專利名稱：防止蛋白氧化降解的方法和組合物的制作方法
相關(guān)申請本申請要求于2002年7月12日申請的美國臨時專利申請順序號60/395,411的權(quán)益，所述申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
蛋白在純化和貯藏期間經(jīng)歷不同程度的降解。氧化是蛋白的主要降解途徑之一，且對蛋白的穩(wěn)定性有破壞作用。蛋白的氧化降解導致電子的失去，這導致氨基酸殘基的破壞、蛋白的聚集[Davies，J.Biol.Chem.2629895-901(1987)、肽鍵的水解[Kang和Kim，Mol.Cells7553-58(1997)以及因此由于改變蛋白的三級結(jié)構(gòu)而使蛋白不穩(wěn)定。
氧化經(jīng)由許多不同且互相聯(lián)系的途徑發(fā)生，且被種種的引發(fā)條件催化，所述引發(fā)條件包括高溫、氧含量、氫離子濃度(pH)以及暴露在過渡金屬、過氧化物和光之中。通常，導致蛋白的氧化降解的一個重要因素是暴露在氧和金屬中。將某些賦形劑配制在藥用組合物中，以提供對聚集的阻止；但因為它們含有氧，因而也可增強氧化。例如，吐溫含有微量的過氧化物污染物，這些污染物在有低濃度金屬的情況下可導致吐溫的氧化。氧自由基和金屬的組合導致吐溫的自動氧化和進一步破壞，因此，提供氧化的催化劑，因而使與所述吐溫一起配制的蛋白降解。
供治療用的人源化抗體和完全人抗體的出現(xiàn)，已產(chǎn)生了通過防止氧化降解來保持藥用組合物中的蛋白穩(wěn)定性的需要。蛋白例如含有單克隆抗體溶液的氧化，可導致所述抗體的降解、聚集和斷裂，且因此損失抗體活性。因此，用將會保護蛋白的賦形劑，來配制含有肽且含有抗體的藥用組合物，使蛋白免受由于多種引發(fā)因子的氧化性損傷，是所希望的。如此，為了提供在一段時期內(nèi)能承受氧化條件的、含有蛋白的穩(wěn)定藥用組合物，有必要在本領(lǐng)域中確定將對蛋白降解的加速進行補救的物理條件和化學條件。
發(fā)明概述本發(fā)明提供保護蛋白以防由于氧化損害的、改進的組合物和制劑。所述組合物包含一種或多種蛋白，所述蛋白對氧化敏感、與金屬螯合劑以及還可任選一種或多種自由基清除劑(特別是氧自由基清除劑(“ROS”清除劑))配制在一起。所述組合物顯示出增強的抗氧化性，導致例如較長的產(chǎn)品保質(zhì)期、允許室溫貯藏的更大穩(wěn)定性和/或在產(chǎn)品包裝方面的更大靈活性。另外，已證明所述組合物顯示出顯著的保護作用，甚至對常常對氧化性損傷特別敏感的、具有一個或一個以上亞基或多肽鏈的多單位蛋白質(zhì)，也顯示出所述的保護作用。因此，本發(fā)明提供一種用于保護(即穩(wěn)定)甚至多單位蛋白組合物例如抗體組合物的重要手段。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種包含蛋白的組合物，所述蛋白與選自以下的金屬螯合劑組合配制在一起(例如，在例如實驗室等級的制備中或在例如藥用組合物的制備中)去鐵胺(DEF)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和/或二(氨乙基)乙二醇醚N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)。螯合劑的一個優(yōu)選組合是在防止蛋白氧化方面顯示出意想不到的協(xié)同作用的DTPA和DEF。另一個優(yōu)選的螯合劑組合是EGTA和DEF。
本發(fā)明的組合物可以還包含一種或多種中和氧自由基的試劑(即ROS清除劑)。合適的ROS清除劑包括例如甘露醇、甲硫氨酸和/或組氨酸。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種包含一種或多種蛋白的組合物，所述一種或多種蛋白與一種或多種金屬螯合劑(例如DEF和/或DTPA)以及一種或多種ROS清除劑(例如甘露醇、甲硫氨酸和/或組氨酸)配制在一起。
可以按照本發(fā)明來保護且因此穩(wěn)定任何合適的、對氧化敏感的目標蛋白或多肽(即可以配制在本文中描述的氧化保護性化合物中)。所述蛋白可以呈其天然(例如自然的)狀態(tài)，或是通過例如微型膠囊化或綴合作用而修飾的。所述蛋白可以是治療劑或是診斷劑。這樣的蛋白包括例如防止氧化性損傷的免疫球蛋白(immunoblobulins)、牛血清白蛋白(BSA)、人生長激素(hGH)、甲狀旁腺激素(PTH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。
另外，可以按照本發(fā)明來保護對氧化性損傷、蛋白聚集和分解特別敏感的多單位蛋白例如抗體，所述氧化性損傷、蛋白聚集和分解使所述蛋白變得無診斷功能和治療功能。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供被保護(即穩(wěn)定)抗體的組合物，例如包括一種或多種單克隆抗體的那些組合物；所述單克隆抗體即包括完全人抗體以及其片段和免疫綴合物(即綴合治療劑的抗體，所述治療劑即例如作為毒素、聚合物、造影劑或藥物的治療劑)的單克隆抗體。
本發(fā)明的組合物也可以包括一種或多種抑制蛋白聚集的試劑。在一個具體的實施方案中，所述試劑選自聚山梨酯80、聚山梨酯20、甘油和泊洛沙姆聚合物。所述組合物可以再進一步包括保持組合物的pH優(yōu)選在約pH5.O至約pH8.0的緩沖劑。合適的緩沖劑包括例如三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、乙酸鹽、2-(N-嗎啉代)-乙磺酸(MES)、琥珀酸、哌嗪雙乙磺酸(PIPES)、Bis-Tris、2-(N-嗎啉代)-丙磺酸(MOPS)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-3-丙磺酸(EPPS)、乙二胺、磷酸和馬來酸。
因此，在另一個方面，本發(fā)明提供一種制備穩(wěn)定的蛋白組合物的方法，即通過將蛋白與一種或多種金屬螯合劑、ROS清除劑和/或如上所述可任選的其它試劑配制在一起。
根據(jù)下面的發(fā)明詳述和實施例，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將會是顯而易見的，所述實施例不應解釋為是限制性的。本申請中引用的所有參考文獻、專利和公布的專利申請的內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于減少或防止例如導致蛋白分解和聚集的蛋白氧化的方法和組合物。如同本文中所示的，通過將蛋白與氧化保護性化合物(例如過渡金屬螯合劑、ROS清除劑及其它活性劑)的不同組合配制在一起，可以達到顯著保護。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗氧化組合物包含易于因氧化機制而損害的、且因此難以保持穩(wěn)定形態(tài)的單克隆抗體。
具體地說，本發(fā)明首次證明，精選的螯合劑組合例如與DTPA或EGTA組合的DEF，對由種種試劑以及金屬(例如銅和鐵)、過氧化物、溫度和光等環(huán)境因素引起的蛋白氧化，具有顯著的保護作用。本發(fā)明進一步證明當組合使用DEF和DTPA時的意想不到的結(jié)果——DEF和DTPA顯示出防止蛋白氧化降解的協(xié)同保護作用(即與單獨用任一種螯合劑而觀察到結(jié)果相比，大于所預期的結(jié)果)。本發(fā)明進一步證明，螯合劑和ROS清除劑的特別組合，例如與甘露醇、甲硫氨酸和/或組氨酸組合的DTPA，提供對蛋白氧化的顯著保護作用。
為使本發(fā)明更加容易理解，首先定義一些術(shù)語。另外的定義在本發(fā)明詳細說明的全文中提到。
定義當用于本文時，用來描述本發(fā)明的下列術(shù)語和短語應該有下面提供的含義。
術(shù)語“氧化保護性化合物”是指通過例如螯合可導致或促進氧化的金屬或者通過清除氧自由基(本文中稱之為“活性氧形式”或“ROS”)而防止、限制、減少或在其它方面控制蛋白氧化的任何物質(zhì)。本發(fā)明組合物中所用的氧化保護性化合物通常提供相對保護，從而使至少約10％免遭氧化，優(yōu)選使至少約20％免遭氧化，更優(yōu)選使至少約40％免遭氧化，再更優(yōu)選使至少約60％免遭氧化，最優(yōu)選使至少約80％或以上免遭氧化。
本文所用的“相對保護”是指與在沒有一種或多種氧化保護性化合物情況下發(fā)生的氧化相比，由一種或多種氧化保護性化合物提供的保護。在一個具體的實施方案中，相對保護(RP)如下計算Rp＝100％-[(用抗壞血酸(Asc)和金屬處理的、含有保護性化合物的樣品中特定帶的強度)÷(用抗壞血酸和金屬處理的、沒有保護性化合物的樣品中特定帶的強度)]本發(fā)明的氧化保護性化合物包括例如過渡金屬螯合劑(例如DTPA、DEF、EGTA等)、ROS清除劑(例如甘露醇、山梨醇、甲硫氨酸、組氨酸、褪黑激素)及其它防止蛋白氧化的試劑。
