專利名稱:在大腸桿菌內(nèi)表達的人類脫輔基脂蛋ai及其變異形式的制作方法
本發(fā)明涉及用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)人類脫輔基脂蛋白AI(apoAI)及其變異型。
動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥(即冠心病)可能是世界上最嚴重的健康問題。已發(fā)現(xiàn)大量與疾病發(fā)展相關(guān)的危險因素、其中最重要的是高血漿膽固醇(CHL)水平。因而，已對人體內(nèi)CHL代謝的研究作了大量工作。
脂蛋白運輸系統(tǒng)把握著了解基因、飲食和激素相互作用以調(diào)節(jié)人體內(nèi)血漿CHL及甘油三酯(TG)水平之機制的關(guān)鍵。血漿中脂蛋白的功能主要是將脂類由一個器官輸送到另一器官。近年已經(jīng)知道，它們不僅溶解疏水脂類，而且也可指定各不同類脂質(zhì)所釋放達到的身體部位。脂蛋白主要有四類乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。
為便于在血漿中運輸，TG和膽固醇酯(LHLE)被包裹在脂蛋白顆粒中，在其中形成一個由極性磷脂(PL)的表面單層包繞的疏水核心。表面外殼還含有相對小量的未酯化CHL以及稱為脫輔基脂蛋白(apo)的蛋白質(zhì)。已鑒定出至少九種apoAⅠ、AⅡ、AⅣ、B(48-100)、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D和E。
特別引人關(guān)注的是有關(guān)血漿脂蛋白水平與冠血病(CHD)發(fā)展的危險性之間關(guān)系的研究。HDL和LDL均為CHL和CHLH的載體，但已證明LDL-CHL水平是正危險因素(Kannel等，Ann.Intern.Med.，9085-91，1979)，而HDL則是重要的負危險因子(Yaari等，Lancet，11011-1015，1981)。雖然有關(guān)這些脂蛋白的確切功能及作用方式尚不完全明瞭，但顯然HDL可通過稱為反向CHL運輸(RCT)的機制特定地用于由外周組織中除去CHL并將其回輸?shù)礁闻K內(nèi)。
HDL的主要脫輔基脂蛋白是apoAⅠ，一些研究表明，血漿apoAⅠ水平與CHD之間反相關(guān)相似于文獻中提到的HDL-CHL水平與CHD之間的反相關(guān)(Iskikawa等，Eur.J.Clin.Invest.，8172-182，1978)。此外，HDL-CHL和apoAⅠ水平與血管造影可證明的冠狀動脈硬化損害的嚴重程度反相關(guān)(Pearson等，Amer.J.Epidem.，109285-295，1979;Maciejko等，New Eng.J.Med.，309385-389，1983)。由此可以認為，血漿中高濃度HDL影響CHD是通過延遲動脈粥樣硬化形成和/或促進已有損傷的消退得以證實的。
HDL脫輔基脂蛋白(主要是apoAⅠ)與卵磷脂的復(fù)合物在體外促進游離CHL由細胞(包括培養(yǎng)的動脈平滑肌細胞)內(nèi)流出(Stein等，Biochem.Biophys.Acta，380106-118，1975)。給帶有實驗性動脈粥樣硬化的動物靜脈內(nèi)灌注磷脂，可有利地影響這種流出過程(Adams等，J.Path.Bact.，9477-87，1968)，并使apoAⅠ/卵磷脂復(fù)合物以相似于天然HDL顆粒的速率由血漿中排除(Malmendier等，Clin.Chem.Acta，131201-210，1983)。
給飼以CHL的兔靜脈內(nèi)輸注apoAⅠ可使動脈損傷的面積減少50%。這表明apoAⅠ具有防止動脈硬化性損傷形成的作用，且可能是通過增加動脈壁對CHL的攝入達到的(Maclejko和Mao，Artheriosclerosis，2407a，1982;Mao等，F(xiàn)ed.Proc.(USA)，42，no7 pABSTRACT357，1983;Badimon等，Cardiovascular Disease186，1986ABSTRACT81)。
ApoAⅠ是HDL的主要蛋白質(zhì)，約占70%，在血漿含量較多，濃度為1.0-1.2mg/ml(Schonfield等，J.Clin.Invest.，691072，1982)。血漿apoAⅠ是有243個氨基酸的單一多肽鏈，其一級結(jié)構(gòu)是已知的(Brewer等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，80623-630，1978)。apoAⅠ的細胞內(nèi)存在形式為其267個氨基酸長的前體物;該較長的蛋白質(zhì)的前18個N末端殘基于細胞內(nèi)被粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號肽酶裂解。新切斷的apoAⅠ仍含有6個氨基酸的N末端延長部分;前體物轉(zhuǎn)化為其成熟形式是由血漿和/或淋巴特異性蛋白酶完成的(Zarmis and Breslow，in Advances in Human Genetics，Harris and Hirschhorn eds.，Plenum，125-215，1985)。
已證明apoAⅠ分子的C末端含有11或22個氨基酸的重復(fù)單元(MeLachlan，Nature，267465-466，1979);串聯(lián)排列的片段并不是嚴格重復(fù)的，但氨基酸取代一般都保留了重復(fù)序列的相應(yīng)位置中殘基的化學(xué)類型。假定這些重復(fù)片段存在于中極兩性的螺旋結(jié)構(gòu)中(Segrest等，F(xiàn)EBS Lett.，38247-253，1974)，據(jù)信這是apoAⅠ的基本生物學(xué)活性，即脂類結(jié)合和卵磷脂CHL?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)活化作用的重要結(jié)構(gòu)要求。apoAⅠ的另外兩個功能，即作為由受體識別HDL顆粒的配基，以及由外周組織中除去CHL，尚沒有與apoAⅠ分子中的特定序列或區(qū)域聯(lián)系起來。
第一個被描述的人類apoAⅠ的分子變異型是Milano(apoAⅠ-MⅠ)變異型(Franceschini等，J.Clin.Invest.，66892-900，1980)，并且是在屬于同一宗族的33個被檢對象中鑒定出來的。對于變異的脫輔基蛋白來說，它們都是雜合的，并是作為常染色體的顯性性狀遺傳的。它們顯示出可以顯著地降低HDL-CHL濃度及緩解高甘油三酯血癥，并與HDL水平負相關(guān)。可以確認的是變異型與特定病理條件之間沒有關(guān)聯(lián);其顯然可防止受影響個體的早期動脈硬化的發(fā)展(Gualandri等，Am.J.Hum.Gen.，1986，in Press)。
apoAⅠ-MⅠ分子中的氨基酸置換改變了變異型脫輔基蛋白的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致有序α螺旋結(jié)構(gòu)的還原并增加了疏水殘基的暴露(Franceschini等，J.Biol.Chem.，26016321-16325，1985)。變異型脫輔基蛋白的改型大大改變了分子的脂質(zhì)結(jié)合性質(zhì)，使之與脂類的聯(lián)系比正常apoAⅠ更為迅速。脫輔基蛋白/脂質(zhì)復(fù)合物相似于由正常apoAⅠ形成的復(fù)合物，但其更容易被變性劑破壞。在變異形式中存在半胱氨酸殘基將有助于形成apoAⅡ及apoAⅠ二聚體的復(fù)合物;而這些蛋白質(zhì)復(fù)合物則可能負責(zé)形成于“受影響的”被試個體中觀察到的異常HDL顆粒。apoAⅠ-MⅠ的所有這些性質(zhì)可有助于加速其分解代謝以及對組織脂類的有效攝取能力。
迄今已發(fā)現(xiàn)了apoAⅠ的其他幾種遺傳變異型(Brelow，Ann.Rev.Biochem.，54699-727，1985)，但一般說來，這些變異型與各種病理條件均無關(guān)聯(lián)、或不能明顯地改變攜帶者體內(nèi)的脂蛋白代謝(參見下面表1)。
已有幾個實驗室制得了ApoAⅠ cDNA克隆(Breslow，Ann.Rev.Biochem.，54699-727，1985;Sharpe等，Nucl.Acids Res.，123917-3932，1984)。mRNA長約890個堿基對(bp)并有一長35bp的5′非翻譯序列，一個有801bp(編碼267個氨基酸)的編碼序列、一個翻譯終止密碼子和一54bp的3′非翻譯序列，其后接有polyA尾部。附圖1中顯示了完整的cDNA核苷酸序列。
