專利名稱:有機(jī)化合物的改進(jìn)的制作方法
本發(fā)明涉及木質(zhì)素改性和降解酶。木質(zhì)素是由取代肉桂醇前體經(jīng)自由基的聚合作用生成的復(fù)合聚合物，含有15～35%(重量)干木材。漿化處理時(shí)，必須從包有木質(zhì)素基質(zhì)中將纖維素離解出來(lái)，使他們能互相結(jié)合，得到具有強(qiáng)度的最終產(chǎn)物。這種聚合物的分離，可以采用化學(xué)漿化方法去除木質(zhì)素，或采用高得率的機(jī)械漿化方法保持木質(zhì)素。漂白處理時(shí)，去除木質(zhì)素，得到發(fā)亮的漿料。
木質(zhì)素對(duì)生物腐蝕具有很高的抗性，業(yè)已證明，任何有機(jī)體都不能以木質(zhì)素作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。但是，這種復(fù)雜的木質(zhì)素聚合物通過(guò)各種高級(jí)真菌的純培養(yǎng)物可以完全降解。對(duì)白蝕菌(white-rot fungi)的木質(zhì)素生物降解作用進(jìn)行的最廣泛的生理研究證明，使用Corticra-ceae族系的Phanerochaete Chrysosporium Burds能夠?qū)δ举|(zhì)素進(jìn)行充分的降解。
在一定的實(shí)驗(yàn)室條件下，大約培養(yǎng)3天的時(shí)間，還觀察不到真菌對(duì)木質(zhì)素的降解作用。接著，培養(yǎng)菌對(duì)碳或氮產(chǎn)生饑餓現(xiàn)象，培養(yǎng)4或5天至多6天，開(kāi)始觀察到木質(zhì)素的降解。根據(jù)對(duì)碳氮的饑餓誘導(dǎo)木質(zhì)素降解，說(shuō)明真菌的木質(zhì)素代謝屬于一種次級(jí)代謝性質(zhì)。
目前真菌的木質(zhì)素降解由于若干原因還不能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。由于誘導(dǎo)降解木質(zhì)素的效率僅僅是作為次級(jí)代謝的結(jié)果，所以木質(zhì)素降解的速度慢得令人難以接受。為此，要求繼饑餓之后即開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)期。此外，真菌把纖維素作為其主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，導(dǎo)致漿料產(chǎn)量降低和漿料制品質(zhì)量低劣。
世界專利文件WO 87/00550號(hào)介紹了名為rLDMTM6的木質(zhì)素降解酶制劑，它是由P.Chrysosprium衍生得到的(rLDMTM6是由麻省坎布里奇Repligen公司制造的木質(zhì)素降解和改性酶的商品牌號(hào))。這種酶制劑基本上是純化的，因此基本上也不含其他rLDMTM，它是一種天然的降解蛋白酶。這種酶含有與血紅素單位相結(jié)合的蛋白質(zhì)成分(脫輔基蛋白)，該血紅素單位等同于以氧化形式(Fe+3)存在的正鐵血紅素Ⅸ。這種rLDMTM6制劑具有適用于木材制漿和污水處理的理想性質(zhì)。rLDMTM顯示有過(guò)氧化物酶的活性，其重要性質(zhì)的特征在于，在有過(guò)氧化氫存在的條件下，能將藜蘆基醇催化氧化為藜蘆基醛。關(guān)于rLDMTM的物理參數(shù)公諸如下(1)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠泳(SDS-PAGE)測(cè)定的分子量;
(2)氨基酸組分;
(3)血紅素含量;
(4)與抗體反應(yīng)速度的等同性;
(5)對(duì)木質(zhì)素模擬底物作用的特異性;
(6)按規(guī)定的乙酸鈉體積摩爾濃度洗脫FPLC層析柱。
盡管可按WO87/00550號(hào)專利文件所述方法制備rLDMTM6，但是如果能夠克隆編碼rLDMTM6蛋白的DNA異在適宜的宿主中表達(dá)，則用遺傳工程方法可期望更有效地實(shí)現(xiàn)是rLDMTM6的制備。然而由于P.Chrysosporium基因的活性在異種宿主中的表達(dá)，以前從未取得成功，并且現(xiàn)有技術(shù)也從未提供過(guò)如何成功地進(jìn)行這種克降和表達(dá)，所以對(duì)此能否獲得成功還很難預(yù)料。
本發(fā)明通過(guò)克隆編碼木質(zhì)素酶蛋白的DNA順序及其在適宜宿主細(xì)胞中的表達(dá)和用正鐵血紅素Ⅸ重建重組木質(zhì)素酶蛋白，提供重組rLDMTM6木質(zhì)素酶。
于是，本發(fā)明提供源于天然P.Chrysosporium的編碼rLDMTM6蛋白的DNA順序，其順序示于表1。從DNA順序中推導(dǎo)得到的蛋白質(zhì)的氨基酸順序示于同一表中。
為rLDMTM6蛋白編碼的DNA順序的克隆開(kāi)始于從Phanerochaete chrysosporium的發(fā)酵中制備足夠量的RNA。大量RNA是從名為SC26，NRRL 15978的ATCC24725的紫外線誘導(dǎo)突變體制備的。
在用逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制mDNA后，基因庫(kù)包括為次級(jí)代謝中的基因編碼的DNA順序，該次級(jí)代謝包括木質(zhì)素改酶或木質(zhì)素降解酶的構(gòu)建。對(duì)rLDMTM6的抗體反應(yīng)用來(lái)檢驗(yàn)基因庫(kù)。對(duì)交叉反應(yīng)克隆進(jìn)行檢測(cè)。用常規(guī)方法，從克隆的分離物中制備噬菌體DNA。然后將該DNA插入到以后將rLDMTM6蛋白表達(dá)于反應(yīng)潛能宿主的適宜載體中。
各種改性重組rLDMTM6蛋白，凡在用血紅素重建時(shí)能基本上具有與rLDMTM6相同酶活性的，都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。由于從其他天然等位基因所表達(dá)的rLDMTM蛋白存在的可能性極大，所以結(jié)構(gòu)修飾既可用已知方法構(gòu)建，也可采用天然來(lái)源。
用遺傳工程修飾的rLDMTM6蛋白還證明，當(dāng)用血紅素重建時(shí)，能具有木質(zhì)素酶活性。例如，含有由一個(gè)或多個(gè)氨基酸在正常的氨基末端延長(zhǎng)的完全rLDMTM6順序的蛋白質(zhì)已按下述方法產(chǎn)生。含有由另外的氨基酸在正常的C末端延長(zhǎng)的該完全順序也可按本文所述方法，通過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在琥珀型宿主中的表達(dá)產(chǎn)生。
在rLDMTM6修飾蛋白的定義范圍內(nèi)，還有從DNA順序所表達(dá)的原初蛋白的亞片段，該順序與所揭示的原初rLDMTM6蛋白的DNA順序雜交。
在用血紅素重建時(shí)，原重組rLDMTM6蛋白或rLDMTM6修飾蛋白可按與天然酶相同方法，用于降解或改性木質(zhì)素;并且對(duì)紙漿木質(zhì)素有作用，如對(duì)未漂白牛皮紙漿;對(duì)磨制木質(zhì)素如機(jī)制漿料，以及對(duì)本質(zhì)素模擬化合物都有作用。
rLDMTM6蛋白的基因也可用作為操查物的rLDMTM6蛋白的cDNA中的部分順序，從基因組DNA即所謂的基因組克隆中分離得到。在本領(lǐng)域中該項(xiàng)技術(shù)是眾所周知的，參閱Maniates，T，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambsock，J.，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(冷泉港實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室，NY，1982年。由此得到的基因組克隆可插入到各種宿主的適宜載體中。
重建時(shí)，除了表1所列DNA順序外，修飾DNA順序包括天然等位基因和用遺傳工程方法修飾的并能為具有rLDMTM6酶活性的rLDMTM6蛋白編碼的DNA順序，這些順序也都屬于本發(fā)明范圍。
在為rLDMTM6蛋白編碼的DNA順序中，可得到以一個(gè)或多個(gè)飾變的等位基因，例如從天然有機(jī)體中經(jīng)過(guò)探查后得到，即由P.Chsysosporium或類似木材降解菌衍生合適的cDNA或基因組DNA庫(kù)，它們具有從為rLDMTM6完全順序編碼的DNA中切割得到的一個(gè)或多個(gè)適宜長(zhǎng)度的標(biāo)記DNA，至少含有大約20至300個(gè)核苷酸，這些方法在本文中已有介紹。
上述為修飾蛋白編碼的修飾順序也可以按本文所述，采用已經(jīng)建立的技術(shù)直接由為rLDMTM6蛋白編碼的cDNA或基因組DNA順序得到，例如采用位點(diǎn)的特殊誘變、環(huán)出方法和其他取代核苷酸的已知方法。
關(guān)于rLDMTM6原蛋白和rLDMTM6修飾蛋白的核苷酸順序，熟悉本領(lǐng)域的專業(yè)人員很容易理解，這是與為rLDMTM6蛋白編碼的其他相當(dāng)?shù)暮塑账犴樞蛳嘁恢碌摹Ｕ缛藗兯?，不同的核苷酸順序能夠?yàn)橥粋€(gè)蛋白質(zhì)編碼，這是因?yàn)橛卸嘤嗟倪z傳密碼，即大多數(shù)氨基酸都可由多個(gè)核苷酸三聯(lián)(密碼子)編碼。因此，本發(fā)明的范圍不僅包括本文所述的特殊核苷酸順序，而且還包括在用血紅素重建時(shí)，為基本上具有相同rLDMTM6木質(zhì)素酶活性的分子編碼的所有相應(yīng)的核苷酸順序。
基于本文公開(kāi)了為rLDMTM6蛋白編碼的核苷酸順序，所以該順序可用本領(lǐng)域已知方法通過(guò)“基因裝配”合成。
