專利名稱:采用雜交測定人體t細(xì)胞白血病病毒i和ii的制作方法
本發(fā)明涉及一種測定病毒中的核苷酸順序是否存在的方法，該病毒涉及人體T細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型和Ⅱ型(HTLVⅠ和Ⅱ)。本發(fā)明還涉及一種用于在引物和標(biāo)記的雜交探針存在下的這樣測定的裝置。
人們已知道，某些T細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)理中涉及到一族T細(xì)胞熱帶還原病毒，稱為人體T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)。目前，已知道有三種類型的HTLV。第一，Ⅰ型(HTLVⅠ)是一種腫瘤病毒，它和在日本、加勒比海地區(qū)和非洲所發(fā)現(xiàn)的人類成年人T細(xì)胞白血病淋巴細(xì)胞瘤(ATLL)有密切的聯(lián)系。第二，Ⅱ型(HTLVⅡ)是一種腫瘤病毒，它是從具有毛發(fā)狀細(xì)胞白血病的T細(xì)胞變株的兩個病人中分離出來的。參見M.Popovic等，《Science》224卷497～500頁(1984)和Rosenblatt，J.D等，New Eng.J.of Med.，8月號(1986)。第三，Ⅲ型(HTLVⅢ)是一種慢病毒，是一種引起艾滋病(AIDS)的病原體，艾滋病是一種會傳染的細(xì)胞免疫系統(tǒng)的疾病，會引起常是致命的感染。
用對付HTLV相關(guān)病毒，如艾滋病的抗體鑒定血清的免疫診斷試驗(yàn)(參見美國專利第4，520，113號，Gallo等)正在血庫中被用于排除潛在感染的血液。也可參見WO86/01834，1986年3月27日公布(加利福尼亞大學(xué))，它是用在制備單克隆抗體中有用的還原病毒多肽去測定HTLV族中的還原病毒。因?yàn)檫@種病毒屬于一種不產(chǎn)生有效數(shù)量病毒顆粒的DNA復(fù)制品，一種測定HTLVⅠ和Ⅱ型有關(guān)的病毒的直接免疫方法用于很大部分的無征狀個體持久感染被證明是不成功的。因?yàn)樵诟腥窘M織和血液中病毒顆粒的數(shù)量可能是很少的(因?yàn)椴《镜男菝?，病毒顆?；騌NA/DNA的直接測定可能是相當(dāng)困難的，如果不是辦不到的話，不要把感染細(xì)胞與合適的T細(xì)胞系進(jìn)行共同培養(yǎng)。
美國專利第4，683，202號(1987年7月28日公布)中，K.Mullis描述了一種通過采用一種標(biāo)記的RNA或DNA雜交探針放大核酸順序以促進(jìn)測定的方法。在這個方法中，引物被用于得到引物延長產(chǎn)物，該延長產(chǎn)物用作核苷酸存在下合成附加的互補(bǔ)鏈的模板。該專利申請案中也描述了一種技術(shù)，即在探針被雜交至所需要的順序上以后，再加上一種限制性內(nèi)切酶以使在所需要的順序內(nèi)的某一位置上裂解雜化物，然后對限制性消化進(jìn)行分析以了解標(biāo)記片斷。美國專利第4，683，194(1987年7月28日公布)，以及《生物技術(shù)》第3卷1008～1012頁(1985)中H.Erlich等和Saiki等寫的文章中，更詳細(xì)地描述了這一后種技術(shù)。兩個專利申請案中都列舉了測定遺傳病，如鐮狀細(xì)胞貪血和β-地中海貪血癥的方法的應(yīng)用。這些方法和用于擴(kuò)增核酸順序的方法在《Science》第230卷。1350～1354頁(1985)中，Saiki等著的文章中也揭示過。
《Clin.Lab.Med》(1985)第五期。513～529頁上Landry等寫的綜述文章中描述了核酸雜交領(lǐng)域用于病毒測定。WO86/01535(1986年3月13日公告)和歐洲專利173，529號(1986年3月5日公告)中都揭示3HTLVⅢ的分子的克隆和利用克隆作為探針測定艾滋病。更進(jìn)一步地，歐洲專利公告173，339號(1986年3月5日公告)中，揭示了用DNA探針測定被外來微生物感染的遺傳分析。歐洲專利185，444號(1986年6月25日公告)中，揭示了一種重組肽作為探針用于測定細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的HTLVⅢ病毒。翁蘇公司(Qncor Inc.)在1986年9月宣布它發(fā)展了一種放射血液試驗(yàn)測定艾滋病毒。
用于測定腫瘤病毒HTLVⅠ和Ⅱ的雜交探針可能鑒定被持久感染，但不產(chǎn)生病毒的那些個人，也可能鑒定抗體陰性，但培養(yǎng)物陽性的個人，而且測定感染的細(xì)胞不需要培養(yǎng)病毒。用擴(kuò)增法增加病毒的核酸的復(fù)制數(shù)將有利于鑒定在被感染個體中病毒的核酸。
本發(fā)明包括一種測定或檢驗(yàn)核酸順序是否存在的方法，所述核酸順序是指大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸的分離體中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ核酸兩者的分離體中，這種方法對于測定HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLV和HTLVⅡ兩者分離體中的核酸是特別有效的，該方法包括(a).用核酸順序的每條鏈的寡核苷酸引物、四種不同的核苷三磷酸和一種聚合作用劑在雜交條件下，一起或分別處理樣品，對核苷順序的每條鏈，合成每個引物的延長物，它是與每條核酸鏈互補(bǔ)的，其中所說的引物基本上與待測定或檢驗(yàn)的核酸順序的每一鏈互補(bǔ)，以每一個引物合成的延長物，當(dāng)它從它的補(bǔ)體中分離時，可作為其他引物的延長產(chǎn)物合成的模板;
(b).在變性條件下處理樣品;
(c).用寡核苷酸引物處理步驟(b)中的產(chǎn)物，將步驟(b)中所產(chǎn)生的單鏈作為模板合成引物延長產(chǎn)物，結(jié)果擴(kuò)增了一個或多個特定核苷順序，如果它或它們是存在的話;和(d).測定樣品中的待測的順序是否存在。
測定產(chǎn)物的一種方法是向步驟(c)的產(chǎn)物中加入一種能與擴(kuò)增的核酸順序雜交的標(biāo)記探針;并測定探針是否已經(jīng)與核酸樣品的擴(kuò)增順序雜交了。在一個具體實(shí)施例中，這樣的測定可以以下列方式來進(jìn)行(1).用一種可識別在探針中的核酸順序中的某一位置的限制性內(nèi)切酶消化雜交的混合物;和
(2).測定限制性消化物是否有與HTLVⅠ或HTLVⅡ順序的存在相關(guān)的限制性片斷。
在步驟(a)以前，病人樣品中的核酸可能被抽出來，因此，待處理的樣品實(shí)際上是一種抽提出的核酸的混合物。另外，步驟(a)中的待處理的樣品不要預(yù)先進(jìn)行這樣的過程，即樣品中的病毒是在培養(yǎng)。
