專利名稱：透明質(zhì)酸衍生物凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸衍生物凝膠，尤其是涉及通過酰胺化反應(yīng)，將含胺基的、具有各種分子量的糖類化合物偶聯(lián)至具有各種分子量的透明質(zhì)酸或其陽離子鹽，生成的透明質(zhì)酸衍生物凝膠，以及該衍生物凝膠的制備方法。依賴于酰胺化反應(yīng)條件及另外的熱處理，本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠具有各種不同的熱屬性。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸是一種直鏈可生物相容的聚合物，含有鏈接的N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸重復(fù)單元，在眼睛的玻璃體、關(guān)節(jié)滑液、公雞雞冠等處以高濃度存在。此處所用術(shù)語“透明質(zhì)酸”有時(shí)同時(shí)指代透明質(zhì)酸及其任一的陽離子鹽。本發(fā)明中使用的透明質(zhì)酸的陽離子鹽包括諸如透明質(zhì)酸鈉和透明質(zhì)酸鉀的無機(jī)鹽以及諸如透明質(zhì)酸四丁基銨的有機(jī)鹽，但不限于此。
透明質(zhì)酸衍生物已被廣泛開發(fā)出以用作術(shù)后防粘連薄膜或凝膠，治療皺紋的材料，整形手術(shù)的材料，治療關(guān)節(jié)炎的材料，藥物傳送體系的載體，等等。特別地，由于透明質(zhì)酸衍生物的特有屬性，在許多應(yīng)用領(lǐng)域?qū)ζ涞年P(guān)注正在增加。例如，美國專利5,356,883公開了透明質(zhì)酸衍生物凝膠，其中透明質(zhì)酸或其鹽的羧基通過各種碳二亞胺而被修飾成O-?；騈-?；Ｃ绹鴮＠?,827,937公開了通過兩步交聯(lián)反應(yīng)得到的交聯(lián)多糖凝膠。進(jìn)一步地，美國專利5,399,351公開了具有各種屬性的凝膠的制備方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供透明質(zhì)酸衍生物凝膠，其中含胺基的糖化合物通過酰胺化連接至透明質(zhì)酸。
本發(fā)明的另一目的是提供根據(jù)反應(yīng)條件具有各種不同熱屬性的透明質(zhì)酸衍生物凝膠。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供通過熱處理制備透明質(zhì)酸衍生物凝膠的方法，所述衍生物凝膠具有各種不同的屬性。
本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠是通過酰胺化將具有各種分子量的透明質(zhì)酸與具有各種分子量的含胺基糖化合物相連接而制備得到的。這些透明質(zhì)酸衍生物凝膠具有優(yōu)良的粘彈屬性，由此可應(yīng)用于諸多用途中。特別地，本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠是顯示出熱特異性應(yīng)答的材料，可通過熱處理使凝膠具有各種不同屬性。此外，本發(fā)明提供了各種具有各種熱屬性的透明質(zhì)酸衍生物，可依賴于酰胺化反應(yīng)條件而制備得到。
另外，由于本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠在透明質(zhì)酸和含胺基的糖化合物之間具有共價(jià)鍵，即酰胺鍵，從而可耐受一些體內(nèi)條件。這些凝膠是新穎的生物可相容材料，其所具有的屬性很大程度上不同于現(xiàn)有的采用碳二亞胺化合物合成的透明質(zhì)酸衍生物。
本發(fā)明制備透明質(zhì)酸衍生物的方法包含如下步驟將透明質(zhì)酸溶液與含胺基糖類化合物溶液混合，從而在二者之間生成離子鍵，然后通過采用一種羧基活化劑，使透明質(zhì)酸的陰離子羧基與糖類化合物的陽離子胺基反應(yīng)，用水或酸溶液洗滌反應(yīng)物以得到精制材料，然后分離精制材料并干燥。換句話說，透明質(zhì)酸衍生物凝膠可通過如下步驟制備得到透明質(zhì)酸與含胺基糖類化合物的混合/攪拌步驟，透明質(zhì)酸的羧基活化步驟，以及透明質(zhì)酸的活化羧基與糖類化合物的胺基的反應(yīng)步驟。上述步驟具有的優(yōu)點(diǎn)是，反應(yīng)過程簡(jiǎn)易，分離步驟簡(jiǎn)單，并且不使用有害的有機(jī)溶劑。
本發(fā)明使用的透明質(zhì)酸或其陽離子鹽優(yōu)選地是一種或多種選自如下的化合物透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸銨、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂以及透明質(zhì)酸四丁基銨。
