專利名稱：絲素蛋白海綿狀三維多孔材料制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于高分子化學(xué)、組織工程、基因工程、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)、醫(yī)藥學(xué)、生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用天然生物大分子—絲素蛋白制備三維多孔材料的方法。
背景技術(shù)：
蠶絲是一種天然蛋白質(zhì)纖維，由18種氨基酸組成。中國是絲綢之鄉(xiāng)，蠶絲在中國的應(yīng)用已有幾千年的歷史。蠶絲由于其獨(dú)特的珍珠光澤、良好的透氣性、質(zhì)地柔軟等性能而廣泛用作服飾材料。由天然蠶絲或廢蠶絲脫膠得到的絲素蛋白對人體無毒、抗原性微弱，和人體具有良好的生物相容性，它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用已日益引起國內(nèi)外研究人員的興趣和重視。近幾十年來，隨著人們對蠶絲研究的深入，對其應(yīng)用早已不僅僅局限于傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域，還應(yīng)用于醫(yī)藥、生物技術(shù)、日用化工、食品等方面。
絲素蛋白是一種對人體安全的綠色材料。利用絲素蛋白制備的絲素材料具有良好的生物相容性、無抗原性、易降解等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、生物技術(shù)、精細(xì)化工等諸多領(lǐng)域。目前多用作醫(yī)用手術(shù)縫合線、藥物緩釋材料、酶固定化材料、隱形眼鏡、細(xì)胞培養(yǎng)基、醫(yī)用材料、智能水凝膠等。
本發(fā)明人曾用絲素蛋白制備靈敏度很高的酶電極和納米微球。
“組織工程，，是一門新興的學(xué)科，其最終的目的是將功能細(xì)胞與可降解三維支架材料(人工細(xì)胞外基質(zhì))在體外聯(lián)合培養(yǎng)，構(gòu)建成為有生命的組織或器官，然后植入體內(nèi)，替代病損的組織，恢復(fù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能；或構(gòu)建一個(gè)有生命的體外裝置，用于暫時(shí)替代病損器官的一部分或全部功能；或?qū)⒛承┥锘钚晕镔|(zhì)如生物活性因子、干細(xì)胞等植入體內(nèi)，引導(dǎo)或誘導(dǎo)自身組織再生，達(dá)到修復(fù)組織結(jié)構(gòu)、恢復(fù)器官、器官功能的目的。
理想的組織工程支架材料通常應(yīng)具備以下特點(diǎn)(1)良好的生物相容性，其本身或降解產(chǎn)物對種子細(xì)胞和機(jī)體無毒性，不會(huì)引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)；(2)適度的生物降解速率，且該降解速率需和組織再生的速率相匹配，最后可完全吸收或安全地排出體外；(3)良好的結(jié)構(gòu)相容性，具有一定的力學(xué)強(qiáng)度和可塑性，能保持穩(wěn)定的三維立體結(jié)構(gòu)，海綿狀或纖維網(wǎng)狀三維支架應(yīng)具有互相連通的孔結(jié)構(gòu)與高的孔隙率，孔徑大小適當(dāng)，可以為種子細(xì)胞的均勻分布和生長提供足夠的空間，同時(shí)也有利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散。
(4)良好的表面相容性，材料表面應(yīng)有利于種子細(xì)胞的粘附與生長。
從臨床應(yīng)用的角度出發(fā)，組織工程的細(xì)胞支架不僅應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中能保持一定的形狀、不會(huì)在操作中破碎，而且還應(yīng)能耐受滅菌消毒處理；需具有一定的柔韌性，使之既能同機(jī)體組織縫合并貼合，又不會(huì)對機(jī)體組織造成機(jī)械損傷。因此，理想的細(xì)胞支架應(yīng)具有一定的生物降解速度、良好的生物相容性和細(xì)胞親和性、有一定的力學(xué)性能、能滅菌消毒、具有特定三維多孔結(jié)構(gòu)，且包含可以控制釋放生長因子的超分子集合體。
用于組織工程支架的材料通常是可降解的，因?yàn)橹Ъ芡黄饡簳r(shí)作用，最終還是希望它能降解并被人體排泄掉。許多天然和人工合成高分子材料以及無機(jī)陶瓷材料，都可被用來制備組織工程支架。膠原和透明質(zhì)酸、甲殼素、殼聚糖、糖胺聚糖、絲素蛋白等屬于天然生物降解材料，它們的細(xì)胞相容性好，異體免疫性反應(yīng)較弱，由它們得到的支架材料顯示出一定的優(yōu)越性。與天然材料相比，合成可降解高分子材料來源穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)和性能可根據(jù)不同組織需要人為地修飾和調(diào)控，可適用于較多的制備技術(shù)。