在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及了一種測定或檢驗(yàn)核酸順序是否存在的裝置，所述的核酸是大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸分離體中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的分離體中的核酸，該裝置對于HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的分離體中核酸是有效的，核酸順序被懷疑是包含在樣品中，該裝置包括(a).對于待測核酸順序的每一條鏈，有一個寡核苷酸引物，一種或多種引物基本上是與每個特殊的核酸順序的每條鏈互補(bǔ)，因此，從一種引物合成的一種延長產(chǎn)物，當(dāng)延長產(chǎn)物從補(bǔ)體中分離出來時，可作為合成其它引物的延長產(chǎn)物的模板;和(b).一種能與核酸順序雜交的標(biāo)記探針。
最好是，該裝置也包含一種聚合作用劑，四種不同的核苷酯和一種用于測定探針和核酸順序是否雜交的工具。
這里的試驗(yàn)裝置也可用于研究試驗(yàn)，臨床試驗(yàn)和其他的診斷應(yīng)用。另外，它也可以用于測定感染細(xì)胞而無需培養(yǎng)病毒，它在檢查用于消除傳染的各種治療劑治療病人也是有用的。
本發(fā)明涉及測定或檢驗(yàn)核酸順序的一種方法和一種裝置，所述核酸順序與被懷疑含有該順序的核酸樣品中的HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的任一種或兩種是相關(guān)的。對HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的分離體已被定好順序。待擴(kuò)增的順序必定對HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒是特異的，即不與HTLVⅢ或其他的非HTLVⅠ或Ⅱ病毒起反應(yīng)。
HTLVⅠ病毒的完整基因組已為Seiki等在《Proc Natl Acad Sci》美國第80卷3618～3622頁(1983)中描述過。HTLVⅡ病毒的完整基因組則由Shimotohno等在《Proc Natl Acad Sci》美國第82卷3101～3105(1985)中描述過。
“大量存在于”一詞應(yīng)用于待測順序意味著該核酸順序一定是足夠地與待測的病毒的核酸互補(bǔ)，以至少在室溫，聚合作用劑和四種核苷三磷酸存在下激發(fā)聚合作用。
所使用的引物是一種任意長度和順序的寡核苷酸，目的是在HTLVⅠ和Ⅱ或HTLVⅠ或Ⅱ病毒中的顯著數(shù)量的核酸上專門激發(fā)聚合作用。尤其是，這里所使用的“引物”一詞是一種由兩個或兩個以上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，最好是三個以上，當(dāng)處在一些條件下，它能起著合成激發(fā)點(diǎn)的作用，在一定條件下，即在核苷三磷酸和聚合作用劑(如DNA聚合酶)存在下，在適當(dāng)溫度和PH下，它可誘發(fā)基本與核酸鏈互補(bǔ)的引物延長產(chǎn)物的合成。引物最好是單鏈的，以擴(kuò)增得到最高的效率，但也可采用雙鏈。如果是雙鏈的，引物在被用于制備延長產(chǎn)物以前，首先要自行處理，以把它的鏈分開。最好是，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須有足夠長以在聚合誘導(dǎo)劑的存在下觸發(fā)延長產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將取決于很多因素包括溫度、緩沖液、核苷酸組份和引物來源。為了達(dá)到發(fā)明的目的，寡核苷酸引物較典型的是含有15～25或更多的核苷酸，盡管它可能包含較少的核苷酸。
這里，所選擇的引物基本上是與被擴(kuò)增的特殊順序的每條鏈互補(bǔ)的。這就意味著引物必須是可足夠互補(bǔ)的，以在一定的條件下，允許聚合作用劑起作用，能和它們各自的鏈雜交，也就是說，引物必須與要擴(kuò)增的鏈的順序足夠互補(bǔ)，以此雜交和形成一種用于合成其他引物的延長產(chǎn)物的模板。引物可能含有一些與鏈的錯誤配段。
可以選擇被擴(kuò)增的順序是取自大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的區(qū)。因此，引物和探針可以用任何適宜的裝置加以鑒定和選擇。這種步驟可用人工方法比較HTLVⅠ和HTLV病毒基因組的核苷酸順序的區(qū)來進(jìn)行。在HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的X區(qū)之間的核苷酸順序同源性已在Shimotohno等《Proc Natl Acad Sci》美國第81卷6657～6661(1984)著的文中描述過。另一個方法是用計算機(jī)程序比較所述核酸順序。為了達(dá)到目的，可以方便地應(yīng)用國立生物醫(yī)學(xué)研究基金會所提供的基礎(chǔ)計算機(jī)算的商業(yè)程序，使用點(diǎn)陣式模型。這種程序包括輸入HTLVⅠ和Ⅱ病毒的核苷酸順序和規(guī)定堿基對同源性窗尺寸。該程序使用了圖解法來比較不同軸上的核酸順序，一個點(diǎn)出現(xiàn)在哪里，那里至少是實(shí)際的同源性。最好是，窗的尺寸大于6個堿基。
基因組中的X區(qū)大多數(shù)存在于兩種病毒的密碼區(qū)之中。因?yàn)檫@個X區(qū)大多數(shù)存在于密碼區(qū)之中，它是最好區(qū)，從中可選擇引物和用于測定順序的探針。不為蛋白質(zhì)編碼的病毒基因組的區(qū)也可以用于確定被用的引物的順序。為了達(dá)到最高靈敏度和最大的專一性的目的，待測定的順序與長度足夠允許專一接觸抗原并大量存在于有關(guān)病毒中的順序是同源的，如果應(yīng)用一種探針和限制性內(nèi)切酶，尤其是在限制裂解部位的情況是這樣的。
用于擴(kuò)增和此后測定產(chǎn)物的技術(shù)已在上述美國專利第4，683，201號和第4，683，194中詳細(xì)描述過，Saiki等《Biotechnology，supra》和Saiki等，《Sciene supra》中也描述過。通常，擴(kuò)增過程包括一個酶促鏈反應(yīng)，以所涉及反應(yīng)步驟數(shù)相對應(yīng)的指數(shù)增長速率制備一種特定的核酸順序，對所要求的順序的末端情況應(yīng)足夠詳細(xì)地知道，以使寡核苷酸引物可以被合成，并雜交到順序的末端，少量的鏈順序可有效地引發(fā)鏈反應(yīng)。一種引物是與負(fù)(-)鏈互補(bǔ)的，另一引物是與正(+)鏈互補(bǔ)的，用酶，如DNA聚合酶Ⅰ(klenow)的大片斷和核苷酸將引物退火到變性的核酸后延長，結(jié)果得到新合成的含有靶的正(+)和負(fù)(-)鏈。因?yàn)檫@些新合成的順序也是引物的模板，周期性地重復(fù)變性、引物退火和延長，結(jié)果引起由引物所限定的區(qū)指數(shù)累積。鏈反應(yīng)的產(chǎn)物將是一個獨(dú)立的核酸雙鏈，它的終端是與所使用的特定的引物的終端相對應(yīng)的。
