劑可以還含有填料、抗凝集劑、潤滑劑、濕潤劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。通過使用本領(lǐng)域公知的任何一種方法可以配制本發(fā)明的組合物，以便在將它施用于患者以后提供快速，持續(xù)或延遲的活性成分的釋放。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過多種途徑施用，包括口服，經(jīng)皮，皮下，靜脈內(nèi)和肌內(nèi)導(dǎo)入。對人類患者的治療而言，從枳椇中分離的上述級分和多糖的典型日劑量為約0.01-10g/kg體重，優(yōu)選1-5g/kg體重，并且可以單劑量或分劑量施用。但是，應(yīng)當(dāng)理解實際施用的活性成分的量應(yīng)該依照各種相關(guān)因素包括將處理的癥狀，選擇的給藥途徑，個體患者的年齡、性別和體重，以及病人癥狀的嚴(yán)重性來決定；因此，上述的劑量應(yīng)該不被用來以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
上述的低級醇不溶性級分和從中分離的多糖可以被加入到食品或飲料中來預(yù)防各種肝病和宿醉。為預(yù)防各種肝病或宿醉而可以加入到食品或飲料中的所述級分和/或多糖的量可以通常為基于食品總重量的0.1-15w/w％，優(yōu)選1-10w/w％，和基于100ml飲料1-30g，優(yōu)選3-10g。
本發(fā)明的保健飲料組合物可以含有其它組分，例如，像常規(guī)飲料中的除臭劑和天然的碳水化合物。這種碳水化合物的實例是單糖如葡萄糖和果糖；二糖如麥芽糖和蔗糖；常規(guī)糖如糊精和環(huán)狀糊精；以及糖醇如木糖醇，山梨糖醇和赤蘚糖醇。作為除臭劑，一種天然的除臭劑如taumatin，levaudioside A和甘草皂苷，或者合成除臭劑如糖精和天冬甜精(aspartam)可能被用到。上述天然碳水化合物的用量通常為基于100ml飲料的約1-20g，優(yōu)選5-12g。
其他可能被加到本發(fā)明食品或飲料組合物中的組分是各種養(yǎng)分，維生素，礦物質(zhì)，合成調(diào)味劑，著色劑，果膠酸及其鹽，海藻酸及其鹽，有機(jī)酸，保護(hù)性的膠狀粘合劑，pH調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，防腐劑，甘油，醇，碳化劑(carbonizing agent)，果汁和蔬菜汁。
下列的參考實施例，檢驗實施例和配制實施例意欲進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明而不限制其范圍。
參考例1通過Gel滲透層析測定絕對分子量分子量的測量是使用裝有泵(光譜系統(tǒng)，p2000型)，保護(hù)柱(TSKPWH，Tosoh公司)，RI-探測器(Shodex SE71型)，SEC(大小排除層析)柱(TSK凝膠3000pw，4000pw，5000pw(7.8×300mm，Tosoh公司)和MALLS(多角度激光分散Dawn DSP-F，Wyatt技術(shù)公司)探測器的GPC設(shè)備，用0.02％疊氮化鈉作為顯影溶劑，其包含0.15 M NaNO3，在流速為0.5ml/min下來進(jìn)行的。
參考例2試劑和材料LDH(乳酸脫氫酶)的量是用340-UV分光計(Sigma公司，美國)測定的。用來測定合成的具有被肝毒性物質(zhì)損害后肝臟愈合活性的蛋白的量的3H-亮氨酸(5.Ci/板)同位素和用來測定合成RNA的量的3H-尿苷同位素都是從Sigma公司購買的。吸收變化的測量是使用氣相色譜頂空(head-space)分析裝置，裝有FID(火焰離子化檢測器)的HP 5890氣相色譜法來進(jìn)行的，以測定乙醇脫氫酶活性。
實施例1韓國本土枳椇的低級醇不溶性級分的制備將干燥和切片的韓國本土枳椇梗(1.5kg)進(jìn)行在120℃，高壓(1.5atm)下的提取3小時。所得的提取溶液過濾通過Wattman紙。將韓國本土枳椇的濾液(218.5g)凍干，所得的粉末經(jīng)過3個循環(huán)的回流提取，每個用31HPLC-級的純甲醇1小時，剩余的粉末被干燥以獲得韓國本土枳椇的甲醇不溶性級分(干重65.71g，產(chǎn)率4.3％w/w)。此外，合并提取物并凍干以獲取溶于甲醇的級分(干重152.29g，產(chǎn)率10.27％w/w)。
實施例2枳椇甲醇不溶性級分的分析實施例1中獲得的甲醇不溶性級分的性質(zhì)分析如下。(1)熔解溫度和熔融焓(entalphy)的測定熔解溫度和熔融焓的測定是通過DSC(差示掃描量熱計，Seiko株式會社DSC6100)測定的。
韓國本土枳椇的甲醇不溶性級分的樣品被放入一個鋁盤內(nèi)，密封，然后以10℃/min的速率從20℃加熱到200℃，分別獲得熔化熱吸收曲線和熔解溫度并從中測得樣品的結(jié)晶度。
韓國本土的甲醇不溶性級分的DSC掃描顯示主峰始于164.9℃，在185.3℃達(dá)到最大熔解溫度。將甲醇不溶性級分制成數(shù)種碳水化合物(mp60-100℃)和少量蛋白質(zhì)(mp60-100℃)(圖2)。
(2)糖鏈的分析為檢測上述的主峰組分中是否含有糖鏈，依照Hakomori等(J.Biochem.Tokyo，55，205-209，1964)和Waeghe T.J.等(Carbohydrate Research，123，281-304，1983)所述方法進(jìn)行甲基化分析。
將500.g的樣品甲基化，然后甲基化的產(chǎn)物使用乙醇吸附的C188×10筒柱(Sep-Pak)被收集。甲基化的產(chǎn)物的酸性糖部分使用THF中的LiB(C2H5)3D(Super-Deupride，1ml，Aldrich公司)還原，還原產(chǎn)物使用C188×10筒柱(Sep-Pak)來回收。隨后，處理過的樣品依次進(jìn)行在1.0 M TFA中121℃下水解2個小時；NaBD4還原；乙?；５玫降牟糠旨谆拇姿崽谴纪ㄟ^GLC和GC-EIMS分析，峰面積是用FID(火焰離子化檢測器)來測量的。
(3)通過GPC測定分子量如參考例1中進(jìn)行的GPC測定的結(jié)果顯示甲醇不溶性級分是由如圖3和表1中所示的4個峰值組分組成的。
表1.甲醇不溶性級分的峰值組分
(4)IR譜(圖4)樣品通過IR光譜(Vector 22型，Bruker Analytische Messtechnik GMBH)分析分辨率，4.0；來源，球面；速率，6，10KHz；捕獲模式，雙重墻(dual wall)/往返條件)IR(KBr，cm-1)醚，酚，亞砜和乙烯基峰(1000-1300nm；主要1039nm)，芳香環(huán)峰(665，939，1313，1663)，羥基峰(3435nm)。
(5)UV光譜(圖5)樣品是通過UV-Vis光譜學(xué)(HP 8453型，Hewlett Packard公司)來分析的，結(jié)果顯示最大吸收在200-300nm，提示存在環(huán)狀環(huán)。
實施例3具有肝臟保護(hù)和宿醉消除活性的多糖的分離為從實施例1中獲得的甲醇不溶性級分中分離具有肝臟保護(hù)和宿醉消除活性的活性化合物，將200mg的甲醇不溶性級分在蒸餾水中溶解，填充到ToyopearlDEAE-650C柱(4.0×30cm)中，依次用0，0.1，0.2，0.3和3M NaCI溶液洗脫。洗脫后的級分用對分子量1000和以下通透的透析膜透析，濃縮，然后凍干以獲得重量分別為38mg，64mg，73mg，5mg和4mg的純化級分。
實施例4韓國本土枳椇中分離級分的定性實施例3中經(jīng)過0，0.1，0.2，0.3和3M NaCl洗脫后獲得的分離級分分別被稱為級分1-5。對每個組分，總糖和多酚組分的含量通過苯酚-硫酸方法(Dubois M.等，Anal.Chem.28，350-356，1956)測定，由此獲得的結(jié)果顯示在表2中。
表2總糖和多酚組分的含量
進(jìn)行GC分析(Varian CP-3800型，設(shè)定條件；檢測器FID，柱SP-2380(30m×0.25mm×0.2μm)，柱溫230℃，注射器溫度250℃，檢測器溫度250℃，流動相N2氣(1.0ml/min))來鑒別上述級分中的糖組分，測定每個級分中的甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖的相對量。結(jié)果顯示在表3中。
表3糖組分的量(相對于甘露糖)
級分3在以上的級分中顯示出最高的肝臟保護(hù)和宿醉消除活性，以下對其進(jìn)行進(jìn)一步地表征。