我們發(fā)現(xiàn)，DNA重組技術(shù)可成功地用于生產(chǎn)含apoAⅠ或其遺傳變異型的蛋白質(zhì)。變異型可以是apoAⅠ中的6-Ser被Thr取代(apoAⅠ-T6)，apoAⅠ-MⅠ或者是結(jié)合有apoAⅠ-T6及apoAⅠ-MⅠ這兩種突變的變異型(apoAⅠ-T6/MⅠ)?？墒褂每筧poAⅠ抗血清，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測這些蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可以以融合蛋白的形式產(chǎn)生，其中apoAⅠ或其遺傳變異型在其N末端與載體肽融合。
因此，本發(fā)明提供了一種能夠在轉(zhuǎn)化的宿主內(nèi)表達蛋白質(zhì)的表達載體，這種蛋白質(zhì)可使用抗人apoAⅠ抗血清經(jīng)LLISA法檢測，且具有如(1)所示的結(jié)構(gòu)通式(1)Met-X-Y (1)其中X是一個鍵，一個包含由β半乳糖苷酶N末端氨基酸殘基推衍出之序列的載體肽序列，或含有蛋白A之一個或多個IgG結(jié)合區(qū)域序列的載體肽序列，或人apoAⅠ的前導(dǎo)序列(Pro sequence);Y代表人apoAⅠ或其遺傳變異型的序列。
Met殘基可歸屬為翻譯起始密碼子。可用能在其中表達所說蛋白的、并用這樣一個表達載體轉(zhuǎn)化的宿主來制備結(jié)構(gòu)通式(1)的蛋白質(zhì)。培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的宿主并回收所產(chǎn)生出的式(1)的蛋白質(zhì)。式(1)的蛋白質(zhì)也構(gòu)成本發(fā)明的一個部分。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，涉及到A).攜帶下列蛋白基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建1-apoAⅠ(見圖1)，2-apoAⅠ-T6，3-apoAⅠ-MⅠ，4-apoAⅠ-T6/MⅠ，5-具有下列N末端延伸部分的apoAⅠThr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met-，(apoAⅠ-RP5)，6-具有下列N末端延伸部分的apoAⅠThr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met-(apoAⅠ-IP1)，7-結(jié)合有apoAⅠ-T6和apoAⅠ-RP5的蛋白質(zhì)(apoAⅠ-RP5/T6)，8-結(jié)合有apoAⅠ-T6和apoAⅠ-IP1的蛋白質(zhì)(apoAⅠ-IP1/T6)，9-結(jié)合有apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-RP5的蛋白質(zhì)(apoAⅠ-RP5/MⅠ)，10-結(jié)合有apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-IP1的蛋白質(zhì)(apoAⅠ-IP1/MⅠ)，11-結(jié)合有apoAⅠ-T6/MⅠ和apoAⅠ-RP5的蛋白質(zhì)(apoAⅠ-RP5/T6/MⅠ)，12-結(jié)合有apoAⅠ-T6/MⅠ和apoAⅠ-IP1的蛋白質(zhì)(apoAⅠ-IP1/T6/MⅠ)，以及13-具有下列N末端延伸部分的apoAⅠArg-His-Phe-Trp-Gln-Gln(ProapoAⅠ)，14-具有由葡萄球菌蛋白A提供的N末端延伸部分的、含541個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，并且從其N末端開始是由(λ噬菌體之CRO蛋白的前11個氨基酸)-(葡萄球菌蛋白A的248個氨基酸(殘基23至270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(β半乳糖苷酶的后17個氨基酸)-(含蛋白水解酶腸激酶之識別序列的17個氨基酸，即Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)-(apoAⅠ，apoAⅠ-T6，apoAⅠ-MⅠ或apoAⅠ-T6/MⅠ)所組成的;以及B)這些基因在大腸桿菌(E.Coli)菌株中的表達。通過這些基因的表達，得到下列蛋白質(zhì)-選自Met-apoAⅠ、Met-apoAⅠ-T6、Met-apoAⅠ-MⅠ以及Met-apoAⅠ-T6/MⅠ的脫輔基脂蛋白;
-其中氨基酸序列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met與選自apoAⅠ、apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ的脫輔基脂蛋白融合的融合蛋白質(zhì);
-其中氨基酸序列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met與選自apoAⅠ、apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ的脫輔基脂蛋白融合的融合蛋白質(zhì);
-脫輔基脂蛋白原ProapoAⅠ或ProapoAⅠ-MⅠ;以及-由(λ噬菌體之CRO蛋白的前11個氨基酸)-(葡萄球菌蛋白A的248個氨基酸(殘基23至270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(β半乳苷酶的后17個氨基酸)-(含有蛋白水解酶腸激酶之識別序列的17個氨基酸，即Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)-(apoAⅠ、apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ或apo-T6/MⅠ)組成的融合蛋白質(zhì)。
附圖中圖1顯示相應(yīng)于人apoAⅠ之成熟形式的完整核苷酸序列。就mRNA意義來說，該序列是以5′至3′方向顯示的;下面一行顯示氨基酸序列。
圖2顯示編碼成熟人apoAⅠ基因之5′末端的重建。將得自質(zhì)粒pAⅠ/A的DNA片段(于第一個Sau3AⅠ限制性酶切點處開始)連接到經(jīng)退火和連接單鏈前體1-4而組裝的合成的寡核苷酸連接物上。所得側(cè)接有兩個BamHⅠ限制位點的796bp片段即為編碼成熟的apoAⅠ分子的片段。
圖3涉及pLS66和pML11-20的核苷酸序列。序列顯示了刪除之前(pLS66，A)和刪除后(pML11-20，B)，pFCE4+的ATG起始密碼子與apoAⅠ基因的開始部分之間的接合。
圖4涉及pIL8-6和pIL8-Ⅰ的核苷酸序列。序列顯示在pIL8-Ⅰ(A)中存在apoAⅠ-MⅠ突變(C→T)，且pIL8-6(B)中存在apoAⅠ-T6突變(G→C)。
圖5顯示對pML11-20的免疫印跡分析(imunoblot analysis)。將由親合層析柱洗脫出的材料及標(biāo)準人HDL部分的等分樣品煮沸并以雙份在12.5%SDS-PAGE板上電泳。按正文中所述的方法吸印到硝酸纖維素濾膜上。泳道1-標(biāo)準HDL;2-來自親合層析柱的洗脫物;3-Mr標(biāo)準品。
圖6顯示對pRP5和pUC9的免疫印跡分析。離心沉淀攜帶野生型pUC9或重組pRP5質(zhì)粒(用IPTG誘導(dǎo)的)細菌培養(yǎng)物的等分樣品并重新懸浮于適當(dāng)緩沖液內(nèi)，與標(biāo)準人HDL部分平行進行凝膠電泳分離;將樣品加熱煮沸后加于12.5%SDS-PAGE板上電泳。按文中所述的方法吸印到硝酸纖維素薄膜上。泳道1-Mr標(biāo)準品;2-標(biāo)準HDL;3-pUC9;4-pRP5。
圖7顯示質(zhì)粒pLM8的構(gòu)建，其中矩形方框指示如下PROTA、AMP、LACZ和APOAⅠ分別為編碼蛋白A、β-內(nèi)酰胺酶、β半乳糖苷酶和人類成熟apoAⅠ的基因;CRO編碼λCro蛋白前11個氨基酸的序列;T蛋白A轉(zhuǎn)錄終止序列;F1噬菌體f1包裝序列;ORI復(fù)制原點;EK.AD由腸激酶識別的蛋白水解位點序列。質(zhì)粒pLMs中的EcoRⅠ和ClaⅠ位點并不是唯一的。
圖8顯示5′proapoAⅠ序列的重建。
圖9顯示能表達ProapoAⅠ之載體pFC33的構(gòu)建。