因此，就本發(fā)明的廣義而言，按本發(fā)明提供的核苷酸順序包括為具有木質(zhì)素酶活性的蛋白質(zhì)編碼，以及與為表1所列的rLDMTM6完全蛋白編碼的順序在約束雜交條件下(例如60℃，在2.5×檸檬酸鹽緩沖液中)進(jìn)行雜交的那些cDNA和/或基因組DNA順序。然而，正如人們可以理解的，天然有機(jī)體的cDNA和/或基因組DNA編碼順序基本上可以修飾或重建，以產(chǎn)生為與上述相似的蛋白質(zhì)，一般說(shuō)來(lái)是為了提高在異種宿主系統(tǒng)或非天然宿主系統(tǒng)中表達(dá)的這種蛋白質(zhì)編碼的非常不相似的DNA順序。因此，就其廣義而言，本發(fā)明提供了為rLDMTM6和為具有rLDMTM6特征的木質(zhì)素酶活性的rLDMTM6改性蛋白編碼的獨(dú)立重組體DNA順序或合成DNA順序。
在為了穩(wěn)定地保持和表達(dá)基因的條件下，將rLDMTM6基因引入微生物宿主，可以采用各種方法。其中之一可為DNA結(jié)構(gòu)提供包括;表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信號(hào)、在這些信號(hào)調(diào)節(jié)控制下的基因和相應(yīng)于宿主有機(jī)體中的順序的DNA順序，借以進(jìn)行整合，和/或在宿主中起作用的復(fù)制系統(tǒng)，借以進(jìn)行整合并保持穩(wěn)定性。
為rLDMTM6或?yàn)閞LDMTM6生物活性亞片段編碼的基本純的核苷酸順序，可以被連接到表達(dá)克隆載體中適宜的限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)上。如有需要，可用連接分子將位點(diǎn)接到核苷酸順序上。(例見(jiàn)Norris，K.E.等，Gene 7355～362，1979。)然后將被連接的DNA用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)潛能的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
rLDMTM6蛋白可以在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)，其所用質(zhì)粒含有從該有機(jī)體中得到的誘導(dǎo)半乳糖酶啟動(dòng)子(Broach，J.R.，Li，Y.，Wu，L.C.and Jayaram，M.in Experimental Manipulation of Gene Expression，1983，P.83，ed.M.Jnouge，Academic Press)。這些質(zhì)粒名為YEp51和YEp52(Broach，J.R.et al.，1983，supra)并且含有大腸桿菌(E.coli)復(fù)制源、-lactamase基因、酵母LEU2基因、2微米復(fù)制源和2微米環(huán)狀REP3座位。重組體基因表達(dá)由酵母GAL10基因啟動(dòng)子操縱。
能夠用于類似方法的其他酵母啟動(dòng)子如(乙)醇脫氫酶(Bennetqen，J.L and Hall，B.D.1982，J.Biol.Chem 257;3108;Ammerer，G.in Methods in Enzymology，1983，第101卷，192頁(yè))、磷酸甘油酸激酶(Derynck，R.，Hitzemann，R.A.，Gray，P.W.，Goeddel，D.V，in Experiment al Manipulation of Gene Expression，1983，p.247，ed.M.Inouye，Acadimic Press)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Alber，T.and Kawasaki.G.，1982，J.Molec and Applied Genet.1419～434)，或烯醇酶(Innes，M.A.et al，1985，Science 226～21)。
由于絲狀真菌曲霉(Aspergillus)與P.chrysosposium有關(guān)，所以rLDMTM6基因也可由這種菌素達(dá)。能夠用于在曲霉(Aspergillus)中表達(dá)基因的適宜的宿主載體就是由Buxton，F(xiàn).P.，Gwynne，，D.J.和Davis，R.W.(Gene，1985，37207，214)介紹的載體。
rLDMTM6蛋白能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，可采用的系統(tǒng)例如有Okayama-Berg克隆系統(tǒng)(Okayama，H.and Berg，P.，1983，Malec.and Cell.Biol.3280～289)、痘苗病毒表達(dá)系統(tǒng)(Moss，B.，1985，Immunology Today 6243;Chakrabarti，S.，Brechling，k.，Moss，B.，1985，Molec.and Cell.Biol.53403)或由鼠類還原病毒衍生的載體(Mulligan，R.C.in Experimental Manipulation of Gene Expression，1983，P.155，ed.M.Inouye，Acadimice Press)。
基于為了對(duì)木質(zhì)素和由木質(zhì)素衍生的底物顯示過(guò)氧化物酶的活性，木質(zhì)素酶蛋白必須用血紅素重建，所以本發(fā)明還提供了重建血紅素酶的方法，包括在有氧化還原系統(tǒng)存在下，酶蛋白與血紅素的反應(yīng)步驟。
根據(jù)該方法采用本發(fā)明的重組木質(zhì)素酶蛋白還可得到重組木質(zhì)素酶。該重組木質(zhì)素酶具有與純化的天然rLDMTM6相同的木質(zhì)素酶活性。用DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的酶能夠降解/改性木質(zhì)素而不明顯地腐蝕纖維素或半纖維素。如同天然酶一樣，rLDMTM6酶可直接發(fā)生作用，不必像用天然菌分離物那樣需要經(jīng)過(guò)代謝誘導(dǎo)。
術(shù)語(yǔ)“過(guò)氧化物酶蛋白”、“木質(zhì)素脫輔基蛋白”或“木質(zhì)素酶蛋白”，在本文中意指該類蛋白不是用血紅素重建的，而在用血紅素重建時(shí)能夠具有過(guò)氧物酶和/或木質(zhì)素酶的活性。
術(shù)語(yǔ)“正鐵血紅素Ⅸ”意指正鐵血紅素Ⅸ的氧化Fe+3的形式。
術(shù)語(yǔ)“木質(zhì)素酶”意指用正鐵血紅素Ⅸ重建的木質(zhì)素酶蛋白。
培養(yǎng)物的保藏根據(jù)布達(dá)佩斯條約關(guān)于微生物保藏的規(guī)定，本文所公開(kāi)的下列培養(yǎng)物保藏在美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方研究中心農(nóng)業(yè)研究菌種保藏委員會(huì)(NRRL)(美國(guó)伊利諾斯州匹奧里亞北方大學(xué)大街1815)。
菌種名稱 菌庫(kù)編號(hào) 保藏日期大腸桿菌(E.coli)(pLn105) NRRL B-18156 1986.12.31大腸桿菌(E.coli)(pLn106) NRRL B-18157 1986.12.31大腸桿菌(E.coli)(pBSR3) NRRL B-18068 1986.5.1大腸桿菌(E.coli)K12 JM105 NRRL B-18067 1986.5.1大腸桿菌(E.coli)(pREV2.2) NRRL B-18091 1986.7.30釀酒酵母(S.Cererisiae)(pLn1001) NRRL Y-18163 1987.1.14圖1克隆3-1和3-2的限制部位圖和估計(jì)值。
圖2完整的rLDMTM6氨基末端順序。
圖3完整的rLDMTM6氨基末端順序與克隆3-2早期順序的組合。
圖4恢復(fù)重建rLDMTM6活性的時(shí)間表。
圖5pLn106的物理圖譜。
圖6pLn106構(gòu)建圖。
圖7pREV2.2和多克隆位點(diǎn)圖。
圖8pLn105構(gòu)建圖。
圖9pTPR構(gòu)建圖。
圖10pLn1001構(gòu)建圖。
以下的實(shí)施例說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的方法。所有百分比以重量計(jì)算，所有溶劑混合物的比例以體積計(jì)算，除非另加說(shuō)明。
用于提取mRNA、制備cDNA庫(kù)、轉(zhuǎn)移細(xì)胞和構(gòu)建體等的大量方法，在本領(lǐng)域內(nèi)都是廣泛使用的方法，許多研究工作者也都熟悉所用的常規(guī)材料及其使用的條件和方法。這些方法，例如已由Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook，J.于1982年作過(guò)介紹(參閱紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版的《實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)-分子克隆》。因此，對(duì)于由微生物細(xì)胞中提取DNA，完成限制酶的消化，DNA片段的電泳測(cè)定，質(zhì)粒的尾部連接和退火，DNA的插入、DNA的連接，細(xì)胞轉(zhuǎn)移，質(zhì)粒DNA的制備，蛋白質(zhì)的電泳測(cè)定和DNA順序的排列，這些方法都屬遺傳工程領(lǐng)域內(nèi)專業(yè)人員熟悉的方法。
本文所用的全部核酸內(nèi)切限制酶均購(gòu)自貝塞斯達(dá)研究室(美國(guó)馬里蘭州蓋瑟斯堡)或新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(美國(guó)麻省貝弗利);并按提供者的說(shuō)明使用。
