專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生物大分子濃縮用ma/aa/mma共聚樹(shù)脂及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物大分子吸水濃縮用的共聚樹(shù)脂技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及輻射合成MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂及方法。
背景技術(shù)：
生物大分子在制備過(guò)程中由于過(guò)柱純化而使樣品的濃度變的很低，以致難以直接進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，為了保存和鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮脫水。
據(jù)趙永芳主編《生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用》(科學(xué)出版社2002，13-15頁(yè))和汪家政和范明主編《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》(科學(xué)出版社2002，60-74頁(yè))介紹，現(xiàn)有常用的生物大分子濃縮方法有沉淀法、吸附法、透析法、超濾法、減壓蒸餾法、冷凍干燥法。但是，沉淀法和吸附法容易對(duì)樣品的性質(zhì)產(chǎn)生影響；透析法的緩沖液要多次更換且透析膜易破裂；超濾雖易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制，但其不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過(guò)程中不可逆的變性，超濾膜價(jià)格昂貴且清洗困難，樣品損失大；減壓蒸餾法易使蛋白受熱變性；冷凍干燥法操作難度大，難以掌握，凍干過(guò)程中還可能會(huì)引起蛋白活性的降低。
據(jù)鄒新禧編著《超強(qiáng)吸水劑》(化學(xué)工業(yè)出版社，1991，1-8頁(yè))介紹，高吸水性樹(shù)脂是一種吸水能力特別強(qiáng)的功能高分子材料，其吸水量可達(dá)自身重量的幾十倍乃至幾千倍，且在一般壓力下具有保水性。該書(shū)的200-259頁(yè)介紹，高吸水性樹(shù)脂在結(jié)構(gòu)上是交聯(lián)度很低的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，它是由化學(xué)交聯(lián)和樹(shù)脂分子鏈間的相互纏繞物理交聯(lián)構(gòu)成的。吸水前，高分子長(zhǎng)鏈相互纏繞在一起，彼此交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，未電離成離子對(duì)，從而達(dá)到整體上的緊固程度。當(dāng)高分子遇水時(shí)，親水基與水分子的水合作用使高分子網(wǎng)束張展，釋放出親水離子，產(chǎn)生網(wǎng)內(nèi)外離子濃度差，從而造成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)外產(chǎn)生滲透壓，水分子以滲透壓作用向網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)滲透。由于樹(shù)脂吸水形成凝膠后強(qiáng)度較差，不易分離；樹(shù)脂網(wǎng)絡(luò)自身的高度親水性導(dǎo)致會(huì)在樹(shù)脂表面吸附蛋白質(zhì)，造成蛋白質(zhì)濃縮過(guò)程中的損失，因而已有吸水樹(shù)脂并不適用于濃縮生物蛋白樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種生物大分子濃縮用丙烯酰胺/丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚樹(shù)脂(MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂)及其使用方法，將高吸水性樹(shù)脂技術(shù)應(yīng)用于生物大分子濃縮脫水，以克服現(xiàn)有生物大分子濃縮的沉淀法和吸附法容易對(duì)樣品的性質(zhì)產(chǎn)生影響，透析法的緩沖液要多次更換且透析膜易破裂，超濾不適合樣品量較少的情況且有些蛋白可能產(chǎn)生不可逆的變性、超濾膜價(jià)格昂貴且清洗困難、樣品損失大，減壓蒸餾法易使蛋白受熱變性，冷凍干燥法操作難度大、且會(huì)引起蛋白活性的降低的缺陷。