術(shù)語“抗氧化組合物”是指含有一種或多種氧化敏感性蛋白以及一種或多種氧化保護性化合物的組合物。這樣的組合物顯示出減弱氧化的傾向，正如由例如存在的氧化相關(guān)聚集體或降解物的百分比降低所表明的。這可以用例如SDS-聚丙烯酰胺電泳(PAGE)或者其它的生化技術(shù)或生物物理技術(shù)來測定；且例如通過測定相對保護來定量。
術(shù)語“中和”是指一種或多種氧化保護性化合物例如螯合劑或ROS清除劑防止氧化的能力，即起氧化保護性化合物作用的能力。
術(shù)語“螯合劑”、“金屬螯合劑”、“過渡金屬螯合劑”及其別的語法上的變體可互換使用；且指的是有許多帶負電荷的配體和/或多電子配體的多官能分子，所述配體可以以不同的親和力多價螯合金屬離子。合適的多電子官能團包括羧基、羥基和氨基。這些基團在氨基多羧酸、羥基多羧酸、羥基氨基羧酸等中的排列，產(chǎn)生具有結(jié)合金屬能力的部分，由此除去溶液中的金屬并且使它不能與含O2化合物起反應。螯合劑的實例包括氨基多羧酸例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、N-2-乙酰氨基-2-亞氨基二乙酸(ADA)、二(氨乙基)乙二醇醚-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、反式-環(huán)己二胺四乙酸(DCTA)、谷氨酸和天冬氨酸，羥基氨基羧酸例如N-羥乙基亞氨基二乙酸(HIMDA)、N，N-二-羥乙基甘氨酸(N-二(羥乙基)甘氨酸)和N-(三羥甲基甲基)甘氨酸(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)，以及N-取代的甘氨酸例如N-甘氨酰甘氨酸。其它的候選螯合劑包括2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙磺酸(BES)和去鐵胺(DEF)。本發(fā)明蛋白制劑中所用的合適螯合劑包括例如結(jié)合溶液中的金屬離子從而使它們變得不能與存在的O2起作用、由此使·OH官能團的產(chǎn)生減至最小或防止·OH官能團產(chǎn)生的那些螯合劑，所述·OH官能團即可以自由地與蛋白起反應且降解該蛋白的·OH官能團。這樣的螯合劑可減少或防止在沒有螯合劑保護情況下配制的蛋白的降解。
用于本發(fā)明的螯合劑可以以其鹽形式存在，所述鹽形式即例如上述螯合劑的羧基官能團或其它酸式官能團的鹽形式。這樣的鹽的實例包括與鈉、鉀、鈣及其它弱結(jié)合金屬離子形成的鹽。正如本領(lǐng)域中已知的，所述鹽的性質(zhì)和待中和的電荷數(shù)將會取決于存在的羧基數(shù)和供給穩(wěn)定螯合劑時的pH。同樣正如本領(lǐng)域中已知的，螯合劑有各不相同的結(jié)合特定靶離子的強度。通常，結(jié)合重金屬離子比結(jié)合其同樣電荷的較低分子量對應物更強烈。
術(shù)語“氧自由基清除劑”、“活性氧形式的清除劑”和“ROS清除劑”可互換使用，且指的是除去溶液中的氧居中的自由基或ROS的化合物。氧居中的自由基是具有氧中心和外層的兩個不成對電子的任何自由基。由于不成對電子的存在，自由基是高度活性的。最常見的ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(·OH)、單線態(tài)氧(1O2)和過氧化氫(H2O2)。本發(fā)明的合適ROS清除劑包括但不限于甲硫氨酸、組氨酸和甘露醇。
I.影響蛋白穩(wěn)定性的因素氧損傷/氧化性損傷蛋白的氧化是最常見的降解原因之一，因為它涉及一種普遍存在的元素——氧的參與。包括過氧化氫和游離超氧化物(O2-)以及羥基自由基(·OH)的活性氧形式，可導致蛋白的相當大的損害；包括蛋白的聚集(Davies，JBC 1987第262卷，第9895頁、肽鍵的水解(Kang和Kim，Mol.Cells 1997第7卷，第553頁)以及分子間交聯(lián)的二酪氨酸(Davies，JBC 1987 第262卷，第9908頁)。
常用的純化和貯藏方法可能使蛋白質(zhì)性生物治療藥物暴露于導致氧化性損傷的條件和組分下。微量(ppm水平)的金屬(Cu2+、Fe2+、Co2+和Mn2+，鐵和銅是最常見的(Packer，Method Enz.第186卷，第14頁)(Ahmed，J.Biol.Chem.1975第250卷，第8477頁))，可浸出最終的容器包裝材料，例如玻璃小瓶；從而促進酰胺鍵的水解(Wang和Hanson，J.Parent.Sci.Tech.1988第42卷，第s4-s25頁)、增強氧化及導致蛋白聚集。暴露在光中也可以產(chǎn)生參與氧化級聯(lián)的活性物質(zhì)。FDA批準的常用表面活性劑——吐溫(聚山梨酯)，可以含有活性氧形式，該活性氧形式作為雜質(zhì)(Packer，Method in Enzymology 1990第186卷)并促進氧化性損傷(Hunt，Biochem.J.1988第250卷，第87頁)(Chang和Bock，Anal.Biochem.1980，第104卷，第112頁)。另外，常規(guī)用來保護小分子以防氧化的某些抗氧化劑，包括例如硫醇衍生物、亞硫酸鹽(如硫酸鈉)和抗壞血酸，對蛋白是有害的，尤其是對大的蛋白例如單克隆抗體是有害的；因為這些添加劑對二硫鍵有害。
因此，本發(fā)明提供在蛋白制劑方面通過控制一種或多種前面提到的氧化機制而減少氧化性損傷的方法和組合物。這在生產(chǎn)過程中和在貯藏條件方面可導致例如改善的產(chǎn)品穩(wěn)定性和/或更高的適應性。
溫度和pH大多數(shù)蛋白的化學降解過程是與溫度有關(guān)的。然而就氧化而論，卻存在矛盾事物。溫度越低氧溶解度越大，但降低氧化降解速率；溫度越高氧溶解度越低，但增加氧化降解速率(J.Par.Sci Tech.第36卷，1982，第222頁)。
pH是影響氧化的另一個因素。當增大pH超過7.0時，氫離子濃度增大；且由于它，氧化電位(能斯特方程)也是如此。已充分證明了pH對肽水解的作用，而在單克隆抗體方面，不但在酸性pH、而且在堿性pH時，所述作用都可以發(fā)生。在酸性條件下，蛋白水解可以在具有氨基酸序列——X-Asp-X、Ser/Thr-X、Pro-X的位點發(fā)生；或者，在堿性條件下，蛋白水解可以在具有氨基酸序列X-Asn-X、X-Asp-X的位點發(fā)生(Volkin，Mol.BioTech.1997第8卷，第105頁)(Reubsaet，J.Pharm.BioMed.Anal.1998第17卷，第955頁)。在酸性條件下，切開的Ser-X和Thr-X受微環(huán)境和N端一側(cè)或C端一側(cè)的相鄰氨基酸的影響(Wang和Hanson，J.Parent.Sci.Tech.1988第42卷，第s4-s25頁)。在酸性及氧化條件下，Pro-X形成谷氨酰半醛或者在2-吡咯烷酮處被水解而形成新的N-末端(Reubsaet，J.Pharm.Biomed.Ana.1998第17卷，第955頁)。
II.不可還原共價蛋白聚集體的形式蛋白聚集體的大多數(shù)形式是二硫化物間的新的交聯(lián)的結(jié)果，或者是新形成的、非二硫化物的交聯(lián)的結(jié)果。由氧化引起的兩種類型的不可還原交聯(lián)，涉及色氨酸(Trp)轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸(一種開式戊環(huán)結(jié)構(gòu))而導致熒光發(fā)射減少和蛋白聚集，或者涉及二酪氨酸間的結(jié)合而導致在410-420nm的熒光光譜發(fā)射增強(在315nm處激發(fā))(Wold和Moldave，ME，1984第107卷，第377頁)。
不可還原二硫化物交聯(lián)的其它形式是酰胺化作用(在酸性條件下的Lys酰胺+羧基)或轉(zhuǎn)酰胺基作用(在酸性或者堿性條件下的Lys酰胺+Asn/Gln)。在有金屬的情況下，可增強/促進蛋白的轉(zhuǎn)酰胺基作用(Hirs和Timasheff，ME.1972第25卷，第411頁)。
β消除是二硫鍵的還原、過硫化物的形成、硫醛變成醛以及在堿性pH時加速的活性脫氫丙氨酸的形成。脫氫丙氨酸可以與酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)以及半胱氨酸形成新的不可還原交聯(lián)，且在酸性條件下，在脫氫丙氨酸的C端一側(cè)發(fā)生肽的水解(“Chemical Deterioration of Protein”1980 Whitaker J.ACSSymp Ser.123，第147頁)。