DNA順序的測(cè)定采用Maxam和Gelbert(Maxam，A.and Gelbert，W.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74560)和Heidecker等(Heidecker，G.，Messing，J.and Grouenborn.B.，1980，Gene 1069)介紹的方法。
瓊脂糖凝膠電泳的測(cè)定采用2X Tris-乙酸酯凝膠緩沖液(80毫摩爾Tris-HCl，pH8.0;40毫摩爾乙酸鈉;36毫摩爾NaCl;2毫摩爾Na EDTA在凝膠和1X緩沖液中展開(kāi)。分析凝膠作為水平凝膠箱中的“海底凝膠”，按常規(guī)展開(kāi)。采用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EtBr)，后著色(0.5毫克/毫升的1X凝膠緩沖液溶液)和San Gabriel(CA)紫外儀器公司制造的TM-36型紫外變換照射器(UV transilluminator)對(duì)DNA譜帶進(jìn)行染色。
從制備的瓊脂糖凝膠中提取DNA是以染色凝膠柱帶上EtBr著色的譜帶的位置開(kāi)始的。將含有有意義的DNA片段的凝膠片手工切成小片，用1.5～2體積的DNA凝膠提取緩沖液(0.5摩爾乙酸銨，10毫摩爾EDTA，10毫摩爾乙酸鎂，0.1%SDS)與該小片穿過(guò)20克針狀物。加入用1毫摩爾乙酸銨、10毫摩爾EDTA飽和的等體積苯酚，置入Eppendorf管中，用旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器在23℃下提取過(guò)夜。將管子置于冰上30分鐘，然后用微量離心分離水相。
用飽和苯酚溶液提取水相重復(fù)3～4次，繼之用三氯甲烷提取，乙醇沉淀。常規(guī)回收大約40%少于15仟堿基的DNA片段。
實(shí)施例1RNA的菌種P.chrysosporium NRRL 15978生長(zhǎng)在氮限制的痕量元素培養(yǎng)基上，補(bǔ)充葡萄糖，緩沖至pH4.5。
采用常規(guī)方法測(cè)量藜蘆基醇氧化為藜蘆基醛的速率，定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中木質(zhì)素的活性。
采用陰離子交換柱，通過(guò)超濾和FPLC方法，分離和純化細(xì)胞外液體中的新的rLDMTM。
(A)培養(yǎng)條件NRRL15978菌種培養(yǎng)在125毫升錐形燒瓶中，在發(fā)酵盤(pán)、1升或2升錐形搖瓶，或20升發(fā)酵罐中穩(wěn)定生長(zhǎng)。前兩種的菌種培養(yǎng)在下列培養(yǎng)基(氮限制BⅢ/葡萄糖培養(yǎng)基)中1.08×10-3摩爾酒石酸銨，1.47×10-2摩爾KH2PO4，2.03×10-3摩爾MgSO4·7H2O、6.8×10-4CaCl2·2H2O，2.96×10-6摩爾維生素B1·HCl和10毫升·L-1痕量元素溶液。該痕量元素溶液含有7.8×10-3次氮基乙酸，1.2×10-2摩爾MgSO4·7H2O，1.7×10-2摩爾NaCl，3.59×10-4摩爾FeSO4·7H2O，7.75×10-4摩爾CoCl2，9.0×10-4摩爾CaCl2，3.48×10-4摩爾ZnSO4·7H2O，4×10-5摩爾CuSO4·5H2O，2.1×10-5摩爾AlK(SO4)2·12H2O，1.6×10-4摩爾H3BO3，4.1×10-5摩爾NaMoO4·2H2O和2.9×10-3摩爾MnSO4·H2O。
該培養(yǎng)基補(bǔ)充10%(重量/升)葡萄糖，并用10.8毫摩爾酒石酸銨緩沖，加7X痕量金屬(基礎(chǔ)水平+6X)和0.04摩爾藜蘆基醇，將pH值調(diào)至4.5。搖瓶菌種和20升發(fā)酵罐使用相同培養(yǎng)基，但另加0.1%吐溫80。
將0.5毫升菌絲體接種物接種到含有10毫升培養(yǎng)基的125毫升穩(wěn)定生長(zhǎng)的錐形燒瓶中，氧氣吹洗0，3和6天。
發(fā)酵盤(pán)含有2升培養(yǎng)基，加100毫升菌絲體接種物接種。接種后一天，在修整過(guò)的發(fā)酵盤(pán)上復(fù)蓋一薄層菌絲。旋轉(zhuǎn)式生物接觸器(RBC)以每分鐘100毫升氧氣流量連續(xù)吹洗菌絲覆蓋部分。
1升或2升錐形搖瓶，分別含有300或600毫升培養(yǎng)基，用50或100毫升菌絲體接種物接種。搖瓶置于新Brunswick(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)接種器中，在39℃下250rpm搖動(dòng)。菌種用氧氣吹洗0，2，4和6天。
20升Virto發(fā)酵罐(序號(hào)43)(VirTis公司，Gardiner，NY)含有10～14升培養(yǎng)基，用裝在1升(300毫升)錐形搖瓶中的7天令木質(zhì)素酶的非均勻菌接種。發(fā)酵罐的漿式攪拌器以300rpm轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)。通過(guò)擴(kuò)散將氧引入大約50英尺長(zhǎng)0.058英寸科爾寧醫(yī)用硅橡膠管(紐約科爾寧，科爾寧玻璃制造廠)。氧氣流量為300毫升/分。
關(guān)于木質(zhì)素酶的測(cè)定是通過(guò)測(cè)量藜蘆基醇氧化為藜蘆醛的速率(藜蘆基醇的氧化作用縮寫(xiě)為VAO)定時(shí)測(cè)定搖瓶或RBC中木質(zhì)素酶的活性。反應(yīng)混合物含有275微升細(xì)胞外液體，或含有大約0.5微克純化酶，2毫摩爾藜蘆基醇，0.4毫摩爾H2O2和20或100毫摩爾酒石酸鈉，最終體積為0.5毫升，pH2.9。反應(yīng)以加入H2O2開(kāi)始并在310毫微米上進(jìn)行跟蹤。蛋白質(zhì)的測(cè)定按Bradford，M.M.(Anal.Biochem.72248～254，1976)方法，采用牛血清白蛋白(Sigma化學(xué)公司，St.louis.Mo)作為標(biāo)準(zhǔn)，或采用409毫微米吸光率的蛋白質(zhì)溶液并且從木質(zhì)素酶的消光系數(shù)中計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。
關(guān)于木質(zhì)素酶的純化，可將按上述方法制備的細(xì)胞外液體經(jīng)0.45微米的微孔薄膜(微孔薄膜公司出品，Bedford，MA)預(yù)過(guò)濾，并經(jīng)Amicon(Danvers，MA)YM10濾器超濾濃縮20倍(此濃縮物即為木質(zhì)素混合物L(fēng)MTM)，再經(jīng)10毫摩爾pH6.0的乙酸鈉滲析和0.45微米薄膜過(guò)濾(Acrodisc Protein Buiding，German，Ann Arbor，MI)。將濾過(guò)的LMTM置于裝有LDC/Milton Roy(Milton Roy公司，羅徹斯特，NY)的Gilson(華盛頓Gilson公司，OH)系統(tǒng)上，固定在410毫微米波長(zhǎng)檢測(cè)器和Gilson可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，采Pharmacia(Piscataway，NJ)FPLC單Q陰離子交換柱進(jìn)行高性能液相色譜(HPLC)層析，根據(jù)從柱上洗脫的木質(zhì)素酶進(jìn)行純化。含有pH6.0的梯度由10毫摩爾至1摩爾乙酸鈉并且以一般方法制備的流動(dòng)相，恒控在410毫微米和280毫微米時(shí)，40分鐘內(nèi)的流速為2毫升/分。從層析柱上以乙酸鈉體積克分子濃度洗脫各個(gè)木質(zhì)素酶(Kirk等，Enzyme Microb.Technol.827～32，1986)。
由P.chrysosporium NRRL 15978產(chǎn)生的木質(zhì)素酶，按Laemmli，U.K.(Nature 227680～685，1970)的SDS-聚丙烯酰胺平板凝膠電泳方法分析。天然平板凝膠的展開(kāi)根據(jù)Ornstein，L.(Ann.N.Y.Acad.Sci.121321～349，1964)和Davis，B.g.(Ann.N.Y.Acad，Sci.121404～427，1964)的方法。電泳分離后，蛋白質(zhì)用考馬斯蘭染色顯示，或采用常規(guī)方法進(jìn)行Western印跡法分析。
實(shí)施例2RNA的制備從P.chrysosporium的藜蘆基醇氧化發(fā)酵培養(yǎng)液制備完全的RAN。將采集到的菌絲體經(jīng)洗滌后用液態(tài)氮冷凍，并用研缽搗碎以便溶解。然后將細(xì)胞粉末懸浮在硫氰酸胍變性溶液中，并在CsCl中離心。分離出RNA帶，將其通過(guò)低(dT)纖維素柱，得到如Maniatis手冊(cè)中所述的含多聚腺苷酸的mRNA(PolyA+mRNA)。
實(shí)施例3cDNA的制備將實(shí)施例2所得的10微克polyA+mRNA注入低dT12-18，并用逆向轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制，該方法基本上按Gnbler和Hoffman(Gnblur，U，and Hoffman，B.J.Gene25263～269，1983)所述進(jìn)行。
將cDNA克隆到人們熟知并且可從市售得到的載體入-gtⅡ(Young，R.A.and Davis，R.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA801194～1198，1983;可從CA圣地亞哥載體克降系統(tǒng)公司得到)，用Eco RⅠ甲基化酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，麻省貝弗利)并按供應(yīng)商建議用S-腺苷甲硫氨酸對(duì)雙股cDNA甲基化，再將其與三個(gè)Eco RⅠ聯(lián)結(jié)子(GGAATTCC，CGGAATTCCG和CCGGAATTCCGG)的混合物連接。這些朕結(jié)子能使所有三個(gè)轉(zhuǎn)譯讀碼都得到融合。