所述透明質(zhì)酸最終反應(yīng)濃度的優(yōu)選范圍為0.05mg/ml至50mg/ml之間。此處使用的某種組分(A)的“最終反應(yīng)濃度”是指組分(A)在總反應(yīng)溶液中的濃度，所述總反應(yīng)溶液除組分(A)外還含有其他組分(B，C...)。
所述透明質(zhì)酸的平均分子量?jī)?yōu)選范圍為500,000與5,000,000之間。
所述含胺基的糖類化合物是一種或多種選自如下的化合物脫乙酰殼多糖、脫乙酰殼多糖衍生物、去乙?；该髻|(zhì)酸以及去乙酰基透明質(zhì)酸衍生物。
所述含胺基的糖類化合物優(yōu)選地以某一量加入，所述量使胺基與透明質(zhì)酸的羧基比例范圍處于0.01到100之間(對(duì)于1摩爾當(dāng)量羧基的胺基的摩爾當(dāng)量)。
如上所述，羧基的活化可采用活化劑進(jìn)行誘導(dǎo)?；罨瘎┎o具體限制，只要它能活化透明質(zhì)酸的羧基并且能溶于水中即可，但優(yōu)選的是一種或多種作為主劑的化合物與一種或多種作為輔劑的化合物的混合物，所述主劑化合物選自如下1-烷基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(此處的烷基是1-10個(gè)碳原子的烷基)，1-乙基-3-(3-(三甲基銨基)丙基)碳二亞胺(“ETC”)以及1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺(“CMC”)，所述輔劑化合物選自如下1-羥基苯并三唑(“HOBt”)，3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(“HOOBt”)，1-羥基-7-氮雜苯并三唑(“HOAt”)，N-羥基琥珀酰亞胺(“NHS”)以及硫代-NHS。活化劑更優(yōu)選的是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(“EDC”)和NHS的混合物。
主活化劑優(yōu)選地以0.01mg/ml至20mg/ml的最終反應(yīng)濃度加入。輔活化劑同樣優(yōu)選地以0.1mg/ml至20mg/ml的最終反應(yīng)濃度加入。
本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠是表現(xiàn)出熱特異性應(yīng)答的材料，由此通過熱處理可使其具有各種屬性。用于所述熱處理的溫度優(yōu)選地介于25℃至130℃之間的范圍，更優(yōu)選地為40℃至80℃。所述熱處理的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選地處于0.5小時(shí)至144小時(shí)之間的范圍?？赏ㄟ^各種途徑實(shí)施熱處理，例如，對(duì)凝膠逐漸加熱，將凝膠加熱至某一溫度然后在該溫度下維持某一特定時(shí)間，加熱凝膠以使其溫度瞬間改變，等等。
根據(jù)本發(fā)明，從酰胺化反應(yīng)得到的產(chǎn)物可通過本發(fā)明所屬領(lǐng)域眾所已知的方法進(jìn)行分離和/或精制。分離和精制方法包括蒸餾(在大氣壓或減壓下)，重結(jié)晶，柱層析，離子交換層析，凝膠層析，親和層析，薄層層析，析相作用，溶劑萃取，滲析，洗滌等等。每一精制步驟均可在每一反應(yīng)或一系列反應(yīng)后進(jìn)行。
下文中，本發(fā)明將通過實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的范圍并不限于此。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述實(shí)施例1偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備為了生產(chǎn)偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠，將含40mg脫乙酰殼多糖(平均分子量300-1600；EugenBio)的1ml儲(chǔ)備溶液加入含200mg透明質(zhì)酸鈉(平均分子量500,000-2,500,000；LGCI)的34ml儲(chǔ)備溶液中，以形成終溶液，其中脫乙酰殼多糖終反應(yīng)濃度為1.0mg/ml，透明質(zhì)酸鈉的終反應(yīng)濃度為5.0mg/ml，然后進(jìn)行攪拌。于該混合物中加入含125mg EDC的2.5ml儲(chǔ)備溶液以及含150mg NHS的2.5ml儲(chǔ)備溶液，使其終反應(yīng)濃度分別為3.125mg/ml和3.750mg/ml，然后進(jìn)行攪拌。加入EDC和NHS后，反應(yīng)在25℃下進(jìn)行3小時(shí)，由此得到高粘彈性凝膠。為了與上述對(duì)比，按上述過程以相同方式制備了另一溶液，不同之處在于沒有加入脫乙酰殼多糖，因而未生成任何凝膠。