擴(kuò)增過程可用圖解法說明，在那里，由互補(bǔ)鏈[S+]和[S-]組成的含有所需要的順序[S]的雙鏈DNA可被用作核酸。在第一和每一個后面的反應(yīng)周期內(nèi)，在原先模板上的每個寡核苷酸的延長將產(chǎn)生一新的無限長度的SSDNA分子產(chǎn)物，這一DNA分子產(chǎn)物長度是以引物的一個引物中止。這些產(chǎn)物此后稱為“延長產(chǎn)物”，將以線性方式累積;即任意次周期后存在的數(shù)量將與周期數(shù)成正比。
由此所產(chǎn)生的長產(chǎn)物在隨后的周期中可作為寡核苷酸引物的一種或另一種的模板，并將產(chǎn)生所需要的順序[S+]或[S-]的分子。這些分子也可以起著寡核苷酸引物的一種或另一種的模板作用，繼續(xù)產(chǎn)生[S+]或[S-]的分子。這些分子也可以起著寡核苷酸引物的一種或另一種的模板作用，繼續(xù)產(chǎn)生[S+]和[S-]，因此，鏈反應(yīng)可以維持，它將以與周期數(shù)相對的指數(shù)速度累積。
由寡核苷酸雜交作用所形成的副產(chǎn)物不同于想要的產(chǎn)物，它們是不能自我催化，因此，它們是以線性速度累積的。
要擴(kuò)增的特定順序[S]可以用圖解表示[S+] 5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3′[S-] 3′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锸?br>引物1 3′GGGGGGGGGG 5′引物2 5′AAAAAAAAAA 3′因此，如果含[S]的DNA....ZZZZZZZZZZZZZZZZAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
....ZZZZZZZZZZZZZZZZTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
被分離為單鏈和它的單鏈被雜交到引物1和2上，下列的延長反應(yīng)可以在四種脫氧核糖核苷三磷酸存在下，由DNA聚合酶催化而進(jìn)行3′ 5′延長物←GGGGGGGGGG 引物1....zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板鏈+初始模板鏈-....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
引物2 AAAAAAAAAA→延長物5′ 3′在形成的雙鏈的變性作用時，產(chǎn)物是3′ 5′....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG新合成的長的產(chǎn)物15′ 3′....zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板鏈+
3′ 5′....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板鏈-5′ 3′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
新合成的長產(chǎn)物2如果這四種鏈被允許在下一個周期中與引物1和2重新雜交的話，那么聚合作用劑將催化下面的反應(yīng)引物2 5′AAAAAAAAAA→延長到此3′....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′新合成的長產(chǎn)物1延長物←GGGGGGGGGG 5′ 引物15′....zzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzz....3′初始模板鏈+引物2 5′AAAAAAAAAA→延長物3′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzz....5′初始模板鏈-延長到此←GGGGGGGGGG 5′ 引物15′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz..3′新合成的長產(chǎn)物2
如果上述四種雙鏈可被分離，就將發(fā)現(xiàn)下面的鏈5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3′新合成的[S+]3′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′第1個周期中合成的長產(chǎn)物13′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′新合成的長產(chǎn)物15′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzz....3′初始模板鏈+5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz...3′新合成的長產(chǎn)物23′..zzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz...5′初始模板鏈-3′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′新合成的[S-]5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzz...3′第一周期中合成的長產(chǎn)物2可見，以一個引物的寡核苷酸順序和另一引物的互補(bǔ)順序中止的每條鏈?zhǔn)潜簧a(chǎn)的所需要的特定核酸順序[S]。
這個工藝的步驟可以無限地重復(fù)，它僅由引物1和2，誘導(dǎo)物和核苷酸存在的數(shù)量所限制。初始的核酸數(shù)量在整個過程中保持恒定，因?yàn)樗槐粡?fù)制。長產(chǎn)物的數(shù)量呈線性增加，因?yàn)樗鼈冎粡某跏己怂嶂挟a(chǎn)生。特定順序的數(shù)量呈指數(shù)增長。因此，特定的順序?qū)⒆優(yōu)橹饕姆N類，這在下面的表中加以說明，它表示在幾個周期后，理論上存在的這一特別順序種類的相對量，假定每個周期中效率為100%在0～n次周期后的雙鏈數(shù)目周期數(shù) 模板 長產(chǎn)物 特殊順序[S]0 - 1 -1 1 1 02 2 1 13 3 1 45 5 1 2610 10 1 101315 15 1 32，75220 20 1 1，048，555n n 1. (2n-n-1)當(dāng)把一個單鏈核酸用作為模板時，每個周期中只形成一個長產(chǎn)物。
這里所用的術(shù)語“核酸限制性內(nèi)切酶”和“限制性內(nèi)切酶”系指一些細(xì)菌酶，它們能在或靠近一特定核苷酸順序上切斷雙鏈DNA。
這里的引物可能由下列指標(biāo)來選擇，它們是供考慮的因素，但不是唯一的或決定的因素。首先，引物可以從存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ基因組的區(qū)中選擇。X區(qū)是存在于密碼區(qū)，因此，X區(qū)被選出來作初始研究。其次，引物缺乏與可能影響試驗(yàn)的病毒基因組的任何順序的同源性，例如，HTLVⅢ中的順序已在《Science》第227卷538～540頁(1985)中，由Starcich等描述的。