圖10顯示由pFC33表達的ProapoAⅠ的凝膠電泳及免疫印跡分析結(jié)果。泳道1HDL標(biāo)準品;泳道2未重組的菌株;泳道3proapoAⅠ;泳道4分子量標(biāo)準品。
根據(jù)本發(fā)明的表達載體為能夠表達DNA序列、特別是表達載體所含之結(jié)構(gòu)基因序列的載體。被表達的DNA序列是“在讀碼中”的、并與控制其表達的上游序列相關(guān)聯(lián)。任何可利用的適當(dāng)啟動子系統(tǒng)，均要考慮到被表達的蛋白質(zhì)及宿主的性質(zhì)等。為此，可使用選自Pl、lac、tac和trp的某種啟動子。在所提供的例子中，51調(diào)節(jié)序列是與欲被表達的apoAⅠ或其遺傳突變型異源的。調(diào)節(jié)序列可以是lac或trp操縱子序列。換句話說，本發(fā)明的表達載體能表達某一異源蛋白質(zhì)，其中所說的異源蛋白是apoAⅠ或其遺傳突變型。優(yōu)選的遺傳突變型是apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ。
本發(fā)明的含編碼式(1)蛋白質(zhì)之DNA序列的表達載體均為典型的質(zhì)粒。它們可以是單股鏈的。每個載體都是可復(fù)制的，有其復(fù)制原點。在表達apoAⅠ或其遺傳突變型時，優(yōu)選的表達載體是自質(zhì)粒pECE4+衍生的;而表達融合蛋白質(zhì)時，優(yōu)選的表達載體是pUC8或pUC9衍生的，其中融合蛋白的載體序列含有自β半乳糖苷酶之N末端氨基酸殘基得到的序列;使用pLM3時，載體序列含有蛋白A的一個或多個IgG結(jié)合區(qū);而表達ProapoAⅠ或其遺傳突變型時則優(yōu)選pDS20。
為表達含apoAⅠ或其遺傳突變型的蛋白質(zhì)，可用依據(jù)于本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?。可使用細菌、酵母或哺乳動物細胞系等原核或真核宿主。典型的宿主是大腸桿菌菌株。應(yīng)選擇那些預(yù)期得到的蛋白質(zhì)不能被細胞蛋白酶降解的宿主。因此，一般來說，可按下述方法制得含apoAⅠ或其遺傳突變型的蛋白質(zhì)
1.選擇已克隆的apoAⅠ cDNA。
2.修剪cDNA，從而為apoAⅠ基因兩端提供限制性酶切點，使之變得更易于被除去。這樣便可能導(dǎo)致編碼信號肽及前體肽之序列的刪除。
3.將apoAⅠ基因以正確讀碼方向插入表達載體中。可引入突變T6和/或MⅠ。在操縱子中apoAⅠ基因或變異基因可以是唯一的結(jié)構(gòu)基因。另外，當(dāng)期望表達作為融合蛋白的apoAⅠ或其遺傳變異型時，可提供在其5′末端連接有編碼載體肽之DNA序列的基因。
4.用表達載體轉(zhuǎn)化能使apoAⅠ或其遺傳變異型得以在其中表達的宿主。
5.培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了的宿主并回收所得的預(yù)期蛋白質(zhì)。
如此可獲得沒有一個或多個內(nèi)含子的、編碼apoAⅠ或其遺傳變異型的基因，該基因可被插入到處于載體中啟動子之轉(zhuǎn)錄控制下的讀碼框內(nèi)?？稍诰幋a載體肽序列的DNA序列之后直接插入基因。因此，就啟動子來說，可在載體內(nèi)讀碼的翻譯起始和終止密碼子之間提供編碼式(1)之蛋白質(zhì)的DNA序列。相似地，亦可將編碼proapoAⅠ或其遺傳變異型的基因插入載體內(nèi)。用所得表達載體轉(zhuǎn)化宿主培養(yǎng)物，即導(dǎo)致所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
可以自β半乳糖苷酶的N末端氨基酸殘基得到融合蛋白質(zhì)的載體肽部分。例如，可自β半乳糖苷酶的前15個N末端氨基酸序列得到。較好是殘基5至15，更好是殘基8至12。以這種方式制得的優(yōu)選載體肽包括序列Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met或Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met。
當(dāng)表達摻入了這類載體肽的融合蛋白時，這些蛋白都是以Met開始的。這種情況適用于包括一個或多個蛋白A之IgG結(jié)合區(qū)的其他載體肽。包括蛋白水解酶如腸激酶、因子X或膠原酶之識別部位的氨基酸序列，可直接加在apoAⅠ或其變異型之氨基酸序列的前面。適宜的序列是Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met。
這就是腸激酶的識別序列。在載體序列中亦可存在其他氨基酸。例如在蛋白A序列和蛋白水解酶識別部位之間可以有多達30個殘基的連接序列。載體序列的N末端部分可包括天然受表達載體內(nèi)啟動子控制的結(jié)構(gòu)基因的第一部分殘基，如多達20個殘基。包括蛋白A之IgG結(jié)合區(qū)的融合蛋白是水溶性的，故可以認為在水溶液環(huán)境中是穩(wěn)定的，并容易通過親合層析如在IgG偶聯(lián)的Sepharose柱上純化成均一的蛋白質(zhì)。
無論載體肽可提供有或沒有N末端延伸部分，式(1)的重組體蛋白都基本上沒有人類來源的其他蛋白質(zhì)。換句話說，所提供的蛋白質(zhì)基本上是純的，不伴有通常與之相關(guān)聯(lián)的其他蛋白質(zhì)。
可將包含apoAⅠ或其遺傳變異型的蛋白質(zhì)用于治療人或動物機體的病變。特別是可用于降低血漿膽固醇和/或甘油三酯水平，進而可用于治療動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病?？梢詾轭A(yù)防或改善/治療已有病理狀態(tài)之目的給予該蛋白質(zhì)。
因此根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白質(zhì)還可作為含有醫(yī)藥活性載體或稀釋劑的醫(yī)藥組合物被提供。這樣的組合物可以按已知方法配制。該蛋白質(zhì)可通過胃腸道外如靜脈內(nèi)注射途徑給藥。
下列實施例旨在進一步闡明本發(fā)明。
實施例1材料和方法菌株和培養(yǎng)基菌株大腸桿菌K12JM101(Messing等，Nature，314309-321，1981)、MC1061(Casadaban和Cohen，J.Mol.Biol.，138179-207，1980)、71/18c1857(Lorenzetti等，Gene，3985-87，1985)、RL841(Kenkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492，1985)、CAG629(rpoH165、10n-;C.A.Gross，Madison，Wisconsin)。
培養(yǎng)基當(dāng)需要時所有菌株均生長在添有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基)中。適當(dāng)情況下，可向培養(yǎng)基內(nèi)加入1mMIPTG以抑制lac啟動子。
酶、酶促反應(yīng)及DNA純化Sigma公司(St.Louis，MO，USA)生產(chǎn)的溶菌酶。Boehringer公司(Mannheim，DE)、BRL有限公司(Gaitheshurg，MD，USA)或New England Biolabs公司(Beverly，MA，USA)生產(chǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶;T4連接酶及所有其他酶均得自Boehringer公司。除特別指出者外，所有酶促反應(yīng)都是按照廠商的產(chǎn)品說明書所述方法完成的。在瓊脂糖水平凝膠板或聚丙烯酰胺垂直凝膠板上分離用限制性核酸內(nèi)切酶消化所得到的DNA片段，以改良的電洗脫方法，使用ISCO1750型濃縮器(ISCO公司，Lincoln，NE，USA)由凝膠基質(zhì)中提取并在Elutip-d柱(Schleicher and Schuell，Keene，NH，USA)上進一步純化。