本發(fā)明的生物大分子濃縮用MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂，特征在于其為按質(zhì)量比AA液體∶MA固體∶氫氧化鈉固體∶蒸餾水＝9∶1-2∶3-4.5∶30-50配成混合溶液，將此混合液與MMA液體按照體積比15-25混合，經(jīng)γ射線輻射共聚形成的三元共聚樹(shù)脂。
本發(fā)明的生物大分子濃縮用MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂的制備方法，利用γ射線引發(fā)單體的自由基聚合，其特征在于按質(zhì)量比AA液體∶MA固體∶氫氧化鈉固體∶蒸餾水＝9∶1-2∶3-4.5∶30-50配成混合溶液，將此混合液與MMA液體按照體積比15-25混合，震蕩至MMA懸浮均勻，立即利用γ射線引發(fā)三元單體聚合成為生物大分子濃縮用MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂。
使用時(shí)，先將本發(fā)明的MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂取一小段稱(chēng)重，吸水后再稱(chēng)重，算出單位重量樹(shù)脂吸水量，根據(jù)待濃縮溶液需要除去的水量計(jì)算出需要加入吸水樹(shù)脂的量；然后將本發(fā)明的樹(shù)脂根據(jù)需要量加入到待濃縮溶液中，靜置，吸水后取出膨脹的樹(shù)脂，取濃縮后溶液與初始溶液一起進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，檢查濃縮倍數(shù)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂利用分子篩和滲透壓協(xié)同作用對(duì)生物大分子溶液進(jìn)行脫水濃縮，解決了沉淀法和吸附法對(duì)樣品的性質(zhì)產(chǎn)生影響和冷凍干燥法引起蛋白活性的降低的問(wèn)題；MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂在制備時(shí)可以放在各種不同大小的容器中，制得的樹(shù)脂適用于生物大分子樣品量多或少的情況，解決了超濾法不適合樣品量較少的情況的問(wèn)題；MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂在使用過(guò)程中不用更換，解決了透析法的緩沖液要多次更換的問(wèn)題；MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂的使用環(huán)境是4℃下，解決了減壓蒸餾法易使蛋白受熱變性的問(wèn)題；MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂的表面不會(huì)吸附蛋白質(zhì)，濃縮后易于從溶液中分離出來(lái)，不會(huì)造成樣品的損失，解決了超濾膜價(jià)格昂貴且清洗困難，樣品損失大的問(wèn)題；MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂價(jià)格低廉，原料常見(jiàn)，制造和使用簡(jiǎn)單，解決了超濾膜價(jià)格昂貴和冷凍干燥法操作難度大，難以掌握的問(wèn)題。


圖1是用本發(fā)明的一種MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂濃縮的牛血清白蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖片。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例2采用另一種MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂濃縮牛血清白蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖片。