連接Eco RⅠ的cDNA由Eco RI核酸內(nèi)切酶切割，并從1%瓊脂糖凝膠中分離得到一部分600～2000堿基對(duì)。這個(gè)經(jīng)Eco RⅠ切割的純cDNA經(jīng)Eco RⅠ切割磷酸酶處理過(guò)的入-gt ⅡDNA連接，再包裝在噬菌體中，用于感染E.coli Y1088，atcc 37195。
實(shí)施例4抗體的篩選按Young等(Young.R.A.and Davis，R.W.Proc.Nat.Acad.Sci.801194～1198，1983)所述，將抗HPLC-純化的P.chrysosporium LDMTM6反應(yīng)的家兔抗rLDMTM6抗體用于探查由600～2000堿基對(duì)cDNA得到的基因庫(kù)。檢測(cè)交叉反應(yīng)的克隆。
按常規(guī)方法(例見(jiàn)Tmaniatis.T.等)，從各個(gè)交叉反應(yīng)的克隆的分離物中制備噬菌體DNA，并用Eco RⅠ消化，以顯示基其cDNA的插入量?？寺?-1的插入量估計(jì)為820堿基對(duì)，其他四個(gè)克隆含有相似的扦入量，約為650堿基對(duì)，其中克隆3-2具有代表性。
圖1給出克隆3-1和-3-2的DNA插入的限制圖。克隆3-1含有所期望的與Eco RⅠ聯(lián)結(jié)子順序連接的低dT區(qū)(用于供給cDNA合成)。
實(shí)施例5rLDMTM6蛋白的氨基末端的特征按Kirk等(Kirk，T.K.，Croan，S.，Tien，M.，Murtagh，K.M.and Farrell，R.L.，Enzyme Microb.Technol.827～32，1986)所述方法，通過(guò)離子交換HPLC，從突變體SC26的P.chrysosporium胞外生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化rLDMTM6。該分離物通過(guò)HPLC進(jìn)行氨基末端的氨基酸分析(Hunkapiller，M.and Hood，L，Methods in Enzymol，91227，486，1983)。該氨基末端的分析結(jié)果在圖2中給出。
在該系統(tǒng)中未檢測(cè)半胱氨酸，因此圖中第3、14和15的氨基酸為空白記錄。
實(shí)施例6木質(zhì)素酶rLDMTM6蛋白的編碼順序的特征如圖3所示，從克隆3-2假定的5′端所進(jìn)行的DNA順序信息的分析，表明具有與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的完整蛋白質(zhì)氨基末端相一致的順序。由于克隆3-1和3-2的145堿基對(duì)區(qū)域匹配良好，通過(guò)克隆3-2和3-1在其共同的Ss+Ⅰ位點(diǎn)的相互連接，可以重建完整長(zhǎng)度的cDNA克隆，得到大約1280堿基對(duì)的Eco RⅠ-Ss+Ⅰ-Eco RⅠ片段。該片段的順序在表Ⅰ中給出。
將該Eco RⅠ-Ss+Ⅰ-Eco RⅠ片段(本文中稱為RⅠ片段)克隆到經(jīng)Eco RⅠ消化的質(zhì)粒pREV2.2(在美國(guó)專利申請(qǐng)文件序號(hào)892680中已予介紹)得到質(zhì)粒pLn102。
這是一種非常不標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法，分別各自得到預(yù)估中氨基未端和C末端各半的蛋白質(zhì)。
當(dāng)RⅠ片段適宜于插入合適的表達(dá)載體如質(zhì)粒并且載體用于轉(zhuǎn)移由非琥珀突變型抑制的細(xì)菌如E.coli JM105時(shí)，則宿主細(xì)菌通過(guò)培養(yǎng)表達(dá)1所示氨基酸順序的蛋白質(zhì)，并且恰好在345位終止信號(hào)之前，在丙氨酸1位延伸至丙氨酸氨基酸順序的C-末端上(344位)。當(dāng)由琥珀突變型抑制的宿主如E.coli JM103被載體轉(zhuǎn)移時(shí)，表1所示氨基酸順序的C-末端是在氨基酸361位上的甘氨酸其位于362位上強(qiáng)終止信號(hào)之前。完整的rLDMTM6脫輔基蛋白的氨基酸順序，可從含有丙氨酸1位至丙氨酸344位的344個(gè)殘基的cDNA順序中預(yù)測(cè)得到。
實(shí)施例7質(zhì)粒pBSR3的構(gòu)建由于在完整的rLDMTM6脫輔基蛋白的起始點(diǎn)上一部分丙氨酸密碼子包括一部分BssHⅡ位點(diǎn)(GCGCGC)，所述位點(diǎn)的平衡位于丙氨酸密碼子之前，并且包括負(fù)1位上所有轉(zhuǎn)氨酸CGC密碼子，所以含有rLDMTM6脫輔基蛋白的所有編碼鏈信息的BssHⅡ-Ss+Ⅰ-Eco RⅠ DNA片段，首先用核酸內(nèi)切限制酶BssHⅡ切割同一片段，并通過(guò)DNA聚合酶的克列諾夫片段處理插入形成的5′端突出部位，從克隆質(zhì)粒pLn102(實(shí)施例6)切割得到，從而完全重新建立為丙氨酸和精氨酸編碼的DNA。然后用核酸內(nèi)切酶Eco RⅠ消化形成線型并經(jīng)處理的質(zhì)粒DNA，使之游離成為所需片段。經(jīng)凝膠分離后的這個(gè)片段可用于形成表達(dá)質(zhì)粒pBSR3，它是與圖7所示質(zhì)粒pREV2.2構(gòu)成融合系統(tǒng)的一部分。如圖7所示，質(zhì)粒pREV2.2包括自啟動(dòng)子(P)下游區(qū)的多克隆位點(diǎn)(MCS)。多克隆位點(diǎn)內(nèi)的限制位點(diǎn)示于圖7直線MCS部分。為了制備pBSR3，用核酸內(nèi)切限制酶Eco RⅠ和Eco RⅤ徹底消化質(zhì)粒pREV2.2，形成的線性化質(zhì)粒，按常規(guī)連接方法與以上得到的并經(jīng)修飾的BssHⅡ-Ss+Ⅰ-Eco RⅠ片段連接。因此，在以pBSR3的GCC開(kāi)始的完整蛋白的編碼順序，在其5′端成上游端前面的是精氨酸的CGC密碼，依次直接在其前面的是為29個(gè)氨基酸編碼的87個(gè)堿基對(duì)(由于MCS部分的影響)，依次直接在該29個(gè)氨基酸前面的是蛋氨酸的密碼ATG。于是，pBSR3為氨基酸順序編碼，該順序具有rLDMTM6脫輔基蛋白完整順序，在其原始的氨基末端前面的是具有蛋氨酸作為其氨基末端的31個(gè)氨基酸部分。pBSR3在非琥珀型宿主中的表達(dá)將在實(shí)施例8中介紹。
實(shí)施例8E.coli(pBSR3)的發(fā)酵和重組(rLDMTM6)蛋白的提取20升E.coli(pBSR3)，NRRL B-18068發(fā)酵液在改進(jìn)的2%酵母提取液培養(yǎng)基中，無(wú)氧培養(yǎng)24～32小時(shí)。培養(yǎng)基的組分如下成分 含量酵母提取液 20.0克/升酪蛋白胨 20.0克/升酪蛋白氨基酸 20.0克/升KH2PO42.0克/升K2HPO42.0克/升Na2HPO4·7H2O 2.0克/升氯霉素 100.0克/升將采集的各等份細(xì)胞進(jìn)行溶解，并采用SDS-PAGE法分析和考馬斯蘭蛋白染料染色，表觀分子量約為41.000的蛋白帶與非轉(zhuǎn)移細(xì)胞控制相比更為主要。代表rLDMTM6脫輔基蛋白的這條蛋白帶是采用對(duì)天然rLDMTM6反應(yīng)的抗體和Western印跡分析法進(jìn)行鑒定的(Towbin，H.，Staehelin，T.and Gordon，J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.764350～4354，1979)，它與相對(duì)應(yīng)的這個(gè)分子量而言，也是主要的免疫反應(yīng)蛋白。該蛋白質(zhì)未經(jīng)糖基化，以區(qū)別于天然的(由P.chsysosporium產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
當(dāng)細(xì)胞經(jīng)順序溶解酶和珠磨處理溶解時(shí)，重組rLDMTM6脫輔基蛋白只有經(jīng)離心后在細(xì)胞小片中能被檢測(cè)到。
為了使重組rLDMTM6蛋白基本上得到溶解，細(xì)胞小片用4～8摩爾尿素溶液或用大約6摩爾的胍溶液進(jìn)行處理。使用8摩爾的尿素溶液可使90～95%的rLDMTM6蛋白得到溶解，而4摩爾的尿素溶液只能溶解50%蛋白。
當(dāng)將4摩爾尿素溶液(在50毫摩爾Tris-HCl和1毫摩爾EDTA組成的pH為8的TE緩沖液中含4摩爾尿素)加到溶解的培養(yǎng)物小片中時(shí)，50%的蛋白仍保留在小片中，需進(jìn)一步與上清液分離。接著加8摩爾尿素溶液可使保留著的50%全部或幾乎全部得到溶解。因此，95%以上的蛋白通過(guò)上述方法都能得到溶解。
此外還發(fā)現(xiàn)，在加入大約10毫摩爾的二硫蘇糖醇時(shí)，其4摩爾尿素中的溶解效率幾乎與8摩爾尿素的溶解水平相同。
實(shí)施例9表達(dá)質(zhì)粒pLn104的制備質(zhì)粒pBSR3(實(shí)施例7)是標(biāo)準(zhǔn)環(huán)出實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生改性pBSR3的基礎(chǔ)，其中除了一個(gè)密碼子外(在1位Ala的GCC前的Arg的CGC密碼)，這些密碼子在1位Ala的起始ATG和GCC之間的核苷酸順序中被切割(環(huán)出)。為得到這一結(jié)果，用核酸內(nèi)切限制酶Eco RⅠ和NdeⅠ處理質(zhì)粒pBSR3，生成的含木質(zhì)素酶編碼順序的片段是凝膠分離，另一部分pBSR3通過(guò)核酸內(nèi)切限制酶pstⅠ和凝膠分離的處理而線性化。于是，分離的兩個(gè)片段與單鏈40堿基核苷酸組合，用來(lái)實(shí)現(xiàn)所要求的環(huán)出和具有如下順序TTAATGAGGAGTCCCTTATGCGCGCCACCTGTTCCAACGG.