對細菌提取中的apoAⅠ進行識別的酶免疫測定(ELISA)將離心收集的細胞重新懸浮于溶胞緩沖液(50mM Tris-Cl PH7.0，30mM NaCl、0.1%NaN3、10mg/L苯甲基磺酰氟)中。制成含1mg/ml溶菌酶的溶液并于4℃攪拌30分鐘。經(jīng)5次反復(fù)凍融后，按下述方法對提取物作酶免疫檢測。用在單體內(nèi)產(chǎn)生的抗人apoAⅠ抗血清(Boehringer，Mannheim、DE)的適當(dāng)稀釋液包被標(biāo)準的96孔微量滴定板，于4℃過夜。用含有0.05%Tween-20和0.01%硫柳汞的10mM Tris-Cl(pH8.0)洗3次后，加入50μl apoAⅠ標(biāo)準品(TAGO公司，Burlingame，CA，USA)的連續(xù)稀釋液，并于37℃保溫1小時。用同一緩沖液洗3次后，加入50μl經(jīng)硫酸銨沉淀而進一步純化的兔抗人apoAⅠ抗血清的適當(dāng)稀釋液(Immuno有限公司，Dunton Green，Nr.Sevenoaks.Kent，GB)。于37℃作用1小時并洗3次以上之后，用New England Nuclear公司(Boston，MA，USA)提供的蛋白A-辣根過氧化物酶藥盒，按制造商所述的方法對各小井染色。
羊抗人apoAⅠ與Affigel 10的偶聯(lián)羊抗apoAⅠ抗體(Boehringer，Manneheim，DE)的制備20ml未稀釋的抗體溶液于4℃對0.1M磷酸鹽緩沖液(PH7)透析過夜，同時攪拌;然后離心使所有碎片與上清分離。
Affigel 10(Bio-Rad公司，Richmond，CA)的制備取40ml凝膠于室溫下平衡，然后用半倍體積異丙醇再用兩倍體積雙蒸水反復(fù)洗滌(4-5次);過濾干燥凝膠并轉(zhuǎn)入50ml加有已經(jīng)透析之抗體的falcon試管中。攪拌下將試管于4℃保溫8小時并加入1ml濃度為1M的甘氨酸乙酯;繼續(xù)保溫過夜。然后用下列溶液反復(fù)洗滌凝膠-100ml PBS+0.1%疊氮鈉;
-100ml 1M乙酸;
-100ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(PH7)+0.5M NaCl;
-100ml PBS+0.1%疊氮鈉;
裝柱并用裝填緩沖液(loading buffer，PBS+10mg/l PMSF+10mg/L Pepstatin A)平衡。
免疫印跡分析使用Laemmli方法跑聚丙烯酰胺板電泳(以適當(dāng)濃度)分離樣品。然后使用印跡轉(zhuǎn)移裝置(tranblot apparatus，Rio-Rad)，以0.2mA電流，在25mMTris堿、192mM甘氨酸、20%甲醇中，4℃處理4小時，將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。用雙蒸水洗濾膜后再于輕輕搖動下加PBS+3%BSA一起保溫1小時。再次用雙蒸水洗濾膜并與已用PBS作1∶250稀釋的第一抗體(與用于ELISA法中的第二抗體相同)一起于室溫下保溫1小時。用PBS和PBS+0.05%Tween20洗兩次后，將濾膜與1∶7500稀釋的第二抗體(在羊體內(nèi)產(chǎn)生的抗兔IgG并已與辣根過氧化物酶結(jié)合;Bio-Rad)在室溫下保溫1小時。將濾膜洗兩次以上，然后用4-氯-1-萘酚染色。
結(jié)果apoAⅠ基因的51末端重建由具有信號肽、肽原(Propeptide)和完整成熟apoAⅠ蛋白之編碼序列的人肝cDNA文庫(Sharpe等，Nucl.Acids Res.，123917-3932)中得到編碼apoAⅠ的全長cDNA克隆(pAⅠ/A)。我們重新構(gòu)建了基因的51末端在于除去成熟apoAⅠ第一個密碼子上游的所有序列。為此目的，用EcoRI和BamHI酶切質(zhì)粒PAⅠ/A，分離含有cDNA插入片段的890bp片段并由1%瓊脂糖凝膠中回收之。于部分消化條件下，用San3AⅠ酶限制性切斷該片段，并將混合物與磷酸化的合成連接物連接以制得適于在大腸桿菌中表達之密碼子的最佳化序列，所設(shè)計的連接物旨在重新構(gòu)建編碼成熟蛋白前9個氨基酸的序列。連接物制備方法如下用磷酸三酯法(Crea和Horn，Nucl.Acids Res.，82231-2348，1980)合成四個寡聚核苷酸1.51-GATCCATGGACGAGCC-312.51-ACCGCAGAGTCCATGG-313.51-CGGTGGCTCGTCCATG-314.51-GATCCCATGGACTCTG-31將所有四種寡核苷酸以等摩爾量連接在一起，用Sau3AⅠ處理連接混合物，由聚丙烯酰胺凝膠上洗脫并純化連接物。所得連接物的序列在圖2中示出。
用BamHI消化含有純化的接接物及部分Sau3AⅠ酶切之a(chǎn)poAⅠ片段的連接混合物。由聚丙烯酰胺凝膠中純化得到一790bp片段，并連接到用小牛腸磷酸酶處理過的BamHⅠ酶切的pAT153-pvuⅡ8上。轉(zhuǎn)化MC1061后，與作為探針的磷酸化寡核苷酸3雜交以篩選重組體。分離陽性菌落，并通過限制性酶切及依照Maxam和Gilbert方法(Methods Enzymol.，65499-560，1980)經(jīng)部分化學(xué)降解來分析其序列以進一步定性。將在正確方向上位定連接物的質(zhì)粒定名為PAⅠ/12。
如此重建的基因的51末端，其前面是以ATG起始密碼子及BamHⅠ粘性端開始的。使用這一方案，即可將編碼成熟apoAⅠ的序列移到在Shine-Dalgarno序列之后攜帶有BamHⅠ位點的任何表達載體上。
使用pFCE4+構(gòu)建重組載體純化含有修變之a(chǎn)poAⅠ基因的BamHⅠ片段并再克隆到pFCE4+(Lorenzetti等，1985)的BamHⅠ位點上。用雙脫氧鏈終止法作序列分析以證實所得構(gòu)建物中的插入片段具有正確定向。該質(zhì)粒被定名為pLS66。
使用這一方案，就已存在于載體中的ATG起始密碼子來說，apoAⅠ是被插入到讀碼之外的。因此，下一步就是通過將apoAⅠ基因直接定位于該ATG密碼子之后來重建讀碼框。
讀碼框內(nèi)定位(in-frame positioning)可利用pFCE4系統(tǒng)，使用寡核苷酸“橋”完成已克隆基因的讀碼框內(nèi)定位，這些寡核苷酸“橋”具有互補于堿基伸長部分的序列，而該伸長部分在一側(cè)接有將被缺失(刪除)的區(qū)域(Sollazzo等，Gene，37199-206，1985)。
為此，可使用磷酸三酯法合成具有下列序列的單股寡核苷酸
51-CTTACATATGGACGAGCC-31應(yīng)使該寡核苷酸以其51端退火接到載體的ATG前面或包括ATG的區(qū)域(核苷酸1至10)內(nèi)，并使其31端退火接到apoAⅠ基因的前8個核苷酸上，從而將存在于pLS66中的8個多余的核苷酸圈出(見圖2)。按已述方法(Kunkel，Proc.Natl.Acad。Sci.USA，82488-492，1985)，使用大腸桿菌RL841作宿主制備pLS66的ssDNA。該細菌菌株是含有質(zhì)粒pCⅠ857(M.Zabeau)之大腸桿菌RZ1032的衍生物，其可產(chǎn)生存在于pFCE4中之PL啟動子的溫度敏感性阻遏物。
使用這種方法，由該菌株所產(chǎn)生的ssDNA含有幾個尿嘧啶殘基以代替胸腺嘧啶，故可“在體外”起到正常功能模板作用，但在轉(zhuǎn)移到野生型(Ung+)大腸桿菌71/18cⅠ857菌株(其為這些質(zhì)粒的正常宿主)內(nèi)之后則是無生物學(xué)活性的。
使0.1pMpLS66ssDNA與2pM激酶誘變的寡核苷酸(20倍過量的)在15mM Tris-Cl(PH8.5)和15mMMgCl2中于56℃退火30分鐘。冷卻至室溫后加入延伸-連接混合物并于15℃反應(yīng)過夜。延伸反應(yīng)混合物(終濃度)10mM Tris-Cl(PH8.5);10mM MgCl2;0.5mM ATP;0.05mM dNTPs;5mM DTT;1單位DNA聚合酶(Klenow片段)和1.5單位T4DNA連接酶。
保溫后用酚提取反應(yīng)混合物，并用異丙醇和乙醇沉淀;轉(zhuǎn)化71/18cⅠ1857反應(yīng)潛能細胞并鋪敷在選擇培養(yǎng)基(LA)上。為了鑒定含有預(yù)期之缺失的克隆，選出150個菌落，使之生長在有序平板上并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。于室溫下，在6×SSC和10×Denhardt氏液中使用誘變的寡核苷酸作探針完成雜交。然后在6×SSC和0.1%SDS中于兩不同溫度下洗濾膜首先于室溫下洗，然后于50℃即理論上的熔點以下4℃洗，以檢查雜交效率。對此可按下列公式計算Tm＝4×GC+2×AT，其中GC和AT是寡核苷酸與誘變的模板所形成的配對數(shù)目(Norrander等，Gene，26101-106，1983)。每次洗滌之后均使濾膜與X射線敏感的膠片接觸曝光。經(jīng)雙脫氧鏈終止序列分析法進一步確定在嚴格溫度下也產(chǎn)生陽性信號的待選突變菌落(圖3B)。該方法的效率相當(dāng)高，約為50%。將其中apoAⅠ基因已正確定位于讀碼框中的pFCE4+定名為pML11-20。