第三，引物最好是在擴(kuò)增的核酸中缺乏二級結(jié)構(gòu)形成，二級結(jié)構(gòu)可能干擾通過擴(kuò)增酶，如大腸桿菌DNA聚合酶的延長，DNA聚合酶的部分最好是Klenow片斷。這可以通過在擴(kuò)增培養(yǎng)基中應(yīng)用約15%(按重量計)，最好是5～10%(按重量計)的二甲基氧化硫(DMSO)和把擴(kuò)增溫度提高到30～40℃，最好為35～40℃或把擴(kuò)增溫度提高到30～40℃，最好為35～40℃來實(shí)現(xiàn)。
第四，引物最好具有約50%含量的鳥嘌呤和胞嘧啶，在引物的3′末端不含有多位相連的腺嘌呤和胸腺嘧啶基，它們可能引起雜交不穩(wěn)定。最后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物是用限制性內(nèi)切酶來測定，探針必須有一個內(nèi)部的(不是末端)限制性部位。
寡核苷酸引物可采用任何適當(dāng)?shù)姆椒▉碇苽?，如采用上面描述的磷酸三酯和磷酸二酯法，或自動?shí)施法。自動實(shí)施法中，二乙基磷酰胺亞酯被用作原材料，并用Beaucage等在《Tetrahedron Letters》第22卷，1859～1862頁中描述的方法合成，在改進(jìn)的載體上合成寡核苷酸的一種方法已在美國專利第4，458，066號中描述過。也可以采用一種生物源(如核酸限制內(nèi)切酶消化物)分離出來的引物。
任何純化或非純化形式的核酸源可以被用于啟動一個或多個核酸，使核酸源含有或被懷疑含有與HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ有關(guān)的特定核酸順序。因此，這個過程也可以應(yīng)用如含信使RNA的DNA或RNA，其中DNA或RNA可以是單鏈或雙鏈的。在這過程中，RNA可被用作模板，用于把模板逆轉(zhuǎn)錄到DNA的制備，酶和/或最佳條件也被應(yīng)用。此外，也可采用含有每條鏈中一條鏈的DNA-RNA雜種體。也可使用這些核酸的任何的混合物，用相同的引物或不同的引物從先前的擴(kuò)增反應(yīng)生產(chǎn)核酸也可應(yīng)用。待擴(kuò)增的特定核酸順序可能只是大分子的一部分或初步可被看作一個個別分子，因此，特定的順序組成了完整的核酸。要擴(kuò)增的順序最初不需要是純的形式;它可能是復(fù)雜的混合物中的一個極小的部分，如在整個人DNA中所含的病毒編碼基因的一部分。啟動核酸可能含有一種以上所需要的特定核酸順序，它們可能是相同的，也可以不同。因此，本方法不僅對于一種特定核酸順序的大量產(chǎn)生是有用的，而且對位于相同或不同的核酸分子上同時擴(kuò)增一種以上不同的特定核苷酸順序也是有用的。
核酸可以得自任何來源，如從高等有機(jī)體，象動物體中的自然DNA或RNA。DNA或RNA可以用Maniatis等在《Molecular Cloning∶A Laboratory Manual》(紐約Cold Spring Harbor Laboratory 1982)，280～281頁中描述的各種技術(shù)，從體內(nèi)樣品，如血液、組織材料，如絨膜-絨毛、或羊膜細(xì)胞抽提得到。
如果樣品是不純的，如血漿、血清或血液，在擴(kuò)增以前，要用可有效地打開樣品的細(xì)胞，液體，組織，病毒衣殼或動物細(xì)胞膜，并可有效地暴露和/或分離核酸鏈的一定量的試劑處理。該暴露和分離鏈的細(xì)胞素和核酸變性步驟將使擴(kuò)增更迅速進(jìn)行。此外，在用擴(kuò)增試劑處理樣品以前，HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒不需要放在樣品中培養(yǎng)。樣品可能被離心分離以得到淡黃色的外殼，然后再通過一根柱以得到白細(xì)胞。然后對白細(xì)胞再進(jìn)行處理以提取核酸，用作被擴(kuò)增的樣品。
任何特定的核酸順序都可以用這個方法得到。必須做到的是順序的兩個末端的堿基數(shù)要有足夠詳細(xì)了解，使得兩個寡核苷酸引物可以被制備，然后雜交到所需要的順序的不同鏈上并處在沿著順序的相對位置上，當(dāng)它從它的模板(互補(bǔ)體)分離時，從一個引物合成的一個延長產(chǎn)物，它可以作為把另一個引物延長至一定長度核酸的模板。關(guān)于順序末端的堿基了解得越徹底，引物對于靶核酸順序的專一性就越強(qiáng)，因此，方法的效率也就越高。我們可以了解，在下文中所使用的引物是一個以上的，尤其是，在有關(guān)要擴(kuò)增的順序末端的資料還有一些不明確的情況下。例如，如果核酸順序是從蛋白質(zhì)順序信息中推論得到的話，那么含有代表以遺傳密碼簡并為基礎(chǔ)的所有可能的密碼變化的順序的引物的收集物將被用于每條鏈。這種收集物的一個引物實(shí)際上將連接至要擴(kuò)增的需要的順序的末端。
通過采用含有那個順序的核酸所生產(chǎn)的特定核酸順序作為模板。如果樣品的靶核酸順序含有兩股鏈，那么，在它被用作模板之前，或者作為獨(dú)立的步驟或與合成引物延長產(chǎn)物同時進(jìn)行時，必須將核酸鏈分離。這種鏈分離可以采用任何適宜的變性條件進(jìn)行，包括物理的、化學(xué)的或酶方法，這里使用的詞“變性”包括所有上述條件下的變性，分離核酸鏈的一種物理方法是把核酸加熱至它變性。典型的熱變性包括溫度范圍約為“80～105℃”，時間約為1～10分鐘。鏈分離也可以由一種酶促使，這種酶是從稱為解螺旋酶或RecA酶中選出來的，后者具有解螺旋酶的活性，在核糖ATP的存在下可使DNA變性。用解螺旋酶分離核酸鏈的合適的反應(yīng)條件已由Kuhn Hoffmann-Berling在《CSH-Quentitative Biology》第43卷63頁(1978)中描述過，而采用RecA的技術(shù)則由C.Radding在《Ann.Rev.Genetics》第16卷，405～437頁(1982)中作過綜述。
如果含有要擴(kuò)增的順序的最初的核酸是單鏈的話，它的補(bǔ)體可通過向那里加入一或二個寡核苷酸引物來合成。如果一個合適的單個引物被加入，在下面描述的引物、聚合作用劑和四種核苷三磷酸存在下，就可合成引物的延長產(chǎn)物。該產(chǎn)物將與單鏈的核酸互補(bǔ)，并與該核酸鏈雜交形成鏈不等長的雙鏈，然后，它們可再被分離為單鏈，象如上描述的那樣，產(chǎn)生兩條單一的獨(dú)立的互補(bǔ)鏈。另一種方法是，兩種合適的引物被加到單鏈核酸上，再進(jìn)行反應(yīng)。
如最初的核酸構(gòu)成要擴(kuò)增的順序，那么，所產(chǎn)生的引物延長產(chǎn)物將完全地或基本上完全地與最初的核酸鏈互補(bǔ)，并雜交形成等長的雙鏈，等長的兩條鏈再被分離為獨(dú)立的鏈分子。