生成的異源雙鏈用DNA聚合酶處理，并且生成的系統(tǒng)以常規(guī)方法分離出所要求的表達(dá)質(zhì)粒pLn104。通過(guò)用pLn104轉(zhuǎn)移E，coli JM105和培養(yǎng)成功的轉(zhuǎn)化株，表達(dá)的345氨基酸木質(zhì)素酶具有完整rLDMTM6蛋白的氨基酸順序，Arg位于其正常的氨基末端之前。
實(shí)施例10表達(dá)質(zhì)粒pLn105的構(gòu)建在直接將起始因子ATG密碼子置于為完全蛋白的1位丙氨酸編碼的GCC前之后，用由pREV2.2得到E.coli啟動(dòng)子和連鎖下游含常規(guī)非編碼核蛋白體結(jié)合位的低核苷酸，按操縱于融合構(gòu)建質(zhì)粒pLn105。此后，pln105用來(lái)編碼在其氨基末端前是精氨酸的完全蛋白的氨基酸順序。更詳細(xì)地說(shuō)，用核酸內(nèi)切限制酶BssHⅡ消化克隆實(shí)施例6的質(zhì)粒(由EcoRⅠ切割與約1280bpEcoRⅠ-SstⅠ-EcoRⅠ片段的簡(jiǎn)單連接pREV2.2形成)制備質(zhì)粒pln105。然后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法用S1核酸酶消化得到的線性化質(zhì)粒，除去由BssHⅡ消化產(chǎn)生的5′端突出部位。用在質(zhì)粒pREV2.2多克隆的位點(diǎn)部分切割的核酸內(nèi)切限制酶，消化生成的片段。生成的大片段通過(guò)連AGCTATAATGAGGAGTCCCTTATGGCTATTACTCCTCAGGGAATACCG接方法與低核苷酸相連接，該順序含有與起始蛋氨酸(ATG)密碼子和丙氨酸密碼子的GC部位連接的非編碼核蛋白體結(jié)合位GGAGTCCCTT(以便重新建立為完全蛋白的1-Ala編碼的GCC)。用E.Coli宿主JM103.NRRLB-39403表達(dá)pln105。氨基末端可表示為蛋氨酸-丙氨酸-蘇氨酸等，如表1。在大量分離的rLDM6蛋白中未測(cè)定蛋氨酸。
實(shí)施例11質(zhì)粒pln106的構(gòu)建如圖6所示構(gòu)建質(zhì)粒pln106。從圖6可歸納得到用在pREV2.2的MCS區(qū)切割的核酸內(nèi)切限制酶BamHⅠ和SmaⅠ消化質(zhì)粒pREV2.2。從消化片段分離得到的3980 bp DNA大片段，用核酸內(nèi)切限制酶BamHⅠ(在pREV2.2的MCS部位切割)及用NaeⅠ(在1170位和1171位的核苷酸之間切割)消化質(zhì)粒pln105，生成的約1118 bp片段與消化片段分離。用常規(guī)連接方法將上述約3980bp和1118bp的分離片段連接起來(lái)，生成的質(zhì)粒pln106包含這些基因，如表1給出的抗氯霉素和抗氨必西林、復(fù)制起點(diǎn)、E.Coli啟動(dòng)子、順序GGAGTCCCTT的非編碼核蛋白體結(jié)合部位、起始密碼子ATG和位91GCC起始至位1170 GTGGCC的DNA順序。這個(gè)DNA順序包括在位91開(kāi)始，延伸至位1122(末端為GGTGCT)順序的編碼rLDMTM6蛋白。
實(shí)施例12重組rLDMTM6脫輔基蛋白在E.Coli(pln106)中的表示質(zhì)粒pln106通過(guò)常規(guī)方法轉(zhuǎn)移入E.Coli SG20251(NRRL 15918)，如實(shí)施例7在20升發(fā)酵液中培養(yǎng)，誘導(dǎo)rLDMTM6脫輔基蛋白的表達(dá)。采用順序溶菌酶和珠磨處理溶解所采集的細(xì)胞，離心分離后，主要在小片部分測(cè)定重組rLDMTM6脫輔基蛋白。如實(shí)施例8所述，重組rLDMTM6脫輔基蛋白與不溶解的小片部分分離。該蛋白溶液在4摩爾尿素、50毫摩爾乙酸鈉、10毫摩爾二硫蘇糖醇(DTT)，pH6中，通過(guò)萃取純化至30%，并用POLYTRON(Brinkman Instrunements，Westbury，NY)再懸浮30秒至3分鐘。用適宜的離心分離法將上清萃取液與小片分離。蛋白溶液用于緩沖液A(4摩爾尿素、50毫摩爾乙酸鈉和5毫摩爾DTT，pH6)的DEAESEPHAROSE陰離子交換柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)。梯度0至0.5～1.0摩爾的Nacl在緩沖液A中展開(kāi)，收集的餾分用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定(見(jiàn)實(shí)施例1)，經(jīng)電泳分離后，用考馬斯藍(lán)著色蛋白質(zhì)。用這種方法從E.Coli菌株SG 20251(NRRL B-15918)產(chǎn)生rLDMTM6的表觀分子量的39.5千道爾頓(Kd)。從E.Coli的pln106產(chǎn)生的rLDMTM6未被糖基化，以與天然(產(chǎn)生的P.Chrysosporium)蛋白區(qū)別。
對(duì)由DEAD-Sepharose柱收集的餾分，還檢驗(yàn)其帶有抗rLDM6木質(zhì)素酶抗體的免疫反應(yīng)活性。匯集具有最強(qiáng)免疫反應(yīng)活性的餾分(25毫升)，并用于4摩爾尿素、50毫摩爾KH2PO4、4毫摩爾DTT，pH7.0的分級(jí)柱，即S-300(400毫升)Sephacryl(Pharmacia)。還檢驗(yàn)分級(jí)柱中餾分(各10毫升)的免疫反應(yīng)活性，匯集最強(qiáng)烈的反應(yīng)部分。當(dāng)用SDS-PAGE檢查時(shí)，根據(jù)掃描考馬斯藍(lán)著色型判斷，所匯集的這部分餾分約含20%rLDMTM6。
如此制備的rLDMTM6的前8個(gè)氨基末端氨基酸測(cè)定Ala Thr-Ser Asn Gly lys Thr，其中該系統(tǒng)中的空位一般是半胱氨酸殘基，因此，在這些發(fā)酵和生產(chǎn)條件下，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)編碼蛋氨酸的起始密碼子ATG。氨基末端的蛋氨酸可存在于其它rLDMTM6制劑中，取決于E.Coli菌株，表示水平和純化方法。
實(shí)施例13重組rLDMTM6木質(zhì)素酶的重建從P.Chrysosporium中血紅素重建木質(zhì)素酶或血紅素重建重組木質(zhì)素酶，迄今未獲得成功。
為了獲得良好的rLDMTM6活性，原理可以是冰凍細(xì)胞或新鮮的采集細(xì)胞。如實(shí)施例10所述制備蛋白溶液。尿素萃取混合物在室溫下不超過(guò)6小時(shí)，在此期間，萃取液離心30分鐘至15小時(shí)，這取決于離心力。直接在陰離子交換柱展開(kāi)，在24小時(shí)內(nèi)將匯集的組分放入重建protocol，除非在-20℃存儲(chǔ)含所匯集rLDMTM6組分，他們可在重建之前存儲(chǔ)較久。
用純度5～100%的rLDMTM6制劑達(dá)到成功的重建，具有rLDMTM6的活性至少由藜蘆基醇/分/毫克rLDMTM6產(chǎn)生26單位的藜蘆基醛的比活性。這些rLDMTM6制劑中表示克隆pln105或pln106的細(xì)胞制成(見(jiàn)實(shí)施例10、11和12)。這些制劑的蛋白質(zhì)濃度在由一般為0.1～0.3摩爾Nacl的陰離子交換柱的洗脫緩沖液中為0.1～1毫克/毫升制劑。如實(shí)施例12所述，在DEAE-Sepharase柱收集組分的分級(jí)柱上洗脫后，也可得到用來(lái)重建酶的蛋白制劑。由分級(jí)柱分離的rLDMTM6蛋白的純度估計(jì)達(dá)20%。
操作重建過(guò)程之前，從DEAE-Sepharose柱或分級(jí)柱得到的蛋白溶液必需首先滲析，從蛋白溶液中除去尿素。由于在緩沖的蛋白溶液中存在DTT，蛋白質(zhì)在還原形式下用于重建。
采用一個(gè)方法如下所述從蛋白質(zhì)總濃度3毫克/毫升的分級(jí)柱匯集的組分和表示約20%全蛋白的重組rLDMTM6是處于pH7.0的4摩爾尿素、50毫摩爾KH2PO4、4毫摩爾DTT緩沖液中。為去除尿素，在4℃下，用超過(guò)200倍體積的pH8.0的50毫摩爾Tris-Cl、1毫摩爾DTT、20%(體積/體積)甘油的緩沖液滲析過(guò)夜。滲析后，將剛?cè)芙庥?.1克當(dāng)量KOH的超過(guò)4倍摩爾的正鐵血紅素Ⅸ(3)加入這種蛋白溶液。然后，在4℃下，在pH8.0的50毫摩爾Tris-Cl、1毫摩爾還原谷胱甘肽、100微摩爾氧化谷胱甘肽滲析過(guò)夜。最后，樣品在4℃下，用pH6.0的10毫摩爾乙酸鈉水溶液滲析過(guò)夜。也已證明這種重建方法的改進(jìn)是有效的。改進(jìn)包括在正鐵血紅素加入前，用含還原和氧化谷胱甘肽的緩沖液，滲析rLDMTM6蛋白溶液。實(shí)驗(yàn)如下所述在4℃下，用超過(guò)200倍體積的包括pH8.0的50毫摩爾Tris-Cl、1毫摩爾還原谷胱甘肽、100微摩爾氧化谷胱甘肽的緩沖液對(duì)由上述分級(jí)柱得到的蛋白溶液滲析過(guò)夜。然后，將超過(guò)4倍摩爾的正鐵血紅素加入滲析過(guò)的蛋白溶液，最終在4℃下，用pH6.0的10毫摩爾乙酸鈉水溶液對(duì)得到的溶液滲析過(guò)夜。
409毫微米索里特氏吸收帶的存在表示重建成功。
概括地說(shuō)，重建protocol包括(a)將1至10倍的過(guò)量血紅素加到脫輔基蛋白溶液(b)用滲析溶液滲析在(a)中得到的溶液，該滲析溶液包括pH5～10的0.1至5毫摩爾還原硫氫基氧化還原系統(tǒng)和10至500微摩爾氧化的硫氫基氧化還原系統(tǒng)。
滲析溶液還可含5～30%(體積/體積)甘油為佳，以20%甘油更佳。
改進(jìn)重建protocol的特征概括如下(a)用pH5～10的包括1～5毫摩爾還原硫氫基氧化還原系統(tǒng)和10微摩爾至500微摩爾氧化的硫氫基氧化還原系統(tǒng)的滲析溶液，滲析脫輔基蛋白的緩沖液。
(b)將1至10倍的過(guò)量摩爾血紅素加入在(a)中得到的脫輔基蛋白溶液。
為去除過(guò)量血紅素，最好用pH4～8的水溶液再滲析在兩種重建方法的(b)中得到的溶液。
如果重建過(guò)程得不到藜蘆基醇氧化的良好比活性，還有一些稱作再活化方法會(huì)導(dǎo)至rLDMTM6具有高比活性。這樣的一種再活化方法是用10～200毫摩爾磷酸鉀或等量的pH5～7緩沖液稀釋初始重建溶液至0.1～0.5毫克/毫升rLDMTM6，添加4倍過(guò)量摩爾(超過(guò)rLDMTM6蛋白質(zhì))的正鐵血紅素Ⅸ，在4～37℃孵化1～24小時(shí)。在4～37℃下和4～24小時(shí)內(nèi)，在10～200毫摩爾磷酸鉀或等量的pH5～7緩沖液中重復(fù)滲析步驟。此外，未經(jīng)稀釋的初始重建溶液加入4倍過(guò)量摩爾的正鐵血紅素Ⅸ，接著通過(guò)10～200毫摩爾磷酸鉀或等量的pH5～7緩沖液的Sephadex G-50柱，生成含rLDMTM6的洗脫液，與起始重組溶液相比具有優(yōu)良的比活性。
實(shí)施例14重組rLDMTM6木質(zhì)素酶的活性業(yè)已證明按實(shí)施例13得到的重建重組木質(zhì)素酶rLDMTM6在木質(zhì)素模擬化合物測(cè)定和含有木質(zhì)素的測(cè)定中是有效的。
所用的木質(zhì)素模擬化合物測(cè)定是(1)藜蘆基醇氧化測(cè)定(VAO)，(2)1，2，4，5-四甲氧基苯(TMB)測(cè)定，以及(3)adlerol測(cè)定。
C2芳香醇對(duì)醛的氧化作用的VAO測(cè)定試驗(yàn)如實(shí)施例1所述。
脫甲氧基化的TMB測(cè)定試驗(yàn)。每1摩爾作用物消耗1摩爾過(guò)氧化氫的木質(zhì)素酶反應(yīng)產(chǎn)物是2摩爾甲醇和2，5-甲氧苯醌。反應(yīng)條件為2至5微克純化酶、20毫摩爾酒石酸鈉(pH2.5)、64微摩爾過(guò)氧化氫和1毫摩爾1，2，4，5-四甲氧基苯。在450毫微米跟蹤反應(yīng)，表現(xiàn)出黃色芳基陽(yáng)離子基團(tuán)的中間產(chǎn)物。