apoAⅠ變異型T6和MⅠ的構(gòu)建將pLS66和pML11-20用作構(gòu)建兩變異型apoAⅠ-T6和apoAⅠ-MⅠ的模板。我們決定使用這兩個模板同時獲得正確定位于讀碼框和一可易位BamHⅠ片段中的變異基因。
為此目的，用常規(guī)方法合成了兩個單一寡核苷酸1.用于T6突變的51-CACCGCAGACTCCATGG-31;
2.用于MⅠ突變的51-GCGCCAGTGCTTGGC-31;
以數(shù)字1指示成熟apoAⅠ之第一個密碼子的第一個核苷酸，寡核苷酸1應(yīng)自殘基8至24退火，在位置17上有一誤配(G→C)。寡核苷酸2應(yīng)自殘基510至524退火，在位置517上有一誤配(C→T)。
使用前述讀碼框定位中所用的同樣方法完成誘變實驗(圖4A和B)。為得到雙突變型，我們首先獲得了T6突變，然后加進MⅠ突變。
所得質(zhì)粒分別定名為pIL5-6＝兩個BamHⅠ位點之間的apoAⅠ-T6;
pIL5-Ⅰ＝兩個BamHⅠ位點之間的apoAⅠ-MⅠ;
pIL5-6Ⅰ＝兩個BamHⅠ位點之間的apoAⅠ-T6/MⅠ;
pIL8-6＝讀碼框中的apoAⅠ-T6;
pIL8-Ⅰ＝讀碼框中的apoAⅠ-MⅠ;
pIL8-6Ⅰ＝讀碼框中的apoAⅠ-T6/MⅠ。
變異型apoAⅠ-RP5和IP1的構(gòu)建經(jīng)用BamHⅠ消化，由質(zhì)粒pLS66、pILS-6、pIL5-Ⅰ和pIL5-6Ⅰ上切下含有apoAⅠ基因及其變異型T6及MⅠ的DNA片段并按前述方法在1%瓊脂糖凝膠上電泳純化。然后將片段連接到已用BamHⅠ酶切成線形的pUC8和pUC9(Vieira和Messing，Gene，19259-268，1982)上。轉(zhuǎn)化JM101反應(yīng)潛能細胞后，用迅速分裂方法鑒定重組質(zhì)粒并經(jīng)用BamHⅠ切斷分離物來進一步確證。經(jīng)用HindⅢ及XhoⅠ切斷來區(qū)別插入片段的兩個相反定向。
用pUC8構(gòu)建便可以使apoAⅠ基因處在了讀碼框內(nèi)，從而序列前面直接連有蛋氨酸殘基及來自細菌β半乳糖苷酶基因之α肽的前9個氨基酸。這便導(dǎo)致apoAⅠ分子的N末端上有-β半乳糖苷酶的10氨基酸延伸部分。
對所有含有正確定向之a(chǎn)poAⅠ基因的重組體pUC9衍生物，均須進一步操作以使apoAⅠ基因處于讀碼框內(nèi)。首先在ATG翻譯起始密碼子與apoAⅠ基因之間用限制性內(nèi)切酶HindⅢ及SalⅠ切斷。用DNA聚合酶(Klenrw片段)填入經(jīng)切斷后所形成的粘性末端，然后用T4DNA連接酶連接。這樣便導(dǎo)致pUC9的多個克隆位點處(apoAⅠ基因的前面)有10個核苷酸的缺失，從而再建正確的讀碼。
這些重組質(zhì)粒被定名為a)pUC8系列pIPⅠ＝有apoAⅠ-IPⅠpIPⅠ-6＝有apoAⅠ-IPⅠ/T6pIPⅠ-Ⅰ＝有apoAⅠ-IPⅠ/MⅠpIPⅠ-6Ⅰ＝有apoAⅠ-IPⅠ/T6/MⅠb)pUC9系列pRP5＝有apoAⅠ-RP5pRP5-6＝有apoAⅠ-RP5/T6pRP5-Ⅰ＝有apoAⅠ-RP5/MⅠpRP5-6Ⅰ＝有apoAⅠ-RP5/T6/MⅠ可獲得擴展了的變異型的理由在于，由于存在細菌β半乳糖苷酶的N末端-天然出現(xiàn)于質(zhì)粒中調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)部分之后的序列，從而提高了表達水平。
在大腸桿菌中的表達1)將所有重組體pFCE4衍生物轉(zhuǎn)化到攜帶質(zhì)粒pCⅠ856的細菌宿主CAG629中(已在“讀碼框定位”一節(jié)中述及)。
用LA將32℃生長過夜的培養(yǎng)物稀釋到1∶10，并在振蕩培養(yǎng)瓶內(nèi)生長直到OD650為0.5-0.6，然后將溫度改變?yōu)?2℃，繼續(xù)培養(yǎng)1～2小時。保溫后在冰上將細胞冷卻10分鐘并經(jīng)離心得到細胞沉淀餅。按“ELISA”一節(jié)中所述方法處理細胞沉淀餅以破碎細胞。以16，000rpm將細胞提取物于4℃離心30分鐘并將上清加到“材料與方法”中所述的親合柱上。充分洗滌后用1M乙酸洗脫滯留的蛋白質(zhì)，用免疫印跡分析法(圖5)和“ELISA”法檢測洗脫部分，初步結(jié)果表明使用pML11-20時，平均每升培養(yǎng)物約得到0.2mg apoAⅠ。
用攜帶突變apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ的所有其他構(gòu)建物則得到相似的結(jié)果。
2)在細菌宿主MC1061中轉(zhuǎn)化所有重組的pUC8/9衍生物。
以1∶100的比例用LA稀釋于37℃生長過夜的培養(yǎng)物，并在加入1mM IPTG之前使之在振蕩培養(yǎng)瓶中生長1小時，然后繼續(xù)保溫4-6小時。保溫時間過后將細胞在冰上冷卻10分鐘并離心得到細胞沉淀餅。從這一步驟以后，各步提取均與所述對PFCE4衍生物的提取方法相同。用免疫印跡分析法(圖6)和“ELISA”法檢測含有pIPⅠ和pRP5的細胞粗提物;初步結(jié)果為每升培養(yǎng)物得到平均約10mgapoAⅠ。
用攜帶與apoAⅠ-RP5及apoAⅠ-IP1結(jié)合的apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ等突變的所有其他構(gòu)建物亦獲得了相似的結(jié)果。
實施例2使用載體pRIT2T(Pharmacia，Sweden)-其中一攜帶apoAⅠ基因的949bp片段被插入到該載體的SmaⅠ位點-構(gòu)建其他變異型。由該質(zhì)粒表達的蛋白質(zhì)包含541個氨基酸。由N末端起，有λ噬菌體之CRO蛋白的前11個氨基酸，之后是葡萄球菌蛋白A序列的248個氨基酸(由殘基23至270)，由于與大腸桿菌β半乳糖苷酶的后17個氨基酸鄰接而出現(xiàn)的5個異常氨基酸(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)以及含有蛋白水解酶腸激酶之識別序列的17個氨基酸(Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)，其直接連在成熟人apoAⅠ(定名為CPA-AⅠ)或其變異型apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ、apoAⅠ-T6/MⅠ之序列的前面。這些嵌合蛋白很穩(wěn)定并可溶于含水溶液中。
已研究了CPA-AⅠ與培養(yǎng)的大鼠肝細胞及小鼠巨噬細胞的相互作用。125Ⅰ標(biāo)記的CPA-AⅠ與培養(yǎng)的細胞于4℃保溫，結(jié)果表明雜交蛋白結(jié)合于細胞表面具有相似于HDL的結(jié)合參數(shù)。雜交蛋白于37℃被細胞攝入并顯示出是被內(nèi)在化了的。當(dāng)與脂質(zhì)結(jié)合形成HDL顆粒時，這一行為相似于天然apoAⅠ的行動。
材料與方法材料通過不連續(xù)KBr梯度由人血漿中制備HDL(1.09＜d＜1.21g/ml)。將HDL對PBS、1mMEDTA廣泛透析，以除去KBr并儲存于4℃。按照Klausner等人的方法(J.Biol.Chem.258，4715-4724，1983)用鐵飽和人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma，A7638)。Pharmacia公司生產(chǎn)的金黃色葡萄球菌蛋白A。Gibco公司生產(chǎn)的含酚紅的Hanks氏平衡鹽溶液。
細胞及細胞培養(yǎng)物由Deschatrette和Weiss建立并定性的一種大鼠肝癌細胞系，即Fao細胞(Biochemie56，1603-1611，1974)，以單層培養(yǎng)在Conn氏改良的、添加有5%胎牛血清(FCS)、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mM谷氨酰胺和10mM HEPES緩沖液(PH7.4)的Ham氏F12培養(yǎng)基(Seromed)中。J774細胞-一種小鼠巨噬細胞系(Ralph等，J.Immunology114，898-905，1975)以旋轉(zhuǎn)懸浮培養(yǎng)方式及下述濃度被保存在含有4.5%FCS、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺和HEPES緩沖液(PH7.4)的D-MEM培養(yǎng)基中。