實(shí)施例2-5偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備及溶脹比的測(cè)定為了解釋方便，下文中組分用量只表示為終反應(yīng)濃度。
為了提供偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠，將含有一系列終反應(yīng)濃度的含脫乙酰殼多糖(平均分子量300-1600；EugenBio)的溶液(如表1所示)加入含有透明質(zhì)酸鈉(平均分子量2,500,000-5,000,000；LGCI)終反應(yīng)濃度為5.0mg/ml的溶液中，對(duì)混合物進(jìn)行攪拌。于混合物中加入EDC使其終反應(yīng)濃度為0.625mg/ml，及加入NHS使其最終反應(yīng)濃度為0.750mg/ml，然后進(jìn)行攪拌。加入EDC和NHS后，反應(yīng)在25℃下進(jìn)行17小時(shí)。然后將氯化鈉的濃度調(diào)至1M。加入與反應(yīng)溶液相同體積的乙醇，以沉淀透明質(zhì)酸衍生物。將沉淀物從反應(yīng)溶液中分離，洗滌并干燥。于干燥的透明質(zhì)酸衍生物中加入水，使衍生物濃度調(diào)節(jié)至10mg/ml，由此得到由凝膠組成的懸浮溶液。從懸浮溶液中只分離出凝膠相產(chǎn)物，然后將凝膠表面的一些水分除去，以測(cè)量凝膠的重量(濕重)。測(cè)重后，將凝膠在120℃下加熱45分鐘用以干燥，從而測(cè)量干燥的透明質(zhì)酸衍生物的重量(干重)。基于如下通式計(jì)算透明質(zhì)酸衍生物凝膠的溶脹比，結(jié)果如表1中所給出。
溶脹比＝濕重/干重表1實(shí)施例2-5中透明質(zhì)酸衍生物凝膠的溶脹比
實(shí)施例6-9偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備及復(fù)數(shù)粘度的測(cè)定為了生產(chǎn)偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠，將含有終反應(yīng)濃度為1.0mg/ml的脫乙酰殼多糖(平均分子量300-1,600；EugenBio)的溶液加入含有終反應(yīng)濃度為5.0mg/ml的透明質(zhì)酸鈉(平均分子量500,000-2,500,000；LGCI)的溶液中，對(duì)混合物進(jìn)行攪拌。于混合物中按表1中所示分別加入一系列終反應(yīng)濃度的EDC和NHS。加入EDC和NHS后，反應(yīng)在25℃下進(jìn)行17小時(shí)。然后將氯化鈉的濃度調(diào)至1M。加入與反應(yīng)溶液相同體積的乙醇，以沉淀偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物。將沉淀物從反應(yīng)溶液中分離出來，洗滌并干燥。于沉淀物中加入水，從而將透明質(zhì)酸衍生物濃度調(diào)節(jié)至10mg/ml。結(jié)果，得到帶有各種相的產(chǎn)物，如表2中所示。
反應(yīng)最后，于0.1Hz及25℃下采用流變計(jì)(PAAR PHYSICA)測(cè)量反應(yīng)混合物的復(fù)數(shù)粘度，由此所得到的值如表2中所述。
表2實(shí)施例6-9中透明質(zhì)酸衍生物的復(fù)數(shù)粘度及材料相(0.1Hz，25℃)
實(shí)施例10去乙?；该髻|(zhì)酸衍生物凝膠的制備當(dāng)透明質(zhì)酸在低或高pH下加熱時(shí)，可發(fā)生去乙?；瘡亩删哂懈叨确磻?yīng)活性的胺基。為了進(jìn)行去乙酰基化，將透明質(zhì)酸于25-50℃下與0.2N至10N的NaOH反應(yīng)1-30小時(shí)。結(jié)果，得到去乙?；潭葹?％-40％的去乙?；该髻|(zhì)酸。于終反應(yīng)濃度為10mg/ml的去乙?；耐该髻|(zhì)酸溶液中，加入終反應(yīng)濃度為2.4mg/ml的EDC溶液及終反應(yīng)濃度為2.9mg/ml的NHS溶液，然后在25℃下反應(yīng)3小時(shí)。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行精制后得到凝膠。
實(shí)施例11偶聯(lián)有去乙?；该髻|(zhì)酸的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備將去乙酰基化程度為1％-40％的去乙?；该髻|(zhì)酸溶液分別與終反應(yīng)濃度為0.5mg/ml的透明質(zhì)酸溶液(平均分子量2,500,000-5,000,000)混合，以形成混合溶液。于混合溶液中加入終反應(yīng)濃度為0.2mg/ml的EDC和終反應(yīng)濃度為0.24mg/ml的NHS，然后在25℃下實(shí)施反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)終止后，將反應(yīng)物精制并干燥，以得到偶聯(lián)有去乙?；耐该髻|(zhì)酸的透明質(zhì)酸衍生物凝膠。
實(shí)驗(yàn)1檢測(cè)偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的熱特性-1為了確定實(shí)施例5，7和8中得到的、偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的熱特性，采用流變儀在0.1Hz下，并溫度在25-75℃范圍內(nèi)增加，測(cè)量每一凝膠的流變能力。結(jié)果如表3-5中所示。
實(shí)施例5中所得的透明質(zhì)酸衍生物凝膠從約60℃開始顯示粘彈性快速增加，并且通常顯示出極高的彈性。實(shí)施例7中所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠隨溫度升高顯示粘彈性降低，并且還顯示出粘性高于彈性。同時(shí)，實(shí)施例8中所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠在25-75℃范圍內(nèi)，顯示粘彈性幾乎沒有改變，由此可以確認(rèn)，其物理結(jié)構(gòu)并不依溫度改變而發(fā)生變化。
表3實(shí)施例5的透明質(zhì)酸衍生物凝膠依賴于溫度的的流變能力(0.1Hz)
表4實(shí)施例7的透明質(zhì)酸衍生物凝膠依賴于溫度的流變能力(0.1Hz)
表5實(shí)施例8的透明質(zhì)酸衍生凝膠依賴于溫度的流變能力(0.1Hz)
實(shí)驗(yàn)2偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的熱特性測(cè)量-2將實(shí)施例2，3和4中所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠懸浮物在60℃下維持36小時(shí)，得到具有高粘彈性的凝膠。25℃及0.02Hz下采用流變儀測(cè)量每一凝膠的復(fù)數(shù)粘度，結(jié)果如表6中所述。
表6偶聯(lián)有脫乙酰殼多糖的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的復(fù)數(shù)粘度(0.02Hz)
實(shí)驗(yàn)3通過各種熱處理形成透明質(zhì)酸衍生物凝膠將實(shí)施例1-5和7-9中生產(chǎn)的透明質(zhì)酸衍生物在25-130℃下熱處理0.1-72小時(shí)，得到具有如下流變能力的凝膠、凝膠懸浮物或溶液。
0.01Hz-0.1Hz下復(fù)數(shù)粘度＝100cP-20,000,000cP0.01Hz-0.1Hz下存儲(chǔ)模量＝0Pa-20,000Pa0.01Hz-0.1Hz下?lián)p耗模量＝0Pa-5000Pa雖然本發(fā)明可以包括在一系列形式中，只要不偏離本發(fā)明的精神或其本質(zhì)特性，但應(yīng)理解，除另外說明外，不應(yīng)以任何的前面所述對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行限制，而應(yīng)廣義理解為處于所附權(quán)利要求定義的精神和范圍內(nèi)，因而處于權(quán)利要求與范圍內(nèi)的所有改變和修正，或這種要求和范圍的同等物，均應(yīng)被所附權(quán)利要求所包含。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明由透明質(zhì)酸和含胺基糖類化合物反應(yīng)生成的透明質(zhì)酸衍生物凝膠，由于其所帶共價(jià)鍵是一種能耐受各種體內(nèi)條件的生物相容性材料。而且，透明質(zhì)酸衍生物凝膠可通過簡(jiǎn)易反應(yīng)和簡(jiǎn)單的分離過程，使用無害有機(jī)溶劑而制得，具有非常良好的粘彈屬性，因而可用于各種目的，例如術(shù)后防粘連凝膠，治療皺紋的材料，整形手術(shù)材料，治療關(guān)節(jié)炎的材料，藥物傳送體系的載體。特別地，通過采用各種反應(yīng)條件，可使透明質(zhì)酸衍生物具有各種不同的熱屬性。此外，通過各種熱處理，可將這些透明質(zhì)酸衍生物制成凝膠狀態(tài)，對(duì)熱顯示出各種特有的特性。
權(quán)利要求
1.一種制備透明質(zhì)酸衍生物凝膠的方法，包含如下步驟(a)將透明質(zhì)酸或其陽離子鹽與含胺基的糖類化合物混合，然后攪拌；(b)活化透明質(zhì)酸或其陽離子鹽的羧基；以及(c)將活化的透明質(zhì)酸或其陽離子鹽的羧基與糖類化合物的胺基反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中透明質(zhì)酸的陽離子鹽是選自如下的一種或者多種鹽透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸銨、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂以及透明質(zhì)酸四丁基銨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中透明質(zhì)酸或其陽離子鹽的終反應(yīng)濃度在0.05mg/ml至50mg/ml之間的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中透明質(zhì)酸或其陽離子鹽的平均分子量在500,000至5,00,000之間的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中含胺基的糖類化合物是選自如下的一種或者多種化合物脫乙酰殼多糖、脫乙酰殼多糖衍生物、去乙?；耐该髻|(zhì)酸以及去乙?；耐该髻|(zhì)酸衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中含胺基的所述糖類化合物的加入量使胺基與透明質(zhì)酸的羧基比例在0.01∶1至100∶1的范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中羧基的活化通過加入一種或多種羧基活化劑來完成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中羧基的活化通過加入一種或多種作為主劑的化合物與一種或多種作為輔劑的化合物來完成，所述主劑化合物選自1-烷基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(此處的烷基是1-10個(gè)碳原子的烷基)，1-乙基-3-(3-(三甲基銨)丙基)碳二亞胺(“ETC”)以及1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺(“CMC”)，所述輔劑化合物選自1-羥基苯并三唑(“HOBt”)，3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(“HOOBt”)，1-羥基-7-氮雜苯并三唑(“HOAt”)，N-羥基琥珀酰亞胺(“NHS”)以及硫代-NHS。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的主活化劑是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(“EDC”)，并且輔活化劑是NHS。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中加入的EDC的終反應(yīng)濃度為0.01mg/ml至20mg/ml之間。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中加入的NHS的終反應(yīng)濃度為0.1mg/ml至20mg/ml之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包含在25-130℃下將步驟(c)中生成的透明質(zhì)酸衍生物凝膠熱處理0.5-144小時(shí)的步驟。
13.通過權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法生成的透明質(zhì)酸衍生物凝膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過透明質(zhì)酸或其陽離子鹽與含胺基糖類化合物的酰胺化作用得到的、具有出色粘彈屬性的透明質(zhì)酸衍生物凝膠，以及制備該衍生物凝膠的方法。特別地，本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠顯示出特有的熱應(yīng)答，并可通過熱處理使其具有各種屬性。本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠可用于各種目的，例如術(shù)后防粘連凝膠，治療皺紋的材料，整形手術(shù)的輔助材料，治療關(guān)節(jié)炎的材料，以及藥物傳送載體。
文檔編號(hào)C08L5/08GK1694903SQ03817743
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2003年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者文泰錫, 金振勛, 李在永, 閔炳赫, 趙光龍 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Lg生命科學(xué)