當(dāng)一種核酸或幾種核酸的互補(bǔ)鏈被分離時，不管核酸最初是雙鏈還是單鏈的，這些鏈都準(zhǔn)備用作為附加的核酸鏈合成的模板。這種合成是在允許引物與模板雜交的條件下進(jìn)行的。通常，這種合成是在較佳PH為7～9，最佳PH為8的緩沖溶液中進(jìn)行。最好是，兩種寡核苷酸引物以克子過量(用于基因組核酸時，引物與模板比例約為108∶1)的量被加入含有分離的模板鏈的緩沖液中。我們應(yīng)該知道，如果這樣的方法被用于診斷的話，互補(bǔ)鏈的數(shù)量不可能了解，因此，與互補(bǔ)鏈數(shù)量相對的引物的量也不能確切地確定。但是，從實(shí)踐來看，當(dāng)要擴(kuò)增的順序包含在一條復(fù)雜的長鏈核酸鏈的混合物時，加入引物的量通常是克分子過量于互補(bǔ)鏈模板的量，克分子過量大，可提高這種方法的效率。
脫氧核糖核苷三磷酸dATP，dCTP，dGTP和TTP也被加到合成的混合物之中，可以與引物一起加入或分開加入，加入的量要合適，這樣所得到的溶液再被加熱到約90～100℃，約1～10分鐘，最佳為1～4分鐘。在這一加熱時間后，溶液再冷卻至適于引物雜交的室溫。往冷卻的混合物中加入可促進(jìn)引物延長反應(yīng)的一種合適的作用劑(該作用劑稱為聚合作用劑)，這種反應(yīng)可在已知技術(shù)的條件下進(jìn)行。如果聚合作用劑是熱穩(wěn)定的，則它可和其它的試劑一起加入。這種合成反應(yīng)可以在室溫到某一溫度下進(jìn)行，超過某一溫度，聚合作用劑不再起作用。例如，如果DNA聚合酶作為作用劑，溫度通常不高于40℃。最合適的是，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
聚合作用劑可以是任何的化合物或體系，它能促進(jìn)完成引物延長產(chǎn)物的合成，聚合作用劑包括酶類。用于此目的合適的酶包括大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片斷、T4 DNA聚合酶，其它有效的DNA聚合酶、聚合酶突變蛋自、逆轉(zhuǎn)錄酶和其它的酶，包括熱穩(wěn)定酶(即這些酶在溫度提高到足夠引起變性后，還可促使引物延長)，它們將促使核苷酸以合適的方式組合，以形成與每一個核酸單鏈互補(bǔ)的引物延長產(chǎn)物。通常，該合成反應(yīng)是在每一個引物的3′末端開始，然后沿著模板鏈的5′末端進(jìn)行，直至合成終端，產(chǎn)生了不同長度的分子。采用上述同樣的方法，可能還有些聚合作用劑參與，但合成反應(yīng)是在5′末端開始，沿另一方向進(jìn)行。
在上述的雜交條件下，如果靶順序存在下，新合成的鏈和它的補(bǔ)體核酸鏈將形成一個雙鏈分子，該雜交物被用于該方法的以后的步驟。在下一步，在雜交條件下處理的樣品被置于變性條件下，使用任何上面描述的方法，在靶順序存在下，可提供單鏈的分子。
新的核酸是在單鏈分子上被合成。如果必要的話，可以加入另外的聚合作用劑、核苷酸和引物，以使反應(yīng)在如上描述的條件下進(jìn)行。同樣，合成反應(yīng)可在每個寡核苷酸引物和一個末端開始，沿著模板單鏈進(jìn)行以產(chǎn)生附加的核酸。在這步以后，延長產(chǎn)物的一半將由兩個引物結(jié)合的特定核酸順序組成。
在需要將靶核酸擴(kuò)增到用于測定所必需的程度時，變性和延長產(chǎn)物合成的步驟常?？梢灾貜?fù)。如以下將進(jìn)一步詳細(xì)描述的那樣，所產(chǎn)生特定核酸順序的數(shù)量將以指數(shù)方式累積。
當(dāng)希望從第一個核酸或核酸混合物產(chǎn)生一個以上的核酸順序時，可以采用適當(dāng)數(shù)量的不同的寡核苷酸引物。例如，如果產(chǎn)生兩種不同的特定核酸時，要使用四種引物。其中兩種引物對于特定核酸順序中的一個順序是專一的，另外兩種引物對于第二個特定核順序是專一的。以這種方式，兩種不同特定順序中的每一種都可以用本發(fā)明方法指數(shù)方式累積。
本發(fā)明也可以分步的方式進(jìn)行，每一步后加入新試劑，或同步進(jìn)行，所有的試劑在初始步驟中一步加入，或部分分步和部分同時進(jìn)行，即在一定數(shù)目的步驟后，加入新試劑。如果一種變性方法，如加熱法被使用，它將使聚合作用劑失效，正如用熱不穩(wěn)定酶作聚合作用劑就是這樣;這樣一來就有必要在每一個鏈分離步驟之后，補(bǔ)充聚合作用劑。當(dāng)一個酶的方法被用于鏈分離步驟時，可使用同時進(jìn)行法。在同時進(jìn)行法中，除了含有所需要的順序的核酸鏈外，反應(yīng)混合物還可能含有鏈分解酶(如解螺旋酶)，用于鏈分解酶的適當(dāng)?shù)哪茉?，如r ATP，四種核苷三磷酸、克分子過量的寡核苷酸引物以及聚合作用劑，如大腸桿菌DNA聚合酶1的Klenow片斷。
如果在同時進(jìn)行法中，把熱用于變性，則熱穩(wěn)定劑，如熱穩(wěn)定的聚合酶可以使用，它在高的溫度下使用，最好采用50～105℃，視作用劑而定，在該溫度下，核酸將由處于平衡態(tài)的單鏈和雙鏈組成。如果核酸長度較短，那么，較低的溫度，如40～50℃就可以了。溫度的提高取決于在該溫度下，酶是否降解或超過該溫度，不足水平的引物雜交是否發(fā)生。這樣的熱穩(wěn)定性酶曾被描述過，例如，A·S.Kaledin等在《Biokhimiya》，第45卷，644～651頁(1980)中描述過。在該恒定的溫度下，反應(yīng)進(jìn)行了，引物在每條鏈的6～8堿基對中具有它們的3′末端。盡管所有反應(yīng)試劑在初始時都存在，該方法的每一步還是連續(xù)地發(fā)生的。必要時，可以添加其他物質(zhì)。在適當(dāng)長的時間以產(chǎn)生所需要的特定的核酸順序后，反應(yīng)可以通過任何已知的方式使酶失話，或?qū)⒎磻?yīng)的組份分開使其停止。
擴(kuò)增作用也可以采用溫度周期反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，此時，溫度逐漸地增高以允許使用熱穩(wěn)定酶用于延長、退火和變性。
本發(fā)明的方法可以連續(xù)地進(jìn)行。在一個自動法實(shí)施例中，反應(yīng)可能通過一個變性區(qū)，一個試劑添加區(qū)和一個反應(yīng)區(qū)循環(huán)。在另一個實(shí)施例中，用于引物延長產(chǎn)物合成的酶可以被固定在一柱中。其它的反應(yīng)組份可以用一個泵使之連續(xù)地循環(huán)通過柱，和一個串連的旋管，因此，所產(chǎn)生的核酸可以重復(fù)地變性而不會使酶失話。
擴(kuò)增產(chǎn)物可以不采用放射性探針，而用Southern blots分析法對它分析來測定。例如，該法中，從含極少量的HTLVⅠ和Ⅱ或HTLVⅠ或HTLVⅡ順序的周圍血液淋巴細(xì)胞中得到的DNA少量樣品被擴(kuò)增并用Southen blotting技術(shù)分析。非放射性探針的應(yīng)用是由高水平的放大信號來促進(jìn)的。
另一種測定方法包括使用一種能與擴(kuò)增的核酸順序雜交的標(biāo)記探針來測定和確定探針是否發(fā)生雜交。這樣的探針必須含有一種來自HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因組中的大量存在的核酸順序，用如上描述的方法，它被選來用于引物和擴(kuò)增順序。最好是，該探針選自HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ基因組的X區(qū)。
