專利名稱：雙乳化制備兩類孔型剛性高分子介質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以雙乳化技術(shù)通過(guò)紫外光引發(fā)懸浮聚合制備兩類孔型高分子剛性微球分離介質(zhì)的方法，屬于用于生物大分子分離純化的色譜介質(zhì)制備技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代生物大分子分離純化技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，液相色譜儀是生物分子分離純化的重要工具，而其中分離介質(zhì)尤為重要。因而獲得優(yōu)良性能的兩類孔型介質(zhì)是生物分離方向的重要研究課題。
為了更快更好地分離效果，人們一直嘗試著找到好的色譜介質(zhì)。在研究作為催化劑載體的膜和大孔聚合物時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)膜的孔徑達(dá)到0.5μm時(shí)，只要有微小的壓力差就可以引發(fā)孔內(nèi)的對(duì)流傳質(zhì)，研究人員設(shè)想如果在色譜填料上有這種橫穿介質(zhì)的特大孔對(duì)流傳質(zhì)時(shí)，溶質(zhì)便會(huì)隨流動(dòng)相一道進(jìn)入介質(zhì)的內(nèi)孔表面，而不是靠濃度差進(jìn)行擴(kuò)散傳質(zhì)，從而加快傳質(zhì)過(guò)程。基于這一原理，Afeyan等人于1989年申請(qǐng)了一種多孔型高分子微球聚合物色譜介質(zhì)的美國(guó)專利(US Pat 5019270)，并把這種分離過(guò)程稱為灌注色譜(Peffusion Chromatography)。在灌柱色譜中，分子容易進(jìn)入顆粒的內(nèi)部，固定相粒子有兩種孔一類是穿透孔(6000～8000)貫穿于固定相的顆粒中，流體以對(duì)流形式通過(guò)；另一類是擴(kuò)散孔(800～1500)，其與穿透孔相連組成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，流體以擴(kuò)散的形式通過(guò)。利用該技術(shù)制備的大孔介質(zhì)的操作流速可達(dá)1500cm/h。該類介質(zhì)是由苯乙烯-二乙烯基苯為骨架的。
Gustavsson和Larsson在《Journal of Chromatography A》第734卷中報(bào)道了以油相(環(huán)己烷)為液體致孔劑，采用油/水/油的兩次乳化法制備超大孔瓊脂糖軟凝膠介質(zhì)的方法(P.E.Gustavsson and P.O.Larsson.Superporous agarose，a new material for chromatography，Journal of Chromatography A，1996，743，231-240)。這類超大孔介質(zhì)既保持瓊脂糖軟凝膠介質(zhì)原有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)具備流通孔的特性。在此基礎(chǔ)上，Larsson公開(kāi)了采用雙乳化法獲得超大孔軟凝膠介質(zhì)的專利技術(shù)(US5,723,601)。
Minglian Zhang等人在2001年《Journal of Chromatography A》第922卷中發(fā)表的論文以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，二乙烯基苯和三聚異氰尿酸三烯丙酯為交聯(lián)劑，有機(jī)致孔劑為環(huán)己醇和月桂醇，通過(guò)原位聚合反應(yīng)制備了具有兩類孔型聚甲基丙烯酸縮水甘油酸分離介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其分離介質(zhì)可以使柱內(nèi)傳質(zhì)性能大大改善，但是由于其微粒介質(zhì)形狀不規(guī)則，在高流速下容易發(fā)生破碎，限制了其應(yīng)用。