細菌菌株和質(zhì)粒所用細菌宿主為大腸桿菌菌株HB101(Boyer和Roulland-Dussoix，J.Mol.Biol.41459-472，1969)和RR1M15(Langley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，1254-1257，1975)。所用質(zhì)粒是pNF2690(Nilsson等，Atti Convegno congiunto A.G.I.-S.I.B.B.M.，195-196，1985)和購自Pharmacia公司(Sweden)的pRIT2T。
DNA構(gòu)建限制性內(nèi)切酶、Klenow DNA聚合酶及T4DNA連接酶購自Boehringer Mannheim公司并按制造商提供的說明書使用。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化是按Morrison的方法(Mettods Enzymol.68326-331，1979)完成的。
雜交基因的表達雜交基因在λ噬菌體PR啟動子控制下，基本上是依照Zabeau和Stanley(EMBO J.1，1217-1224，1982)所述方法表達的。使細菌于30℃生長到OD600＝0.9。加入于54℃預(yù)加熱的等體積培養(yǎng)液使培養(yǎng)物溫度迅速上升至42℃。收獲細胞前于42℃將培養(yǎng)物保溫90分鐘。按Zabeau和Stanley所述方法(1982)將整個細胞溶胞產(chǎn)物加于凝膠上。
雜交蛋白的純化依照Marston等人(Biotechnology2，800-804，1984)的方法純化雜交蛋白。將細菌沉淀餅重新懸浮于3倍體積(W/V)緩沖液A(50mM Tris/Hcl(PH8.0)、50mM NaCl、1mM EDTA)中并于冰上超聲處理5×20秒鐘。離心(在Sorvall SS34轉(zhuǎn)子，4℃，10，000rpm、10分鐘)后，將細胞沉淀物重新懸浮于9倍體積(W/V)含0.5%Triton X-100、10mM EDTA的緩沖液A中并于室溫下放置5分鐘。按上述方法離心懸液并將沉淀餅重新懸浮于9倍體積(W/V)含8M尿素的緩沖液A中，然后于室溫下保溫1小時。
將尿素懸液加于9倍體積(V/V)含50mM磷酸鉀緩沖液(PH10.7)、50mM NaCl、1mM EDTA的溶液內(nèi)并于室溫下攪拌30分鐘，同時加入KOH以使PH保持在10.7。然后中和懸液并于4℃對緩沖液A透析。按上述方法離心經(jīng)過透析的懸液;此時在清澈的上清中的雜交蛋白已相當(dāng)純，這一步驟中所得雜交蛋白的平均產(chǎn)率為每升細菌培養(yǎng)物50-60mg。進一步的純化是在IgG-Sepharose 6FF柱(Pharmacia)上經(jīng)親合層析達到的。樣品上柱后用含有0.05%Tween20的PBS、PBS和5mM AcoNH4(PH5)洗，并用1M AcOH/AcONH4(PH2.8)洗脫。然后將純化的蛋白質(zhì)對緩沖液A透析。
使用Biogel 1.5A凝膠過濾柱進行校準在50mM Tris/HCl(PH8.0)、50mM NaCl、1mM EDTA中平衡由BioRad公司生產(chǎn)的Biogel1.5A柱(40cm×1cm)。以3ml/小時的流速洗脫樣品并收集之(每管250μl)。用葡聚糖蘭(dextran blue，2，000KD)、甲狀腺球蛋白(699KD)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(440KD)、HDL(285KD)和醛縮酶(158KD)校準層析柱。使用1.25μg〔125Ⅰ〕-CPA-AⅠ或800μg未標(biāo)記的CPA-AⅠ測定雜交蛋白的Mr。
蛋白質(zhì)的碘化處理使用Iodo-Gen試劑(Pierce Chemical公司)碘化蛋白質(zhì)。碘化反應(yīng)混合物含有100μg Iodo-Gen、1mg蛋白(在200μl PBS中)和lmCi無載體Na〔125Ⅰ〕(16.5mCi/μg)(AmershamInternational公司)。于4℃作用10分鐘后，在10ml Sephadex G50柱上從蛋白中分離出游離碘。用PBS(0.2%BSA)由柱上洗脫HDL、轉(zhuǎn)鐵蛋白和IgG，并用50mM Tris/HCl(PH8.0)、0.15M NaCl、1mM EDTA、0.2%BSA洗脫雜交蛋白。雜交蛋白、IgG和轉(zhuǎn)鐵蛋白未經(jīng)透析即可使用。必須使HDL對PBS、0.5mM EDTA充分透析，直到少于5%的標(biāo)記物可溶于10%(W/V)三氯乙酸中。用氯仿/甲醇進行脂類提取后，測知有不到5%的標(biāo)記物與脂類相聯(lián)結(jié)。所得比活性為200-400cpm/ng蛋白質(zhì)。
結(jié)合試驗對懸浮細胞的結(jié)合試驗于4℃進行兩小時。為得到Fao細胞的懸液，于37℃將單層細胞在PBS、1mM EDTA中保溫30分鐘。然后通過將懸液以1000g×5分鐘(4℃)離心沉淀細胞并重新懸浮于3ml Hanks氏液/BSA中的方法，將這些細胞或生長有J774巨噬細胞的懸液洗三次。每份結(jié)合試驗混合物含有1×106細胞(在1ml Hanks/BSA中)及所指出量的〔125Ⅰ〕-apoAⅠ-Ⅰ-PA或〔125Ⅰ〕-HDL。于4℃作用2小時后，用Hanks氏液/BSA將細胞洗四次，移入Eppendorf管內(nèi)并用r計數(shù)儀計數(shù)放射活性。為進行比較實驗，將10μg碘化的配體各用10-800μg未標(biāo)記的HDL、CPA-AⅠ、蛋白A或轉(zhuǎn)鐵蛋白與之竟?fàn)?，其中每種竟?fàn)幬锞诩尤氲饣潴w之前30分鐘于4℃加到細胞內(nèi)。
HDL和CPA-AⅠ的配體吸印(Ligand blot)用PBS洗J774細胞(2×108個)兩次并在10mM Tris/HCl(pH7.4)、0.1mM EDTA中制成勻漿。以2000g離心10分鐘以制備去核后上清(PNS)。用1%(V/V)Triton X-114(Bordier，J.Biol.Chem.256，1604-1607，1981)提取PNS。將去污劑相與等體積含二硫蘇糖醇的樣品緩沖液混合，加熱至沸，然后用碘乙酰胺使之烷基化。以每泳道約1mg蛋白將其加到5-15%SDS聚丙烯酰胺凝膠上。將湊膠吸印到硝酸纖維素薄膜上并經(jīng)Ponceau S染色以顯現(xiàn)電泳帶。將硝酸纖維素條在含有10%(W/V)低脂乳粉的Hanks氏液中浸漬6小時。使配體〔125Ⅰ〕-CPA-AⅠ或〔125Ⅰ〕-HDL以12.5μg/ml在Hanks氏液/乳液中結(jié)合16小時。用Hanks氏液/乳液將硝酸纖維素條洗4次并用抗人HDL、抗CPA-AⅠ或抗蛋白A(1/50血清稀釋)兔抗血清檢測配體，洗滌，并于抗兔IgG過氧化物酶存在下保溫，結(jié)果表明具有二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)(Burnette，Anal。Biochem.112，195-203，1981)。然后使干燥后的印跡對X射線膠片曝光。
分析方法按Frank和Trosin所述的(H.Tschesce(editor)Modern Methods in Protein Chemistry，Walter de Gruyter & Co.，Berlin，287-302，1985)用依據(jù)Lottspeich(Hoppe Seylers Z.Physiol.Cem.361，1829-1834，1980)設(shè)計的氣一液相微量序列分析儀，經(jīng)自動Edman降解法測定氨基末端序列。依據(jù)Tadros等人(Eur.J.Biochem.138，209-212，1983)的方法，使用羧肽酶ε，A和/或B測定雜交蛋白的羧基末端序列。為進行氨基酸分析，按Tadros等人(Eur.J.Biochem.127，315-318，1982)的方法水解蛋白質(zhì)，并使用自動氨基酸分析儀(Durrum D-500)測定氨基酸組成。未檢測色氨酸和半胱氨基。
為進行顯微鏡觀察，用2%磷鎢酸對HDL和CPA-AⅠ的樣品作負性染色。依照Bradford的方法(Anal.Biochem。72，248-254，1976)測定蛋白質(zhì)濃度。
結(jié)果攜帶編碼雜交蛋白CPA-AⅠ之基因的質(zhì)粒pLM8的構(gòu)建載體pRIT2T是pRIT2的衍生物(Nilsson等，1985)，它是為了在大腸桿菌內(nèi)完成細胞內(nèi)雜交蛋白的溫度誘導(dǎo)的表達而設(shè)計的。該構(gòu)建物含有處于λPR啟動子控制下的葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)域。多克隆位點有利于外來基因在蛋白A的31端插入。蛋白A轉(zhuǎn)錄終止序列被直接插入到多克隆位點的下游。質(zhì)粒pLM3含有在讀碼框中與人apoAⅠ的成熟基因融合的大腸桿菌lacZ基因(Monaco等，1985)。