Cα-Cβ鍵的切開(kāi)和對(duì)Cα醛產(chǎn)生氧化作用的測(cè)定試驗(yàn)。反應(yīng)條件和控制與VAO測(cè)定相同，只是alderol替換藜蘆基醇。
用帶有YSI 2510氧化酶探查物的YSI型25氧化酶測(cè)定器(Yellow Springs Instrument Co.，Inc.，Yellow Springs，OH)測(cè)量過(guò)氧化物隨時(shí)間的消耗速率，進(jìn)行木質(zhì)素測(cè)定。反應(yīng)條件與VAO測(cè)定相同，但具有用磨制的木質(zhì)素或木質(zhì)素紙漿取代的40微摩爾過(guò)氧化氫和藜蘆基醇20至250微克/毫升。
圖表1給出典型的比活性，用rLDMTM6蛋白的VAO和TMB測(cè)定方法測(cè)量，由E.Coli NRRL B-18157(非琥珀型宿主)表達(dá)(見(jiàn)實(shí)施例12)，以及如實(shí)施例13所述，與天然木質(zhì)素酶庫(kù)的比活性相比進(jìn)行重建，其中P.Chrysosporium rLDMTM6是主要的。asloerol對(duì)rLDMTM6酶的比活性可與P.Chrysospori rLDMTM6酶相比擬。
圖表1具有模擬化合物的木質(zhì)素酶活性VAO(單位/毫克)+TMB(任意單位/毫克)＊重建rLDMTM6 25.5 510P.Chrysosporium rLDMTM6 22.9 422＊TMB測(cè)定比活性可以表示為在450毫微米每毫克rLDMTM6每分鐘增加的吸收單位。
+VAO測(cè)定比活性可以表示為每毫克rLDMTM6的國(guó)際單位(每分鐘形成藜蘆基醛的微摩爾)。
重建重組木質(zhì)素酶與木質(zhì)素的比活性，在加入5分鐘后表明對(duì)純松木質(zhì)素AT(木質(zhì)素紙漿)是76.9單位/毫克rLDMTM6，對(duì)磨制的木質(zhì)素為66.0單位/毫克rLDMTM6(1個(gè)單位表示每分鐘消耗1毫摩爾過(guò)氧化氫)。
重建的最后步驟是用pH6.0的10毫摩爾乙酸鈉滲析，在這最后滲析后，重建rLDMTM6的活性在儲(chǔ)藏中提高。圖4表示在4℃儲(chǔ)藏8天中重建rLDMTM6的VAO活性的提高。0天表示從pH6.0的10毫摩爾乙酸鈉滲析中取出樣品的時(shí)間。按上述進(jìn)行VAO測(cè)定，8天中活性提高10倍。再儲(chǔ)藏5天后，活性不再增加，但相當(dāng)穩(wěn)定。在滲析后4℃下儲(chǔ)藏，P.Chrysosporium木質(zhì)素酶的活性無(wú)任何提高。
用木質(zhì)素在過(guò)氧化物消耗測(cè)定和TMB測(cè)定中也可觀察到活性隨重建rLDMTM6時(shí)間而提高。用天然的P.Choysosporium材料觀察不到離析后活性的提高。
從過(guò)氧化物消耗計(jì)算rLDMTM6儲(chǔ)藏7天的活性是76.9單位/毫克rLDMTM6，其一個(gè)單位表示與儲(chǔ)藏6天酶的39.1單位/毫克rLDMTM6比較，每分鐘1毫摩爾過(guò)氧化氫的消耗。活性的提高依賴于溫度。表2表示用同樣的重建rLDMTM6所做實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，并示于圖4。上述其它實(shí)施例所要求蛋白質(zhì)產(chǎn)物的重建，導(dǎo)致具有類似VAO活性的木質(zhì)素酶蛋白質(zhì)，pBSR3(實(shí)施例7)蛋白質(zhì)的活性較低除外。
圖表2rLDMTM6的活性提高與溫度關(guān)系天數(shù)儲(chǔ)藏溫度 VAO活性單位/毫克rLDMTM6(37℃下測(cè)定)5 原料 5.556 4℃ 5.705.6523℃ 7.257.05重復(fù)試驗(yàn)室溫下活性比4℃時(shí)提高26%。
實(shí)施例15質(zhì)粒pln1001的構(gòu)建和重組rLDMTM6
蛋白在釀酒酵母的表達(dá)在磷酸酵母三碳糖同分異構(gòu)酶(TPI)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止區(qū)之區(qū)，插入含91位起始和1172位末端(見(jiàn)表Ⅰ)的rLDMTM6核苷酸順序，通過(guò)與線性酶母E.Coli穿梭機(jī)制載體YEp6(Struhl.，K.等Proc.Nat.Acad，Sci.761035～1039頁(yè)(1979年)的連接構(gòu)建pln1001;這種插入還包括在TPI啟動(dòng)子和rLDMTM6編碼順序之間，有含轉(zhuǎn)化酶信號(hào)順序(INV-SS)的66bp額外低核苷酸(Carison，M.，Taussig，R.，Kustu，S.and Bolein，D.，Mol.Biol(1983)439～447)，以致在釀酒酵母中表達(dá)時(shí)可分泌出rLDMTM6蛋白質(zhì)。
按第二步驟在分離5′和3′與YEp6連接的構(gòu)建插入。
A)從進(jìn)一步分離TPI啟動(dòng)子構(gòu)建質(zhì)粒PTPR從圖9可概括為用預(yù)先由SalⅠ消化的M13mp10載體(Messing，J.and Viera，J.Gene 19260～276頁(yè)1982年)連接含TPI啟動(dòng)子和位于SalⅠ聯(lián)結(jié)子旁的PTPIC-10的1200bp BglⅡ-BglⅡ片段(Alber，T.and Kawasaki，G.J.Molec.and Applied Gen.1419～434〔1982)，以便得到MTPⅠ載體，其中M13mp10的HindⅢ和BamHⅠ位點(diǎn)分別連接到TPⅠ啟動(dòng)子的5′和3′端。
然后，產(chǎn)生直接致突變的低核苷酸(Vlasuk，G.P.and Inouye，S.Experimental Manipulation of gene expression(ed.H.Inouye)Academic Press291～303頁(yè))和(Itakura，K.，Rossi，J.J.and Wallace，R.B.(1984年)Ann.Rev.Biochem.53323～356頁(yè))，以致在TPⅠ的氨基末端蛋氨酸的密碼子后，直接形成HaeⅢ位點(diǎn)。
含TPⅠ啟動(dòng)子的BamHⅠ-HindⅢ片段從MTPⅠ移動(dòng)，質(zhì)粒pTPR是該片段與預(yù)先BamHⅠ和Hind消化的具有pBR322片段連接的產(chǎn)物。
B)5′部分的構(gòu)建(如圖10所示)該TPⅠ啟動(dòng)子是與質(zhì)粒pTPR凝膠分離得到的合適的1000bp EcoRⅠ-HaeⅢ片段。
用BssHⅡ和KpnⅠ(KpnⅠ切割728位和729位的核苷酸之間rLDM6編碼順序)線性化含RⅠ片段的質(zhì)粒，當(dāng)含從瓊脂糖膠分離的rLDM6編碼順序的5′末端時(shí)，產(chǎn)生637bp片段66bp片段順序?yàn)镃TCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCAAAATATCTGCATCAATGGAGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGACCAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGTTGCGCGC其含有轉(zhuǎn)化酶信號(hào)順序，帶有5′鈍端和在3′末端的BsshⅡ重疊，并合成4個(gè)低核苷酸;1A是5′末端40堿基編碼鏈，1B是3′末端22堿基編碼鏈，2A是5′末端45堿基非編碼鏈，2B是3′末端21堿基非編碼鏈。為避免形成連環(huán)體，只有1B和2B被激酶催化。退火和連接4個(gè)低核苷酸，生成分離的INNss片段。
約1000bp EcoRⅠ-HaeⅢ片段、637bp BssHⅡ-KpnⅠ片段和66bp片段與EcoRⅠ-KpnⅠ消化的pUC19連接在一起(Yanisch-Perron，C.Viera，J.and Messing，J.(1985))。
c)3′部位的構(gòu)建(如圖10所示)從含TPI轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的質(zhì)粒pTPIC-10的約700bp EcoRⅠ-CcoRⅤ片段是凝膠分離。
rLDM6編碼順序的444bp NaeⅠ-KpnⅠ片段也是凝膠分離。
700bp和444bp片段與EcoRⅠ-KpnⅠ消化的pUC19連接。
D)pln1001的構(gòu)建(如圖10所示)含5′單位的KpnⅠ-EcoRⅠ片段和含3′部位的KpnⅠ-EcoRⅠ片段，分別與B)和C)構(gòu)建的質(zhì)粒凝膠分離，并且與用EcoRⅠ消化的YEp6連接。
E)重組木質(zhì)素酶脫輔基蛋白H8在釀酒酵母中的表示。
生成的質(zhì)粒pln1001轉(zhuǎn)入宿主釀酒酵母DBY747(伯克利，加利福尼亞大學(xué)酵母三傳原料中心)，在用亮氨酸、尿嘧啶、色氨酸、蛋氨酸、酪蛋白氨基酸(Difco，Detroit，MI)和葡萄糖補(bǔ)充的基本培養(yǎng)基中接種DBY747(pln1001)，隨著劇烈振蕩，在30℃孵化18小時(shí)，此外，宿主可在含0.67%酵母氮基質(zhì)、2%葡萄糖和0.5%酪蛋白氨基酸(Difco)的合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。采集這些細(xì)胞，通過(guò)珠磨溶解，從未溶解細(xì)胞片中，用多克降抗體對(duì)P.Choysosporium rLDM6免疫反應(yīng)測(cè)定rLDM6蛋白質(zhì)的表觀分子量為41000道爾頓。
表1RI片段的核苷酸順序(其中包括編碼rLDM6脫輔基蛋白順序)和導(dǎo)出rLDM6脫輔基蛋白的氨基酸順序位1→GAA TTC CGA GAG AGA TAG CTG CGA AGA GCT GCT ATC TCT CTC位91GCT CTC TTG CTC TCG GCT GCG AAC GCG GCT GCG GTG ATC GAG位
ACC TGT TCC AAC GGC AAG ACC GTC GGC GAT GCGARG ALA THR CYS SER ASN GLY LYS THR VAL GLY ASP ALA(-1) (1)TCG TGC TGC GCT TGG TTC GAC GTC CTG GAT
CAG CAGSER CYS CYS ALA TRP PHE ASP VAL LEU ASP ASP ILE GLN GLNAAC CTG TTC CAC
CAG TGC GGC
GCG CAC GAGASN LEU PHE HIS GLY GLY GLN CYS GLY ALA GLU ALA HIS GLUTCG ATT CGT CTC GTC TTC CAC GAC TCC ATC GCA ATT TCG CCCSER ILE ARG LEU VAL PHE HIS ASP SER ILE ALA ILE SER PROGCC ATG GAG GCA CAG GGC AAG TTC GGC GGC GGT GGT GCT GACALA MET GLU ALA GLN GLY LYS PHE GLY GLY GLY GLY ALA ASPGGC TCC ATC ATG ATC TTC GAC GAT ATC GAG ACT GCG TTC CACGLY SER ILE MET ILE PHE ASP ASP ILE GLU THR ALA PHE HISCCT AAC ATC GGT CTC GAC GAG ATC GTC AAG CTC CAG AAG CCAPRO ASN ILE GLY LEU ASP GLU ILE VAL LYS LEU GLN LYS PRO