這樣一種探針法包括在美國專利第4，683，194號Supra中描述過的寡聚體限制技術(shù)。在該方法中，擴(kuò)增了的核酸被變性，并在溶液中雜交到標(biāo)記的寡核苷酸探針上，它可專一性地雜交到靶順序(跨越引物所含有的一特殊的區(qū))上，并至少跨越一個感頭趣的限制性部位。在靶和探針之間所形成的雙鏈將重新構(gòu)成限制部位，當(dāng)用限制性內(nèi)切酶，如BglⅠ，PvuⅡ，或HinfⅠ裂解時，就釋放出一個標(biāo)記探針片斷，它可以用凝膠電泳法從整個長度的探針中分離出來。然后，所得的凝膠被放射自顯影照相。用這個方法分析擴(kuò)增產(chǎn)物是快速的，即結(jié)果可以在幾小時內(nèi)得到。最好的情況是，探針是30～45堿基長，并被標(biāo)記，同樣，BglⅠ，PvuⅡ或HinfⅠ是優(yōu)先選用的限制性內(nèi)切酶?？捎糜诜治鰯U(kuò)增產(chǎn)物的另一種方法是涂點(diǎn)法(dot bot method)。在這個方法中，擴(kuò)增的樣品直接涂點(diǎn)在膜上，并和標(biāo)記探針雜交。這種標(biāo)記物可用光譜學(xué)，光化學(xué)或用生物化學(xué)，免疫化學(xué)或化學(xué)方法測定。這些實(shí)例包括酶，如堿基磷酸酶、放射性標(biāo)記物如32P、熒光標(biāo)記物或生物素。在一個實(shí)施例中，探針是一種含生物素的探針，其中的生物素被結(jié)合到分子結(jié)構(gòu)的間隔壁(Spacer arm)上
其中Y為0，NH或N-CHO，x是1～4的數(shù)，y是2～4的數(shù)。
間隔壁反過來結(jié)合到分子的普索拉靈(Psoralen)一部分上
普索拉靈(Psoralen)一部分插入和穿過交叉為一“裂口環(huán)”探針，如Courage-Tabbe等在《Boichim Biophys Acta，第697卷1～5頁(1982)中描述的，這里，裂口環(huán)的單鏈雜交區(qū)跨越兩種引物之間所包含的區(qū)。這種生物素化作用(bioti nylatin)的詳細(xì)說明和涂點(diǎn)法在美國專利第4，582，789和4，617，261號中更詳細(xì)和完全地描述了。生物素化探針可避免對放射性同位素的需要另一種方法是，如果需要的話，在預(yù)雜交的條件下，探針首先被涂點(diǎn)在膜上，然后，在雜交條件下，把擴(kuò)增產(chǎn)物以反向涂點(diǎn)方式，加到預(yù)處理的膜上。
涂點(diǎn)方法所費(fèi)時間要大于上述描述的寡聚體限制法，因?yàn)槟な紫缺仨氼A(yù)雜交，然后再雜交到探針上。但是，對于迅速突變的病毒，它具有這樣的優(yōu)點(diǎn)含有有限堿基失配的順序仍可在一合適的雜交條件下測定，采用寡聚體限制法時，任何可引起限制性內(nèi)部位取消的突變株病毒，由于病毒的變異性，將難以被檢測出來。
本發(fā)明也涉及一種裝置的形式，它是一種包裝了多個容器的裝置，每個容器各盛有要使用的引物和探針。該裝置也具有一個盛有用于合成引物延長產(chǎn)物的聚合作用劑，如酶的容器和一盛有四個核苷三磷酸的每種容器和一個用于測定標(biāo)記物(如，若標(biāo)記物是生物素時的一種抗生物素蛋白-酶復(fù)合物)的容器。此外，該裝置還備有一個容器，它包括含有一種或一種以上具有HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因組的順序的核酸正控制器，和包括沒有這樣核酸的負(fù)控制器的容器。此外，該裝置備有裝盛每種限制酶的容器，限制酶能夠在探針中一個順序所含有的部位下裂解含有靶順序的核酸。
下面的例子列舉了本發(fā)明的各種實(shí)施例，但不受這些實(shí)施的限制。在實(shí)例中，除了指出外，所有部分和百分比，如果是固體，以重量百分比表示，如果是液體，以體積百分?jǐn)?shù)表示，溫度皆指攝氏溫度。
實(shí)施例1
被擴(kuò)增的所需要的順序包含11個編碼的DNA樣品中，所述DNA樣品是從地區(qū)腫瘤學(xué)中心，SUNY北部醫(yī)學(xué)中心，Syracuse，紐約13210，Bernard Poiesz博士處得到的，它們被鑒定為194BK，342，367，361，368H，207，307，308B，323，326和340。引物和探針是用HTLVⅠ病毒和具有少數(shù)錯誤配段的HTLVⅡ病毒的X區(qū)選擇出來的，由Shimotohno等在《Proc Natl Acad Sci》美國，第81卷，6657～6661頁(1984)鑒定。
密碼樣本首先在白細(xì)胞間素2(inleukin-2)存在下培養(yǎng)，Poiesz博士用于測定病毒的存在。然后，DNA以下列方法從樣品中抽提出來。
1、1～2×108個培養(yǎng)細(xì)胞置于盛有20ml十二烷基硫酸鈉溶胞緩沖液(1% SDS，150m M Na Cl，25m M Na2EDTA)的試管中進(jìn)行溶胞。
2、400ml 5mg/μl的蛋白酶K溶液加入到每一個試管中，在37℃保溫過夜。
3、DNA用酚和CHCl異戊醇連續(xù)抽提，再用乙醇沉淀。
4、DNA用玻璃棒挑出，再置于1×TE緩沖液(10mM Tris，lmM Na2EDTA，PH為7.5)中，并用1×TE緩沖液完全滲析。
Ⅰ、引物的合成下列兩種寡脫氧核糖核苷酸引物，被命名為SK43和SK44，分別用下面描述的方法制備5′-CGGATACCCAGTCTACGTGT-3′(SK43)5′-GAGCCGATAACGCGTCCATCG-3′(SK44)A.自動合成方法由Beaucage和Caruthers[《Tetrahadron
Letters》第22卷，1859～1862頁(1981)]合成的二乙基磷酰胺亞酯被連續(xù)地縮合到一個核苷上，這種核苷是從使用Bioserch SAM-1可控的孔玻璃載體取得的。該方法包括用在二氯甲烷中的三氯醋酸進(jìn)行脫三苯甲基作用，使用苯并三唑作為激活質(zhì)子供體進(jìn)行濃縮，并用在四氫呋喃和吡啶中的醋酸酐和雙甲基氨基吡啶覆蓋。循環(huán)時間約為30分鐘。每一步驟的產(chǎn)量基本上是定量的，并通過收集和在脫三苯甲基作用過程所釋放的二甲氧基三苯甲醇的光譜檢驗(yàn)測定。
B.寡脫氧核糖核苷酸去保護(hù)和純化方法載體從柱中移出，在室溫下，暴露到密閉試管中1ml濃的氫氧化銨中保持4小時。然后，載體可通過過濾去除，含有部分保護(hù)的寡脫氧核苷酸的溶液加熱至55℃保持5小時。然后，去除氨，殘余物被置于預(yù)先制備的聚丙烯酰胺凝膠中。在30伏/cm下電泳90分鐘，之后，含有該產(chǎn)物的帶用熒光板的紫外投影法來鑒定。這個帶切下來，并且用1ml蒸餾水在4℃過夜洗提。這種溶液置于Altech RP18柱中，并在PH6.0，用1%醋酸銨緩沖液中的7～13%梯度的乙腈洗提。洗提結(jié)果通過用260nm紫外吸光率監(jiān)視，并收集合適的級分，用在固定體積的紫外吸光率定量，在真空離心機(jī)中在室溫下蒸發(fā)干燥。