其中最受重視的合成生物降解材料已被美國食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)使用。較常見的有聚己內(nèi)酯(polyε-caprolactone，PCL)和聚乙交酯(polyglycolide，PGA)、聚丙交酯(polylactide，PLA)及共聚物聚丙交乙交酯。這些材料的突出優(yōu)點(diǎn)是具有相對良好的生物相容性及可調(diào)節(jié)的物化性能，可以通過簡單的水解而降解，產(chǎn)物經(jīng)人體新陳代謝排出體外。但從更高的生物安全性角度來講，天然高分子材料避免了合成高分子制備過程中可能存在的引發(fā)劑、強(qiáng)毒性有機(jī)溶劑殘留以及是否能完全降解的問題。因此尋求開發(fā)一種天然的而又來源穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)和性能可根據(jù)不同組織需要人為地修飾和調(diào)控的高分子材料就顯得尤為重要。絲素蛋白由于其本身的特性，可作為一種潛在的兼有天然和合成高分子材料特性的生物材料。本發(fā)明人曾系統(tǒng)的研究了在溫和條件下制備絲素蛋白納米微球的工藝過程，研究結(jié)果顯示如果工藝條件選擇得當(dāng)絲素蛋白就有很強(qiáng)的可塑性能，可以按應(yīng)用目的制備不同的應(yīng)用器件。傳統(tǒng)的海綿狀多孔材料都是用添加致孔劑、發(fā)泡法、低溫反復(fù)冷凍等方法。
日本的Rina Nazarov等曾研究了三種制備再生絲素蛋白三維多孔材料的方法，分別用凍干法、發(fā)泡法、鹽瀝濾法制備多孔材料。但在制備工藝、材料的均一性、柔韌性、孔隙率、吸水率等方面仍有不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種全新的高性能絲素蛋白三維多孔材料的制備方法，使得工藝簡單，制得到材料性能優(yōu)異，易于按特定需求澆注成型。
本發(fā)明提出的高性能絲素蛋白三維多孔材料的制備方法，是一種全新的方法，具體是以天然的或再生絲素蛋白為原料，配成水溶液，用醇類有機(jī)溶劑(如正丁醇等)作變性劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性，然后澆注到特定容器，經(jīng)冷凍-解凍得到乳白色的海綿狀多孔材料；再用后處理溶劑浸泡、洗滌，調(diào)節(jié)海綿體的強(qiáng)度以及除去海綿體中殘留的有機(jī)溶劑，再經(jīng)真空干燥或冷凍干燥即得到絲素蛋白海綿狀三維多孔材料。
上述方法中，所用的絲蛋白為天然蠶繭或工業(yè)廢蠶絲經(jīng)脫膠，中性鹽溶解后用去離子水或PEG等水溶性高分子透析制備，重量濃度為0.1～40％。
上述方法中，添加的變性劑為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、乙二醇、丙三醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇、丙酮、四氫呋喃、吡啶之一種或幾種。加入的體積為絲素蛋白溶液體積的0.1-20倍。
上述方法中，所用的后處理劑為醇類溶劑(如甲醇、乙醇)、去離子水之一種或幾種。
上述方法的操作步驟如下將廢蠶絲用0.1～3.0％的NaHCO3或NaCO3溶液，或0.1～1.0mol/L的硼酸-硼砂緩沖溶液，在90～100℃的溫度下處理20～90分鐘，然后用去離子水漂洗干凈；按需要重復(fù)1～5次以完全脫除絲膠；65℃下干燥24h；接著將脫膠干燥后的絲蛋白用某種中性鹽(如7～10mol/L的BrLi溶液)或CaCl2-H2O-C2H5OH三元體系恒溫25～90℃攪拌下溶解，溶液灌入膜通量為10,000～1,4000的纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，制備的絲蛋白可調(diào)配濃度為0.1～40.0％的溶液。
取5mL絲蛋白溶液，在25℃低速攪拌下滴加0.1～20mL變性劑，放入變溫冰箱冷凍12～120h，冷凍溫度為-80-0℃。取出結(jié)冰的絲蛋白溶液室溫下解凍之后即得到白色海綿狀材料，再用乙醇等醇類有機(jī)溶劑和去離子水浸泡、洗滌以調(diào)節(jié)海綿體的強(qiáng)度同時(shí)除去海綿體中殘留的有機(jī)溶劑，再經(jīng)真空干燥或冷凍干燥即得到絲素蛋白海綿狀三維多孔材料。
上述方法制備的絲素蛋白海綿狀三維多孔材料具有很好的柔韌性和機(jī)械力學(xué)性能，孔隙率高、澆鑄性能好、復(fù)脹性好。實(shí)物和掃描電子顯微鏡如附圖1、2所示。本發(fā)明可以通過調(diào)節(jié)絲蛋白濃度、變性劑添加量、變性劑種類、冷凍時(shí)間、冷凍溫度、海綿體后處理時(shí)間等參數(shù)控制海綿體的孔隙率、孔徑尺寸、機(jī)械力學(xué)性強(qiáng)度等。用本方法制備的絲素蛋白海綿狀多孔材料穩(wěn)定性好、孔徑均一；柔韌性、彈性好，可任意折疊彎曲而不出現(xiàn)斷裂，壓縮形變＞90％，孔隙率可達(dá)到98％，彈性回復(fù)率可達(dá)100％，吸水率最高可達(dá)到5000％；復(fù)脹性能好，干態(tài)海綿放入水中五分鐘左右即完全復(fù)原。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明的技術(shù)措施所取得的獨(dú)特效果本發(fā)明利用變性劑誘導(dǎo)絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變后在低溫下進(jìn)一步發(fā)生冷凍相分離制得性能優(yōu)異的絲素蛋白海綿狀三維多孔材料，整個(gè)工藝工程無需添加任何引發(fā)劑、致孔劑、表面活性劑、交聯(lián)劑和強(qiáng)毒性有機(jī)溶劑，具有更高的生物安全性。制備過程中還可以通過調(diào)節(jié)絲蛋白濃度、變性劑添加量、變性劑種類、冷凍時(shí)間、冷凍溫度、海綿體后處理時(shí)間等參數(shù)很方便的控制海綿體的孔隙率、孔徑尺寸、機(jī)械力學(xué)性強(qiáng)度等。同時(shí)可以根據(jù)需要制備成特定形狀的多孔材料。
此外，絲蛋白是一種弱的兩性聚電解質(zhì)，pI為3.9～4.2，具有潛在的pH敏感性，可以在不同的pH條件下控制釋放。同時(shí)絲蛋白是一種純天然生物大分子，在體內(nèi)可完全降解，是作為藥物載體的理想材料。本發(fā)明的工藝過程簡單，成本低廉，因此，本發(fā)明在組織工程、基因工程、生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖1中(a)、(b)為兩種形狀的絲蛋白海綿狀三維多孔材料實(shí)物照片。
圖2中(a)、(b)為兩種絲蛋白海綿狀三維多孔材料的電子顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式
以下利用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
實(shí)施例1將10g左右去蛹蠶繭浸入2L 0.5％NaHCO3溶液中，攪拌煮沸55min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作一次后將蠶絲65℃下烘干24h放入干燥器備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲3g溶解于100mL濃度為9.5mol/L的BrLi溶液中，45℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為2.32％的絲蛋白水溶液，調(diào)節(jié)絲蛋白濃度為1.0％。
取上述絲蛋白溶液5mL，25℃恒溫水浴勻速攪棒下滴加3mL正丁醇，穩(wěn)定2min后倒入塑料盒再放入低溫冰箱-25C下冷凍48h。絲蛋白冷凍48h后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成乳白色海綿，乳白色海綿經(jīng)乙醇浸泡1h，再用去離子水浸泡沖洗，去除有機(jī)溶劑，再冷凍干燥即得到絲素蛋白海綿狀多孔材料。
實(shí)施例2將30g左右廢蠶絲浸入3L 0.5％Na2CO3溶液中，攪拌煮沸45min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲65℃下烘干之后放入干燥器備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲6g溶解于100mL濃度為10.0mol/L的BrLi溶液中，45℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為8％的絲蛋白水溶液，再通過稀釋，調(diào)節(jié)絲蛋白溶液濃度為5％。
取上述絲蛋白溶液10mL，25℃恒溫水浴勻速攪伴下滴加5mL丙酮，穩(wěn)定2min后放入低溫冰箱-30℃下冷凍24h。絲蛋白冷凍后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成乳白色海綿，海綿用去離子水漂洗去除海綿體中的有機(jī)溶劑再真空干燥即得到較結(jié)實(shí)的海綿狀多孔材料。
實(shí)施例3將20g左右廢蠶絲浸入2L 0.5mol/L的硼酸-硼砂緩沖溶液溶液中，攪拌煮沸60min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作一次后將蠶絲65℃下烘干放入干燥器備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲12g溶解于100mL濃度為10.0mol/L的LiBr溶液中，45℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為11％的絲蛋白水溶液，通過稀釋調(diào)節(jié)絲蛋白濃度為10％。
取上述絲蛋白溶液10mL，25℃恒溫水浴下滴加10mL叔丁醇，穩(wěn)定2min后倒入球形容其中并放入低溫冰箱-40℃下冷凍36h。絲蛋白冷凍后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成乳白色球海綿體，海綿體用去離子水浸泡、漂洗除孔隙中的有機(jī)溶劑再真空干燥即得到海綿狀多孔材料。
實(shí)施例4將15g左右廢蠶絲浸入2L 0.5mol/L的硼酸-硼砂緩沖溶液溶液中，攪拌煮沸60min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作一次后將蠶絲65℃下烘干備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲10g溶解于100mL濃度為CaCl2-H2O-C2H5OH三元溶液中，78℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為11％的絲蛋白水溶液。再按專利介紹的方法，用PEG透析制備濃度為35％的絲蛋白溶液。
取上述絲蛋白溶液10mL，25℃恒溫水浴下滴加10mL四氫呋喃，穩(wěn)定3min后倒入塑料盒后放入低溫冰箱-50℃下冷凍24h。絲蛋白冷凍后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成乳白色海綿體，海綿體經(jīng)甲醇浸泡再用去離子水浸泡、漂洗去除正戊醇之后再真空干燥即得到絲素蛋白海綿狀多孔材料。
實(shí)施例5將20g左右廢蠶絲浸入2L 0.5mol/L的硼酸-硼砂緩沖溶液溶液中，攪拌煮沸60min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作一次后將蠶絲65℃下烘干備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于100mL濃度為CaCl2-H2O-C2H5OH三元溶液中，80℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為12％的絲蛋白水溶液。再按專利介紹的方法，用PEG透析制備濃度為40.0％的絲蛋白溶液。
取上述絲蛋白溶液5mL，25℃恒溫水浴下滴加4.0mL正戊醇，穩(wěn)定3min后放入低溫冰箱-75℃下冷凍12h。絲蛋白冷凍后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成乳白色海綿體，海綿體經(jīng)甲醇浸泡再用去離子水浸泡、漂洗去除正戊醇之后再真空干燥即得到絲素蛋白海綿狀多孔材料。
權(quán)利要求
1.一種絲素蛋白三維多孔材料的制備方法，其特征在于以天然的或再生絲素蛋白為原料，配成水溶液，用醇類有機(jī)溶劑作變性劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性，然后澆注到特定容器中，經(jīng)冷凍-解凍得到乳白色的海綿狀多孔材料；再用后處理溶劑浸泡、洗滌，調(diào)節(jié)海綿體的強(qiáng)度以及除去海綿體中殘留的有機(jī)溶劑，再經(jīng)真空干燥或冷凍干燥即得到絲素蛋白海綿狀三維多孔材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于絲素蛋白水溶液的濃度為0.1～40％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑變性劑為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丙三醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙二醇、丙酮、四氫呋喃、吡啶之一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于有機(jī)溶劑變性劑加入的體積為絲素蛋白溶液體積的0.01～20倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述冷凍的溫度為-80～0℃，冷凍時(shí)間為12～120小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所用的后處理溶劑為甲醇、乙醇、去離子水之一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明為一種絲素蛋白海綿狀三維多孔材料的制備方法。具體是利用變性劑誘導(dǎo)絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變后在低溫下進(jìn)一步發(fā)生冷凍相分離，形成結(jié)構(gòu)均勻且形狀可以任意調(diào)控的三維多孔海綿材料?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)絲蛋白濃度、變性劑添加量、變性劑種類、冷凍時(shí)間、冷凍溫度、海綿體后處理等參數(shù)控制多孔材料的孔隙率、孔徑尺寸、機(jī)械力學(xué)性能等。制備過程中無需加入任何交聯(lián)劑、致孔劑、表面活性劑以及強(qiáng)毒性有機(jī)溶劑，制備工藝簡單易行。用本方法制備的海綿狀三維多孔材料質(zhì)地均勻、孔隙率高、韌性好、具有良好的可塑性、復(fù)脹性和穩(wěn)定性，壓縮形變＞90％，孔隙率可達(dá)到98％，彈性回復(fù)率可達(dá)100％，吸水率最高可達(dá)到5000％。
文檔編號(hào)C08H1/06GK1583836SQ20041002471
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月27日
發(fā)明者邵正中, 曹正兵, 陳新, 周平, 姚晉榮 申請人:復(fù)旦大學(xué)