按圖7中所述的路線構(gòu)建攜帶有PA與apoAⅠ之間融合的質(zhì)粒pLM8。由pLM3分離側(cè)接有限制性位點EcoRⅠ及ClaⅠ的949bp片段并用Klenow DNA聚合酶填充兩突出端。將該片段連接到用SmaⅠ切成線形的pRIT2T上。所得質(zhì)粒PLM8攜帶一編碼含541個氨基酸之融合蛋白的開放讀碼，其由51端上蛋白A的基因及31端上成熟的人apoAⅠ基因所組成，由其編碼的融合蛋白可根據(jù)對蛋白水解作用特異的序列分離開。
雜交蛋白的表達、分離和純化在pNF2690-一個編碼溫度敏感性Cl857λ阻遏物突變型的相容性質(zhì)粒的存在下，攜帶pLM8的大腸桿菌細胞能夠大量地表達雜交蛋白。當(dāng)生長于42℃時，被誘導(dǎo)的CPA-AⅠ的量約為總量的20%。雜交蛋白的表現(xiàn)Mr，如所預(yù)計的，經(jīng)SDS-PAGE法測定為62KD。所提供的標(biāo)準提取方法(超聲處理、凍融、溶菌酶-Triton X-100處理)都是不成功的。已采納了一種變性方法，包括將經(jīng)過超聲處理的細菌加入8M尿素中保溫，之后加一種堿性緩沖液保溫。經(jīng)中和并透析而復(fù)性后，離心懸液，得到含純度大于90%之融合蛋白的清澈的上清液。進一步的純化是通過在IgG Sepharose柱上進行親合層析而達到的。
雜交蛋白的定性使用在羊體內(nèi)產(chǎn)生的特異性apoAⅠ抗體，通過識別過程進一步鑒定雜交蛋白。蛋白A不能識別羊抗體。
前8個氨基酸的氨基末端序列和后3個氨基酸的羧基末端序列是與apoAⅠ和蛋白A的已知序列一致的。另外，氨基酸組成分析的結(jié)果也與預(yù)期的組成一致。
為確定雜交蛋白在細胞表面上結(jié)合的量(見下述)，必須測定其固有的Mr。這可使用Biogel1.5A柱經(jīng)凝膠過濾來完成。由柱洗脫物的峰值部分給出Mr為316KD，其相當(dāng)于單體Mr(62KD)的5倍。雜交蛋白洗脫的寬分布圖表明還存在有其他多聚體以及出現(xiàn)于外水體積中的小量集聚的物質(zhì)。將316KD這一平均值作為所有實驗的固有Mr。此與在同一柱上用作標(biāo)準物的HDL的Mr(285KD)差不多。碘化的雜交蛋白的洗脫曲線相似于未標(biāo)記的雜交蛋白的洗脫曲線。
在負性染色后，用電子顯微鏡檢查HDL和雜交蛋白顆粒。顯微照相顯示出直徑范圍為9-12nm的均質(zhì)顆粒群。雜交蛋白顆粒稍大于HDL，此進一步確實了凝膠過濾分析的結(jié)果。
雜交蛋白和HDL之生物學(xué)活性的比較將由大腸桿菌中提純的雜交蛋白和由人血漿中提純的HDL平行地用于研究它們與細胞表面受體相結(jié)合的能力。研究了幾個細胞類型小鼠巨噬細胞(J774)和大鼠肝細胞(Fao)細胞系。有證據(jù)表明，這兩個細胞類型具有不同的HDL。膽固醇交換發(fā)生在巨噬細胞中，而降解作用發(fā)生在肝細胞中。
4℃時結(jié)合的數(shù)據(jù)碘化的配體于4℃時可在細胞上結(jié)合2小時。30分鐘時結(jié)合的量即已達到了平臺。用500μg未標(biāo)記的配體進行竟?fàn)?，以估計非特異結(jié)合的量，然后從總結(jié)合曲線減去這個值，即得到特異性結(jié)合的值。按Scatchard分析法(Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.51，660-672，1949)，使用特異性結(jié)合值來計算親合力。對HDL和雜交蛋白兩者來說，結(jié)合是特異的并且是高親合力的。就與J774或Fao細胞的高親合力結(jié)合來說，HDL的Kd為2.8-3.0×10-8M，而雜交蛋白的Kd為3.5-4.9×10-9M。下列表2中顯示了這些結(jié)果。另外，還有一種沒有完全被帶HDL及雜交蛋白的未標(biāo)記配體竟?fàn)幍牡陀H合力組分。
兩種細胞類型中高親合力結(jié)合組分給出99-155ng/1×106細胞的最大結(jié)合此代表了每個細胞1.9-3.6×105個結(jié)合位點。每個細胞結(jié)合位點的數(shù)目及結(jié)合親合力對HDL和雜交蛋白兩者來說是十分相似的。這提示有一單一受體被卷入其中，而且單單apoAⅠ組分即能解釋對HDL的受體介導(dǎo)的結(jié)合。
竟?fàn)幯芯坑嘘P(guān)apoAⅠ的特異結(jié)合的其他證據(jù)得自于竟?fàn)幯芯?。HDL和雜交蛋白兩者彼此有效地竟?fàn)幗Y(jié)合于J774和Fao細胞。在達到非特異性組成之前，竟?fàn)幰恢笔怯行У?。蛋白A不能竟?fàn)帉﹄s交蛋白或HDL的結(jié)合。作為一個獨立的對照，竟?fàn)幯芯恐惺褂昧宿D(zhuǎn)鐵蛋白。雖然轉(zhuǎn)鐵蛋白是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合于細胞表面上的，但它不能竟?fàn)幣cHDL或雜交蛋白的結(jié)合。
蛋白A和IgG結(jié)合活性因為雜交蛋白也含有蛋白A，所以檢測蛋白A本身是否能與細胞結(jié)合是很重要的。將蛋白A碘化至相似的比活性并分析其與J774及Fao細胞的結(jié)合。既使蛋白A的濃度很高時(100μg/ml)，也沒有檢測出特異性結(jié)合。與細胞相關(guān)的放射活性的量小于雜交蛋白的非特異性結(jié)合的量。
因為J774細胞表達IgG的Fc受體，所以在進行這些使用雜交蛋白的實驗時，必須特別小心。從而，〔125Ⅰ〕-兔IgG以高親合力(Kd＝1×10-8M)結(jié)合于細胞表面Fc受體上。當(dāng)存在兔IgG時結(jié)合〔125Ⅰ〕CPA-AⅠ，所結(jié)合的雜交蛋白的量增加2.7倍。反之，當(dāng)存在雜交蛋白時結(jié)合〔125Ⅰ〕-兔IgG，則結(jié)合量亦增加(1.6倍)。由此可見，IgG和CPA-AⅠ之間的復(fù)合物能夠與Fc受體或HDL受體結(jié)合。為了只研究HDL受體，所有結(jié)合實驗都是在沒有IgG的培養(yǎng)基內(nèi)進行的。在添加了BSA的Hanks氏緩沖液(特別是沒有IgG的)中將細胞洗3次，以除去存在于培養(yǎng)基中的IgG。
HDL受體的特性在檢測HDL、雜交蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白之前，于4℃用胰蛋白酶處理J774細胞。胰蛋白酶處理沒有降低HDL或雜交蛋白結(jié)合量。但對〔125Ⅰ〕-轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合降低到對照組的38%。與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體比較，HDL受體有相對高的胰蛋白酶抗性。
為鑒定參予結(jié)合HDL和雜交蛋白的受體而進行了一次配體印跡試驗。于還原條件下，對來由J774細胞的PNS的Triton X-114提取物作SDS-聚丙烯凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上?！?25Ⅰ〕-HDL和〔125Ⅰ〕-CPA-AⅠ各自結(jié)合于大約110KD的帶上。這條帶是通過觀察濾膜的放射自顯影圖象上顯現(xiàn)的〔125Ⅰ〕標(biāo)記的配體而直接鑒定的，或者使用兔抗HDL抗血清進行抗體檢測并用羊抗兔IgG過氧化物酶顯現(xiàn)而間接鑒定的。對于HDL，因在硝酸纖維素上有碘化標(biāo)記物的高本底，使得放射自顯影圖象上特異帶的檢測不夠分明。
實施例3人apoAⅠ是作為前體蛋白，即267個氨基酸的Prepro apoAⅠ(前apoAⅠ原)合成的。在分泌期間18氨基酸長的前導(dǎo)肽被裂解，而留下代表了ProapoAⅠ(apoAⅠ原)的蛋白原。因此ProapoAⅠ包含了6個氨基酸的N末端延伸部分(Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln)，之后是成熟蛋白質(zhì)。
為了表達ProapoAⅠ，按照圖8所示的程序以合成方法重新構(gòu)建apoAⅠ基因的51端。合成了編碼proapoAⅠ之前15個氨基酸(其包括6個氨基酸的前體肽)的NdeⅠ-BamHⅠ寡核苷酸。此合成的DNA包括一直接接在BamHⅠ位點前面的NcoⅠ位點。將攜帶來自質(zhì)粒pDR720(Pharmacia，Sweden;Russel和Bennet，Gene20，231，1982)之trp啟動子的EcoRⅠ-SalⅠ片段連接到編碼λcⅡShine-Dalgarno序列的合成的SalⅠ-NdeⅠ片段上，以得到圖中所示的EcoRⅠ-NdeⅠ107bp片段。將該DNA小片段連接到編碼proapoAⅠ51序列的片段上并再克隆到被測定了序列的M13mp8(Messing等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，3642，1977)中。