III.用于確定蛋白降解程度的分析技術(shù)如同本文中描述的，在一個實施方案中，本發(fā)明采用依據(jù)化合物來確定蛋白降解程度的有效方法。不僅可用該方法來鑒定防止這樣降解的化合物，而且可用該方法來確定所提供的保護程度。尤其是所提供的方法涉及增加蛋白的氧化性損傷，且證實這種損傷產(chǎn)生在實時和加速老化期間所觀察到的同樣的物質(zhì)。在一個具體的實施方案中，通過使樣品暴露于抗壞血酸鈉(例如4mM、pH7.5、37℃達48小時)，來模擬氧化條件。通過樣品在SDS-PAGE上電泳，繼之以銀染色，可以目測氧化形式。至于我們的分析，加入3μg材料，這高于銀染色的常用加樣量；所述銀染色具有毫微克水平的靈敏度。這保證甚至在相對低豐度時的物質(zhì)的檢測。為樣品間的直接比較而分析凝膠譜帶強度的光密度測定法是本領(lǐng)域中已知的。例如可用該方法在各種各樣金屬的范圍內(nèi)，靠產(chǎn)生氧化的化合物，來評價所提供的保護程度?？梢杂迷S多分析法例如反相-高壓液相色譜法(RP-HPLC)、紫外測定法、熒光測定法和無梯度洗脫來確定氧化產(chǎn)物的存在(Reubasaet等，(1998)J.Pharm.Biomed Anal.17955-978)。一般通過使樣品在pH7.5、37℃暴露于抗壞血酸鈉達48小時，來完成恰當?shù)难趸??？梢杂梅治龇ɡ缤ㄟ^銀染色的SDS-PAGE的顯現(xiàn)法，來證實氧化。
本發(fā)明也包括其它識別增加氧化性損傷的方法，所述氧化性損傷即與在實時和加速老化期間發(fā)生的損傷相當?shù)难趸該p傷。例如，可以使用許多氧化劑例如堿性介質(zhì)、銅、鐵、過氧化物酶和抗壞血酸。
IV.蛋白用本發(fā)明方法和組合物，可以穩(wěn)定(即保護)對氧化敏感的任何蛋白，包括結(jié)合蛋白、免疫球蛋白(immunoglobins)、酶、受體、激素及其片段。獲得或產(chǎn)生所述蛋白之源或方式并不重要，例如不管是用適當?shù)募兓桨笍募毎蚪M織材料中分離的，用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的，還是用標準肽合成技術(shù)化學合成的。例如，可以用本發(fā)明的方法和組合物來穩(wěn)定各種各樣的天然蛋白、合成蛋白和/或包括嵌合蛋白和/或融合蛋白在內(nèi)的重組蛋白。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定抗體(包括單克隆抗體和人抗體)的組合物和方法。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可互換使用，且包括其片段和衍生物。
本發(fā)明中所用的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指一群僅包含一種能與特定表位起免疫反應的抗原結(jié)合部位的抗體分子。本發(fā)明也涉及用本發(fā)明組合物和方法穩(wěn)定的重組抗體。重組抗體包括但不限于嵌合單克隆抗體和人源化單克隆抗體(既包含人部分、又包含非人部分)、單鏈抗體和多特異性抗體。嵌合抗體是抗體分子中不同部分來源于不同動物物種的分子，例如具有來源于鼠單克隆抗體的可變區(qū)和來源于人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些抗體。單鏈抗體具有一個抗原結(jié)合部位且由單一多肽組成。多特異性抗體是具有至少兩個特異性結(jié)合不同抗原的抗原結(jié)合部位的抗體分子。可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來生產(chǎn)這樣的分子。人源化抗體是具有一個或多個來自非人類物種的互補性決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)的、來自非人類物種的抗體分子。此外，可以用本發(fā)明的制劑和方法來穩(wěn)定完全人抗體；不管所述抗體來源于人，還是來源于包含人基因的轉(zhuǎn)基因動物。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會認識到，用本發(fā)明組合物和方法配制的抗體可以是抗體片段，特別是包含抗體的抗原結(jié)合部分的片段。術(shù)語“抗原結(jié)合部分”是指一種或多種保持與抗原結(jié)合能力的抗體片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段來執(zhí)行。包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”的結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，一種由VL區(qū)、VH區(qū)、CL區(qū)和CH1區(qū)組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，一種包含通過二硫鍵在絞鏈區(qū)連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH區(qū)和CH1區(qū)組成的Fd片段；(iv)由抗體一條臂的VL區(qū)和VH區(qū)組成的Fv片段；(v)由VH區(qū)組成的dAb片段(Ward等，1989，Nature 341544-546)；以及(vi)分離的互補性決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個區(qū)—VL區(qū)和VH區(qū)是由不同基因編碼的，但可以利用重組方法，通過合成接頭將連接它們，使之成為單鏈蛋白，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等，1988，Science 242423-426；以及Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這樣的單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，獲得這些抗體片段，并且可以以與完整抗體的相同方式，根據(jù)用途對所述片段進行篩選。
因此，本發(fā)明也提供按照本文所述而配制的穩(wěn)定的治療用抗體和/或診斷用抗體組合物。合適的治療用抗體不僅包括任何抗體或其片段，而且包括抗體衍生物和免疫綴合物(例如與治療部分例如細胞毒素、治療劑或放射性金屬離子綴合的抗體)。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害的任何藥劑。實例包括泰素、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙素、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素以及其類似物或同系物。治療劑包括但不限于抗代謝藥(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化劑(例如氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐星、絲裂霉素C以及順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)霉素(例如柔紅霉素(從前稱為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放線菌素D(從前稱為放線菌素)、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有絲分裂藥(例如長春新堿和長春花堿)。用于綴合這樣的治療部分到抗體上的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。
本發(fā)明也提供包括一種或多種用本發(fā)明抗氧化組合物穩(wěn)定的蛋白(例如配制在本發(fā)明抗氧化組合物中)的試劑盒，且可任選提供使用說明書。
V.氫化保護性化合物已證明金屬螯合劑抑制/減少自由基的形成和吐溫(聚山梨酯)氧化。已證明了它們的效力，所述效力隨實驗條件而變化。已證明最常用的螯合劑EDTA在Cu催化的Fenton反應中抑制自由基的形成。在某些情況下，EDTA在Fe催化的Fenton反應中增強自由基的形成(Bioch.Biophy.Acta 1997，第1337卷，第319頁)。因為Fe-EDTA絡(luò)合物有一種允許羥基自由基(HO●)逃脫的敞開結(jié)構(gòu)，所以發(fā)生這一點。也有人提出EDTA在溶液中抑制Fe，阻止它在生理pH時沉淀(ME1990，第186卷，第16頁)。
DTPA可減少依賴鐵的、由O2和H2O2而來的羥基自由基(HO●)的形成(Packer，ME 1990，第186卷，第42頁)。去鐵胺是依賴鐵的脂質(zhì)過氧化的強有力抑制劑(Packer，ME 1990，第186卷，第42頁)。雖然已在蛋白制劑中使用過這兩種螯合劑；但是以前從來沒有一起使用過它們，例如在保護蛋白以防氧化的制劑中。