圖3是實(shí)施例3采用本發(fā)明共聚樹(shù)脂濃縮牛血清白蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖片。
圖4是實(shí)施例4以共聚樹(shù)脂濃縮牛血清白蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂并用于濃縮牛血清白蛋白首先用天平稱(chēng)量90g AA液體、10g MA固體、30g氫氧化鈉固體；用500mL蒸餾水溶解。用50mL移液管移取25mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液體，震蕩懸浮(在此可以使用超聲震蕩法)。聚AA均聚型高吸水性樹(shù)脂的吸水率高、耐鹽性差，而聚MA均聚型高吸水性樹(shù)脂的吸水率低，但耐鹽性較強(qiáng)，而生物大分子多溶解在鹽溶液中，故可用MA/AA兩種單體交聯(lián)。由于MA和AA兩種單體都是親水性化合物，會(huì)吸附生物大分子造成不必要的損失，于是按最大懸浮量加入疏水性化合物MMA用來(lái)共聚，得到一種新型三元共聚樹(shù)脂，達(dá)到適用于生物大分子濃縮的目的?；靹蚝笥米⑸淦魑』旌弦褐林睆?mm醫(yī)用點(diǎn)滴管中，鐵夾封閉塑料管兩端。使用3mm醫(yī)用點(diǎn)滴管為容器的好處在于制得的樹(shù)脂吸水膨脹后直徑利于操作，也方便我們直接根據(jù)樹(shù)脂的長(zhǎng)度估算其吸水的體積來(lái)達(dá)到不同的濃縮程度。立即將注有混合單體的點(diǎn)滴管置于Co60γ射線輻照，125Gy/min，50min。利用輻射聚合的優(yōu)勢(shì)在于輻射聚合可以不加引發(fā)劑，聚合物純度高，性能好；輻射聚合可以比化學(xué)聚合在更溫和的條件下進(jìn)行，一般可以在常溫常壓下進(jìn)行；輻射射線的穿透力強(qiáng)且在被照體系中均勻分布。輻照結(jié)束后室溫放置30min，利用輻射后效應(yīng)增大單體聚合度。取待濃縮牛血清白蛋白(BSA)溶液10mL，吸取20μL至EP管1中，標(biāo)記為“1×”。剪取4cm長(zhǎng)樹(shù)脂，剝?nèi)ネ鈱庸鼙?，投入待濃縮溶液中(15mL離心管)，4℃下靜置。觀察剩余溶液體積為5mL時(shí)，取20μL至EP管2中，標(biāo)記為“2×”。觀察剩余溶液體積為2mL時(shí)，取20μL至EP管3中，標(biāo)記為“5×”。用平頭鑷夾出樹(shù)脂，取約20μL EP管4中，標(biāo)記為“樹(shù)脂”。分別加80mL1×Sample Buffer至“1×”、“2×”、“5×”和“樹(shù)脂”管，100℃煮4min。各管分別加樣10μL進(jìn)行10％SDS PAGE電泳。SDS膠經(jīng)過(guò)染色，脫色如圖1。圖1中從左向右1-5條泳道分別是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(用來(lái)估測(cè)蛋白質(zhì)的分子量大小，標(biāo)識(shí)目標(biāo)蛋白，排除雜蛋白干擾)，“1×”樣品，“2×”樣品，“5×”樣品，樹(shù)脂樣。由膠可見(jiàn)蛋白的濃縮倍數(shù)逼近溶液濃縮前后體積比，蛋白損失趨進(jìn)于0。需要說(shuō)明的是在此沒(méi)有利用其他較精確的生化方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的精確濃度，而是根據(jù)膠上染色的深淺作出的估算，并且在樹(shù)脂樣品上并沒(méi)有蛋白存在的事實(shí)基礎(chǔ)上得到蛋白的濃縮倍數(shù)逼近溶液濃縮前后體積比的結(jié)論。
實(shí)施例2制備另一種MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂濃縮牛血清白蛋白BSA濃縮實(shí)驗(yàn)首先用天平稱(chēng)量90g AA液體、20g MA固體、45g氫氧化鈉固體；用300mL蒸餾水溶解。用20mL移液管移取15mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液體，震蕩懸浮?；靹蚝笥米⑸淦魑』旌弦褐林睆?mm醫(yī)用點(diǎn)滴管中，鐵夾封閉塑料管兩端。立即將注有混合單體的點(diǎn)滴管置于Co60γ射線輻照，125Gy/min，50min。取待濃縮BSA溶液10mL，吸取20μL至EP管1中，標(biāo)記為“1×”。剪取4cm長(zhǎng)樹(shù)脂，剝?nèi)ネ鈱庸鼙?，投入待濃縮溶液中(15mL離心管)，4℃下靜置。觀察剩余溶液體積為5mL時(shí)，取20μL至EP管2中，標(biāo)記為“2×”。觀察剩余溶液體積為2mL時(shí)，取20μL至EP管3中，標(biāo)記為“5×”。用平頭鑷夾出樹(shù)脂，取約20μL EP管4中，標(biāo)記為“樹(shù)脂”。分別加80mL1×Sample Buffer至“1×”、“2×”、“5×”和“樹(shù)脂”管，100℃煮4min。各管分別加樣10μL進(jìn)行10％SDS PAGE電泳。SDS膠經(jīng)過(guò)染色，脫色如圖2。圖2中從左向右6-10條泳道分別是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(用來(lái)估測(cè)蛋白質(zhì)的分子量大小，標(biāo)識(shí)目標(biāo)蛋白，排除雜蛋白干擾)，“1×”樣品，“2×”樣品，“5×”樣品，樹(shù)脂樣。由膠可見(jiàn)蛋白的濃縮倍數(shù)逼近溶液濃縮前后體積比，蛋白損失趨進(jìn)于0。
實(shí)施例3采用本發(fā)明共聚樹(shù)脂濃縮牛血清白蛋白實(shí)驗(yàn)首先用天平稱(chēng)量90g AA液體、8g MA固體、40g氫氧化鈉固體；用400mL蒸餾水溶解。用20mL移液管移取20mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液體，震蕩懸浮(在此可以使用超聲震蕩法)?；靹蚝笥米⑸淦魑』旌弦褐林睆?mm醫(yī)用點(diǎn)滴管中，鐵夾封閉塑料管兩端。立即將注有混合單體的點(diǎn)滴管置于Co60γ射線輻照，125Gy/min，50min。取待濃BSA溶液10mL，吸取20μL至EP管1中，標(biāo)記為“1×”。剪取4cm長(zhǎng)樹(shù)脂，剝?nèi)ネ鈱庸鼙?，投入待濃縮溶液中(15mL離心管)，4℃下靜置。觀察剩余溶液體積為5mL時(shí)，取20μL至EP管2中，標(biāo)記為“2×”。觀察剩余溶液體積為3.3mL時(shí)，取20μL至EP管3中，標(biāo)記為“3×”。觀察剩余溶液體積為2mL時(shí)，取20μL至EP管4中，標(biāo)記為“5×”。用平頭鑷夾出樹(shù)脂，取約20μL EP管5中，標(biāo)記為“樹(shù)脂”。分別加80mL1×Sample Buffer至“1×”、“2×”、“3×”、“5×”和“樹(shù)脂”管，100℃煮4min。各管分別加樣10μL進(jìn)行10％SDS PAGE電泳。SDS膠經(jīng)過(guò)染色，脫色如圖3。圖3中從左向右11-16條泳道分別是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記，“1×”樣品，“2×”樣品，“3×”樣品，“5×”樣品，樹(shù)脂樣。由膠可見(jiàn)蛋白的濃縮倍數(shù)小于溶液濃縮前后體積比，有部分蛋白吸附在樹(shù)脂上，以樹(shù)脂膨脹后總體積計(jì)算則蛋白損失量較大。說(shuō)明MA相對(duì)含量減少會(huì)使樹(shù)脂表面吸附蛋白。
實(shí)施例4以共聚樹(shù)脂濃縮牛血清白蛋白實(shí)驗(yàn)首先用天平稱(chēng)量90g AA液體、10g MA固體、40g氫氧化鈉固體；用400mL蒸餾水溶解。用20mL移液管移取28mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液體，震蕩懸浮?；靹蚝笥米⑸淦魑』旌弦褐林睆?mm醫(yī)用點(diǎn)滴管中，鐵夾封閉塑料管兩端。立即將注有混合單體的點(diǎn)滴管置于Co60γ射線輻照，125Gy/min，50min。取待濃縮BSA溶液10mL，吸取20μL至EP管1中，標(biāo)記為“1×”。剪取4cm長(zhǎng)樹(shù)脂，剝?nèi)ネ鈱庸鼙冢度氪凉饪s溶液中(15mL離心管)，4℃下靜置。觀察剩余溶液體積為6.7mL時(shí)，取20μL至EP管2中，標(biāo)記為“1.5×”。觀察剩余溶液體積為5mL時(shí)，取20μL至EP管3中，標(biāo)記為“2×”。觀察剩余溶液體積為3.3mL時(shí)，取20μL至EP管4中，標(biāo)記為“3×”。觀察剩余溶液體積為2.5mL時(shí)，取20μL至EP管5中，標(biāo)記為“4×”。觀察剩余溶液體積為2mL時(shí)，取20μL至EP管6中，標(biāo)記為“5×”。用平頭鑷夾出樹(shù)脂，取約20μL EP管7中，標(biāo)記為“樹(shù)脂”。分別加80mL1×Sample Buffer至“1×”、“1.5×”“2×”、“3×”、“4×”“5×”和“樹(shù)脂”管，100℃煮4min。各管分別加樣10μL進(jìn)行10％SDS PAGE電泳。SDS膠經(jīng)過(guò)染色，脫色如圖3。圖3中從左向右17-23條泳道分別是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記，“1×”樣品，“1.5×”樣品，“2×”樣品，“3×”樣品，“4×”樣品，“5×”樣品，樹(shù)脂樣。由膠可見(jiàn)蛋白的濃縮倍數(shù)小于溶液濃縮前后體積比，有部分蛋白吸附在樹(shù)脂上，蛋白損失量較大。說(shuō)明MMA相對(duì)含量減少會(huì)使樹(shù)脂表面吸附蛋白。
實(shí)施例5BSA濃縮實(shí)驗(yàn)首先用天平稱(chēng)量90g AA液體、10g MA固體、20g氫氧化鈉固體；用550mL蒸餾水溶解。用20mL移液管移取28mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液體，震蕩懸浮?；靹蚝笥米⑸淦魑』旌弦褐林睆?mm醫(yī)用點(diǎn)滴管中，鐵夾封閉塑料管兩端。立即將注有混合單體的點(diǎn)滴管置于Co60γ射線輻照，125Gy/min，50min。氫氧化鈉相對(duì)含量減少和蒸餾水含量增加使樹(shù)脂表面粘著性增大粘著性大，處理困難，不適用于濃縮用途。
權(quán)利要求
1.一種生物大分子濃縮用MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂，特征在于其為按質(zhì)量比AA液體∶MA固體∶氫氧化鈉固體∶蒸餾水＝9∶1-2∶3-4.5∶30-50配成混合溶液，將此混合液與MMA液體按照體積比15-25混合，經(jīng)γ射線輻射共聚形成的三元共聚樹(shù)脂。
2.一種生物大分子濃縮用MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂的制備方法，利用γ射線引發(fā)單體的自由基聚合，其特征在于按質(zhì)量比AA液體∶MA固體∶氫氧化鈉固體∶蒸餾水＝9∶1-2∶3-4.5∶30-50配成混合溶液，將此混合液與MMA液體按照體積比15-25混合，震蕩至MMA懸浮均勻，立即利用γ射線引發(fā)三元單體聚合成為生物大分子濃縮用MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂。
全文摘要
本發(fā)明生物大分子濃縮用MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂及其制備方法，特征是按質(zhì)量比AA液體∶MA固體∶氫氧化鈉固體∶蒸餾水＝9∶1－2∶3－4.5∶30－50配成混合溶液，按與MMA液體體積比15－25混合，震蕩至MMA懸浮均勻，采用γ射線引發(fā)三元單體聚合，即成為生物大分子濃縮用MA/AA/MMA共聚樹(shù)脂；可應(yīng)用于生物大分子濃縮脫水。本發(fā)明可克服現(xiàn)有生物大分子濃縮的沉淀法和吸附法容易對(duì)樣品的性質(zhì)產(chǎn)生影響，透析法的緩沖液要多次更換且透析膜易破裂，超濾不適合樣品量較少的情況且有些蛋白可能產(chǎn)生不可逆的變性、超濾膜價(jià)格昂貴且清洗困難、樣品損失大，減壓蒸餾法易使蛋白受熱變性，冷凍干燥法操作難度大、且會(huì)引起蛋白活性的降低的缺陷。
文檔編號(hào)C08F220/14GK1624016SQ20031010654
公開(kāi)日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月5日
發(fā)明者姚雪彪, 張穎, 陳文明, 竇震 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)