為了表達重組的proapoAⅠ，按圖9中所示的程序構(gòu)建一表達載體。由重組的M13mp8上切下一包含表達信號(其后接有proapoAⅠ基因的51末端)的EcoRI-NcoⅠ片段(見圖8)，并連接到下列兩個片段上a)用EcoRⅠ-BamHⅠ切斷的質(zhì)粒pDS20(Duester等，Cell.30，855，1982)的大片段;
b)得自pML11-20(其含有apoAⅠ序列的其余部分)的NcoⅠ-BamHⅠ片段。
所得質(zhì)粒pFC33能夠在大腸桿菌B菌株(Delbruck，1946，Bacterial viruses or becteriophages，Biol.Rev.2130-40)中于trp啟動子控制下表達proapoAⅠ蛋白，或更具體地說是表達Met-proapoAⅠ。為了誘導(dǎo)，使細胞在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長過夜。第二天用沒有色氨酸的M9培養(yǎng)基稀釋細胞并于37℃保溫6小時，然后收獲之。
圖10顯示了proapoAⅠ的凝膠電泳和免疫印跡分析結(jié)果。離心沉淀得到細菌培養(yǎng)物的等分部分并與標(biāo)準的人類樣品平行地重新懸浮于凝膠電泳緩沖液中。加熱至沸后，將樣品加在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。然后按實施例1中所述的方法在硝酸纖維素濾膜上進行吸印試驗。
表2〔125Ⅰ〕-HDL和〔125Ⅰ〕-CPA-AI同F(xiàn)ao或J744細胞的結(jié)合Mr 結(jié)合Fao μg/ml M 高親合力位點數(shù)/細胞HDL 285，000 8.6 3.0×10-8362，000CPA-AI 316，000 11.0 3.5×10-8248，000J774HDL 285，000 8.0 2.8×10-8190，000CPA-AI 316，000 15.5 4.9×10-8277，000
勘誤表
勘誤表
權(quán)利要求
1.能夠在已轉(zhuǎn)化的宿主內(nèi)表達蛋白質(zhì)的表達載體，所說的蛋白質(zhì)能夠使用抗人apoAI抗血清以ELISA法檢測，并且具有下列式(1)的結(jié)構(gòu)通式Met-X-Y (1)其中X是鍵、包括得自β半乳糖苷酶N末端氨基酸殘基之序列或包括蛋白A的一個或多個IgG結(jié)合區(qū)域之序列的載體肽序列、或人apoAI的前導(dǎo)序列；且y代表人apoAI或其遺傳變異型的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的表達載體，其中所說的蛋白質(zhì)是Met-apoAⅠ、Met-apoAⅠ-T6、Met-apoAⅠ-MⅠ或Met-apoAⅠ-T6/MⅠ。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的表達載體，其得自于質(zhì)粒pFCE4+。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3的表達載體，其為質(zhì)粒pML11-20、pIL8-6、pIL8-Ⅰ或pIL8-6Ⅰ。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1的表達載體，其中載體肽序列包括一得自β半乳糖苷酶的多至前15個N末端氨基酸殘基的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的表達載體，其中載體肽包括序列Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met或Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的表達載體，其得自于質(zhì)粒pUC8或pUC9。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的表達載體，其為質(zhì)粒pIPI、pIPI-6、pIPI-Ⅰ、pIPI-6Ⅰ、pRP5、pRP5-6、pRP5-Ⅰ或pRP5-6Ⅰ。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1的表達載體，其中載體肽包括葡萄球菌蛋白A或其殘基23至270。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1的表達載體，其中載體肽序列包括蛋白A的一個或多個IgG結(jié)合區(qū)域，所說的結(jié)合區(qū)域是通過蛋白水解酶的識別序列與人apoAⅠ或其遺傳變異型相融合的。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10的表達載體，其中載體肽是由(λ噬菌體之CRO蛋白的前11個氨基酸)-(葡萄球菌蛋白A的248個氨基酸(殘基23至270))-(Pro-Gly-Asp-Ser-Thr)-(β半乳糖苷酶的后17個氨基酸)-(含有蛋白水解酶腸激酶之識別序列的17個氨基酸即Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met)所組成的。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1的表達載體，其中載體肽序列包括蛋白A的一個或多個IgG結(jié)合區(qū)域，而且它是自質(zhì)粒pLM3衍生得到的。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的表達載體，其為質(zhì)粒pLM8。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1的表達載體，其中人apoAⅠ的前導(dǎo)序列是與人apoAⅠ或其遺傳變異型的序列融合的，并且是由質(zhì)粒pDS20衍生得到的。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的表達載體，其為質(zhì)粒pFC33。
16.已用上述權(quán)利要求
之任一項中所限定的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主，并從而能夠在其中表達如權(quán)利要求
1中所限定的式(1)的蛋白質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求
16的宿主，其中宿主是大腸桿菌的菌株。
18.生產(chǎn)能夠使用抗人apoAⅠ抗血清以ELISA法檢測的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括培養(yǎng)如權(quán)利要求
16或17中限定的已經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主并回收如此得到的所說的蛋白質(zhì)。
專利摘要
一種能夠在已轉(zhuǎn)化的宿主內(nèi)表達蛋白質(zhì)的表達載體，所說的蛋白質(zhì)能夠使用抗人apoAI抗血清以ELISA方法檢測，并且其具有下列式(1)的結(jié)構(gòu)通式Met-X-Y(1)其中x是鍵、載體肽序列一其包括得自β半乳糖苷酶之N末端氨基酸殘基的序列或含蛋白A之一個或多個1gG結(jié)合區(qū)域的序列、或者是人apoAI的前導(dǎo)序列；且Y代表人apoAI或其遺傳變異型的序列。用這樣的載體轉(zhuǎn)化的宿主生產(chǎn)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可用于治療動脈粥樣硬化和心血管疾病。
文檔編號C12P21/02GK87107991SQ87107991
公開日1988年9月21日 申請日期1987年10月22日
發(fā)明者羅蘭多·洛倫澤蒂, 盧恰·莫納科, 馬爾科·索里阿, 拉法埃萊·帕隆巴, 安東內(nèi)爾·伊薩基, 保羅·薩爾米恩托斯 申請人:卡洛·埃爾巴意大利農(nóng)業(yè)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan