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      微生物酶法制備低分子量巖藻多糖工藝的制作方法

      文檔序號:3660299閱讀:632來源:國知局
      專利名稱:微生物酶法制備低分子量巖藻多糖工藝的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及以褐藻中的巖藻多糖為原料,利用微生物巖藻多糖酶微生物酶法制備低分子量巖藻多糖工藝。
      背景技術(shù)
      巖藻多糖屬于異多聚碳水化合物,其主要成分是L-巖藻糖,它的線性主鏈?zhǔn)菐r藻吡喃環(huán)以α-1,3-糖苷鍵連接而成,其中還夾雜著其他糖類,如半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸等,因材料來源而異。該糖通常在4-0基發(fā)生硫酸化作用,也可在其他位點(diǎn)上,因此,該多糖屬于含硫多糖。在早期的動物試驗中發(fā)現(xiàn)巖藻多糖容易產(chǎn)生抗原性和明顯的毒副作用,如果經(jīng)過部分水解,溶液的粘度會降低,并且可以降低該糖在應(yīng)用中可能產(chǎn)生的抗原性和毒副作用。分子量大小適度的低分子量巖藻多糖可以保持原多糖的生理活性,有些還具有特定的生理活性。低分子量巖藻多糖的生物學(xué)活性除與分子量大小有關(guān)外,還與含硫量及含硫基團(tuán)位點(diǎn)及支鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)。
      目前中低分子量巖藻多糖的獲得多以化學(xué)降解方法(酸解法)為主,采用化學(xué)方法進(jìn)行部分水解,生產(chǎn)條件要求苛刻(高溫、高壓、耗能),產(chǎn)生糖的聚合度大小不一,純化難度大,得率低。采用酶法降解,則可克服這些缺點(diǎn),同時酶法降解還有利于保護(hù)一些含硫側(cè)鏈基團(tuán)和其它支鏈。巖藻多糖可以通過海洋微生物和貝類產(chǎn)生的巖藻多糖酶水解產(chǎn)生較低分子量的巖藻多糖,并進(jìn)一步經(jīng)過巖藻糖苷酶的水解,產(chǎn)生巖藻糖。日本從貝類肝胰腺中提取巖藻多糖酶來制備具有生理活性低分子量巖藻多糖獲得成功,如日本學(xué)者采用扇貝肝胰腺中提取純化的巖藻多糖酶,成功地從分子量為480000的巖藻多糖中生產(chǎn)出分子量在50000左右的活性巖藻多糖,但是,由于貝類加工過程中肝胰腺采集及貯存較為困難,從而造成該種酶的制備難度大,限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。
      我國巖藻多糖的研究工作較少,目前僅有少數(shù)幾篇文章涉及到其提取和分離過程。目前,國內(nèi)外還未檢索到用微生物巖藻多糖酶酶法制備低分子量巖藻多糖的報道。
      技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)課題是利用微生物生產(chǎn)巖藻多糖酶,利用該酶進(jìn)一步水解作用生產(chǎn)低分子量巖藻多糖。
      為解決上述技術(shù)課題,本發(fā)明采用了以下技術(shù)工藝a、以褐藻為原料,將原料粉碎、過篩后用水浸提,溫度在40~100℃時,攪拌浸提6~10小時,離心去除固形物,收集濾液、濃縮,采用α-淀粉酶去除淀粉,乙醇分級沉淀,沉淀物冷凍干燥,得到巖藻多糖粉末;b、對上述巖藻多糖實施酶解反應(yīng),溫度在30~50℃時,反應(yīng)時間控制在2小時以內(nèi);c、酶解反應(yīng)完畢后升溫使酶活喪失;d、經(jīng)凝膠色譜分子篩分離,冷凍干燥得到低分子量巖藻多糖。
      上述的制備低分子量巖藻多糖的原料用水浸提時原料與水的浸提比為1∶7~15,浸提、過濾、濃縮后加α-淀粉酶,反應(yīng)溫度在40~60℃反應(yīng)時間1~2hr,α-淀粉酶量控制在40Iu/ml濃縮液。
      上述酶制劑是由微生物分別通過固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵方法制得的以巖藻多糖酶為主的酶制劑;用于生產(chǎn)巖藻多糖酶的微生物培養(yǎng)基原料包括褐藻及其提取物和農(nóng)業(yè)有機(jī)廢料中的一種或幾種。
      制備巖藻多糖酶的微生物發(fā)酵溫度控制在25~32℃之間,時間控制在12~48小時,再經(jīng)過分離得到粗酶液。
      用于生產(chǎn)巖藻多糖的褐藻包括多囊墨角藻、海帶、羊棲菜等。
      用于生產(chǎn)巖藻多糖的溫度控制在70~90℃。
      酶解反應(yīng)的巖藻多糖濃度控制在≤10%。
      所述的酶解反應(yīng)溫度在35~45℃,反應(yīng)完畢后溫度升至100℃使酶活喪失。
      所述的酶解反應(yīng)的pH值控制在pH6~pH8。所述的酶解反應(yīng)中巖藻多糖酶量控制在≤40Iu/g底物。
      由上述技術(shù)方案可以制備巖藻多糖分子量范圍在900~50000道爾頓中的任意一段低分子量巖藻多糖,可以保持原多糖的生理活性,同時還具有特定的生理活性,本發(fā)明采用的是用微生物生產(chǎn)巖藻多糖酶制備巖藻多糖,即通過海洋微生物產(chǎn)生的巖藻多糖酶水解產(chǎn)生較低分子量的巖藻多糖。與現(xiàn)有技術(shù)相比,一方面解決了采用扇貝類制備巖藻多糖酶過程中肝胰腺難以采集及貯存、運(yùn)輸所遇到的困難,使得巖藻多糖酶的制備更加容易;另一方面,克服利用化學(xué)法需要高溫、高壓、耗能的苛刻制備條件,同時避免了化學(xué)法產(chǎn)生糖的聚合度大小不一、純化難度大及得率低的缺陷;酶法降解還有利于保護(hù)一些含硫側(cè)鏈基團(tuán)和其它支鏈。
      本發(fā)明公開的低分子量巖藻多糖的制備工藝中酶的生產(chǎn)易于控制,生產(chǎn)量大。
      附圖概述

      圖1是巖藻多糖酶的制備工藝流程圖;圖2是低分子量巖藻多糖的制備工藝流程圖。
      具體實施例方式
      1、巖藻多糖酶的制備巖藻多糖酶的制備參見圖1,具體工藝過程如下①巖藻多糖酶的生產(chǎn)原料用于生產(chǎn)巖藻多糖酶的微生物培養(yǎng)原料主要利用褐藻(多囊墨角藻、海帶、羊棲菜等)及其抽提物和農(nóng)業(yè)有機(jī)廢料(麩皮)。培養(yǎng)基以單一或復(fù)合成分均可。
      ②巖藻多糖酶制劑制備用于生產(chǎn)低分子量巖藻多糖的酶制劑主要是巖藻多糖酶,它可以由微生物分別通過固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵方法來生產(chǎn)。溫度控制在25~32℃之間,時間控制在12~48小時,再經(jīng)過分離得到粗酶液。
      以海洋真菌為例,較為理想的是溫度控制在28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)24hr,再經(jīng)過分離,得到粗酶液。
      各種溫度和時間條件下測得的數(shù)據(jù)如下表一、二表一溫度時間(hr)酶活力(單位Iu/g干培養(yǎng)基)25℃24 24.528℃24 32.530℃24 2732℃24 17.5表二溫度時間(hr)酶活力(單位Iu/g干培養(yǎng)基)28℃12 17.528℃24 3328℃36 24.328℃48 182、巖藻多糖的制備巖藻多糖的制備參見圖2,具體工藝過程如下①原料的加工上述的生產(chǎn)原料,首先應(yīng)篩選去除霉變成份,并干燥保存,再經(jīng)分級粉碎后,過360目篩備用。
      ②巖藻多糖制備將粉碎并過篩的原料,用水浸提,溫度70~90℃時,攪拌浸提6~10小時。離心去除固形物,收集濾液,濃縮,加α-淀粉酶,反應(yīng)溫度在40~60℃反應(yīng)時間1~2hr,α-淀粉酶量控制在40Iu/ml濃縮液,淀粉酶去除淀粉,乙醇分級沉淀。沉淀物冷凍干燥,得到巖藻多糖粉末。
      上述制備巖藻多糖的原料用水浸提,溫度70~90℃時,攪拌浸提6~10小時的具體實施例如表三
      表三溫度提取時間(hr)糖的得率40℃10 0.5698g/20g海帶≈2.8%60℃8 0.5892g/20g海帶≈2.9%80℃10 0.6823g/20g海帶≈3.4%100℃ 10 0.6845g/20g海帶≈3.4%3、酶法制備低分子量巖藻多糖,參見圖2。
      ①酶解反應(yīng)酶解反應(yīng)條件為溫度40℃,pH6.5,反應(yīng)時間控制在2小時內(nèi),以產(chǎn)物聚合度為依據(jù)。反應(yīng)完畢后升溫至100℃,使酶活喪失。
      ②低分子量巖藻多糖的制備經(jīng)凝膠色譜分子篩分離,得到不同級別的低分子量巖藻多糖,冷凍干燥得到粉末。
      權(quán)利要求
      1.一種酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,該工藝包括以下步驟a、以褐藻為原料,將原料粉碎、過篩后用水浸提,溫度在40~100℃時,攪拌浸提6~10小時,離心去除固形物,收集濾液、濃縮,乙醇分級沉淀,沉淀物冷凍干燥,得到巖藻多糖粉末;b、對上述巖藻多糖實施酶解反應(yīng),溫度在30~50℃時,反應(yīng)時間控制在2小時以內(nèi);c、酶解反應(yīng)完畢后升溫使酶活喪失;d、酶解液經(jīng)凝膠色譜分子篩分離、冷凍干燥得到低分子量巖藻多糖。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于所述的制備低分子量巖藻多糖的原料用水浸提時原料與水的浸提比為1∶7~15,浸提、過濾、濃縮后加α-淀粉酶,反應(yīng)溫度在40~60℃反應(yīng)時間1~2hr,α-淀粉酶量控制在40Iu/ml濃縮液。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于上述酶制劑是由微生物分別通過固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵方法制得的以巖藻多糖酶為主的酶制劑;用于生產(chǎn)巖藻多糖酶的微生物培養(yǎng)基原料包括褐藻及其提取物和農(nóng)業(yè)有機(jī)廢料中的一種或幾種。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于制備巖藻多糖酶的微生物發(fā)酵溫度控制在25~32℃之間,時間控制在12~48小時,再經(jīng)過分離得到粗酶液。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于用于生產(chǎn)巖藻多糖的褐藻包括多囊墨角藻、海帶、羊棲菜等。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于在生產(chǎn)巖藻多糖過程中用水浸提褐藻時的溫度控制在70~90℃。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于酶解反應(yīng)的巖藻多糖濃度控制在≤10%。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于所述的酶解反應(yīng)溫度在35~45℃,反應(yīng)完畢后溫度升至100℃使酶活喪失。
      9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于所述的酶解反應(yīng)的pH值控制在pH6~pH8。
      10.根據(jù)權(quán)利要求1或3或4所述的酶法制備低分子量巖藻多糖工藝,其特征在于所述的酶解反應(yīng)中巖藻多糖酶量控制在≤40Iu/g底物。
      全文摘要
      本發(fā)明是利用微生物生產(chǎn)巖藻多糖酶,利用該酶進(jìn)一步水解生產(chǎn)低分子量巖藻多糖,其工藝包括a、以褐藻為原料,將原料粉碎、過篩后用水浸提,溫度在40~100℃時,攪拌浸提6~10小時,離心去除固形物,收集濾液、濃縮,去除淀粉,乙醇分級沉淀,沉淀物冷凍干燥,得到巖藻多糖粉末;b、對上述巖藻多糖實施酶解反應(yīng);c、完畢后升溫使酶活喪失;d、經(jīng)凝膠色譜分子篩分離,冷凍干燥得到低分子量巖藻多糖,使得巖藻多糖酶的制備更加容易,克服了利用化學(xué)法需要高溫、高壓、耗能的苛刻制備條件,同時避免了化學(xué)法產(chǎn)生糖的聚合度大小不一、純化難度大及得率低的缺陷;酶法降解還有利于保護(hù)一些含硫側(cè)鏈基團(tuán)和其它支鏈。
      文檔編號C08B37/00GK1515592SQ03112609
      公開日2004年7月28日 申請日期2003年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月2日
      發(fā)明者蔡敬民, 秦松, 吳克, 吳茜茜, 劉斌, 楊本宏, 潘仁瑞 申請人:合肥學(xué)院
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