本發(fā)明其它氧化保護性化合物包括本領(lǐng)域公認的自由基清除劑，包括例如甘露醇、FDA批準的賦形劑和OH●清除劑(Kocha，BBA第1337卷，1997，第319頁)、組氨酸(Kammeyer，BBA第49卷，1999，第117頁)以及褪黑激素(自由基清除劑)(Reiter，Nutr.1998第19卷，第691頁)。
本發(fā)明氧化保護性化合物也可以是與防止蛋白聚集的試劑組合在一起的。這有助于進一步防止蛋白樣品和蛋白制劑的損傷與失活。合適的試劑包括例如聚山梨酯(例如聚山梨酯80和/或聚山梨酯20)、甘油、泊洛沙姆聚合物(例如泊洛沙姆407和泊洛沙姆188)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮以及芐澤。這樣的試劑是市場上買得到的，且是本領(lǐng)域眾所周知的。
VI.藥用組合物可以把本發(fā)明氧化保護性化合物摻入到適合于給藥的藥用組合物中。也可以將本發(fā)明氧化保護性化合物摻入到適合于診斷目的和/或?qū)嶒炇夷康牡慕M合物中。這樣的組合物一般包括目標蛋白以及氧化保護性化合物和藥學上可接受載體的組合。本文所用的術(shù)語“藥學上可接受的載體”是用來包括與給藥不矛盾的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。在本領(lǐng)域中，適合于藥用活性物質(zhì)的這樣的介質(zhì)和試劑的使用，是眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與所述活性化合物是不相容的；否則，期待其在所述組合物中的應用。也可以把補充的活性化合物摻入到所述組合物中。
因此，本發(fā)明不僅進一步提供包含穩(wěn)定蛋白的診斷用藥用組合物及治療用藥用組合物，而且進一步提供通過將蛋白與氧化保護性化合物和藥學上可接受載體的組合配制在一起而制備這樣組合物的方法。這樣的組合物可以還包括另外的試劑，包括不同濃度的聚山梨酯和不同濃度的甘油，以及保持pH例如在約5.O至約8.0的、各種各樣的緩沖劑。因此，在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供一種通過將一種或多種蛋白與DEF和EGTA或DTPA配制在一起(任選配合ROS清除劑以及藥學上可接受的載體)而制備抗氧化組合物的方法。
當然，藥用組合物的適當劑量取決于普通技能醫(yī)生、獸醫(yī)或研究人員的知識范圍內(nèi)的諸多因素。所述劑量會變化，例如隨受治療者或被處理樣品的身份、大小以及條件而改變；另外，會隨準備給予所述組合物的途徑而變化；如果是能應用的，則因按照本發(fā)明配制的蛋白組合物，而會隨主治醫(yī)師希望所述藥劑有的作用而改變。當為了調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白的表達或活性而準備把一種或多種的這些組合物給予動物(例如人)時，醫(yī)生、獸醫(yī)或研究人員在開始時例如可以規(guī)定一種相對小的劑量，其后增大劑量直到獲得適當?shù)姆磻獮橹埂Ａ硗?，不用說，任何特定動物受治療者的具體劑量水平將取決于各種各樣的因素，包括所用具體藥劑的活性、受治療者的年齡、體重、一般健康狀況、性別以及飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速率、任何藥物組合和所調(diào)節(jié)的表達或活性的程度。
本發(fā)明的藥用組合物是配制得適合于其預定的給藥途徑的。給藥途徑的實例包括胃腸外給藥例如靜脈內(nèi)給藥、真皮內(nèi)給藥、皮下給藥，口服給藥(例如吸入)，透皮給藥(局部給藥)，經(jīng)粘膜給藥以及直腸給藥。為了胃腸外應用、皮內(nèi)應用或皮下應用而采用的溶液劑或混懸劑可以包括下列組分無菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它的合成溶劑，抗菌劑例如苯甲醇或?qū)αu苯甲酯，緩沖劑例如乙鹽酸、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)節(jié)滲漲度的試劑例如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A例如鹽酸或氫氧化鈉來調(diào)節(jié)pH?？梢杂糜刹ＡЩ蛩芰现瞥傻陌碴场⒁淮涡宰⑸淦骰蚨啻蝿┝康男∑?，來包裝所述的胃腸外制劑。
適合于注射用的藥用組合物包含無菌水溶液(水溶性之處)或分散體系以及適合于用無菌注射溶液或分散體系臨時配制的無菌粉針劑。至于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。就一切情況而論，所述組合物必須是無菌的，而且應該是液體，使得存在易于注射性。它必須在生產(chǎn)和貯藏條件下穩(wěn)定，必須加以防腐以抵抗微生物例如細菌和真菌的污染作用。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如通過應用包衣，例如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒徑，以及通過利用表面活性劑，可以維持適當?shù)牧鲃有?。用各種各樣的抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、硫柳汞等，可以確保防止微生物的作用。在許多情況下，在所述組合物中包含等滲劑例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉，將是更好的?？吭谒鼋M合物中包括延遲吸收的藥劑例如一硬脂酸鋁和明膠，可以導致所述注射用組合物的長期吸收。
通過以所需要的量將活性化合物(例如多肽或抗體)摻入到具有一種上面列舉成分或上面列舉成分組合的合適溶劑中，可以配制無菌注射液；在需要時，繼之以過濾除菌。一般而言，通過將所述活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上述的所需其它組分的無菌載體中，制備分散體。就供制備無菌注射液用的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由預先過濾除菌的其溶液得到的所述有效成分加上任何額外的所需組分的粉末。
口服的組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用的載體?？梢杂妹髂z膠囊包裝它們或?qū)⑵鋲褐瞥善瑒榱丝诜委熜越o藥，所述活性化合物可以與賦形劑摻混在一起，并且可以將所述活性化合物以片劑、藥片或膠囊形式使用。也可以用用作漱口劑的液體載體，來制備口服組合物；在那方面，口服而發(fā)嗖嗖聲地應用該液體載體中的所述化合物，并且將其吐出或吞服。
可以包括藥學上相容的粘合劑和/或輔料作為所述組合物的一部分。所述片劑、丸劑、膠囊劑、藥片等可包含下列任何成分或類似性質(zhì)的化合物粘合劑例如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠，賦形劑例如淀粉或乳糖，崩解劑例如海藻酸、羧甲基淀粉鈉或玉米淀粉，滑潤劑例如硬脂酸鎂或Sterotes，助流劑例如膠態(tài)二氧化硅，甜味劑例如蔗糖或糖精，或者矯味劑例如薄荷、水楊酸甲酯或橙矯味劑。
至于通過吸入給藥，以來自噴霧器或包含合適拋射劑(例如氣體，所述氣體例如二氧化碳)的分散器或霧化吸入器的氣溶膠噴霧形式，遞送所述化合物。
系統(tǒng)給藥也可以通過經(jīng)粘膜途徑或透皮途徑。對于經(jīng)粘膜給藥或透皮給藥，將適合于待透過屏障的滲透劑用于所述制劑中。這樣的滲透劑通常是本領(lǐng)域中已知的，且對于透過粘膜給藥，包括例如去垢劑、膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。通過使用鼻噴霧劑或栓劑，可完成透過粘膜的給藥。對于透皮給藥，正如本領(lǐng)域中通常已知的，將所述活性化合物配制成軟膏劑、藥膏、凝膠劑或乳膏劑。
也可以以栓劑形式(例如，用常規(guī)栓劑的基質(zhì)例如可可脂及其它甘油酯)，或可以以用于直腸遞送的滯留型灌腸劑形式；來配制所述化合物。
在一個實施方案中，所述的活性化合物可以與保護所述化合物抵抗被機體迅速清除的載體例如控釋制劑(包括植入物和微膠囊遞藥系統(tǒng))一起制備。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，用于配制這樣制劑的方法將是顯而易見的。也可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc在市場上獲得所述材料。也可以將脂質(zhì)體懸浮液(包括含有單克隆抗體的脂質(zhì)體，所述單克隆抗體即摻入到脂質(zhì)體中或結(jié)合在其上的單克隆抗體)用作藥學上可接受的載體。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可制備所述的這些；例如，正如美國專利4,522,811號中所描述的。
尤其有利的是配制單位劑型的口服組合物或胃腸外組合物，以便于給藥和給藥的一致性。本文所用的單位劑型是指對于待治療的受治療者適合作為單位劑量的物理上分離的單位；每個單位含有計算用以與所需藥用載體結(jié)合產(chǎn)生所需療效的預定量的活性化合物。對于本發(fā)明的單位劑型的規(guī)定由以下因素決定或者直接取決于以下因素所述活性化合物的獨特特性和待達到的特定療效，和用于治療個體的敏感性的這樣一種活性化合物的配制領(lǐng)域中固有的限制。
至于抗體，優(yōu)選的劑量是0.1mg/kg體重到100mg/kg體重(通常10mg/kg到20mg/kg)。如果所述抗體必須在腦中起作用，則50mg/kg到100mg/kg的劑量通常是合適的。一般而言，部分人抗體和完全人抗體在人體內(nèi)具有比其它抗體長的半壽期。因此，較低的劑量和較不頻繁的給藥常常是可能的?？梢杂美缰|(zhì)化(lipidation)的修飾，來穩(wěn)定抗體；從而增強攝取和組織穿入(例如，到結(jié)腸上皮中)。抗體脂質(zhì)化的一種方法是由Cruikshank等描述的((1997)J.AcquiredImmune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14193)。
VII.示范性組合物的配制本小節(jié)提供按照本發(fā)明來制備示范性組合物的限度和配方。熟練的主治醫(yī)師可以容易地僅僅用常規(guī)實驗法來配制更多的在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它組合物。
合適的組合物可以包括一種或多種蛋白，所述蛋白的濃度為約1μg/ml至約500mg/ml、約50μg/ml至約300mg/ml或者約1mg/ml至約100mg/ml。
可以包括濃度在下列示范性范圍內(nèi)的一種或多種金屬螯合劑。合適的組合物可以包括濃度為約1μM至約10mM、約10μM至約10mM、約50μM至約5mM或者約75μM至約2.5mM的DTPA和/或EGTA。另外或者可以包括濃度為約1μM至約5mM、約10μM至約1mM或者約20μM至約250μM的DEF。
可以配制包括一種或多種ROS清除劑的組合物，來包含濃度在下面示范性范圍中的ROS清除劑。合適的組合物可以包括濃度約0.01％至約25％、0.1％至約25％、約0.5％至約12％或者約1％至約5％的甘露醇。另外或者所述組合物可以包括濃度為約10μM至約200mM、約100μM至約200mM、約500μM至約100mM或者約15mM至約35mM的甲硫氨酸。另外或者合適的組合物可以包括濃度約10μM至約200mM、約100μM至約200mM、約500μM至約100mM或者約15mM至約35mM的組氨酸。
合適的組合物可以包括一種或多種濃度約為0.0005％到12％、約0.001％至約0.1％或者約0.005％至約0.1％的聚山梨酯(例如聚山梨酯80和/或聚山梨酯20)。另外或者合適的組合物可以包括濃度約0.1％至約20％或者約1％至約5％的甘油。另外或者合適的組合物可以包括一種或多種濃度約0.001％至約30％或者約0.2％至約10％的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆407和/或泊洛沙姆188)。
合適的組合物可以任選包括緩沖劑，以保持約5.0至約8.0或者約5.5至約7.5的pH。緩沖劑的濃度可以為約5mM至約100mM或者約20mM至約50mM。
一個示范性的組合物包含結(jié)合蛋白、約50μM至約5mM的DTPA、約10μM至約1mM的DEF、保持所述組合物的pH在約5.0到8.0的緩沖劑和一種或多種下列試劑，所述下列試劑即約0.0005％至約12％的聚山梨酯20、約0.0005％至約12％的聚山梨酯80、約0.1％至約20％的甘油、約0.001％至約30％的泊洛沙姆407以及約0.001％至約30％的泊洛沙姆188。該組合物也可包含另外的試劑，包括甲硫氨酸、組氨酸和/或甘露醇。
在另一個示范性組合物方面，該組合物包含結(jié)合蛋白，約50μM至約5mM的DTPA，一種或多種下列試劑——約0.5％至約12％的甘露醇、約500μM至約100mM的組氨酸和約500μM至約100mM的甲硫氨酸，一種或多種下列試劑——約0.0005％至約12％的聚山梨酯20、約0.0005％至約12％的聚山梨酯80、約0.1％至約20％的甘油、約0.001％至約30％的泊洛沙姆407和約0.001％至約30％的泊洛沙姆188，以及保持所述組合物pH在約5.0到8.0的緩沖劑。
又一個示范性組合物包含DTPA、甘露醇、聚山梨酯、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉以及抗體或抗體片段。
實施例材料與方法1.蛋白氧化試驗使蛋白遭受氧化的許多方法是本領(lǐng)域中已知的，且可以用這些方法來試驗按照本發(fā)明的制劑，測試它們針對氧化條件的保護能力。通常采用的方法包括使蛋白暴露于H2O2或抗壞血酸+金屬和O2中(暴露在空氣中)(Reubsaet，J.Pharm.Biomed.Ana.(1998)17955)。在本實施例中，通過用pH7.5的抗壞血酸鈉(濃度4mM)、1μM銅或鐵在37℃一般保溫48小時處理樣品，來模擬氧化條件。除非注釋，所用蛋白樣品的濃度是1mg/ml。
2.促進穩(wěn)定性研究對于促進穩(wěn)定的精確研究，選擇合適的溫度是重要的。高溫可導致由部分解折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生的蛋白的不可逆變性是本領(lǐng)域眾所周知的。這樣的變化可使穩(wěn)定性研究復雜化，因為在蛋白解折疊轉(zhuǎn)變開始的溫度時或在超過這溫度時進行的促進穩(wěn)定的研究中，所觀察到的化學改變可能并不代表在適合于裝入小瓶終產(chǎn)物的常用貯藏條件例如4℃下發(fā)生的真實變性。可以用生物物理學技術(shù)例如量熱學和熒光光譜學，來證實高溫是否會導致這樣的變化。因此，對于這項研究，發(fā)現(xiàn)37℃并不導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解折疊。
3.金屬螯合劑、銅和鐵的溶液針對銅和鐵介導的氧化性損傷，為了研究金屬螯合劑對蛋白的保護作用，在如同上面小節(jié)1描述的促進氧化的條件下所進行的一系列研究中，試驗了EDTA、EGTA、DTPA和DEF等金屬螯合劑。用SDS-PAGE、氣相分配色譜-高壓液相色譜(GPC-HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析了蛋白樣品(精選的樣品)。
4.SDS-PAGF用Bio-Rad的Criterion凝膠(對于還原的樣品，4-20％；對于非還原的樣品，4-15％)，進行SDS-PAGE。以每孔3μg樣品的恒定加樣量，對所有凝膠(孔)進行加樣。利用一根Tosohaas TSK3000 SWXL柱(7.8mm×30cm)，用75μg注射液進行GPC-HPLC分析。
5.生物活性研究用特異性的ELISA，測定抗T淋巴細胞抗原的抗體的生物活性。用可溶性T淋巴細胞抗原包被96孔板。以各種各樣的濃度向所述板中加入所述抗體，并讓所述抗體結(jié)合可溶性T淋巴細胞抗原。用抗人IgG的堿性磷酸酶綴合的抗體、繼之以所述磷酸酶底物——對硝基苯磷酸，來檢測結(jié)合抗體。用ELISA板讀出器來測定OD405。所記錄的活性以暴露在既沒有氧化劑又沒有氧化保護性化合物中的參考標準——抗T淋巴細胞抗原抗體的100％結(jié)合活性為基準。
6.評價防止氧化的效力在升高的但比蛋白解折疊所必需的轉(zhuǎn)變溫度低的溫度(37℃)，溫育蛋白樣品達48小時。為分析防止氧化的保護程度，用還原性SDS-PAGE電泳所述蛋白樣品，而且用銀染色，來目測觀察。用光密度測定法來測定蛋白帶的強度的量。比較對照組合物中氧化相關(guān)物質(zhì)的強度與抗氧化組合物相應物質(zhì)的強度。
把保護的限度分類如下譜帶強度減少10％或以上，或者至少約10％的相對保護；譜帶強度減少20％或以上，或者至少約20％的相對保護；
譜帶強度減少40％或以上，或者至少約40％的相對保護；譜帶強度減少60％或以上，或者至少約60％的相對保護；譜帶強度減少80％或以上，或者至少約80％的相對保護。
實施例1螯合劑對銅和抗壞血酸誘導的蛋白氧化的影響將螯合劑加到抗壞血酸處理過的、包含單克隆抗體和添加的銅的樣品中，以及將螯合劑加到抗壞血酸處理過的、包含單克隆抗體而沒有添加銅的樣品中；并評價三個時間點(48小時、96小時、144小時)的降解。另外，也評價包含吐溫-80(有DTPA和沒有DTPA)的樣品。結(jié)果示于表1中。
表1
結(jié)果正如由銀染色的SDS-PAGE凝膠所顯現(xiàn)的，抗壞血酸在37℃處理達48小時的、包含抗T淋巴細胞抗原抗體的樣品無疑地增強降解和聚集。觀察到新的帶，且因抗壞血酸處理而使通常與低水平所述單克隆抗體(即以小于所述帶總強度的5％強度的參考標準存在的)有關(guān)的特異性聚集體和分解產(chǎn)物增加。由于所述銅離子的存在而使氧化性損傷變得更壞，形成約12條的帶，表示聚集體和分解產(chǎn)物兩者。添加EDTA(0.1mM或者1mM)則增強氧化性損傷。
比較起來，在沒有銅期間和在存在銅期間，DTPA(0.1mM和1mM)有強烈的保護作用(即減弱氧化，正如由所述抗體的聚集體和分解產(chǎn)物的減少所表示的)。雖然當不存在銅時，DEF提供一些防止氧化性損傷的保護，但探測到用DEF處理過的包含DEF銅的樣品中的損傷。向包含抗T淋巴細胞抗原抗體和0.02％吐溫-80的溶液中加入1mM DTPA也是保護性的，大大地減少反映大量氧化性損傷的所述譜帶的數(shù)目和強度。
當增加溫育時間時，也增大氧化性損傷的程度；通過SDS-PAGE，以存在多肽分解產(chǎn)物的譜帶強度增大最多達十倍且新的多肽分解產(chǎn)物形成新譜帶的形式，使這具體化。例如，溫育144小時，無保護的樣品受到強烈的氧化；這以SDS-PAGE的模糊成片條帶的形式顯現(xiàn)。但是，重要的是甚至在較長的溫育時間后，DEF和DTPA的保護作用是明顯的；正如通過SDS-PAGE由譜帶強度的極小增強和最小限度的新帶形成所顯現(xiàn)的。
用0.1mM DTPA與1.0mM DTPA處理過的樣品的譜帶強度沒有顯著性差異，提示在較低濃度時達到最大的保護。因此，測試較低的螯合劑濃度以確定用于保護的最低濃度。
因為抗壞血酸處理是相對粗糙的，產(chǎn)生氧化的物質(zhì)；所以進行另外的實驗，來研究通過高溫而不是加入抗壞血酸和金屬而產(chǎn)生的蛋白形式。使沒有抗壞血酸和金屬的、在較高溫度(45℃和53℃)溫育達幾個星期的、抗T淋巴細胞抗原抗體的樣品與已遭受到抗壞血酸和金屬處理的樣品一起在SDS-PAGE凝膠上電泳。不但在還原條件下，而且在非還原條件下，所看到的來自抗壞血酸處理泳道的氧化形式(正如SDS-PAGE的譜帶)和非抗壞血酸處理泳道的是一樣的(根據(jù)SDS-PAGE譜帶的順序)。這證明了導致所述抗體的相關(guān)聚集和分解形式的抗壞血酸處理方案的有效性。
實施例2螯合劑、吐溫-80和蛋白濃度對金屬和抗壞血酸誘導的蛋白氧化的影響下面的實驗聚焦在兩個主要參數(shù)上螯合劑的有效濃度(例如，低于實施例1所用那些濃度的試驗濃度)和基于不同金屬處理的有差別的效力。
用0.025mM、0.05mM、0.075mM和0.1mM的螯合劑處理含有抗T淋巴細胞抗原的單克隆抗體和0.02％吐溫-80的樣品，并在37℃溫育48小時。另外，或者用銅或者用鐵或者不用金屬處理所述樣品。同樣，另外的蛋白樣品在其暴露于銅和抗壞血酸處理期間時有較高(5mg/ml)的蛋白濃度。結(jié)果示于表2中。
表2
</claim><claim>6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的層壓制品，其特征在于各層具有根據(jù)下表的厚度
</claim><claim>7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的層壓制品，其特征在于各層在每種情況下單獨或以組合的方式包含根據(jù)下表的材料
</claim><claim>8.制備管和類似的箔片型包裝用的多層層壓制品的方法，所述多層層壓制品具有包埋的阻擋層(30)，金屬箔片，特別是鋁箔(60)，和非必要地外部結(jié)構(gòu)(70)，特別是外膜和/或密封膜(70)，其特征在于DEF在保護蛋白使其免受鐵介導的氧化性損傷方面的實用性。
這些數(shù)據(jù)清楚地顯示出由不同金屬螯合劑提供的防止氧化的作用隨金屬而定的差異。DTPA針對銅保護則較好，而DEF針對鐵保護。此外，較高的抗體濃度似乎并不影響DTPA的保護作用，因為通過SDS-PAGE，對于含有5mg/ml抗體的樣品，觀察到如同1mg/ml樣品的一樣帶型的譜帶。
實施例3DTPA和DEF的組合對防止蛋白氧化的協(xié)同作用上述的研究(實施例2)顯示，DTPA和DEF具有金屬特異性的、防止氧化的保護作用。具體地說，針對銅介導的蛋白損傷，DTPA有保護作用；而針對鐵介導的損傷，DEF有保護作用。因為通常發(fā)現(xiàn)藥品級玻璃中的銅和鐵，所以研究同時用銅和鐵處理、以及分別用銅和鐵處理DTPA和DEF組合的影響。另外，也研究了在有鐵的情況下是否較高濃度的DTPA(大于0.1mM)防止氧化。因此，對含有單克隆抗體、0.02％吐溫-80、銅或鐵或者這兩種金屬、以及不同濃度的DTPA濃度或DTPA/DEF組合的蛋白樣品進行評價。
結(jié)果在較高的DTPA濃度(0.5mM和1.0mM)時，在用鐵處理的樣品方面，有看得出的保護作用。在用銅或鐵或者這兩種金屬處理的樣品方面，有看得出的、由于DTPA與DEF組合的顯著保護作用。具體地說，如實施例1和實施例2中所示的，依據(jù)SDS-PAGE譜帶的不同帶型，或者用0.1mM DTPA或者用0.1mM DEF處理的蛋白樣品，顯示出一些氧化性損傷。然而，與所觀察到的、來自各個螯合劑的保護相比，0.1mM DTPA和DEF的組合處理則有比預期的保護作用大得多的保護作用。此外，1mM DTPA和0.1mM DEF的組合提供比所述0.1mM DTPA/DEF組合的保護少的保護。
除實施例1和實施例2中試驗的抗T淋巴細胞抗原抗體的樣品外，在所試驗的其它蛋白樣品中，也觀察到DTPA和DEF防止蛋白氧化的這種協(xié)同保護作用。例如，對于某些抗體，降解產(chǎn)物是更多的。對于某些抗體，兩種或更多種氧化保護性化合物使譜帶強度恢復回原狀——直到在沒用抗壞血酸和金屬處理的樣品方面所看到的程度；而對于其它抗體，所述組合減弱該強度，但顯示出小于完全保護的保護。在實施例4中進一步研究DTPA和DEF之間的意想不到的協(xié)同作用。
實施例4在防止蛋白氧化方面螯合劑濃度對DTPA和DEF之間的協(xié)同作用的影響通過用不同濃度的DTPA和DEF配制蛋白組合物，來研究DTPA和DEF對防止蛋白制劑氧化的協(xié)同保護作用。具體地說，使含有抗體、0.02％吐溫-80的蛋白樣品同時暴露于銅和鐵并用不同濃度的DTPA/DEF處理。
結(jié)果所有測試的樣品都顯示出在一定程度上保護抗體免遭氧化性損傷。一些組合有助于防止較高分子量的聚集，但不阻止物質(zhì)形成，這些物質(zhì)在重鏈帶和輕鏈帶之間洗脫出來。在用1mM DTPA/0.5mMDEF、0.02mM DTPA/0.1mM DEF和0.1mM DTPA/0.5mM DEF處理的樣品方面，觀察到最大的保護。
在銀染色后，用BIO-RAD GS-800光密度計掃描SDS-PAGE凝膠。光密度分析提供“校正的強度”(即表示帶的強度總和的且對任何染色背景進行過校正的帶強度)。利用Quantity One軟件來比較譜帶的強度，從而用數(shù)量表示保護作用；這些譜帶代表在整個實驗期間不斷觀察到的具體的氧化形式，包括聚集體和抗體的分解產(chǎn)物。
根據(jù)來自代表性帶/氧化形式的光密度數(shù)據(jù)的校正強度，顯然的是，防止氧化和DTPA/DEF濃度之間的關(guān)系不是簡單相加的。對于使一種形式極小化有效的DTPA和DEF的組合，未必阻止另一種形式的形成。最有效的具體濃度范圍(即使氧化譜帶減到最少的)是0.1mM到0.5mM的DTPA濃度與0.02mM到0.1mM的DEF濃度。這些結(jié)果表明，甚至在極低的螯合劑濃度時(例如，0.02mM DEF/0.1mMDTPA)，DTPA和DEF的組合提供顯著的保護。
實施例5DTPA、DEF和EGTA對于由EDTA增強的氧化性損傷的影響DTPA和DEF之間協(xié)同作用的實驗導致進行多項研究，以確定這兩種螯合劑中任何一種或兩種螯合劑是否可“拯救”由EDTA增強的氧化性損傷。另外，研究了單獨提供保護作用或配合先前研究的螯合劑提供保護作用的EGTA的能力。具體地說，使含有0.02％吐溫-80和EGTA或EDTA的蛋白樣品與其它螯合劑一起共同暴露于銅和/或鐵并進行評價。
結(jié)果在有DTPA、DEF或這兩種螯合劑的情況下，觀察到用EDTA處理的樣品中的嚴重的氧化性損傷。1mM EGTA，對基于銅的氧化，有相當大的保護作用(可與對照相比較的)；且針對由鐵引起的氧化，有較小的保護作用(與對照相比，正如由增加的聚集體和分解產(chǎn)物所表示的)。1mM EGTA+0.1mM DTPA顯示出略微增強的氧化，而1mM EGTA+0.1mM DEF顯示出良好的保護(可與對照相比較的)。然而，1mM EGTA+0.1mM的DEF和0.1mM的DTPA卻提供較差的保護。有趣的是，與EDTA或者EGTA一起的、較高濃度(1mM)的DEF和DTPA未能顯示出改進。
實施例6螯合劑、吐溫-80、蛋白濃度、甘露醇、甲硫氨酸和/或組氨酸對金屬和抗壞血酸誘導的蛋白氧化的影響為研究上述實施例中提出的抗氧化組合物的通用性，使兩種單克隆抗體和五種其它蛋白和肽暴露于金屬和抗壞血酸以及附加的螯合劑和涉及氧的自由基(稱為活性氧形式或“ROS”)清除劑的組合。這些實驗表明，可以使用本發(fā)明防止氧化且穩(wěn)定化的、包括各種各樣蛋白的組合物，所述蛋白即有各種各樣分子量、濃度以及生物物理學和生物化學特征的蛋白。
1.對單克隆抗體氧化的影響在有附加的螯合劑和ROS清除劑組合的情況下，研究了兩種單克隆抗體(一種抗T淋巴細胞抗原的抗體和一種抗腫瘤表面抗原的抗體)。
用最適于所述抗體分子量的凝膠濃度，通過SDS-PAGE，來測定防止氧化的保護程度。將凝膠銀染色，然后用BIO-RAD GS-800光密度計掃描。利用有關(guān)的Quantity One軟件，檢測出不斷探測到的、表示氧化相關(guān)物質(zhì)種類(不但聚集體、而且分解產(chǎn)物)的所述譜帶并將其定量。光密度分析提供“校正的體積”，即表示帶的強度總和的、且對任何染色背景進行過校正的帶強度。最合適的保護劑混合物應該使這些校正的強度值減到最小。
用4mM抗壞血酸和金屬(1μM Cu和1μM Fe)處理所有的抗體樣品。所測試的附加的組合包括沒有螯合劑，100μM DTPA和20μMDEF，100μM DTPA和3％甘露醇，100μM DTPA和25mM甲硫氨酸，100μM DTPA和25mM組氨酸，100μM DTPA、20μM DEF和25mM甲硫氨酸，以及100μM DTPA、20μM DEF和3％甲硫氨酸。所述抗體蛋白溶液包含溶于PBS中的1mg/ml的蛋白與或者0.01％吐溫-80或者2％甘油。在室溫下溫育所有的樣品達至少48小時，然后將其貯藏在4℃。結(jié)果(對于測試的兩種單克隆抗體，結(jié)果是類似的)示于表3中。
表3
也測定防止氧化的相對保護值如下RP＝100％-[(用保護性化合物的譜帶強度)÷(在沒有保護性化合物情況下的譜帶強度)]在表4中顯示了所述單克隆抗體蛋白樣品的防止氧化的相對程度的結(jié)果。(A＝抗T淋巴細胞抗原的抗體，B＝抗腫瘤表面抗原的抗體)表4
結(jié)果在不存在螯合劑組合或螯合劑與ROS清除劑的組合的情況下，這兩種單克隆抗體蛋白樣品都顯示出氧化；不僅通過銀染色的SDS-PAGE，通過目測明顯的新譜帶，而且通過相當于導致氧化、分解和聚集的化合物例如抗壞血酸、金屬、吐溫-80以及甘油的已知譜帶的強度增強，來看出這一點。對于含有螯合劑組合或螯合劑與ROS清除劑的組合的每一種情況，蛋白樣品的分解和聚集都被顯著地減少，正如通過大大地減少凝膠上的譜帶強度所表示的。
2.對IgG、BSA、hGH、PTH和ACTH氧化的保護作用在有附加的螯合劑與ROS清除劑的組合的情況下，研究了人的免疫球蛋白G(IgG)、牛血清白蛋白(BSA)、人生長激素(hGH)、甲狀旁腺激素(PTH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。用最適于所述蛋白或肽分子量的凝膠濃度，通過SDS-PAGE，來測定保護的程度。將凝膠銀染色，然后用BIO-RAD GS-800光密度計掃描。利用有關(guān)的QuantityOne軟件，檢測出不斷探測到的、表示氧化相關(guān)物質(zhì)種類(不但聚集體、而且分解產(chǎn)物)的所述譜帶并將其定量。光密度分析提供“校正的體積”，即表示帶的強度總和的、且對任何染色背景進行過校正的帶強度。最合適的保護劑混合物應該使這些校正的強度值減到最小。將所述蛋白樣品的濃度與對應的凝膠濃度概括于表5中。
表5
用4mM抗壞血酸和金屬(1μM Cu和1μM Fe)處理所有的蛋白樣品。所測試的附加的組合包括沒有螯合劑，100μM DTPA和20μMDEF，100μM DTPA和3％甘露醇，100μM DTPA和25mM甲硫氨酸，100μM DTPA和25mM組氨酸，100μM DTPA、20μM DEF和25mM甲硫氨酸，以及100μM DTPA、20μM DEF和3％甲硫氨酸。所述抗體蛋白溶液包含溶于PBS中的1mg/ml的蛋白與或者0.01％吐溫-80或者2％甘油。在室溫下溫育所有的樣品達至少48小時，然后將其貯藏在4℃。
結(jié)果因暴露在金屬和抗壞血酸中，IgG不僅顯示出氧化誘導的分子量較高的聚集體的增加，而且顯示出所述抗體氧化的分解產(chǎn)物和遷移到重鏈與輕鏈之間的物質(zhì)；這種IgG與先前實施例中所研究的抗體相似。把氧化保護性化合物組合引入到IgG樣品中，則減少氧化降解。
因暴露在金屬與抗壞血酸中，BSA顯示出兩種主要的降解產(chǎn)物(強度大于原來“主帶”的強度(即通過銀染色的SDS-PAGE，對應于樣品中最大量的主要蛋白種類的帶))。DTPA和DEF的所有組合以及螯合劑與ROS清除劑的所有組合，阻止這些氧化物質(zhì)的形成(沒有可探測出的帶)。
因暴露在金屬和抗壞血酸中，人生長激素顯示出有略微小些的表觀分子量的帶，可能起因于異構(gòu)化。在含有DTPA和DEF組合的樣品中，以及在含有這些螯合劑與ROS清除劑的組合的樣品中，檢測不出該帶。
在PTH方面，暴露在金屬和抗壞血酸中，則增加聚集物質(zhì)的數(shù)量。用DTPA和DEF組合處理，以及用這些螯合劑與ROS清除劑的組合處理，則減少所述的聚集物質(zhì)。
在ACTH方面，暴露在金屬與抗壞血酸中，則產(chǎn)生許多聚集物質(zhì)。在含有DTPA與DEF組合樣品中，以及在含有這些螯合劑和ROS清除劑的組合的樣品中，這些物質(zhì)被減少。
表6概述了用前面提到的蛋白和肽的實驗結(jié)果?？偟恼f來，包含DTPA和DEF的組合，以及包含這些螯合劑和ROS清除劑的組合，導致在各種各樣的蛋白濃度、蛋白大小和蛋白類型(抗體、激素等等)方面的可以計量的保護作用。
表6
實施例7同研究蛋白氧化的GPC-HPLC方法的相關(guān)性GPC-HPLC除銀染色的SDS-PAGE外，用GPC-HPLC來探查蛋白聚集的發(fā)生以及起因于氧化的分子量和/或三級結(jié)構(gòu)的變化。在整個這項研究期間，采用抗T淋巴細胞抗原的抗體。本研究的焦點在單體主峰(即全部(未受影響的)蛋白(一般在12-12.2分鐘洗脫出))的變化上以及在聚集體峰的演變上。遭受到氧化性損傷的樣品不但在主峰保留方面顯示出相當大的變化(減少)，而且在主峰形狀方面顯示出相當大的變化(變寬)。對于氧化性損傷規(guī)模大的蛋白樣品，看到保留時間為9-9.5分鐘及7.3分鐘的兩個另外的峰(這些對應于柱空體積)?？箟难岷徒饘衮蟿┮话阋?4-16分鐘的保留時間洗脫出來，而對應的峰被忽略不計。
在暴露于銅和抗壞血酸的樣品方面，觀察到各螯合劑之間的保護的差異。DTPA處理過的樣品顯示在12.175分鐘的尖的單體峰，表示天然抗體結(jié)構(gòu)的特征，而DEF的該樣品的主峰是變寬且位移的(提示與天然完整抗體相比的抗體結(jié)構(gòu)的變化)，其保留時間為11.5分鐘。與通過SDS-PAGE而觀察到的最大量氧化性損傷有關(guān)的EDTA也有寬的、位移的單體峰和另外的聚集體峰。
在用抗壞血酸和鐵處理的一套類似的蛋白樣品中，GPC-HPLC的層析譜類似于SDS-PAGE的結(jié)果；即DTPA提供較差的保護，這以一種變寬且位移的峰的形式被觀察到，而去鐵胺處理的樣品有一種較靠近所述天然抗體峰的單體峰。EDTA處理的樣品的層析譜清楚顯示出氧化性損傷的存在。
生物活性/結(jié)合親和性挑選四個有代表性樣品來測定生物活性。通過測定滴定抗原所需要的抗體濃度，來確定結(jié)合親和性；用ELISA來測定生物活性。在表7中顯示了結(jié)果。
表7
結(jié)果所有三個方法SDS-PAGE、GPC和ELISA一致地顯示氧化導致對蛋白結(jié)構(gòu)破壞，結(jié)果是活性的相當大的損失；而加入防止氧化的賦形劑例如DTPA、DEF及其組合，則防止由于氧化過程的生物活性損失。
實施例8同研究蛋白氧化的光氧化方法的相關(guān)性在樣品的光氧化方面，用SDS-PAGE而觀察到的譜帶與化學氧化和實時穩(wěn)定性研究中看到的譜帶一致。蛋白樣品的分子量和通過凝膠的洗脫圖提示聚集體和分解產(chǎn)物是有關(guān)的產(chǎn)物，例如，重鏈和輕鏈的氧化交聯(lián)體(linkages)。本實驗聚焦較短時標的光氧化實驗，與化學氧化實驗平行地進行。這允許一起比較由兩種類型的氧化過程產(chǎn)生的物質(zhì)。
把包括抗體的、濃度1mg/ml的蛋白樣品(抗免疫受體(immunoreceptor)的抗體和抗T淋巴細胞抗原的抗體)用作試驗蛋白。緩沖條件包括如同先前描述的PBS，而且也包括DTPA(1mM)、甘露醇(10％)、甲硫氨酸(15mM)和組氨酸(50mM)。也組合DTPA(1mM)和甘露醇(10％)。為了產(chǎn)生化學氧化，使樣品暴露于4mM抗壞血酸和1μM銅及1μM鐵中。通過銀染色的SDS-PAGE，來分析樣品。
對于這兩種蛋白樣品，在一天10X的光照處理后，觀察到性質(zhì)不同的光氧化物質(zhì)的演變。觀察到光氧化的抗免疫受體抗體物質(zhì)和化學氧化的物質(zhì)之間的同樣的譜帶順序。然而，在抗T淋巴細胞抗原的抗體方面，在光氧化物質(zhì)譜帶和化學氧化譜帶之間，有明顯的差異。這表明本發(fā)明的制劑在減少起源于不同類型機制的氧化性物質(zhì)方面是有效的。
結(jié)果用1mM DTPA處理的樣品顯示出超過無保護樣品的某些改善。用甘露醇、DTPA/甘露醇和組氨酸處理的樣品也顯示出保護作用。在減少所目測的在SDS-PAGE的重鏈和輕鏈之間的光氧化物質(zhì)形成方面，甲硫氨酸是特別有用的。
結(jié)論上述實施例表明，氧化導致蛋白(特別是單克隆抗體)的相當大的破壞，而通過將蛋白與金屬螯合劑的精選組合配制在一起，可減少氧化性損傷；所述金屬螯合劑即或者單獨包括DTPA、EGTA和DEF的金屬螯合劑，或者包括配合一種或多種ROS清除劑(例如甘露醇、組氨酸和/或甲硫氨酸)的DTPA、EGTA和DEF的金屬螯合劑。上述實施例進一步顯示DTPA和DEF對減少氧化有意想不到的協(xié)同作用。尤其是，或者有ROS清除劑或者沒有ROS清除劑的至少0.1mMDTPA和0.02mM DEF的組合，作為通用的添加物，在保護抗體及其它蛋白制劑的防止氧化方面，是有效的。上述實施例更進一步顯示螯合劑EDTA具有的對蛋白的破壞作用，以及上述組合物可以防氧化或“拯救”受該EDTA影響的蛋白。
等同實施方案本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到或者僅僅用常規(guī)實驗就能夠確定，本文中描述的本發(fā)明具體實施方案的許多等同實施方案。所附權(quán)利要求書包括這樣的等同實施方案。本申請中所引用的所有參考文獻、專利和出版的專利申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種包含蛋白的組合物，所述蛋白與DTPA和DEF配制在一起。
2.一種包含蛋白的組合物，所述蛋白與EGTA和DEF配制在一起。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，所述組合物還包含選自以下的ROS清除劑甘露醇、甲硫氨酸和組氨酸。
4.一種包含蛋白、DTPA和ROS清除劑的組合物，所述ROS清除劑選自甘露醇、甲硫氨酸和組氨酸。
5.權(quán)利要求1、3或4中任一項的組合物，其中所述DTPA的濃度為約1μM至約10mM。
6.權(quán)利要求1-3中任一項的組合物，其中所述DEF的濃度為約1μM至約5mM。
7.權(quán)利要求3-5中任一項的組合物，所述組合物包含濃度約0.01％至約25％的甘露醇。
8.權(quán)利要求3-5中任一項的組合物，所述組合物包含濃度約10μM至約200mM的甲硫氨酸。
9.權(quán)利要求3-5中任一項的組合物，所述組合物包含濃度約100μM至約200mM的組氨酸。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的組合物，所述組合物還包含抑制蛋白聚集的試劑。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述抑制蛋白聚集的試劑選自聚山梨酯80、聚山梨酯20、甘油和泊洛沙姆聚合物。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述抑制蛋白聚集的試劑是濃度0.001％至約0.1％的聚山梨酯80或聚山梨酯20。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的組合物，所述組合物還包含保持組合物的pH在約5.0至約8.0的緩沖劑。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述緩沖劑選自磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、乙酸鹽、MES、琥珀酸、PIPES、Bis-Tris、MOPS、ACES、BES、TES、HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸和馬來酸。
15.權(quán)利要求1的組合物，所述組合物包含甘露醇、聚山梨酯、Tris和氯化鈉，其中所述蛋白是抗體或其片段。
16.權(quán)利要求1-15中任一項的組合物，其中所述蛋白的濃度為約1μg/ml至約500mg/ml。
17.權(quán)利要求1-16中任一項的組合物，其中所述蛋白是抗體或其片段。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體或其片段。
19.權(quán)利要求17的組合物，其中所述抗體是人抗體或其片段。
20.權(quán)利要求17-19中任一項的組合物，其中所述抗體與選自以下的試劑綴合毒素、聚合物、造影劑和藥物。
21.權(quán)利要求1-20中任一項的組合物，其中所述蛋白是微囊化的。
22.權(quán)利要求1-21中任一項的組合物，其中所述組合物是藥用組合物。
23.一種用于制備穩(wěn)定蛋白組合物的方法，所述方法包括將蛋白與DTPA和DEF配制在一起。
24.一種用于制備穩(wěn)定蛋白組合物的方法，所述方法包括將蛋白與EGTA和DEF配制在一起。
25.權(quán)利要求23或24的方法，所述方法還包括添加選自以下的ROS清除劑甘露醇、甲硫氨酸和組氨酸。
26.一種用于制備穩(wěn)定蛋白組合物的方法，所述方法包括將蛋白與DTPA和ROS清除劑配制在一起，所述ROS清除劑選自甘露醇、甲硫氨酸和組氨酸。
27.一種用于保護蛋白以防氧化的方法，所述方法包括將所述蛋白與DTPA和DEF配制在一起。
28.一種用于保護蛋白以防氧化的方法，所述方法包括將所述蛋白與EGTA和DEF配制在一起。
29.權(quán)利要求27或28的方法，所述方法還包括添加選自以下的ROS清除劑甘露醇、甲硫氨酸和組氨酸。
30.一種用于保護蛋白以防氧化的方法，所述方法包括將所述蛋白與DTPA和ROS清除劑配制在一起，所述ROS清除劑選自甘露醇、甲硫氨酸和組氨酸。
31.權(quán)利要求23-30中任一項的方法，其中所述DTPA或EGTA的濃度為約1μM至約10mM。
32.權(quán)利要求23-30中任一項的方法，其中所述DEF的濃度為約1μM至約5mM DEF。
33.權(quán)利要求25、26和29-32中任一項的方法，其中所述氧化保護性化合物選自約0.01％至約25％的甘露醇、約10μM至約200mM的組氨酸和約10μM至約200mM的甲硫氨酸。
34.權(quán)利要求23-33中任一項的方法，所述方法還包括向所述組合物中加入抑制蛋白聚集的試劑。
35.權(quán)利要求23-33中任一項的方法，所述方法還包括向所述組合物中加入保持pH在約5.0至約8.0的緩沖劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述緩沖劑選自約5mM至約100mM的磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、乙酸鹽、MES、琥珀酸、PIPES、Bis-Tris、MOPS、ACES、BES、TES、HEPES、EP、乙二胺、磷酸和馬來酸。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述組合物包含甘露醇、聚山梨酯、Tris和氯化鈉，其中所述蛋白是抗體或其片段。
38.權(quán)利要求23-37中任一項的方法，其中所述蛋白的濃度為約1μg/ml至約500mg/ml。
39.權(quán)利要求23-38中任一項的方法，其中所述蛋白是抗體或其片段。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述抗體是人抗體或其片段。
41.權(quán)利要求39或40的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或其片段。
42.權(quán)利要求39-41中任一項的方法，其中所述抗體與選自以下的試劑綴合毒素、聚合物、造影劑或藥物。
43.權(quán)利要求23-42中任一項的方法，其中所述蛋白是微囊化的。
44.權(quán)利要求23-43中任一項的方法，其中所述組合物是藥用組合物。
全文摘要
提供用于防止蛋白、尤其是抗體的氧化性損傷的方法和組合物。所述組合物包括金屬螯合劑例如DTPA、EGTA和/或DEF的組合；并且可以還包括一種或多種自由基清除劑、特別是氧自由基清除劑。還公開了用本發(fā)明組合物來增強蛋白穩(wěn)定性的方法。
文檔編號C08K5/17GK1703233SQ03821189
公開日2005年11月30日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者J·K·茨尼, A·D·納吉 申請人:米德列斯公司