Yang Shi等在2003年的《Chromatographia》第57卷中發(fā)表的論文以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，二乙烯基苯和三聚異氰尿酸三烯丙酯為交聯(lián)劑懸浮聚合生成兩類孔型的PGDH分離介質(zhì)，并已經(jīng)申請(qǐng)了專利(CN01134656.6)。其致孔劑為固體碳酸鈣和有機(jī)溶劑，制得的分離介質(zhì)的在高的流速下(1535cm/h)有好的機(jī)械強(qiáng)度和高的動(dòng)態(tài)吸附容量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于生物大分子分離的兩類孔型剛性微球介質(zhì)的制備方法。以該方法制備的分離介質(zhì)具備高機(jī)械強(qiáng)度、高吸附容量和高傳質(zhì)速率的特點(diǎn)，且介質(zhì)的孔徑、孔隙率和粒徑是可控的。
本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的。采用雙乳化法光引發(fā)懸浮聚合制備兩類孔型剛性介質(zhì)微球。包括懸浮液的預(yù)處理與制備、雙乳化反應(yīng)、固化和交聯(lián)過(guò)程、固體微粒中致孔劑的去除過(guò)程，其特征在于，先將單體甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)按照0.3～3的體積比混合制成聚合物單體溶液；再將乳化劑司班80(Span80)、光聚合引發(fā)劑安息香乙醚溶解在上述的聚合物單體溶液中，司班80的濃度為10～100g/L單體溶液，光聚合引發(fā)劑安息香乙醚加入量相當(dāng)于聚合單體體積的0.1～5％；上述溶液混合均勻后，分別加入聚合物單體體積10～100％的有機(jī)致孔劑甲苯與正庚烷，混合均勻；然后加入濃度為1～40％的甘油水溶液，甘油水溶液的加入量為聚合單體體積的10～150％；上述溶液在2000～10000rpm攪拌速度下形成的乳化液加入到濃度為10～200 g/L的吐溫80(Tween 80)水溶液中，在500～5000rpm攪拌速度下再次攪拌形成二次乳化，吐溫80水溶液體積與聚合單體體積之比為1∶1～1∶20；上述乳化液在100～4000rpm轉(zhuǎn)速下采用0.5～4kW紫外光引發(fā)懸浮聚合反應(yīng)成聚合物微球，反應(yīng)時(shí)間為5～30分鐘；微球用無(wú)水乙醇進(jìn)行抽提除去液體致孔劑和乳化劑，再經(jīng)干燥即可得到兩類孔型P-GMA-EDMA-DE剛性分離介質(zhì)，抽提過(guò)程在常溫常壓下進(jìn)行。
上述的優(yōu)化條件單體甲基丙烯酸縮水甘油酯與交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯體積比為0.5～0.8，司班80的濃度為25～35g/L單體溶液；有機(jī)致孔劑甲苯與正庚烷體積分別為聚合物單體溶液體積的20～90％；甘油水溶液的濃度為15～25％，其加入體積為聚合單體體積的80～120％；甘油水溶液在聚合物單體中形成乳化液所需轉(zhuǎn)速為5000～8500rpm，二次乳化的攪拌速度為1000～2000rpm；二次乳化的連續(xù)相中吐溫80的濃度為25～135g/L水溶液，其水溶液體積與聚合單體體積之比為1∶2～1∶12；聚合反應(yīng)中紫外光的功率為1～2kW，攪拌速度為200～500rpm，反應(yīng)時(shí)間為15～25分鐘。
下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明1、本發(fā)明采用雙乳化技術(shù)形成微球。第一次乳化所用的致孔劑是甘油水溶液，選取的乳化劑是司班80，通過(guò)調(diào)節(jié)聚合反應(yīng)過(guò)程中甘油水溶液加入量和乳化過(guò)程的轉(zhuǎn)速可以有效地控制介質(zhì)超大孔(孔徑在500nm以上)的數(shù)量和大小，從而獲得較為理想的傳質(zhì)性能；第二次乳化過(guò)程選取的乳化劑是吐溫80。