級分3的表征由參考例1中的方法測定的級分3的絕對分子量是114,500 Da(圖7)。IR分析(KBr)顯示峰(cm-1)在3550-3450(寬，OH)，1660-1600(C＝C)和1290-1420(＝CH-OH)處(圖8)。1H-NMR(600MHz，D2O)在4.4-4.8ppm處顯示了一個峰(糖峰)(圖9)。
實施例5中國本土枳椇分離級分的表征重復(fù)實施例1中的步驟以從中國本土枳椇的果梗中獲得甲醇不溶性級分(干重61.5g，產(chǎn)率4.1％w/w)和溶于甲醇的級分(干重133.5g，產(chǎn)率8.9％w/w)。將甲醇不溶性級分依照實施例3的方法進(jìn)行離子交換層析，經(jīng)0，0.1，0.2，0.3和3M NaCl洗脫后得到的分離級分分別被稱為級分1’-5’。
將級分1’-5’依照實施例4中的方法表征。糖組分通過GC分析鑒定，結(jié)果顯示在表4中。
表4.糖組分的量(相對于半乳糖)
SEC-RI峰和絕對分子量是依照參考例1中的步驟測定的。結(jié)果分別顯示在表5和6中。
表5通過SEC-RI檢測器的甲醇不溶性級分的峰組分比例
表6通過SEC-MALLS測量甲醇不溶性級分的絕對分子量
檢驗實施例1枳椇的甲醇不溶性級分的肝臟保護(hù)功能(1)對被四氯化碳破壞的肝臟的保護(hù)活性將從五周齡的Sprague-Dawley大鼠中取出的肝臟用組織切片機(jī)(美國Brendel/Vitron公司)切成圓盤狀的樣品，每個的直徑約為0.8mm厚度為200.m(濕重18-22mg)。切好的樣品被分成四組，其中兩組(組3和組4)分別用實施例1中準(zhǔn)備的甲醇不溶性級分和溶于甲醇的級分處理，每組的濃度為200.g/ml。然后，4個切好的樣品在O2/CO2＝95％/5％的氣氛下在熱動力器官組織切片培養(yǎng)儀(日本Sankyo公司)中表面培養(yǎng)。1小時后，向組3、組4和剩余兩組中的一個(組2)中每組加入四氯化碳至濃度為4mM。另一組(組1)用蒸餾水替代四氯化碳進(jìn)行處理(對照)。然后所有組保存5小時來誘導(dǎo)肝損傷。
其后，枳椇提取級分的肝解毒功效通過依照Bonney等(“SomeCharacteristics and Function of Adult Rat Liver Pimary Culture，in GeneExpression and Carcinogenesis in Cultured Liver”，(1975)Gerschenson，E和Thompson，E.B.(Eds)，Academic Press，New York，第24-45頁)描述的方法測量合成蛋白的量來評估。如圖1Oa所示，證明甲醇不溶性級分較溶于甲醇的級分有高得多的活性。
此外，圖10b中的結(jié)果是通過按照上述方法用實施例5中制備的甲醇不溶性級分或溶于甲醇的級分來獲得的，其中甲醇不溶性級分表現(xiàn)出比溶于甲醇的級分高很多。
(2)恢復(fù)被D-半乳糖胺/LPS損傷的肝臟功能的活性已經(jīng)知道D-半乳糖胺和細(xì)菌的脂多糖(LPS)一起施用引起肝損傷，這種損傷在生物化學(xué)和組織學(xué)上與人類肝炎引起的肝損傷是相似的。枳椇的甲醇不溶性級分對該損傷的肝臟的解毒作用檢測如下用500.M的D-半乳糖胺和1.g/ml的LPS替代四氯化碳，重復(fù)檢驗實施例1中的步驟，來測量修復(fù)損傷肝臟的活性。如圖11a所示，甲醇不溶性級分和溶于甲醇的級分都有顯著的修復(fù)活性。此外，圖11b中的結(jié)果顯示實施例5中獲得的甲醇不溶性級分和溶于甲醇的級分也顯示出顯著的修復(fù)活性。
(3)修復(fù)溴苯損傷的肝臟除用1mM的溴苯代替四氯化碳外，韓國或中國本土枳椇提取物的解毒活性通過(1)中描述的步驟評估。圖12a(韓國)和12b(中國)中顯示的結(jié)果提示甲醇不溶性級分比溶于甲醇的級分在修復(fù)受損肝臟方面更有效。
此外，從培養(yǎng)基中釋放的LDH(乳酸脫氫酶)的量通過使用Sigma試劑盒340-UV裝置測定，結(jié)果，圖13a(韓國)和13b(中國)，顯示甲醇不溶性級分比溶于甲醇的級分在誘導(dǎo)由溴苯引起的LDH的釋放方面更有效。
檢驗實施例2枳椇的甲醇不溶性級分中分離的多糖的肝臟保護(hù)活性。
用組織切片機(jī)(美國Brendel/Vitron公司)將從五周齡的Sprague-Dawley大鼠中摘取的肝臟切片以獲得直徑約為0.8mm，厚度為200.m(濕重18-22mg)的圓盤狀樣品。切好的樣品被分成7組，其中的5組分別用實施例4中制備的五個多糖級分來處理，每個的濃度為200.g/ml(分別為組1-組5)。然后，切好的樣品在O2/CO2＝95％/5％的氣氛下，在熱動力器官組織培養(yǎng)儀(日本Sankyo公司)里表面培養(yǎng)1個小時。然后，向組1-5和剩余兩組中的一個(組6)中的每個樣品加入溴苯至濃度為4mM。最后剩余的一組(組7)用蒸餾水替代溴苯進(jìn)行處理(對照)。
其后，韓國土產(chǎn)枳椇的每個多糖級分的肝臟解毒功效通過依照Bonney等(見上)描述的方法測定的合成蛋白的量來評估。圖14中顯示的結(jié)果證明級分3的多糖有最高的活性。
檢驗實施例3枳椇不溶性級分中分離的多糖的宿醉消除活性為了測量檢驗實施例1中得到的枳椇的甲醇不溶性級分的宿醉消除活性，15只三周齡的Sprague-Dawley大鼠被分成了3組，禁食24小時但是允許攝入水。然后，2ml 40％的乙醇用不銹鋼探頭(長度10cm)通過口服施用于每只大鼠。1小時后，將2ml，500mg/ml的甲醇不溶性級分或從中分離的多糖(級分3)施用于實驗組(組2和組3)的每只大鼠，對照的大鼠(組1)施用2ml水。4小時后，從每只大鼠心臟采取的血樣中的乙醇含量按照Bergmeyer描述的方法(In Methods of EnzymaticAnalysis，第3版，598-6062，1984)測量。
結(jié)果(圖15)顯示，從組1-組3中采取的血樣的乙醇濃度分別為0.058％，0.032％和0.028％。即與對照組相比，枳椇的甲醇不溶性級分和從中分離的多糖將血液的乙醇濃度分別降低了44.8％和51.7％。這個結(jié)果證明了枳椇的醇不溶性級分和從中分離的多糖具有顯著降低血液中的乙醇濃度的能力。
受損肝臟的乙醇脫氫酶活性的檢測如下。
大鼠被CO2窒息，從中取出其肝臟，用蒸餾水洗滌。每個肝臟樣品被放入10倍體積的含有0.154 M KCl的0.1 M磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)中，并用聚四氟乙烯玻璃勻漿器攪勻。將均化的溶液在4℃下在9,000xg下進(jìn)行離心30分鐘，得到的上清液在4℃下在110,000xg下進(jìn)行超速離心1小時，以獲得上清液胞質(zhì)級分。將2-3mg的胞質(zhì)級分加到包含55mM焦磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)，20mM乙醇和0.2mM NAD的反應(yīng)混合物中。反應(yīng)混合物中用到的NAD的濃度在0.025mM-2mM之間變化。測量反應(yīng)混合物在340nm處的吸光度變化3min，通過吸收曲線的斜率計算乙醇脫氫酶的活性。
如圖16所示，甲醇不溶性級分和從甲醇不溶性級分的級分3中分離的多糖表現(xiàn)出增大的乙醇脫氫酶活性，由此證明了它們優(yōu)越的宿醉消除活性。
如以下所例舉，本發(fā)明的低級醇不溶性級分和從中分離的多糖可以按照任何一種已知的常規(guī)方法用于制備在藥理學(xué)上有效的散劑，片劑，膠囊，注射劑或液體組合物。將實施例1中得到的2g干燥提取物與1g乳糖混合來獲得散劑，其被填充和密封在密閉的包裝中。將100mg實施例1中得到的干燥提取物，100mg玉米淀粉，100mg乳糖和2mg硬脂酸鎂混合并壓片以獲得片劑制劑。將100mg實施例1中得到的干燥提取物，100mg玉米淀粉，100mg乳糖，2mg硬脂酸鎂混合裝入明膠膠囊中以獲取膠囊制劑。將100mg實施例5中得到的干燥提取物，蒸餾水和適量的pH調(diào)節(jié)劑溶解以獲取注射制劑，該制劑被裝入2ml的安剖(ample)中并依照常規(guī)的注射劑制備方法滅菌以獲得注射制劑。
保健食品可依照下列方法典型地制備[保健食品的制備]將糙米，大麥，糯米和薏苡(Job′s-tears)的烘焦干燥的膳食混合物粉碎并過篩以獲得60目或以下的谷物顆粒。此外，黑豆，黑芝麻和野生芝麻的混合物被蒸制、干燥、烘焦，粉碎，并過篩以得到60目或以下的種子微粒。
實施例1中得到的干燥的枳椇的甲醇不溶性級分被粉碎并過篩以得到60目及以下的顆粒，將其與谷物顆粒和種子顆粒以下述比例混合來制備顆粒型的保健食品。
谷物糙米30w％，薏苡15w％，大麥20w％，種子野生芝麻7w％，黑豆8w％，黑芝麻7w％，韓國土產(chǎn)枳椇的干燥粉末3w％，花菇(Shiitake mushroom)0.5w％，地黃根(rehmania root)0.5w％盡管已經(jīng)參照上述具體實施方案描述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改進(jìn)和變化，其也屬于后附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.枳椇熱水提取物的低級醇不溶性級分。
2.權(quán)利要求1的低級醇不溶性級分，其中所述低級醇選自甲醇，乙醇和丁醇。
3.權(quán)利要求2中的低級醇不溶性級分，其中所述低級醇是甲醇。
4.一種多糖，其分離自權(quán)利要求1-3的低級醇不溶性級分。
5.權(quán)利要求4的多糖，其具有以下特征由甘露糖，葡萄糖，半乳糖，鼠李糖和阿拉伯糖以1∶2.51∶12.53∶187∶13.43的比例組成；絕對分子量114,500Da；IR(KBr，nm)峰3550-3450Da(寬，OH)，1660-1600Da(C＝C)和1290-1420Da(＝CH-OH)；和1H-NMR(600MHz，D2O)峰4.4-4.8ppm(糖峰)。
6.權(quán)利要求4的多糖，其具有以下特征由半乳糖，鼠李糖，葡糖醛酸，半乳糖醛酸，木糖，甘露糖和葡萄糖以1∶0.84∶1.05∶0.87∶0.89∶2.05的比例組成。
7.制備權(quán)利要求1-3中任何一項的低級醇不溶性級分的方法，其包含以下步驟獲得干燥枳椇的熱水提取物；將所述熱水提取物進(jìn)行低級醇提取處理以獲得低級醇不溶性級分。
8.制備權(quán)利要求4的多糖的方法，其包含以下步驟獲得干燥枳椇的熱水提取物；用低級醇處理所述熱水提取物以獲得低級醇不溶性級分；將醇不溶性級分進(jìn)行離子交換柱層析以獲得所述多糖。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述低級醇選自甲醇，乙醇和丁醇。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述低級醇是甲醇。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述離子交換柱層析是使用陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂進(jìn)行的。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述離子交換柱層析是使用選自Cepharose CL，Biogel A Cepharose樹脂，F(xiàn)ractogels和Toyopearl樹脂的改性的珠類型的離子交換樹脂進(jìn)行的。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述離子交換柱層析是使用Toyopearl樹脂進(jìn)行的。
14.一種用于消除宿醉的組合物，其包含權(quán)利要求1的低級醇不溶性級分或權(quán)利要求4的多糖，和藥用載體。
15.一種用于預(yù)防或治療肝病的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的低級醇不溶性級分或權(quán)利要求4的多糖，和藥用載體。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述肝病是肝炎或肝硬化。
17.一種保健食品，其包含權(quán)利要求1的低級醇不溶性級分或權(quán)利要求4的多糖，和飲食學(xué)上可接受的添加劑。
18.權(quán)利要求17的保健食品，其中所述食品是飲料類型的。
全文摘要
一種藥物組合物和保健食品，其包含一種不溶于低級醇的枳椇提取物或者是一種從中分離的多糖，具有有效的保護(hù)肝臟和消除宿醉活性。
文檔編號C08B37/00GK1615145SQ02827195
公開日2005年5月11日 申請日期2002年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月17日
發(fā)明者羅千洙, 鄭南澈, 金世炫 申請人:(株)生命之樹, 山林廳林業(yè)研究院