C.寡脫氧核糖核苷酸的特性純的寡核苷酸試驗(yàn)整份部分是由聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP標(biāo)記的32P。這些標(biāo)記的化合物在50伏/cm下電泳45分鐘后，通過14～20%聚丙烯酰胺凝膠的放射自顯影法檢定。這個方式可測定分子量。堿基組分可通過采用蛇毒液雙酯酶和細(xì)菌堿性磷酸酶，把寡脫氧核糖核苷酸消化為核苷酸來確定，隨后用逆相高壓液相色譜柱(HPLC)和10%乙腈，1%醋酸銨流動相對所得到的核苷酸進(jìn)行分離和定量。
Ⅱ、擴(kuò)增反應(yīng)從來自Poiesz博士的每個11個編碼的DNA樣品得到的一微克DNA被加入到100ml緩沖液中，緩沖液是由10m M Tris-HCl，PH 7.5，50mM氯化鈉和10m M氯化鎂組成，并含有100×10-12M的引物SK43，100×10-12M引物SK44和濃度皆為150×10-9M的d ATP，dCTP，dGTP和TTP。
所得到的溶液再加熱至100℃保持10分鐘，并冷卻至室溫，保持2分鐘，隨后，2μl含有大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片斷的一個單位加入溶液。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行兩分鐘，然后加熱至95℃2分鐘使酶失活。變性，引物退火，用Klenow片斷延長(每個步驟為2分鐘)和加入聚合酶，重復(fù)19次。
Ⅲ.寡脫氧核糖核苷酸探針的合成和磷酸化作用順序的一個標(biāo)記的DNA探針SK455′-＊ACGCCCTACTGGCCACCTGTCCAGAGCATCAGATCCCTG-3′，其中＊表示標(biāo)記，是根據(jù)第一部分描述的方法合成的。探針是這樣標(biāo)記的將探針10×10-12M與在40μl反應(yīng)溶液中的4個單位T聚核苷酸激酶和50×10-12Mγ32P-ATP(約7200居里/毫克分子)接觸90分鐘溫度為37℃，反應(yīng)溶液含有70m M Tris緩沖液(PH7.6)、10m MMg Cl、1.5mM精胺和2.5mM二硫代蘇糖醇。然后，全部反應(yīng)液用25m MEDTA調(diào)節(jié)到100μl，取出整份部分，用于通過TCA沉淀法測定比活性。標(biāo)記的探針用高速真空器濃縮，并在Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩沖液(89mM三羥甲基氨基甲烷，89mM硼酸，2.5mM乙二胺四乙酸，PH8.9)中，在18%聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺與BIS比例為19∶1)電泳純化500 Vhr。在放射自顯影照相法定位后，含有標(biāo)記探針的凝膠部分被切下來，壓碎并于0.2ml TE緩沖液中，在4℃過夜以洗提)。反應(yīng)產(chǎn)物的TCA沉淀物顯示比活性是2居里/毫克分子，最終濃度是20p M/ml。
Ⅳ、帶有探針和BglⅠ的擴(kuò)增基因組DNA的雜交/消化。
A、溶液中的測定10μl(微升)擴(kuò)增的DNA(含有71納克(ng)基因組DNA的預(yù)擴(kuò)增等效物)被放入一個1.5ml的微逐出管(Microfuge tube)，將20μl TE緩沖液加入至最終體積為30μl。樣品在95℃下變性，歷時100分鐘。將含有0.02PM SK45探針的10m10.6M Na Cl加入試管，輕輕地晃動混合，在上面鋪蓋礦物油，并立即轉(zhuǎn)移到56℃的加熱塊上一小時。加入10μl 50m M的Mg Cl2和1μl BglⅠ(8個單位)，重復(fù)退火的DNA在56℃消化30分鐘。通過加入4μl 75m MEDTA和6μl徑跡染料(tracking dye)至最終體積為60μl，使反應(yīng)停止。
無機(jī)油用0.2ml三氯甲烷提取，13μl反應(yīng)混合物(約15納克基因組DNA)摻入在Hoeffer SE200容器中的30%聚丙烯酰胺小凝膠中。凝膠在約300伏的電壓下電泳1小時，直到溴酚蘭染料從起點(diǎn)朝前移開3.0cm為止。凝膠頂端1.5cm被取出，其余部分凝膠暴露在-70℃的兩個強(qiáng)化篩(intensification)中，至少過夜。
B.用涂點(diǎn)法測定擴(kuò)增的DNA被加至Na OH和Na2EDTA的緩沖液中，最后的濃度為400mM Na OH和25m M Na2EDTA，最終體積為200μl。
將一離子膜在水中浸濕，放入到一個Bio-Rad免疫點(diǎn)真空器械中。然后抽真空，使器械保持平衡，上述的DNA樣品置于膜上。然后，用20×SSPE洗滌膜，這果SSPE是一種含有Na Cl，磷酸鈉，EDTA和Na OH組成的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。然后將膜取出，放于20×SSPE之中，攪拌2～5分鐘。然后對膜涂點(diǎn)干燥，在紫外光中暴露6分鐘，使DNA交聯(lián)到膜上。
然后，將膜置于預(yù)雜交溶液中[預(yù)雜交溶液含有3×SSPE，5×Denhardt′s溶液，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，30%甲酰胺，用玻璃杯蒸餾水(glass-distilled water)加到10ml]，在42℃下，攪拌30分鐘。然后將預(yù)雜交溶液排出，再加入5ml雜交溶液(與加入0.5×10-12MSK45一樣)。然后在攪拌下，在42℃保溫1小時。
在雜交后，膜放在2×SSPE，0.1% SDS的溶液在室溫、攪拌條件下沖洗二次，歷時15分鐘。然后再用0.2×SSPE，0.1% SDS溶液在50℃，攪拌下沖洗10分鐘。膜被涂點(diǎn)干燥和暴露到膠片上。
Ⅴ、結(jié)果討論在溶液中和膜上測定的放射自顯影照相表明，HTLVⅠ和ⅡDNA順序只存在在下列樣品342(HTLVⅠ)367(HTLVⅠ)、361(HTLVⅠ)、307(HTLVⅠ)、308B(HTLVⅠ)、323(HTLVⅡ)和326(HTLVⅠ)。所有后來發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)本，是HTLVⅠ或HTLVⅡDNA正鏈。另外四種樣品如下194BK＝來自白血病病人的DNA(沒有分離到病毒)，207＝進(jìn)行性白血病病人(不涉及皮膚)，340＝進(jìn)行性白血病病人(不同于207)，368H＝HTLVⅢ。
因此，所采用的引物可用于擴(kuò)增DNA以允許探針可準(zhǔn)確地測定順序。在10% DMSO(最小亞結(jié)構(gòu)分子式)存在下，在37℃擴(kuò)增也指出，HTLVⅠ和HTLVⅡ樣品是正樣品。
實(shí)施例2HTLVⅠ上述實(shí)施例1中的擴(kuò)增或雜交或消化實(shí)驗(yàn)可用擴(kuò)增Pol區(qū)3365～3483的HTLVⅠ專一的引物重復(fù)，這些引物是
5′-CTTCACAGTCTCTACTGTGC-3′(SK54)and5′-CGGCAGTTCTGTGACAGGG-3′(SK55).