TTC GTT CAG AAG CAC GGT GTC ACC CCT GGT GAC TTC ATC GCCPHE VAL GLN LYS HIS GLY VAL THR PRO GLY ASP PHE ILE ALATTC GCT GGT GCT GTC GCG CTC AGC AAC TGC CCT GGT GCC CCGPHE ALA GLY ALA VAL ALA LEU SER ASN CYS PRO GLY ALA PROCAG ATG AAC TTC TTC ACT GGT CGT GCA CCT GCT ACC CAG CCCGLN MET ASN PHE PHE THR GLY ARG ALA PRO ALA THR GLN PROGCT CCT GAT
GTC CCC GAG CCC TTC CAC ACT GTC GACALA PRO ASP GLY LEU VAL PRO GLU PRO PHE HIS THR VAL ASPCAA ATC ATC AAC CGT GTC AAC GAC GCA GGC GAG TTC GAT GAGGLN ILE ILE ASN ARG VAL ASN ASP ALA GLY GLU PHE ASP GLUCTC GAG CTT GTC TGG ATG CTC TCC GCG CAC TCC GTC GCA GCGLEU GLU LEU VAL TRP MET LEU SER ALA HIS SER VAL ALA ALAGTG AAC GAC GTC GAC CCG ACC GTC CAG GGT CTG CCC TTT BACVAL ASN ASP VAL ASP PRO THR VAL GLN GLY LEU PRO PHE ASPTCG ACC CCC GGA ATC TTC GAC TCC CAG TTC TTC GTC GAG ACTSER THR PRO GLY ILE PHE ASP SER GLN PHE PHE VAL GLU THRCAG CTT CGT GGT
TTC CCC GGC TCT GGC GGC AAC CAAGLN LEU ARG GLY THR ALA PHE PRO GLY SER GLY GLY ASN GLNGGC GAG GTC GAG TCG CCG CTC CCT GGC GAA ATT CGC ATC CAGGLY GLU VAL GLU SER PRO LEU PRO GLY GLU ILE ARG ILE GLNTCC GAC CAC ACT ATC GCC CGC GAC TCA CGC ACG GCG TGT GAASER ASP HIS THR ILE ALA ARG ASP SER ARG THR ALA CYS GLUTGG CAG TCC TTC GTC AAC AAC CAG TCC AAG CTC GTC GAT GACTRP GLN SER PHE VAL ASN ASN GLN SER LYS LEU VAL ASP ASPTTC CAA TTC ATT TTC CTC GCC CTC ACC CAG CTC GGC CAG GACPHE GLN PHE ILE PHE LEU ALA LEU THR GLN LEU GLY GLN ASP
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TYR ARG ILE ARG LEU GLU PRO THR VAL THR VAL ALA GLY(361)CTC GTG ACG GAA CTT CGG CTT TAC TAG ATT TCA TCC ATT GTATCT CTG CAT CTG ACT ACG AAT CTT ATT CGT CTA CTC TCT TAAAAA AAA AAA AAC CGG AAT
在表1中，DNA核苷酸密碼順序以三聯(lián)體排列組成，或密碼子與DNA編碼的氨基酸蛋白質(zhì)順序一致。在表1的各種位置標(biāo)上核苷酸，或者標(biāo)記在上面的行內(nèi)，或者用箭頭標(biāo)記。表1還表示用核苷酸編碼的氨基酸蛋白順序，在這種蛋白質(zhì)順序中的氨基酸(或終止)用括弧標(biāo)記在下面的行內(nèi)完整順序的第1個(gè)氨基酸用正數(shù)開(kāi)始標(biāo)記位置)。在預(yù)計(jì)的氨基酸順序中，給以3個(gè)星號(hào)代表終止信號(hào)的核苷酸三聯(lián)體(密碼子)，可以認(rèn)為，在抑制宿主中密碼子TAG不是有效的終止區(qū)，于是該蛋白質(zhì)延至下一個(gè)TAA密碼子。反之，在無(wú)抑制基因宿主中，蛋白質(zhì)在TAG密碼子處終止。表示蛋白質(zhì)的顆粒抑制基因菌株確定在3個(gè)星號(hào)標(biāo)志的琥珀終止密碼子處連接氨基酸。
業(yè)已查明在1位Ala之前的核苷酸順序部分是人工制品，或換言之其與用天然mRNA編碼的假設(shè)信號(hào)順序無(wú)關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種木質(zhì)素酶蛋白的分離重組體或合成DNA的編碼順序。
2.用于木質(zhì)素酶蛋白的DNA密碼，包括下列氨基酸順序。10ALA THR CYS SER ASN GLY LYS THR VAL GLY ASP ALA20SER CYS CYS ALA TRP PHE ASP VAL LEU ASP ASP ILE GLN GLN30 40ASN LEU PHE HIS GLY GLY GLN CYS GLY ALA GLU ALA HIS GLU50SER ILE ARG LEU VAL PHE HIS ASP SER ILE ALA ILE SER PRO60ALA MET GLU ALA GLN GLY LYS PHE GLY GLY GLY GLY ALA ASP70 80GLY SER ILE MET ILE PHE ASP ASP ILE GLU THR ALA PHE HIS90PRO ASN ILE GLY LEU ASP GLU ILE VAL LYS LEU GLN LYS PRO100 110PHE VAL GLN LYS HIS GLY VAL THR PRO GLY ASP PHE ILE ALA120PHE ALA GLY ALA VAL ALA LEU SER ASN CYS PRO GLY ALA PRO130GLN MET ASN PHE PHE THR GLY ARG ALA PRO ALA THR GLN PRO140 150ALA PRO ASP GLY LEU VAL PRO GLU PRO PHE HIS THR VAL ASP160GLN ILE ILE ASN ARG VAL ASN ASP ALA GLY GLU PHE ASP GLU170 180LEU GLU LEU VAL TRP MET LEU SER ALA HIS SER VAL ALA ALA190VAL ASN ASP VAL ASP PRO THR VAL GLN GLY LEU PRO PHE ASP200SER THR PRO GLY ILE PHE ASP SER GLN PHE PHE VAL GLU THR210 220GLN LEU ARG GLY THR ALA PHE PRO GLY SER GLY GLY ASN GLN230GLY GLU VAL GLU SER PRO LEU PRO GLY GLU ILE ARG ILE GLN240 250SER ASP HIS THR ILE ALA ARG ASP SER ARG THR ALA CYS GLU260TRP GLN SER PHE VAL ASN ASN GLN SER LYS LEU VAL ASP ASP270PHE GLN PHE ILE PHE LEU ALA LEU THR GLN LEU GLY GLN ASP280 290PRO ASN ALA MET THR ASP CYS SER ASP VAL ILE PRO GLN SER300LYS PRO ILE PRO GLY ASN LEU PRO PHE SER PHE PHE PRO ALA310 320GLY LYS THR ILE LYS ASP VAL GLU GLN ALA CYS ALA GLU THR330PRO PHE PRO THR LEU THR THR LEU PRO GLY PRO GLU THR SER340 344VAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA.
3.用于木質(zhì)素酶蛋白的DNA密碼，包括下列氨基酸順序10ALA THR CYS SER ASN GLY LYS THR VAL GLY ASP ALA20SER CYS CYS ALA TRP PHE ASP VAL LEU ASP ASP ILE GLN GLN30 40ASN LEU PHE HIS GLY GLY GLN CYS GLY ALA GLU ALA HIS GLU50SER ILE ARG LEU VAL PHE HIS ASP SER ILE ALA ILE SER PRO60ALA MET GLU ALA GLN GLY LYS PHE GLY GLY GLY GLY ALA ASP70 80GLY SER ILE MET ILE PHE ASP ASP ILE GLU THR ALA PHE HIS90PRO ASN ILE GLY LEU ASP GLU ILE VAL LYS LEU GLN LYS PRO100 110PHE VAL GLN LYS HIS GLY VAL THR PRO GLY ASP PHE ILE ALA120PHE ALA GLY ALA VAL ALA LEU SER ASN CYS PRO GLY ALA PRO130GLN MET ASN PHE PHE THR GLY ARG ALA PRO ALA THR GLN PRO140 150ALA PRO ASP GLY LEU VAL PRO GLU PRO PHE HIS THR VAL ASP160GLN ILE ILE ASN ARG VAL ASN ASP ALA GLY GLU PHE ASP GLU170 180LEU GLU LEU VAL TRP MET LEU SER ALA HIS SER VAL ALA ALA190VAL ASN ASP VAL ASP PRO THR VAL GLN GLY LEU PRO PHE ASP200SER THR PRO GLY ILE PHE ASP SER GLN PHE PHE VAL GLU THR210 220GLN LEU ARG GLY THR ALA PHE PRO GLY SER GLY GLY ASN GLN230GLY GLU VAL GLU SER PRO LEU PRO GLY GLU ILE ARG ILE GLN240 250SER ASP HIS THR ILE ALA ARG ASP SER ARG THR ALA CYS GLU260TRP GLN SER PHE VAL ASN ASN GLN SER LYS LEU VAL ASP ASP270PHE GLN PHE ILE PHE LEU ALA LEU THR GLN LEU GLY GLN ASP280 290PRO ASN ALA MET THR ASP CYS SER ASP VAL ILE PRO GLN SERLYS PRO ILE PRO GLY ASN LEU PRO PHE SER PHE PHE PRO ALA310 320GLY LYS THR ILE LYS ASP VAL GLU GLN ALA CYS ALA GLU THR330PRO PHE PRO THR LEU THR THR LEU PRO GLY PRO GLU THR SER340VAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA＊＊＊MET ILE PRO350TYR ARG ILE ARG LEU GLU PRO THR VAL THR VAL ALA GLY.
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3的DNA順序，其中用于蛋氨酸的ATG密碼在用于丙氨酸的氨基末端密碼之前。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求
之任一項(xiàng)的DNA順序，系天然來(lái)源的基因組DNA順序。
6.一種與權(quán)利要求
2、3和4限定的DNA在約束雜交條件下進(jìn)行雜交的DNA密碼順序。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求
之任一項(xiàng)的DNA順序，其5′端與信號(hào)順序可經(jīng)操作連接。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求
之任一項(xiàng)的DNA順序，與用于原核宿主和/或真核宿主中表達(dá)的控制順序可經(jīng)操作連接。
9.一種含有并能表達(dá)權(quán)利要求
1至8中任一項(xiàng)限定的DNA順序的轉(zhuǎn)移載體。
10.一種選自pBSR，pLn104，pLn105，pLn106和pLn1001的質(zhì)粒。
11.用權(quán)利要求
1至8之任一項(xiàng)限定的DNA順序轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞。
12.一種產(chǎn)生木質(zhì)素酶蛋白的方法，其中包括培養(yǎng)權(quán)利要求
11的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
13.一種按權(quán)利要求
12的方法得到的重組木質(zhì)素酶蛋白。
14.一種未糖基化的木質(zhì)素酶蛋白，包括下列氨基酸順序ALA THR CYS SER ASN GLY LYS THR VAL GLY ASP ALASER CYS CYS ALA TRP PHE ASP VAL LEU ASP ASP ILE GLN GLNASN LEU PHE HIS GLY GLY GLN CYS GLY ALA GLU ALA HIS GLUSER ILE ARG LEU VAL PHE HIS ASP SER ILE ALA ILE SER PROALA MET GLU ALA GLN GLY LYS PHE GLY GLY GLY GLY ALA ASPGLY SER ILE MET ILE PHE ASP ASP ILE GLU THR ALA PHE HISPRO ASN ILE GLY LEU ASP GLU ILE VAL LYS LEU GLN LYS PROPHE VAL GLN LYS HIS GLY VAL THR PRO GLY ASP PHE ILE ALAPHE ALA GLY ALA VAL ALA LEU SER ASN CYS PRO GLY ALA PROGLN MET ASN PHE PHE THR GLY ARG ALA PRO ALA THR GLN PROALA PRO ASP GLY LEU VAL PRO GLU PRO PHE HIS THR VAL ASPGLN ILE ILE ASN ARG VAL ASN ASP ALA GLY GLU PHE ASP GLULEU GLU LEU VAL TRP MET LEU SER ALA HIS SER VAL ALA ALAVAL ASN ASP VAL ASP PRO THR VAL GLN GLY LEU PRO PHE ASPSER THR PRO GLY ILE PHE ASP SER GLN PHE PHE VAL GLU THRGLN LEU ARG GLY THR ALA PHE PRO GLY SER GLY GLY ASN GLNGLY GLU VAL GLU SER PRO LEU PRO GLY GLU ILE ARG ILE GLNSER ASP HIS THR ILE ALA ARG ASP SER ARG THR ALA CYS GLUTRP GLN SER PHE VAL ASN ASN GLN SER LYS LEU VAL ASP ASPPHE GLN PHE ILE PHE LEU ALA LEU THR GLN LEU GLY GLN ASPPRO ASN ALA MET THR ASP CYS SER ASP VAL ILE PRO GLN SERLYS PRO ILE PRO GLY ASN LEU PRO PHE SER PHE PHE PRO ALAGLY LYS THR ILE LYS ASP VAL GLU GLN ALA CYS ALA GLJ THRPRO PHE PRO THR LEU THR THR LEU PRO GLY PRO GLU THR SERVAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA.
15.一種未糖基化的木質(zhì)素酶蛋白，包括下述氨基酸順序ALA THR CYS SER ASN GLY LYS THR VAL GLY ASP ALASER CYS CYS ALA TRP PHE ASP VAL LEU ASP ASP ILE GLN GLNASN LEU PHE HIS GLY GLY GLN CYS GLY ALA GLU ALA HIS GLUSER ILE ARG LEU VAL PHE HIS ASP SER ILE ALA ILE SER PROALA MET GLU ALA GLN GLY LYS PHE GLY GLY GLY GLY ALA ASPGLY SER ILE MET ILE PHE ASP ASP ILE GLU THR ALA PHE HISPRO ASN ILE GLY LEU ASP GLU ILE VAL LYS LEU GLN LYS PROPHE VAL GLN LYS HIS GLY VAL THR PRO GLY ASP PHE ILE ALAPHE ALA GLY ALA VAL ALA LEU SER ASN CYS PRO GLY ALA PROGLN MET ASN PHE PHE THR GLY ARG ALA PRO ALA THR GLN PROALA PRO ASP GLY LEU VAL PRO GLU PRO PHE HIS THR VAL ASPGLN ILE ILE ASN ARG VAL ASN ASP ALA GLY GLU PHE ASP GLULEU GLU LEU VAL TRP MET LEU SER ALA HIS SER VAL ALA ALAVAL ASN ASP VAL ASP PRO THR VAL GLN GLY LEU PRO PHE ASPSER THR PRO GLY ILE PHE ASP SER GLN PHE PHE VAL GLU THRGLN LEU ARG GLY THR ALA PHE PRO GLY SER GLY GLY ASN GLNGLY GLU VAL GLU SER PRO LEU PRO GLY GLU ILE ARG ILE GLNSER ASP HIS THR ILE ALA ARG ASP SER ARG THR ALA CYS GLUTRP GLN SER PHE VAL ASN ASN GLN SER LYS LEU VAL ASP ASPPHE GLN PHE ILE PHE LEU ALA LEU THR GLN LEU GLY GLN ASPPRO ASN ALA MET THR ASP CYS SER ASP VAL ILE PRO GLN SERLYS PRO ILE PRO GLY ASN LEU PRO PHE SER PHE PHE PRO ALAGLY LYS THR ILE LYS ASP VAL GLU GLN ALA CYS ALA GLU THRPRO PHE PRO THR LEU THR THR LEU PRO GLY PRO GLU THR SERVAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA＊＊＊MET ILE PROTYR ARG ILE ARG LEU GLU PRO THR VAL THR VAL ALA GLY.
16.根據(jù)權(quán)利要求
14或15的木質(zhì)素酶蛋白，其中蛋氨酸位于丙氨酸氨基末端之前。
17.一種重建活性血紅蛋白的方法，其中包括在存在氧化還原系統(tǒng)的條件下，脫輔基蛋白與血紅素反應(yīng)的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17的方法，其中包括(a)用含有氧化還原系統(tǒng)的滲析溶液滲析脫輔基蛋白溶液。(b)將血紅素加到步驟(a)中得到的脫輔基蛋白溶液。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18的方法，其中步驟(a)的滲析溶液含有5～30%(體積/體積)的丙三醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求
17的方法，其中包括(a)將血紅素加到脫輔基蛋白溶液;(b)用含有氧化還原系統(tǒng)的滲析溶液滲析按步驟(a)得到的溶液。
21.根據(jù)權(quán)利要求
18，19或20的方法，其中包括用水溶液滲析按步驟(b)得到的溶液。
22.根據(jù)權(quán)利要求
17至21之任一項(xiàng)的方法，其中氧化還原系統(tǒng)是硫氫基氧化還原系統(tǒng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求
18至22任一項(xiàng)的方法，其中滲析溶液含有0.1至5毫摩爾還原的硫氫基氧化還原系統(tǒng)和10至500微米氧化的氧化還原系統(tǒng)，pH為5至10。
24.根據(jù)權(quán)利要求
17至23之任一項(xiàng)的方法，其中所述氧化還原系統(tǒng)為谷胱甘肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求
17至24之任一項(xiàng)的方法，其中以1倍至10倍過(guò)量摩爾數(shù)的血紅素加到脫輔基蛋白溶液。
26.根據(jù)權(quán)利要求
17至25之任一項(xiàng)的方法，其中以4倍過(guò)量摩爾數(shù)的血紅素加到脫輔基蛋白溶液。
27.根據(jù)權(quán)利要求
17至26之任一項(xiàng)的方法，其中蛋白質(zhì)為還原蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求
17至27之任一項(xiàng)的方法，其中蛋白質(zhì)是過(guò)氧化物酶蛋白。
29.根據(jù)權(quán)利要求
17至28之任一項(xiàng)的方法，其中蛋白質(zhì)是木質(zhì)素酶蛋白，血紅素是正鐵血紅素Ⅸ。
30.根據(jù)權(quán)利要求
17至29之任一項(xiàng)的方法，其中蛋白質(zhì)是權(quán)利要求
13、14、15或16限定的木質(zhì)素酶蛋白。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求
17至30之任一項(xiàng)的方法得到的活性血紅蛋白。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求
17至30之任一項(xiàng)的方法得到的木質(zhì)素酶。
專利摘要
通過(guò)克隆編碼木質(zhì)素酶脫輔基蛋白的P.Chrysosporium的DNA順序，獲得重組木質(zhì)素酶，在適宜的宿主細(xì)胞中表達(dá)重組脫輔基蛋白，以及用血紅素重建重組木質(zhì)素酶蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/09GK87106313SQ87106313
公開(kāi)日1988年5月4日 申請(qǐng)日期1987年9月11日
發(fā)明者羅伯特·L·法雷爾, 保羅·吉利普, 阿爾吉斯·安尼里昂尼斯, 卡沙雅·賈, 瓦哈利安, 西奧多·E·梅昂, 姆斯斯·R·魯希布魯斯·A·薩多尼克, 詹尼弗·A·杰克遜 申請(qǐng)人:山道士有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan