專利名稱：醛糖酸酯、制備醛糖酸酯的方法和制備在游離氨基上與多糖或多糖衍生物偶聯(lián)的藥學(xué)活 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醛糖酸酯、包含這些酯的固形物和溶液及其制備方法。本發(fā)明還涉及用醛糖酸酯進(jìn)行的制備在游離氨基上與多糖或多糖衍生物偶聯(lián)的藥學(xué)活性成分的方法以及可通過這些方法獲得的藥學(xué)活性成分。
近年來，隨著生物工程研究的藥用蛋白質(zhì)的增加，藥學(xué)活性成分尤其是蛋白質(zhì)與聚乙二醇衍生物的軛合(“聚乙二醇化”)或與多糖如葡聚糖或尤其是羥乙基淀粉的軛合(“羥乙基淀粉化”)越來越重要。
這類蛋白質(zhì)的生物半衰期通常太短，但可以通過與上述聚合物如PEG或HES偶聯(lián)而被特別地延長。然而，這種偶聯(lián)也可能對(duì)蛋白質(zhì)的抗原性具有有益影響。對(duì)于其它藥學(xué)活性成分，通過這種偶聯(lián)可大大增加其在水中的溶解度。
DE 196 28 705和DE 101 29 369分別描述了通過相應(yīng)的羥乙基淀粉的醛糖內(nèi)酯(aldonolactone)與血紅蛋白和兩性霉素B的游離氨基在無水二甲亞砜(DMSO)中進(jìn)行羥乙基淀粉偶聯(lián)的可行方法。
由于通常不能使用無水、非質(zhì)子溶劑，尤其是對(duì)于蛋白質(zhì)，或者是出于溶解度的原因或者是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性，所以在水性介質(zhì)中與HES偶聯(lián)的方法還是行之有效的。例如，在鏈的還原端已被選擇性地氧化成醛糖酸的羥乙基淀粉的偶聯(lián)可通過水溶性碳二亞胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺)的介導(dǎo)進(jìn)行(PCT/EP 02/02928)。然而，使用碳二亞胺通常伴有弊端，因?yàn)樘级啺烦３?huì)引起蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)的副反應(yīng)。
對(duì)于含有磷酸酯基團(tuán)的化合物如核酸，這種偶聯(lián)通常是不可能的，因?yàn)榱姿狨セ鶊F(tuán)也可以與EDC反應(yīng)(S.S.Wong，Chemistry of ProteinConjugation and Cross-Linking，CRC-Press，Boca Raton，倫敦，紐約，華盛頓，1993，199頁)。
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所基于的目的是提供這樣的化合物該化合物尤其使得多糖或其衍生物與含氨基的活性成分尤其是蛋白質(zhì)在純水系統(tǒng)中或在含水的溶劑混合物中偶聯(lián)且避免前述弊端成為可能。
另外還期望這類化合物具有這樣的性質(zhì)活性成分與多糖或多糖衍生物通過共價(jià)鍵的連接盡可能是定量的。
另外，本發(fā)明還基于的目的是提供使多糖或其衍生物與活性成分在盡可能溫和的條件下連接成為可能的化合物。因此，尤其期望反應(yīng)盡可能少地改變活性成分的結(jié)構(gòu)、活性和耐受性。例如，避免分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)反應(yīng)。此外，還期望能與含磷酸酯基團(tuán)的活性成分連接。
因此本發(fā)明還有一個(gè)目的是給出可盡可能選擇性地與活性成分偶聯(lián)的化合物。因此，尤其期望能調(diào)節(jié)軛合物的特定化學(xué)計(jì)量學(xué)，特別期望通過使用這些化合物使得制備1∶1的軛合物成為可能。
最后，本發(fā)明還基于的目的是提供一種盡可能簡單且經(jīng)濟(jì)的制備這類化合物和多糖或多糖衍生物與活性成分的偶聯(lián)產(chǎn)物的方法。
這些目的以及其它雖然沒有逐字?jǐn)⑹龅捎杀疚闹兴龅纳舷挛拿黠@推導(dǎo)出的目的或由此自然明了的目的用權(quán)利要求1中所述的醛糖酸酯可以實(shí)現(xiàn)。對(duì)本發(fā)明的這些醛糖酸酯的適宜修飾以及可在制備軛合物的方法中使用的穩(wěn)定的醛糖酸酯被引用了權(quán)利要求1的從屬權(quán)利要求2-17所保護(hù)。
至于制備醛糖酸酯的方法，權(quán)利要求18-27能實(shí)現(xiàn)該基本目的。
權(quán)利要求28-32描述了制備多糖-活性成分軛合物的方法以及可通過這些方法獲得的藥學(xué)活性成分。
提供衍生自在鏈的還原端被選擇性地氧化成醛糖酸的多糖或多糖衍生物的醛糖酸酯可獲得實(shí)現(xiàn)上述目的的化合物。這類酯可被認(rèn)為是活化的酸。它們?cè)谒越橘|(zhì)中與親核的NH2基團(tuán)反應(yīng)得到(更穩(wěn)定的)酰胺。
此外，通過本發(fā)明尤其取得了以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的醛糖酸酯使得容易地將活性成分通過共價(jià)鍵與多糖或多糖衍生物連接成為可能。
本發(fā)明的醛糖酸酯可在溫和的條件下與活性成分反應(yīng)。在這種情況下，尤其是反應(yīng)對(duì)活性成分的結(jié)構(gòu)、活性和耐受性改變很小。以這種方法尤其可以避免特別是分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)反應(yīng)。另外，還可以偶聯(lián)含磷酸酯基團(tuán)的藥學(xué)活性成分而且不改變這些基團(tuán)。
本發(fā)明的醛糖酸可以與活性成分非常選擇性地偶聯(lián)。例如還可以調(diào)節(jié)所期望的軛合物的特定的化學(xué)計(jì)量學(xué)，使用這些化合物尤其使得制備1∶1的軛合物成為可能。
另外，本發(fā)明還提供了制備活化的醛糖酸酯和多糖或多糖衍生物與活性成分的偶聯(lián)產(chǎn)物的簡單且經(jīng)濟(jì)的方法。
本發(fā)明的醛糖酸酯由在鏈的還原端可被選擇性地氧化的多糖或多糖衍生物衍生而來。該類多糖以及可由其獲得的衍生物是本領(lǐng)域中所公知的，且可商購獲得。多糖是其分子中含大量的(最?。?0，但通常大得多)通過糖苷鍵連接在一起的單糖分子(葡萄糖)的大分子碳水化合物。優(yōu)選的多糖的重均分子量優(yōu)選為1500-1000000道爾頓，特別優(yōu)選為2000-300000道爾頓，非常特別優(yōu)選為2000-50000道爾頓。分子量Mw由常規(guī)方法測(cè)定。這些方法包括例如GPC、HPLC、光散射法等。
尤其可以通過多糖殘基的分子量來改變?cè)隗w內(nèi)的停留時(shí)間。
優(yōu)選的多糖包括淀粉和可通過水解獲得的淀粉片斷，這種淀粉片斷可被認(rèn)為是淀粉降解產(chǎn)物。通常淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，它們?cè)谥Щ壬嫌胁町悺１景l(fā)明特別優(yōu)選支鏈淀粉。
在此處支鏈淀粉首先是指在葡萄糖分子之間具有α-(1-4)和α-(1-6)鍵的非常廣泛支化的淀粉或淀粉產(chǎn)品。鏈的支化通過α-(1-6)鍵進(jìn)行。在天然存在的支鏈淀粉中大約每15-30葡萄糖區(qū)段不規(guī)則地存在這些支化。天然支鏈淀粉的分子量非常大，為107-2’108道爾頓。據(jù)估計(jì)支鏈淀粉還在一定限度內(nèi)形成螺旋。
對(duì)于支鏈淀粉可以定義其支化程度。支化的量度為具有分支點(diǎn)(α-(1-6)鍵)的葡萄糖殘基的分子數(shù)與支鏈淀粉中葡萄糖殘基的總分子數(shù)之比，該比值以mol％表示。天然存在的支鏈淀粉的支化度為約4mol％。制備醛糖酸酯優(yōu)選采用的支鏈淀粉具有5-10mol％的平均支化度。
還可以使用具有明顯超過已知天然支鏈淀粉的支化度的超支化支鏈淀粉。在此處，支化度在各種情況下均為平均值(平均支化度)，因?yàn)橹ф湹矸凼嵌喾稚⑽镔|(zhì)。
與未改性的支鏈淀粉或羥乙基淀粉相比，這類超支化支鏈淀粉具有明顯更高的支化度，所述支化度以支化的葡萄糖殘基的mol％表示，因此其結(jié)構(gòu)與糖原更相似。
超支化支鏈淀粉的平均支化度通常為＞10至25mol％。這就意味著這些支鏈淀粉平均約每10-4個(gè)葡萄糖單元具有一個(gè)α-(1-6)鍵，因而具有一個(gè)分支點(diǎn)?？捎糜卺t(yī)藥領(lǐng)域的優(yōu)選的支鏈淀粉類型的特征是支化度為11-16mol％。
進(jìn)一步優(yōu)選的超支化支鏈淀粉具有13-16mol％的支化度。
可用于本發(fā)明的支鏈淀粉優(yōu)選具有2000-800 000道爾頓、特別是2000-300 000道爾頓、特別優(yōu)選2000-50 000道爾頓的重均分子量Mw值。
上述淀粉可商購獲得。此外其分離也可由文獻(xiàn)獲悉。因此，淀粉尤其可從馬鈴薯、木薯、樹薯(manioc)、米、小麥或玉米中分離?？蓮倪@些植物中獲得的淀粉通常最初要進(jìn)行水解降解反應(yīng)。在該過程中，分子量從約20 000 000道爾頓降低至數(shù)百萬道爾頓，分子量進(jìn)一步降低至前面提到的值同樣也是已知的。尤其是采用蠟質(zhì)玉米淀粉降解片斷制備本發(fā)明的醛糖酸酯是可能的和特別優(yōu)選的。
上述的超支化淀粉片斷尤其在德國專利申請(qǐng)102 17 994中有描述。
另外還可以使用多糖衍生物制備本發(fā)明的醛糖酸酯。這些衍生物尤其包括羥烷基淀粉，例如羥乙基淀粉和羥丙基淀粉，其可以由上述淀粉、尤其是由支鏈淀粉通過羥烷基化獲得。其中，優(yōu)選羥乙基淀粉(HES)。
本發(fā)明優(yōu)選使用的HES是支鏈淀粉的羥乙基化衍生物，其中所述的支鏈淀粉為占蠟質(zhì)玉米淀粉95％以上的葡萄糖聚合物。支鏈淀粉由以α-1，4-糖苷鍵存在且具有α-1，6-糖苷分支的葡萄糖單元構(gòu)成。
HES具有有利的流變學(xué)性質(zhì)，目前在臨床上作為血容量替代物(volumereplacement agent)使用并用于血液稀釋療法(Sommermeyer等，Krankenhauspharmazie，第8卷(8，1987)271-278頁和Weidler等，Arzneimittelforschung/Drug Res.，41，(1991)494-498頁)。
HES主要由重均分子量Mw、數(shù)均分子量Mn、分子量分布和取代程度來表征。在這種情況下醚鍵中的羥乙基取代可能在葡萄糖殘基的2、3和6位碳原子上。在此處取代程度以DS(“取代度”)或MS(“摩爾取代度”)描述，其中DS以取代的葡萄糖分子在所有葡萄糖單元中的比例為基準(zhǔn)，MS是指每個(gè)葡萄糖單元中羥乙基的平均數(shù)。
取代程度MS(摩爾取代度)被定義為每個(gè)葡萄糖殘基的羥乙基平均數(shù)。它根據(jù)樣品中的羥乙基總數(shù)進(jìn)行測(cè)量，例如通過Morgan法、通過醚斷裂并隨后定量測(cè)定由此形成的碘乙烷和乙烯來測(cè)量。
不同的是，取代程度DS(取代度)被定義為取代的葡萄糖殘基在所有葡萄糖殘基中的比例。它可由樣品水解后所測(cè)得的未取代的葡萄糖量進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)這些定義很顯然MS＞DS。在其中只存在單取代即每個(gè)取代的葡萄糖殘基只有一個(gè)羥乙基的情況下，MS＝DS。
羥乙基淀粉殘基優(yōu)選具有MS為0.1-0.8的取代程度。特別優(yōu)選羥乙基淀粉殘基具有MS為0.4-0.7的取代程度。
對(duì)于羥乙基化作用，未取代的葡萄糖殘基中各羥基的反應(yīng)活性不同，這取決于反應(yīng)條件。因此有可能在一定限度內(nèi)影響取代模式，即隨機(jī)分布于各聚合物分子中的各個(gè)不同取代的葡萄糖殘基。有利的是C2位和C6位大部分被羥乙基化，C6因?yàn)槠淙菀捉咏１蝗〈?br> 對(duì)于本發(fā)明的目的而言，優(yōu)選使用主要在C2位上被取代和盡可能均勻取代的羥乙基淀粉(HES)。在EP 0 402 724 B2中描述了這類HES的制備。它們?cè)谏砩线m當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)完全降解，而另一方面又顯示出可控的消除特性。主要在C2位取代使得α-淀粉酶降解羥乙基淀粉較困難。有利的是如果可能在聚合物分子內(nèi)不存在連續(xù)取代的葡萄糖殘基，以便確保完全降解。此外，盡管取代度低，但這類羥乙基淀粉在水性介質(zhì)中具有足夠高的溶解度，以致其溶液在長時(shí)期內(nèi)也是穩(wěn)定的且不形成團(tuán)塊或凝膠。
基于葡萄糖殘基的羥乙基，優(yōu)選羥乙基淀粉殘基的C2∶C6取代比為2-15。C2∶C6取代比特別優(yōu)選為3-11。
上述的多糖或多糖衍生物的醛基選擇性地氧化成醛糖酸本身是已知的。該氧化可通過溫和的氧化劑例如DE 196 28 705 A1中所述的碘/氫氧化鉀或通過酶來完成。
可以使用游離的醛糖酸進(jìn)行反應(yīng)。另外，也可以使用鹽。這些鹽尤其包括堿金屬鹽，如例如醛糖酸的鈉鹽和/或鉀鹽。
使用醇制備本發(fā)明的醛糖酸酯。術(shù)語醇包括含HO基團(tuán)的化合物。這些HO基團(tuán)尤其可與氮原子或苯基鍵合。
優(yōu)選使用本領(lǐng)域已知的酸性醇。這些醇尤其包括N-羥基二酰亞胺例如N-羥基琥珀酰亞胺和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺、取代的酚和羥基吡咯，例如羥基苯并三唑，特別優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。
用于制備本發(fā)明的醛糖酸酯的其它合適的酸性醇在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。(V.H.L.Lee編輯，Peptide and Protein Drug Delivery，Marcel Dekker，1991，65頁)。
在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，使用其HO基團(tuán)的pka為6-12、優(yōu)選為7-11的醇。該值是指在25℃下測(cè)定的酸解離常數(shù)，該值在文獻(xiàn)中被多次引用。
醇的分子量優(yōu)選為80-500g/mol，尤其是100-200g/mol。
可以將醇以游離形式加入反應(yīng)混合物中。也可以使用在加入水后(適當(dāng)時(shí)用酸催化)可釋放醇的化合物進(jìn)行反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，使用碳酸二酯與醛糖酸或醛糖酸鹽進(jìn)行反應(yīng)。這些化合物使反應(yīng)能夠特別迅速和溫和，僅形成碳酸或碳酸鹽、醇和所期望的醛糖酸酯。
優(yōu)選的碳酸二酯尤其是N′N-琥珀酰亞胺基碳酸酯和磺基-N′N-琥珀酰亞胺基碳酸酯。
這些碳酸二酯可以以較小量被使用。因此，以醛糖酸和/或醛糖酸鹽為基準(zhǔn)，可以使用1至3摩爾過量、優(yōu)選1至1.5摩爾過量的碳酸二酯。使用碳酸二酯時(shí)反應(yīng)時(shí)間較短。因此，在很多情況下反應(yīng)可以在2小時(shí)后、優(yōu)選在1小時(shí)后完全。
產(chǎn)生醛糖酸酯的反應(yīng)優(yōu)選在無水非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。水含量應(yīng)優(yōu)選不超過0.5％重量，特別優(yōu)選不超過0.1％重量。合適的溶劑尤其是二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)和/或二甲基甲酰胺(DMF)。
酯化反應(yīng)是本身已知的，可以用任何一種方法進(jìn)行。產(chǎn)生醛糖酸酯的反應(yīng)尤其可使用活化化合物進(jìn)行。當(dāng)使用游離醇時(shí)這種方法是適宜的?；罨衔镉绕浒ㄌ级啺?，如例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。
當(dāng)使用游離的醇時(shí)，后者可以以摩爾過量使用。在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，以醛糖酸和/或醛糖酸衍生物為基準(zhǔn)，優(yōu)選使用5-50倍摩爾過量、特別優(yōu)選8-20倍摩爾過量的醇成分。
產(chǎn)生醛糖酸酯的反應(yīng)在溫和的條件下進(jìn)行。因此，上述反應(yīng)可優(yōu)選在0℃-40℃、特別優(yōu)選10℃-30℃的溫度下進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，反應(yīng)用低堿活性(base activity)進(jìn)行。低堿活性可通過將反應(yīng)混合物加入10倍過量的水中來測(cè)定。在這種情況下，加入之前水在25℃下的pH為7.0，水基本上不合緩沖劑。通過測(cè)量加入反應(yīng)混合物之后在25℃下的pH得到反應(yīng)混合物的堿活性。加入之后該混合物的pH優(yōu)選不高于9.0，特別優(yōu)選不高于8.0，且特別優(yōu)選不高于7.5。
HES-醛糖酸類例如與N-羥基琥珀酰亞胺的反應(yīng)在不含水、含EDC的干燥DMA中于室溫下平穩(wěn)進(jìn)行，得到HES-酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。在這一點(diǎn)上，特別令人驚奇的是不存在通過大量過量存在的葡萄糖殘基的OH基團(tuán)與EDC反應(yīng)而發(fā)生的HES分子的副反應(yīng)，且由EDC和醛糖酸最初形成的O-酰基異脲重排成相應(yīng)的N-?；宓姆磻?yīng)被抑制。
由上述反應(yīng)得到的溶液可不經(jīng)分離醛糖酸酯而直接用于偶聯(lián)反應(yīng)。由于與溶解在緩沖容積中的靶蛋白相比，在非質(zhì)子溶劑中的預(yù)活化的醛糖酸的體積通常較小，因此在大多數(shù)情況下非質(zhì)子溶劑的量沒有干擾作用。優(yōu)選的溶液包含至少10％重量的醛糖酸酯，優(yōu)選至少30％重量的醛糖酸酯，特別優(yōu)選至少50％重量的醛糖酸酯。
醛糖酸酯可被已知的沉淀劑如例如干燥的乙醇、異丙醇或丙酮從非質(zhì)子溶劑例如DMA的溶液中沉淀出來，并通過重復(fù)該過程一次以上而被純化。優(yōu)選的固形物包含至少10％重量的醛糖酸酯，優(yōu)選至少30％重量的醛糖酸酯，特別優(yōu)選50％重量的醛糖酸酯。
然后可將所述的醛糖酸酯分離出來作為用于偶聯(lián)例如用于羥乙基淀粉化的物質(zhì)。在此過程中，未發(fā)生與EDC活化的酸的上述副反應(yīng)。
對(duì)于偶聯(lián)，也可以將活化的醛糖酸的溶液加入藥學(xué)活性成分的水溶液中，該水溶液優(yōu)選是被緩沖的，具有適宜的pH。藥學(xué)活性成分包含至少一個(gè)可反應(yīng)產(chǎn)生醛糖酰胺(aldonamide)的氨基。優(yōu)選的活性成分包括蛋白質(zhì)和肽。
反應(yīng)的pH取決于活性成分的性質(zhì)。如果可能，pH優(yōu)選為7-9，特別優(yōu)選為7.5-8.5。
偶聯(lián)通常在0℃-40℃、優(yōu)選10℃-30℃的溫度下進(jìn)行，該溫度條件并非旨在進(jìn)行限制。反應(yīng)時(shí)間可通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ菀椎卮_定。反應(yīng)時(shí)間通常為1小時(shí)至100小時(shí)，優(yōu)選20小時(shí)至48小時(shí)。
相對(duì)于藥學(xué)活性成分，可以使用過量的醛糖酸酯。以藥學(xué)活性成分為基準(zhǔn)，優(yōu)選使用1-5倍摩爾過量、特別優(yōu)選1.5-2倍摩爾過量的醛糖酸酯。
在上述反應(yīng)中基本上唯一的副產(chǎn)物是醇，例如N-羥基琥珀酰亞胺，其可以容易地與偶聯(lián)產(chǎn)物分離，例如通過超濾法分離?？赡馨l(fā)生的副反應(yīng)是被水水解成游離的酸和游離的醇。因此特別令人驚奇的是本發(fā)明的醛糖酸酯大部分參與了與藥學(xué)活性成分的偶聯(lián)反應(yīng)。這從實(shí)施例、尤其是通過附圖中所描繪的色譜圖可明顯看出。


圖1未反應(yīng)的牛白蛋白(BSA)的MALLS-GPC色譜圖。單體白蛋白和二聚體白蛋白被明顯分開。
圖2未反應(yīng)的HES-10/0.4-琥珀酰亞胺基酯的MALLS-GPC色譜圖。
圖3 HES-10/0.4-琥珀酰亞胺基酯和BSA的反應(yīng)產(chǎn)物的MALLS-GPC色譜圖。所給出的信號(hào)是折射率(RI)、UV檢測(cè)器和90°的光散射信號(hào)的3重檢測(cè)信號(hào)。
圖4 HES-10/0.4-琥珀酰亞胺基酯和BSA的反應(yīng)產(chǎn)物的MALLS-GPC色譜圖，表示分子量對(duì)時(shí)間。
以下通過實(shí)施例和比較實(shí)施例更詳細(xì)地解釋了本發(fā)明，而并非旨在將本發(fā)明限制于這些實(shí)施例。
實(shí)施例和制備方法實(shí)施例1用N-羥基琥珀酰亞胺制備HES 10/0.4-酸酯在40℃下，將平均分子量Mw＝10000道爾頓且取代程度MS＝0.4、鏈的末端還原端已經(jīng)按照DE 19628705被選擇性地氧化的5g干燥羥乙基淀粉溶解在30ml干燥二甲基乙酰胺中，將溶液冷卻后，加入10倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺，同時(shí)排除潮氣。然后分份加入與HES酸等摩爾量的EDC，加入后24小時(shí)使反應(yīng)混合物反應(yīng)至完全。隨后用干燥丙酮沉淀出反應(yīng)產(chǎn)物并通過重復(fù)再沉淀將其純化。
實(shí)施例2Hes 10/0.4-酸偶聯(lián)的肌紅蛋白的制備將15mg肌紅蛋白溶解在20ml蒸餾水中，并用氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7.5。在1小時(shí)期間將1.5g實(shí)施例1中制備的HES 10/0.4-酸N-羥基琥珀酰亞胺分份加入該溶液中，并通過加入氫氧化鈉溶液使pH保持在7.5不變。
將混合物攪拌過夜。
通過凝膠滲透色譜法測(cè)定羥乙基淀粉化的肌紅蛋白的形成，以所用的肌紅蛋白為基準(zhǔn)，產(chǎn)率為70％。
實(shí)施例3用N′N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯制備HES 10/0.4-酸酯將0.02mmol(相當(dāng)于0.14g)干燥的HES 10/0.4-酸溶解在2ml干燥的二甲基甲酰胺中，同時(shí)排除潮氣。將0.02mmol N′N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯加入該溶液中，在室溫下攪拌1小時(shí)使反應(yīng)進(jìn)行至完全。
實(shí)施例4HES 10/0.4-酸與牛血清白蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物的制備將50mg牛血清白蛋白(相當(dāng)于0.7mmol BSA)溶解在6ml pH8.4的0.3摩爾的碳酸氫鹽溶液中。將由實(shí)施例3得到的混合物加入該溶液中，通過在室溫下攪拌2小時(shí)使反應(yīng)進(jìn)行至完全。
通過低壓HPGPC用多檢測(cè)(UV 280nm、MALLS光散射檢測(cè)器(MALLS＝多角激光散射)、RI檢測(cè)器)證明反應(yīng)已經(jīng)成功。
為了比較，圖1-4給出了未反應(yīng)的HES 10/0.4-琥珀酰亞胺基酯、起始原料BSA和反應(yīng)混合物的色譜圖。
由BSA峰的明顯降低和280nm處檢測(cè)到的更高分子量峰的出現(xiàn)可明顯看出反應(yīng)成功。
實(shí)施例5用N′N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯制備HES 50/0.7-酸酯將0.02mmol(0.5g)干燥的HES 50/0.7-酸溶解在2ml干燥的二甲基甲酰胺中，同時(shí)排除潮氣。將0.02mmol N′N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯加入該溶液中，在室溫下攪拌1小時(shí)使反應(yīng)進(jìn)行至完全。
實(shí)施例6HES 50/0.7與BSA偶聯(lián)產(chǎn)物的制備將50mg牛血清白蛋白BSA(0.7mmol)溶解在6ml pH8.4的0.3摩爾的碳酸氫鹽溶液中。將由實(shí)施例5得到的活化的HES 50/0.7-酸的溶液加入該溶液中，通過在室溫下攪拌2小時(shí)使反應(yīng)進(jìn)行至完全。
如實(shí)施例4所述通過低壓HPGPC用三重檢測(cè)對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行分析監(jiān)測(cè)。
由280nm處未反應(yīng)的BSA信號(hào)降低以及相應(yīng)的移動(dòng)至更高分子量的偶聯(lián)產(chǎn)物的信號(hào)的出現(xiàn)可明顯看出反應(yīng)成功。該移動(dòng)比實(shí)施例4中更大，與HES酸的更高的分子量相符合。
權(quán)利要求
1.在鏈的還原端被選擇性地氧化成醛糖酸的多糖或多糖衍生物的醛糖酸酯。
2.權(quán)利要求1中所述的醛糖酸酯，其特征在于所述的多糖或多糖衍生物為淀粉片斷或淀粉片斷衍生物。
3.權(quán)利要求2中所述的醛糖酸酯，其特征在于所述的淀粉片斷為支鏈淀粉降解片斷。
4.權(quán)利要求3中所述的醛糖酸酯，其特征在于所述的支鏈淀粉降解片斷通過酸降解和/或α-淀粉酶降解蠟質(zhì)玉米淀粉而獲得。
5.權(quán)利要求4中所述的醛糖酸酯，其特征在于所述的淀粉片斷具有Mw為2000-50 000道爾頓的平均分子量和5-10mol％α-1，6-糖苷鍵的平均分支。
6.權(quán)利要求4中所述的醛糖酸酯，其特征在于所述的淀粉片斷具有Mw為2000-50 000道爾頓的平均分子量和＞10-25mol％α-1，6-糖苷鍵的平均分支。
7.權(quán)利要求2中所述的醛糖酸酯，其特征在于所述的淀粉片斷衍生物為蠟質(zhì)玉米淀粉降解片斷的羥乙基衍生物。
8.權(quán)利要求7中所述的醛糖酸酯，其特征在于所述的羥乙基淀粉片斷的平均分子量Mw為2-300 000道爾頓，取代程度MS為0.1-0.8，且在葡萄糖殘基的C2和C6碳原子上的C2/C6取代比為2-15。
9.權(quán)利要求1-8中至少一項(xiàng)所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇分子量為80-500g/mol。
10.權(quán)利要求1-9中至少一項(xiàng)所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇pka為6-12。
11.權(quán)利要求1-10中至少一項(xiàng)所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇包含HO-N基團(tuán)或酚基團(tuán)。
12.權(quán)利要求1-11中至少一項(xiàng)所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇選自N-羥基琥珀酰亞胺、磺基-N-羥基琥珀酰亞胺、取代的酚和羥基苯并三唑。
13.權(quán)利要求12中所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇為N-羥基琥珀酰亞胺和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。
14.包含權(quán)利要求1-13中至少一項(xiàng)所述的至少一種醛糖酸酯的固形物。
15.包含權(quán)利要求1-13中至少一項(xiàng)所述的至少一種醛糖酸酯的溶液。
16.權(quán)利要求15中所述的溶液，其特征在于所述的溶液包含至少一種有機(jī)溶劑。
17.權(quán)利要求16中所述的溶液，其特征在于所述的溶液包含不超過0.5％重量的水。
18.權(quán)利要求15-17中至少一項(xiàng)所述的溶液，其特征在于所述的溶液包含至少一種非質(zhì)子溶劑。
19.權(quán)利要求18中所述的溶液，其特征在于所述的溶劑包括二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)和/或二甲基甲酰胺(DMF)。
20.制備權(quán)利要求1-19中至少一項(xiàng)所述的醛糖酸酯的方法，其特征在于使至少一種醛糖酸和/或一種醛糖酸衍生物與至少一種醇成分在非質(zhì)子溶劑中反應(yīng)。
21.權(quán)利要求20中所述的方法，其特征在于以醛糖酸和/或醛糖酸衍生物為基準(zhǔn)使用5-50倍摩爾過量的醇成分。
22.權(quán)利要求20或21中所述的方法，其特征在于使用至少一種活化試劑進(jìn)行反應(yīng)。
23.權(quán)利要求22中所述的方法，其特征在于所述的活化試劑包含至少一種碳二亞胺。
24.權(quán)利要求22或23中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于以醛糖酸和/或醛糖酸衍生物為基準(zhǔn)使用1-3摩爾過量的活化試劑。
25.權(quán)利要求20-24中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于使用一種釋放醇成分以與醛糖酸或醛糖酸衍生物反應(yīng)的化合物。
26.權(quán)利要求25中所述的方法，其特征在于使用碳酸二酯。
27.權(quán)利要求20-26中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于反應(yīng)在0-40℃的溫度下進(jìn)行。
28.權(quán)利要求20-27中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于反應(yīng)在低堿活性下進(jìn)行。
29.制備在游離氨基官能團(tuán)上與多糖或多糖衍生物偶聯(lián)的藥學(xué)活性成分的方法，其特征在于使權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的至少一種醛糖酸酯與含有至少一個(gè)氨基的藥學(xué)活性成分反應(yīng)。
30.權(quán)利要求29中所述的方法，其特征在于反應(yīng)在水性介質(zhì)中進(jìn)行。
31.權(quán)利要求30中所述的方法，其特征在于水性介質(zhì)的pH為7-9。
32.權(quán)利要求29-31中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于反應(yīng)在0℃-40℃的溫度下進(jìn)行。
33.權(quán)利要求29-32中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的藥學(xué)活性成分為多肽或蛋白質(zhì)。
34.可通過權(quán)利要求29-33中至少一項(xiàng)所述的方法獲得的藥學(xué)活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及在鏈的還原端被選擇性地氧化形成醛糖酸的淀粉片斷或淀粉片斷衍生物的醛糖酸酯以及含有所述的醛糖酸酯的固形物和溶液。本發(fā)明還涉及制備所述的醛糖酸酯的方法、制備在游離氨基上與多糖或多糖衍生物偶聯(lián)的藥學(xué)活性成分的方法以及由此獲得的藥學(xué)活性成分。
文檔編號(hào)C08B33/02GK1720264SQ200380104701
公開日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月4日
發(fā)明者K·佐默邁爾 申請(qǐng)人:超分子非腸道膠體有限公司