2、致孔劑的選擇與添加量。在乳化過(guò)程中連續(xù)相和分散相的粘度是影響乳化液分散均勻度和穩(wěn)定性的重要因素。本發(fā)明將甘油作為水溶液的粘度調(diào)節(jié)劑，通過(guò)采用一定濃度的甘油水溶液使分散相在聚合物單體溶液中獲得較好的穩(wěn)定性。隨著水相致孔劑中甘油濃度的變化，兩類孔型介質(zhì)中超大孔的大小與數(shù)量也會(huì)發(fā)生變化；另外由于甘油是水溶性小分子，在微球介質(zhì)聚合成型后用乙醇或水多次洗滌即可除去。
3、有機(jī)致孔劑的選擇與配比。根據(jù)單體與交聯(lián)劑的類型，選擇適宜的有機(jī)致孔劑，以便形成的兩類孔型介質(zhì)具有大的比表面積，本發(fā)明采用甲苯與正庚烷為有機(jī)致孔劑，可以使合成的介質(zhì)比表面積大，吸附容量大，同時(shí)還可以提高微球介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度。
4、聚合方法的選擇。目前分離介質(zhì)大多采用懸浮熱聚合反應(yīng)，而本發(fā)明所用的微球的形成方法是雙乳化法，其形成的體系一般狀態(tài)下很不穩(wěn)定，要是采用常用的熱聚合法幾乎不能合成所需的微球，所以本發(fā)明利用電磁攪拌下的懸浮光引發(fā)聚合生成兩類孔型介質(zhì)微球，反應(yīng)所用光源為紫外線燈，功率是kW級(jí)的，反應(yīng)器位于紫外燈正下方，反應(yīng)液面離紫外線燈約30cm距離。光聚合反應(yīng)比熱聚合反應(yīng)用時(shí)大大縮短，可以加快介質(zhì)微球的制備速度。
5、乳化過(guò)程中轉(zhuǎn)速的控制。本發(fā)明中微球的形成就是靠?jī)纱稳榛纬傻模谝淮稳榛霓D(zhuǎn)速影響到兩類孔型介質(zhì)中超孔的大小及數(shù)量；第二次乳化的轉(zhuǎn)速影響到微球的粒徑分布。本發(fā)明的第一次乳化轉(zhuǎn)速為5000～8500rpm，第二次乳化轉(zhuǎn)速為1000～2000rpm。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是以紫外光引發(fā)懸浮聚合反應(yīng)，利用甘油水溶液—油—水雙乳化技術(shù)制備具有兩類孔型(超大孔和擴(kuò)散孔)的剛性介質(zhì)。該介質(zhì)的超大孔大小與介質(zhì)粒徑大小可以通過(guò)乳化過(guò)程調(diào)節(jié)，使操作技術(shù)更加簡(jiǎn)化；并且超大孔致孔劑是甘油水溶液，致孔劑去除也更容易，制備得到的分離剛性介質(zhì)在高的流速下(3000cm/h)有好的機(jī)械強(qiáng)度與高的動(dòng)態(tài)吸附容量。


圖1兩類孔型剛性介質(zhì)在光學(xué)顯微鏡下的照片(10×10)，可以看到介質(zhì)都是球形粒子圖2兩類孔型剛性介質(zhì)在掃描電子顯微鏡下的照片(1,500×)，能看到一個(gè)完整的球形粒子，并可以清晰的看到超大孔區(qū)；圖3兩類孔型剛性介質(zhì)在掃描電子顯微鏡下的照片(10,000×)，能在上面清晰的看到超大孔與小孔。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)例將對(duì)本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1稱取0.08克安息香乙醚和1.5克司班80溶解到4.5mL甲基丙烯酸縮水甘油脂(GMA)，3.0mL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)中；再加入3mL甲苯和2mL正庚烷并混合均勻。向混合液中加入8.5mL的20％的甘油溶液，以8000rpm攪拌5分鐘，在顯微鏡下可以清楚的看到其乳化所形成的小液滴，再將攪拌好的乳化液加入到60mL含有1.8克吐溫80的水溶液中，以1600rpm攪拌1分鐘，然后將整個(gè)混合體系轉(zhuǎn)移到帶有電磁攪拌的反應(yīng)器中，在2kW紫外燈下進(jìn)行懸浮聚合，反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到聚四氟紗袋中，用水多次洗滌，在自然條件下風(fēng)干，再用無(wú)水乙醇抽提24小時(shí)，除去有機(jī)致孔劑與乳化劑，真空干燥后得到上述的兩類孔型微球介質(zhì)3.0克。稱取1.0克兩類孔型介質(zhì)與5mL二氧六環(huán)和5mL二乙胺進(jìn)行混合，在60℃水浴搖床200rpm反應(yīng)6.5小時(shí)；待反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水多次洗滌介質(zhì)，然后向經(jīng)G3漏斗抽干后的介質(zhì)中加入60mL 0.1mol/L的硼氫化鈉溶液，在25℃水浴搖床200rpm反應(yīng)12小時(shí)；用蒸餾水與無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，充分干燥(＜1Tor，1Tor＝133.332Pa)，得到可以用于生物分離用的陰離子交換兩類孔型剛性分離介質(zhì)。制備好的剛性分離介質(zhì)的體積平均粒徑為42.53μm，比表面積為41.085m2/g干樹(shù)脂，靜態(tài)吸附容量為81.7mgBSA/mg濕樹(shù)脂。利用重力法在標(biāo)準(zhǔn)色譜柱(HR 5/10，Amersham Biosciences)中填充制好的分離介質(zhì)，在300cm/h流速下，動(dòng)態(tài)吸附容量高達(dá)32.63mgBSA/mL柱體積(54.83mg BSA/mg濕樹(shù)脂)，在3000cm/h流速下，動(dòng)態(tài)吸附容量高達(dá)21.31mgBSA/mL柱體積(35.52mg BSA/mg濕樹(shù)脂)。
實(shí)施例2稱取0.08克安息香乙醚和1.5克司班80溶解到4.5mL甲基丙烯酸縮水甘油脂(GMA)，3.0mL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)中；再加入3mL甲苯和2mL正庚烷混合均勻。向混合液中加入4.5mL的20％的甘油溶液，以8000rpm攪拌5分鐘，在顯微鏡下可以清楚的看到其乳化的小液滴，再將攪拌好的乳化液加入到含有1.8克吐溫80的60mL水中，以1600rpm攪拌1分鐘，然后將整個(gè)混合體系轉(zhuǎn)移到帶有電磁攪拌的反應(yīng)器中，在紫外燈下進(jìn)行懸浮聚合，反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到聚四氟紗袋中，用水洗滌，在自然條件下風(fēng)干，再用無(wú)水乙醇抽提24小時(shí)，除去有機(jī)致孔劑與乳化劑，真空干燥后得到上述的兩類孔型微球介質(zhì)3.0克，利用二乙胺修飾分離介質(zhì)，取1.0克分離介質(zhì)與5mL二氧六環(huán)和5mL二乙胺進(jìn)行混合，在60℃水浴搖床200rpm反應(yīng)6.5小時(shí)；待反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水多次洗滌介質(zhì)，向經(jīng)G3漏斗抽干后的介質(zhì)中加入60mL 0.1mol/L的硼氫化鈉溶液，在25℃水浴搖床200rpm反應(yīng)12小時(shí)，用蒸餾水與無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，充分干燥(＜1Tor，1Tor＝133.332Pa)，得到可以用于生物分離用的陰離子交換兩類孔型剛性分離介質(zhì)。制好的分離介質(zhì)的體積平均粒徑為42.0μm，靜態(tài)吸附容量為80.5mgBSA/mg濕樹(shù)脂。利用重力法在標(biāo)準(zhǔn)色譜柱(HR 5/10，Amersham Biosciences)中填充制好的分離介質(zhì)，在流速下，動(dòng)態(tài)吸附容量高達(dá)27.53mgBSA/mL柱體積(54.83mg BSA/mg濕樹(shù)脂)，在3000cm/h流速下，動(dòng)態(tài)吸附容量為11.31mgBSA/mL柱體積(18.85mg BSA/mg濕樹(shù)脂)。
權(quán)利要求
1.一種雙乳化制備兩類孔型剛性高分子介質(zhì)的方法，該方法包括聚合物單體溶液和致孔劑的選擇、乳化液形成、聚合反應(yīng)、清洗步驟，其特征在于先將單體甲基丙烯酸縮水甘油脂、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯按照0.3～3的體積比混合制成聚合物單體溶液；再將乳化劑司班80、光聚合引發(fā)劑安息香乙醚溶解在上述的聚合物單體溶液中，司班80的濃度為10～100g/L單體溶液，光聚合引發(fā)劑安息香乙醚加入量相當(dāng)于聚合單體體積的0.1～5％；上述溶液混合均勻后，分別加入聚合物單體體積10～100％的有機(jī)致孔劑甲苯與正庚烷，攪拌均勻；然后加入濃度為1～40％的甘油水溶液，甘油水溶液的加入量為聚合單體體積的10～150％；上述溶液在2000～10000rpm攪拌速度下形成的乳化液加入到濃度為10～200g/L的吐溫80水溶液中，在500～5000rpm攪拌速度下再次攪拌形成二次乳化，吐溫80水溶液體積與聚合單體體積之比為1∶1～1∶20；上述乳化液在100～4000rpm轉(zhuǎn)速下采用0.5～4kW紫外光引發(fā)懸浮聚合反應(yīng)成聚合物微球，反應(yīng)時(shí)間為5～30分鐘；微球用無(wú)水乙醇進(jìn)行抽提除去液體致孔劑和乳化劑，再經(jīng)干燥即可得到兩類孔型P-GMA-EDMA-DE剛性分離介質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于單體甲基丙烯酸縮水甘油脂與交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯體積比為0.5～0.8，司班80的濃度為25～35g/L單體溶液；有機(jī)致孔劑甲苯與正庚烷體積分別為聚合物單體溶液體積的20～90％；甘油水溶液的濃度為15～25％，其加入體積為聚合單體體積的80～120％；甘油水溶液在聚合物單體中形成乳化液所需轉(zhuǎn)速為5000～8500rpm，二次乳化的攪拌速度為1000～2000rpm；二次乳化的連續(xù)相中吐溫80的濃度為25～135g/L水溶液，其水溶液體積與聚合單體體積之比為1∶2～1∶12；聚合反應(yīng)中紫外光的功率為1～2kW，攪拌速度為200～500rpm，反應(yīng)時(shí)間為15～25分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雙乳化制備兩類孔型剛性高分子介質(zhì)的方法。該方法包括聚合物單體溶液和致孔劑的選擇、乳化液形成、聚合反應(yīng)、清洗步驟，其特征在于將單體甲基丙烯酸縮水甘油脂、光引發(fā)劑安息香乙醚、乳化劑司班80和交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯形成均勻的混合液，再將甘油水溶液致孔劑分散于混合溶液中形成乳化液；此乳化液在吐溫80水溶液中形成二次乳化；整個(gè)體系在一定轉(zhuǎn)速下通過(guò)紫外光引發(fā)懸浮聚合反應(yīng)；反應(yīng)后體系經(jīng)水和無(wú)水乙醇反復(fù)清洗獲得具有超大孔和擴(kuò)散孔兩類孔型結(jié)構(gòu)的色譜分離介質(zhì)。該方法制備的分離介質(zhì)具有超大孔，比表面積大，介質(zhì)內(nèi)部傳質(zhì)快，適于高速下操作，洗脫條件溫和，在大規(guī)模分離生物大分子具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08F2/00GK1563122SQ20041001906
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月22日
發(fā)明者孫彥, 孫國(guó)勇, 史清洪, 董曉燕, 白姝 申請(qǐng)人:天津大學(xué)