專利名稱：具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，屬生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多孔可降解高分子生物材料如聚α-羥基酸類的聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚β-羥基烷酸酯(PHA)類的聚三羥基丁酯(poly3-hydroxybutyrate)(PHB)，聚三羥基戊酯(poly3-hydroxvalerate)(PHV)和聚三羥基丁酯-三羥基戊酯(PHBV)，以及聚己酸內(nèi)酯(polycaprolactone)(PCL)，聚氨基甲酸酯類(polyurethanes)(PU)，聚丙烯酸-反式丁烯二酸(Polypropylene furmarate)(PPF)材料在組織損傷修復(fù)和作為組織工程細(xì)胞支架材料方面已經(jīng)有許多研究和應(yīng)用報(bào)道(Biomaterials，1998，19 1405-1412；J Biomed Mater Res，1996，30，475-84及J Biomed Mater Res 1993，27，1135-1148)。過去的研究顯示，三維多孔細(xì)胞載體支架材料的三維結(jié)構(gòu)、氣孔率、孔徑、孔的連通性及連通孔徑都對(duì)細(xì)胞的植入、貼附、增殖、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)建有影響。而復(fù)雜多孔結(jié)構(gòu)的材料的成型制備技術(shù)也是影響組織工程材料發(fā)展的關(guān)鍵之一。目前最常用的制備方法是溶劑澆鑄/鹽瀝濾法是由Mikos等人(美國發(fā)明專利5514378)提出的。該技術(shù)使用氯化鈉、糖類晶體等不溶于有機(jī)溶劑的顆粒作為致孔劑，可用于制備PLLA、PLGA等可溶于有機(jī)溶劑(如氯仿和二氯甲烷)的高分子聚合物多孔細(xì)胞支架。為了制備高孔隙率的支架，也有人采用近似立方形的粒子來制備(Biomaterials，2000，21，2443-2452)多孔支架，但此種方法嚴(yán)重影響支架的力學(xué)強(qiáng)度。
用溶劑澆鑄/鹽瀝濾法可以制備出孔隙率高達(dá)95％的多孔膜和三維支架。其孔隙率可以通過控制致孔劑與聚合物溶液的比例調(diào)節(jié)，而孔隙的大小由致孔劑的幾何尺寸控制。由于該技術(shù)具有這些優(yōu)點(diǎn)，成為組織工程支架用多孔細(xì)胞支架的常用制備技術(shù)，廣泛用于骨、軟骨、神經(jīng)、皮膚組織構(gòu)建。但是，傳統(tǒng)的溶液澆鑄/粒子析出技術(shù)也存在一些不足之處，主要問題是孔的形態(tài)與所加致孔劑的形態(tài)相似，呈立方狀體；孔隙間的相互連通程度不高、沒有達(dá)到最適合細(xì)胞生長(zhǎng)的三維多孔連通結(jié)構(gòu)(Biomaterials，1998，19，4105)。此外，由于孔的連通性差，致孔劑在支架中有殘余，導(dǎo)致支架的力學(xué)穩(wěn)定性差，力學(xué)強(qiáng)度低。
動(dòng)物和人體的松質(zhì)骨主要由無機(jī)磷酸鈣礦物晶體與有機(jī)的膠原蛋白復(fù)合而成。通過化學(xué)方法如采用鹽酸溶液浸泡可以將無機(jī)組分溶去，留下多孔的有機(jī)三維多孔支架。這種去礦物支架(脫鈣骨)具有優(yōu)良的三維多孔結(jié)構(gòu)、高的氣孔率和孔連通性。過去的研究顯示，脫鈣骨的結(jié)構(gòu)非常適合用于骨組織缺損修復(fù)和作為骨組織工程細(xì)胞支架。但是，異體骨和自體骨的來源非常有限，而且由于脫鈣骨的主要組成是膠原蛋白，異種骨和異體骨來源的脫鈣骨直接植入人體內(nèi)有可能會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。這些缺點(diǎn)大大限制了脫鈣骨作為直接植入體應(yīng)用的推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種按權(quán)利要求1或4所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，它是以骨為模板，采用可降解合成高分子材料制備具有脫鈣骨三維結(jié)構(gòu)的支架材料。該多孔支架材料不僅可以彌補(bǔ)脫鈣骨來源不足的限制，而且可以避免任何的免疫排斥反應(yīng)，在組織損傷修復(fù)和組織工程的研究和應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，具有脫鈣骨多孔三維結(jié)構(gòu)的高分子生物支架材料的制備及其性能研究還未見報(bào)道。所述的多孔支架不僅具有自然骨的有機(jī)部分的孔結(jié)構(gòu)，而且具有足夠的力學(xué)強(qiáng)度，可作為組織缺損修復(fù)材料和骨組織工程細(xì)胞支架材料，以滿足新一代生物材料發(fā)展的需要。
本發(fā)明提出的一種具有脫鈣骨多孔三維結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于該方法包括以下幾個(gè)步驟(1)制備骨模板取動(dòng)物或人尸體關(guān)節(jié)部位的松質(zhì)骨后，一種方法是在去離子水中浸泡2～3天，去掉血水，然后在40～100℃烘箱中干燥。將干燥后的松質(zhì)骨放在爐中經(jīng)800～1300℃保溫2～4小時(shí)煅燒，升溫速率2～3℃/min制得煅燒骨，它只具有松質(zhì)骨的無機(jī)組分。另外一種方法是使用化學(xué)方法如用乙二胺浸泡松質(zhì)骨48～72h，然后用流動(dòng)的水和去離子水反復(fù)沖洗24～96h，冷凍干燥也可得上述同樣的結(jié)果。
(2)所用的材料為高分子材料而且澆鑄態(tài)為溶液狀態(tài)。將高分子材料溶解在溶劑中，形成不同濃度的溶液。將方法1所得的骨模板浸泡在高分子材料溶液中，在室溫下30～60分鐘。浸泡結(jié)束后從溶液中取出浸泡物，置于通風(fēng)櫥中室溫干燥24～72h，再在真空干燥箱中50～70℃干燥24～72h。
(3)干燥結(jié)束后，將骨模版與高分子的混合物浸泡在鹽酸溶液中，室溫48～72h，溶解掉骨模板后得到高分子支架，再將此支架用與鹽酸濃度相當(dāng)?shù)臐舛鹊腘aOH溶液沖洗，然后用去離子水沖洗2～3次，最后在室溫干燥即得本發(fā)明所述高分子支架。
本發(fā)明所用的高分子主要是生物降解型的，不過也可以用非生物降解型的高分子材料。生物降解型的主要由聚羥基羧酸酯(包括聚羥基乙酸、聚己乙酯等或其共聚物)、聚原酸酯、聚酸酐、或由它們組成的共聚物、共混物等。常用的非降解型的高分子主要包括聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚砜等具有一定生物相容性的材料。
本發(fā)明所用得制備骨模板的方法包括高溫煅燒法和化學(xué)方法。
本發(fā)明所用的高分子的溶劑首先應(yīng)對(duì)所用高分子不溶解，且不會(huì)改變高分子的性質(zhì)。通常采用具有揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，一般為氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜、N，N-二甲基乙酰胺、1，4-而氧環(huán)六烷等。最佳溶劑為氯仿。
本發(fā)明所用的高分子溶液的濃度為2-30％(W/V)。
本發(fā)明所用的鹽酸溶液的濃度為0.5-4mol/L。
本發(fā)明主要采用生物相容性高分子作為支架材料，從而可以減少或避免毒副反應(yīng)的發(fā)生，能更好的符合醫(yī)學(xué)應(yīng)用要求。
利用本發(fā)明制備的多孔高分子支架材料具有與脫鈣骨完全相同的三維多孔結(jié)構(gòu)和氣孔率，孔與孔之間完全連通。而且，由于其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)使得本發(fā)明制備的材料與采用傳統(tǒng)溶劑澆鑄/鹽瀝濾法制備的具有相同氣孔率的多孔支架材料相比具有更高的力學(xué)強(qiáng)度，材料的抗壓強(qiáng)度達(dá)到100～500KPa，抗壓摸量為0.5-5MPa。


通過下面的結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明所做的詳細(xì)說明，可以更好地理解本發(fā)明所述的技術(shù)方法。其中，圖1為脫鈣骨的光學(xué)顯微鏡照片；圖2為采用10％聚乳酸(PDLLA)制備的具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔支架光學(xué)顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明優(yōu)異的特點(diǎn)和效果可從下列實(shí)施例來描述，但它們并不是對(duì)本發(fā)明作任何限制。
實(shí)施例1取動(dòng)物或人尸體關(guān)節(jié)部位的松質(zhì)骨，在去離子水中浸泡三天，去掉血水，然后在60℃烘箱中干燥。將干燥后的松質(zhì)骨放在爐中經(jīng)1100℃保溫兩小時(shí)煅燒，升溫速率2℃/min制得煅燒骨。將分子量為七萬的聚(D，L-乳酸)(PDLLA)溶解在三氯甲烷中制備出10％的聚乳酸溶液。在室溫下將煅燒骨在聚乳酸溶液中浸泡30分鐘。浸泡結(jié)束后從溶液中取出煅燒骨，置于通風(fēng)櫥中室溫干燥24h，再在50℃真空干燥箱中干燥24h。干燥結(jié)束后，在室溫下將此煅燒骨與聚乳酸的混合物在100ml 1mol/L的鹽酸溶液中浸泡48h，溶解掉煅燒骨模板得到多孔支架，再將此支架用1mol/L的NaOH溶液沖洗，然后用去離子水沖洗三次，最后在室溫干燥得到具有脫鈣骨三維結(jié)構(gòu)的聚(D，L-乳酸)支架。該支架的抗壓強(qiáng)度可達(dá)210KPa，該支架材料適用于作為組織工程細(xì)胞支架材料，通過在該支架上植入成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外或體內(nèi)構(gòu)建骨組織。
實(shí)施例2采用按實(shí)施例1描述的方法制備的煅燒骨。將分子量為五萬的聚乙醇酸(PGA)溶解在三氯甲烷中制備出15％的聚乙醇酸溶液。在室溫下將煅燒骨在聚乙醇酸溶液中浸泡30分鐘。浸泡結(jié)束后從溶液中取出煅燒骨，置于通風(fēng)櫥中室溫干燥24h，再在50℃真空干燥箱中干燥24h。干燥結(jié)束后，在室溫下將此煅燒骨與聚乙醇酸的混合物在100ml 4mol/L的鹽酸溶液中浸泡48h，溶解掉煅燒骨模板得到多孔支架，再將此支架用4mol/L的NaOH溶液沖洗，然后用去離子水沖洗三次，最后在室溫干燥得到具有脫鈣骨三維結(jié)構(gòu)的聚乙醇酸支架。該支架的抗壓強(qiáng)度可達(dá)180KPa，該支架材料適用于作為組織工程細(xì)胞支架材料，通過在該支架上植入成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞在體外或體內(nèi)構(gòu)建骨或軟骨組織。
權(quán)利要求
1.一種具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于具體步驟是(1)采用天然骨除去松質(zhì)骨的有機(jī)成分制成骨模板；(2)高分子材料溶于有機(jī)溶劑，骨模板浸泡在高分子溶液中，浸泡結(jié)束后從溶液中取出浸泡物，干燥；(3)干燥后用鹽酸溶液除去骨模板，得到高分子支架。
2.按權(quán)利要求1所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于可采用下面二種方法中任意一種除去松質(zhì)骨的有機(jī)成分制備骨模板(1)高溫煅燒方法是取動(dòng)物或人尸體關(guān)節(jié)部位的松質(zhì)骨，在去離子水中浸泡2-3天，去掉血水，然后在40-100℃烘箱中烘干，再在800-1300℃經(jīng)2-4小時(shí)煅燒；(2)化學(xué)方法是用乙二胺浸泡松質(zhì)骨48-72h，然后用水和去離子水反復(fù)沖洗24-96h，冷凍干燥。
3.按權(quán)利要求1所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于高溫煅燒的升溫速率為2-3℃/min。
4.按權(quán)利要求1所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于所述的生物降解性的高分子為聚羥基羧酸酯、聚原酸酯、聚酸酐、或由它們所組成的共聚物、共混物中的任一種；所述的非生物降解性的高分子為聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇或聚砜材料中一種所述的溶劑為氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜、N，N-二甲基乙酰胺或1，4-而氧環(huán)六烷中的任何一種；高分子溶液的濃度為2-30％(W/V)。
5.按權(quán)利要求1或4所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于骨模板浸泡在高分子材料溶液中是室溫下30-60分鐘。
6.按權(quán)利要求1或4所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于骨模板浸泡在高分子溶液結(jié)束后，先室溫干燥24-72小時(shí)，再在50-70℃干燥24-72小時(shí)。
7.按權(quán)利要求1或4所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于所述的鹽酸溶液的濃度為0.5-4mol/L。
8.按權(quán)利要求1或4所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于干燥后骨模板和高分子的混合物浸泡在鹽酸溶液中的時(shí)間為48-72小時(shí)，浸泡結(jié)束后再將此支架用相應(yīng)濃度的NaOH溶液沖洗和去離子水沖洗2-3次，室溫干燥。
9.按權(quán)利要求1所述具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，其特征在于所制備的多孔高分子生物支架材料是用作組織缺陷修復(fù)材料或組織細(xì)胞支架材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有脫鈣骨結(jié)構(gòu)的多孔高分子生物支架材料的制備方法，屬生物材料領(lǐng)域。本發(fā)明以除掉有機(jī)成分的松質(zhì)骨為骨模板，將高分子材料溶于有機(jī)溶劑，然后澆注到骨模板內(nèi)。干燥后再采用鹽酸溶液將骨模板溶去，可以得到與天然松質(zhì)骨有機(jī)組分三維多孔結(jié)構(gòu)相同的高分子支架材料。采用此法制備的多孔支架材料具有比常規(guī)的鹽瀝濾法更高的力學(xué)強(qiáng)度、孔隙率和更多的連通孔。采用本發(fā)明制備的多孔支架材料適用作組織缺損修復(fù)材料和組織工程細(xì)胞支架材料。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單易行且便于推廣。
文檔編號(hào)C08J9/26GK1546179SQ20031010937
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者常江, 李海燕, 常 江 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所