下面的探針SK56與限制性內(nèi)切酶PvuⅡ一道使用5′-CCGCAGCTGCACTAATGATTGAACTTGAGAAGGAT-3′(SK56).
放射自顯影照相表明HTLVⅠDNA順序只存在于后來鑒定為HTLVⅠ正DNAs的樣品之中。
HTLVⅡ例1中的擴(kuò)增或雜交或消化實(shí)驗(yàn)可用擴(kuò)增Pol區(qū)4198～4300HTLVⅡ?qū)Ｒ坏囊镞M(jìn)行重復(fù)，這些引物是5′-ATCTACCTCCACCATGTCCG-3′(SK58)5′-TCAGGGGAACAAGGGGAGCT-3′(SK59).
下面的探針SK60可與限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ一道使用5′-TAAGGGAGTCTGTGTATTCATTGAAGGTGGAAATTGGGTC-3′(SK60).
放射自顯影照相表明，HTLVⅡDNA順序只存在于后來鑒定為HTLVⅡ正DNA的樣品323之中。
權(quán)利要求
1.一種測定或檢驗(yàn)核酸順序是否存在的方法，所述核酸順序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸，或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的核酸分離體之中，特別適于HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者分離體中的核酸，其核酸順序被懷疑是包含在樣品中，其特征在于該方法包括a、用核酸順序的每一鏈的寡核苷酸引物、四種不同的核苷三磷酸、一種聚合作用劑在雜交的條件下，一起或分別處理樣品，對于每一核酸順序鏈，每一引物的延長產(chǎn)物被合成，它與要測定或檢驗(yàn)的核酸順序的每一鏈互補(bǔ)，這樣，一種引物合成的延長產(chǎn)物，當(dāng)延長產(chǎn)物從它的補(bǔ)體中分離出來時，可作為合成其他引物的延長產(chǎn)物的模板；(b)、在變性條件下處理樣品以將引物延長產(chǎn)物從它們的模板中分離出來，如果待測的順序是存在的；(c)、用寡核苷酸引物處理步驟(b)中的產(chǎn)物，將步驟(b)中所產(chǎn)生的每一條單鏈作為模板合成引物延長產(chǎn)物，結(jié)果擴(kuò)增了要測定的順序，如果它是存在的話；和(d)、確定要測的順序是否存在于樣品之中。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述步驟(d)包括如下幾步(1)向步驟(c)的產(chǎn)物加入一個可與擴(kuò)增的核酸順序雜交的標(biāo)記探針;和(2)確定探針是否已經(jīng)與核酸樣品中的擴(kuò)增的順序雜交。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于步驟(b)和(c)至少重復(fù)一次，而且引物是從HTLVⅠ和HTLVⅡ基因組中的X區(qū)中選出的。
4.如權(quán)利要求
1～3的任一權(quán)利要求
所述的方法，其特征在于所述的聚合作用劑是從下列酶中選出的一種酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片斷，反轉(zhuǎn)錄酶、或一種在暴露到足夠使核酸變性的溫度下仍保持其酶活性以在步驟(a)和(c)的反應(yīng)溫度下，形成所述的延長產(chǎn)物的酶。
5.如權(quán)利要求
1～4中任一權(quán)利要求
所述的方法，其特征在于在步驟(a)之前，樣品用可使樣品中所含有的核酸鏈裸露的試劑處理，所述鏈可同時或隨后分離。
6.如權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于步驟(2)包括下列幾步(1)用對探針順序內(nèi)某一位置有識別的限制性內(nèi)切酶消化步驟(d)中的雜交了的混合物;和(2)確定限制消化物中是否含有與待測定的HTLVⅠ和HTLVⅡ順序或HTLVⅠ或HTLVⅡ順序存在有關(guān)的限制片斷。
7.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于步驟(1)和(2)使用了一種含有一個或一個以上具HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒基因組或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因組的順序的核酸的正控制和/或不含有任何具從HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒中得到的核酸的負(fù)控制。
8.一種含有擴(kuò)增核酸順序的組成，所述順序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸分離體或HTLVⅠ或HTLVⅡ兩者的核酸分離體中，特別是HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的分離體中的核酸，其特征在于，該組成是這樣產(chǎn)生的(a)、用核酸順序每條鏈的寡核苷酸先導(dǎo)物、四種不同的核苷三磷酸和一種聚合作用劑在雜交條件下，一起或分別處理含有所述核酸順序的非擴(kuò)增形式的樣品，對每一核酸順序，每一引物的延長產(chǎn)物被合成，延長產(chǎn)物基本上是與所要測定或檢驗(yàn)的核酸順序的每一鏈互補(bǔ)，這樣，從一個引物合成的延長產(chǎn)物，當(dāng)延長產(chǎn)物從它的補(bǔ)體上分離出來時，可以作為合成其他引物延長產(chǎn)物的模板;(b)、將引物延長產(chǎn)物從模板分離出來，在模板上，延長產(chǎn)物被合成以產(chǎn)生單鏈分子;和(c)、用寡核苷酸引物處理步驟(b)中的產(chǎn)物，這樣，用步驟(b)中所產(chǎn)生的每一條單鏈作為模板合成引物延長產(chǎn)物，結(jié)果導(dǎo)致了核酸順序的擴(kuò)增。
9.一種測定和檢驗(yàn)核酸順序是否存在的裝置，所述核酸順序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者核酸的分離體中，特別適于HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的分離體中的核酸，核酸順序被懷疑包含在樣品中，其特征在于該裝置包括(a)、一種用于要檢測的核酸順序的每鏈的寡核苷酸引物，它的一種或多種引物基本上與每條特定核酸順序的每條鏈互補(bǔ)，這樣，從一個引物合成的一種延長產(chǎn)物，當(dāng)延長產(chǎn)物從它的補(bǔ)體中分離出來時，可以作為合成其它引物延長產(chǎn)物的模板;和(b)、一種能與核酸順序雜交的標(biāo)記探針。
10.如權(quán)利要求
9所述的裝置，其特征在于它進(jìn)一步包括一種聚合作用劑，四種不同的核苷三磷酸中的一種和測定所述探針和所述順序雜交物的手段。
專利摘要
在含有一個或一個以上核酸的樣品中，是否存在HTLVI和HTLVII兩者分離體或HTLVI或HTLVII的分離體的核酸順序，以及懷疑含有這樣的順序可通過下述方法來測定，即采用引物擴(kuò)增順序以形成延長產(chǎn)物作為模板和測定擴(kuò)增的產(chǎn)物，如果它是存在的話。這可以通過把一種附加的標(biāo)記雜交探針加到已擴(kuò)增的產(chǎn)物上，或者游離于溶液中或固定在載體上來實(shí)現(xiàn)。
文檔編號C12N15/09GK87108073SQ87108073
公開日1988年6月8日 申請日期1987年11月25日
發(fā)明者約翰·約瑟夫·史寧史凱, 雪利·依·瓦克, 伯納德·波意茲 申請人:塞特斯公司, 紐約州立大學(xué)研究基金會導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan