專利名稱：重組人復(fù)合干擾素－聚乙二醇偶聯(lián)物的制備及其偶聯(lián)產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及蛋白質(zhì)的聚乙二醇化學(xué)修飾方法和修飾產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展使得人們把多肽和蛋白質(zhì)作為藥物使用的夢(mèng)想成為現(xiàn)實(shí)[1]。自從1982年FDA批準(zhǔn)第一個(gè)用于治療人類糖尿病的生物藥物——重組人胰島素(rhInsulin)以來已經(jīng)有幾百種生物藥應(yīng)用于臨床治療中，包括生長因子、集落刺激因子、激素、干擾素、白細(xì)胞介素、單克隆抗體等等。據(jù)估計(jì)，在2000年，有大約500個(gè)生物藥物制品在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，并且蛋白質(zhì)制品(糖蛋白，非糖蛋白，和抗體)的年增長率大約將在10-35％[2]。盡管較以前相比，有更多的生物藥品正在開發(fā)，但是所有這些蛋白藥物用于人體時(shí)都具有多肽類藥物的典型問題明顯的免疫原性和抗原性，容易被體內(nèi)蛋白酶降解，可以被腎臟清除，體內(nèi)的循環(huán)半壽期短，穩(wěn)定性差和溶解度低等。因此多肽類生物藥的配方設(shè)計(jì)(formulation)和給藥方式(Administration)成為制約生物藥發(fā)展的關(guān)鍵。多年的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的大部分生物藥物存在以下的缺點(diǎn)[3]1.給藥途徑單一，大部分生物藥是通過靜脈注射或皮下注射的方式進(jìn)行給藥的，口服的生物藥非常少。
2.在體內(nèi)的循環(huán)半壽期太短，這主要是由于被體內(nèi)蛋白酶的降解，以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除和腎臟清除等原因造成的。
3.某些藥在體內(nèi)有明顯的抗原-抗體反應(yīng)。
4.由于以上的原因造成其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)較差，從而影響了藥效的發(fā)揮。
為了改善蛋白質(zhì)等生物藥劑的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)人們采用了幾種策略來解決這些問題1)通過基因工程手段改變天然蛋白的氨基酸的順序以減小其免疫原性和抗原性以及增加其抗蛋白酶降解的能力。
2)通過化學(xué)或者基因工程手段將其與免疫球蛋白或血清白蛋白偶聯(lián)或者融合。
3)通過藥物釋放載體實(shí)現(xiàn)藥物蛋白質(zhì)的保護(hù)和緩釋。
4)通過化學(xué)手段將藥物蛋白質(zhì)與天然或者合成的高分子相偶聯(lián)。用高分子增加蛋白質(zhì)的表觀分子量，遮蔽蛋白質(zhì)表面以達(dá)到減小其免疫原性和抗原性，以及增加其抗蛋白酶降解的能力。
但是，迄今為止最為成功的方法是采用方法4)，通過將聚乙二醇與藥物蛋白共價(jià)偶聯(lián)來實(shí)現(xiàn)的，即蛋白質(zhì)的PEG化技術(shù)(PEGylation Technology)[4-5]。
干擾素(IFN，Interferon)是一類具有廣譜的抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)，可以激活自然殺傷細(xì)胞(NK cell)等多種功能的細(xì)胞素的總稱。其為由多種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)類似、功能相近、具有生物活性的低分子糖蛋白，是一類重要的細(xì)胞因子。干擾素一般分為I型和II型，I型包括IFN-α、IFN-β和IFN-ω，其中IFN-α又可分成25種以上一級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異的亞型；II型包括IFN-γ。這些干擾素分別由不同的基因編碼產(chǎn)生，生物活性各異。目前臨床上使用的干擾素大都是通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)得到。DNA重組技術(shù)生產(chǎn)干擾素的優(yōu)點(diǎn)在于此方法可以高純度、大批量地生產(chǎn)干擾素。
1981年，美國安進(jìn)(Amgen)公司的研究人員首次合成了一種非天然的I型干擾素(Consensus interferon，IFN-α-conl，復(fù)合干擾素)。這種復(fù)合干擾素結(jié)構(gòu)上與普通干擾素相近，具有166個(gè)氨基酸殘基，其中大約30％位置上的氨基酸與IFN-β相同，60％以上的氨基酸與IFN-γ相同，只有20個(gè)位置上的氨基酸與臨床上最常使用的IFN-α2a的相應(yīng)位置的氨基酸不同。但是復(fù)合干擾素的生物活性卻是普通干擾素的2-20倍。因而成為研究的熱點(diǎn)。美國專利4695623、4897471、5372808已公開了復(fù)合干擾素具有廣譜的干擾素活性，有較強(qiáng)的抗病毒和抗腫瘤以及激活NK細(xì)胞的活性，可以用于治療疾病。中國專利97193506公開了應(yīng)用復(fù)合干擾素治療丙型肝炎的方法，中國專利98114663公開了重組復(fù)合干擾素的制備方法和治療乙型肝炎和丙型肝炎的用途。這些已有的研究都表明復(fù)合干擾素治療慢性丙型肝炎效果顯著，特別是在降低血清病毒負(fù)荷和治療其它干擾素治療無效或復(fù)發(fā)的病人方面，優(yōu)于其它類型的干擾素。
但是復(fù)合干擾素與其它蛋白質(zhì)藥物相同，具有穩(wěn)定性差，體內(nèi)半衰期短，藥代動(dòng)力學(xué)差等缺點(diǎn)，因此用PEG修飾復(fù)合干擾素，提高其熱穩(wěn)定性，并通過提高其表觀分子量以及在體內(nèi)抗酶解能力，來提高其在體內(nèi)的半衰期，達(dá)到復(fù)合干擾素的長效作用具有重要的意義。
蛋白質(zhì)PEG化原理20世紀(jì)50年代末期，用化學(xué)修飾的方法研究蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。自20世紀(jì)70年代末以來，有關(guān)用合成高分子聚乙二醇(PEG)及其衍生物進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的研究報(bào)道越來越多。蛋白質(zhì)PEG化學(xué)修飾主要應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。在生物醫(yī)學(xué)方面，PEG化學(xué)修飾可以降低免疫原性的免疫反應(yīng)性、抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，延長藥物蛋白在體內(nèi)的循環(huán)半壽期等；在生物技術(shù)領(lǐng)域，酶經(jīng)過化學(xué)修飾后能夠在有機(jī)溶劑中高效地發(fā)揮催化作用，并表現(xiàn)出新穎的催化性能。蛋白質(zhì)的免疫原性由蛋白質(zhì)分子表面的抗原決定簇決定。PEG是一種線性、親水、柔軟且不帶電的分子，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的非必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合時(shí)，可作為一種屏障，遮蔽蛋白質(zhì)表面的抗原決定簇，使該蛋白作為異源物質(zhì)而不會(huì)被識(shí)別，避免相應(yīng)抗體的產(chǎn)生，或者阻止抗體與抗原的結(jié)合從而抑制相應(yīng)的免疫反應(yīng)。由于PEG修飾可以消除蛋白質(zhì)的免疫原性，因而不會(huì)通過免疫反應(yīng)而被清除；也由于PEG在蛋白質(zhì)表面的遮蔽作用，使得蛋白質(zhì)不易被蛋白酶降解；還由于蛋白質(zhì)被修飾以后，其分子量大大增加，不易被腎小球過濾。上述幾個(gè)因素作用的結(jié)果，使修飾之后的蛋白質(zhì)在體內(nèi)的循環(huán)半壽期明顯延長。
PEG的化學(xué)性質(zhì)PEG是一種兩端帶羥基的線型聚合物，結(jié)構(gòu)式如下 PEG是通過由氫氧離子親核攻擊環(huán)氧化物引發(fā)的乙撐氧陰離子開環(huán)聚合反應(yīng)合成的。PEG化技術(shù)中最常用的PEG是單甲氧基PEG(mPEG)，結(jié)構(gòu)式如下 mPEG是通過由甲氧離子引發(fā)的乙撐氧陰離子開環(huán)聚合反應(yīng)合成的。PEG的一些特性可以簡(jiǎn)單的歸納如下1)雙親性——既溶于水又溶于大部分有機(jī)溶劑，不溶于乙醚和脂肪族烴；2)無毒性(MW＞1000)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)可以內(nèi)服；3)極弱的免疫原性；4)高濃度時(shí)可以促使細(xì)胞融合；5)與其他高分子，例如右旋糖酐，形成雙水相體系；6)可以用作蛋白質(zhì)和核酸的沉淀劑。
與其他的高分子聚合物相比，PEG的多分散性(Mw/Mn)比較窄對(duì)于低分子量PEG(＜5kd)Mw/Mn小于1.01；對(duì)于高分子量PEG(＞50kd)Mw/Mn小于1.1。由于PEG在水和大部分有機(jī)溶劑中良好的溶解性，一般被認(rèn)為是雙親性分子。研究表明PEG在水溶液中每個(gè)乙基氧單元可以結(jié)合2～3個(gè)水分子。由于PEG鏈具有高度的柔韌性和結(jié)合水分子的能力，因此，在溶液中PEG與相同分子量的球形蛋白相比，其水力學(xué)半徑是后者的5～10倍。這個(gè)特性被認(rèn)為是PEG沉淀蛋白質(zhì)；表面排斥蛋白質(zhì)和細(xì)胞；降低蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性；增加蛋白質(zhì)抗酶解能力的主要原因。
PEG的分子量范圍很寬，適合用作修飾劑或修飾劑出發(fā)原料的PEG的相對(duì)分子質(zhì)量一般為300-100,000。PEG通常沒有免疫原性和毒性，不會(huì)破壞生物分子的活性，其生物相容性已通過美國食品和藥物管理局(FDA)的認(rèn)證。特別是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過PEG類修飾劑修飾后，修飾劑的許多優(yōu)良性質(zhì)也會(huì)在修飾蛋白中得到體現(xiàn)。PEG分子末端有兩個(gè)能被活化的-OH基團(tuán)，化學(xué)修飾時(shí)則多采用單甲氧基聚乙二醇(mPEG)的衍生物為修飾劑。除了線形mPEG，還有分支mPEG(即通過賴氨酸、三嗪等將兩個(gè)或更多的PEG鏈連接在一起)和星形mPEG。多數(shù)情況下PEG衍生物與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合是以蛋白質(zhì)分子上的氨基和巰基作為修飾位點(diǎn)，這主要是因?yàn)榘被蛶€基具有親核性，并且大多存在于蛋白質(zhì)分子的表面。
在蛋白質(zhì)的PEG化過程中，PEG末端的羥基是其化學(xué)反應(yīng)的功能基團(tuán)。但它的反應(yīng)活性差，只能在較激烈的條件下與其它基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而這樣的條件常常為蛋白質(zhì)所不能忍受。因此，必需將PEG改造成各種活化中間體，以便能夠在溫和的條件下以較高的反應(yīng)速率與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，這便是PEG的活化，即在PEG的一個(gè)末端或兩個(gè)末端上接上一個(gè)可以反應(yīng)的官能團(tuán)。官能團(tuán)的選擇根據(jù)欲被連接的分子上可用的反應(yīng)基團(tuán)來決定。對(duì)于蛋白質(zhì)來說，典型的反應(yīng)性氨基酸包括賴氨酸，半胱氨酸，組氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，N-末端氨基和C-末端羧基。如果是糖蛋白，鄰位的羥基可以被高碘酸鹽氧化形成兩個(gè)可反應(yīng)的甲醛成分。PEG與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)最通用的路徑是用官能團(tuán)活化PEG使之適合與賴氨酸和N-末端的氨基反應(yīng)。關(guān)于PEG活化方法，Samuel Zalipsky6，7和J.M.Harris8作了較詳細(xì)的綜述。
修飾反應(yīng)的影響因素蛋白質(zhì)與修飾劑作用所要求的反應(yīng)條件，除修飾過程能夠順利進(jìn)行外，還必須滿足如下要求一是不引起蛋白質(zhì)的不可逆變性，二是有利于選擇性地修飾蛋白質(zhì)。為此，反應(yīng)物配比、pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)介質(zhì)等都要控制在一定的范圍。在所有影響蛋白質(zhì)分子的化學(xué)修飾反應(yīng)的條件中，pH值是最重要的一個(gè)條件，因?yàn)樗鼪Q定了具有潛在反應(yīng)能力的功能基所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的離子狀態(tài)。一般情況下，增加pH可以提高反應(yīng)速率，降低pH可以減小反應(yīng)速率。反應(yīng)活性較高的修飾劑可以在生理pH下與蛋白質(zhì)耦合；而反應(yīng)活性較低的修飾劑通常需要較高的pH。而修飾反應(yīng)的專一性則對(duì)應(yīng)于一個(gè)優(yōu)化pH值。通過改變修飾劑與蛋白質(zhì)的摩爾比和改變pH可以迅速地給出對(duì)應(yīng)于特定修飾度的實(shí)驗(yàn)條件。溫度也是一個(gè)必須要注意的條件，因?yàn)闇囟瓤梢杂绊懙交钚詭€基的微環(huán)境。恰當(dāng)選擇溫度可以減少或防止一些競(jìng)爭(zhēng)的基團(tuán)反應(yīng)。有些蛋白質(zhì)屬于熱敏性蛋白質(zhì)，修飾反應(yīng)需要在低溫下進(jìn)行。在此情形下，反應(yīng)時(shí)間要適當(dāng)延長。反應(yīng)介質(zhì)可改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象或封閉反應(yīng)部位，因而影響修飾反應(yīng)。通過基于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以容易地得到適宜的修飾反應(yīng)條件。通過對(duì)一個(gè)或多個(gè)操作因素的控制，就可以得到所需的連有單個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或多個(gè)修飾劑的蛋白質(zhì)耦合物。
公開的聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)形成蛋白-聚乙二醇偶聯(lián)物的方法和由所述方法而產(chǎn)生的偶聯(lián)物存在一些問題。其中包括，形成偶聯(lián)物所采用的化學(xué)修飾方法可能使蛋白質(zhì)變性或完全失活；此外，由于偶聯(lián)反應(yīng)本身的特性往往會(huì)使反應(yīng)體系的pH值降低，不利于偶聯(lián)產(chǎn)物的質(zhì)量控制。使用先前公開的方法來控制此pH值的降低可能造成pH更大范圍的波動(dòng)和蛋白質(zhì)生物活性的損失；另外，先前公開的蛋白質(zhì)-聚乙二醇偶聯(lián)物的分離、純化方法并不總是能夠達(dá)到很好的效果，特別是在大規(guī)模制備的情況下；最后，聚乙二醇和蛋白質(zhì)之間的化學(xué)鍵不穩(wěn)定，可能發(fā)生水解裂解。如果給藥后發(fā)生這樣的裂解，聚乙二醇對(duì)蛋白質(zhì)的修飾將達(dá)不到預(yù)期的效果本發(fā)明通過選用化學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的聚乙二醇修飾劑以及完全可控的修飾反應(yīng)條件來制備高質(zhì)量的蛋白質(zhì)-聚乙二醇偶聯(lián)物，并通過色譜分離方法來分級(jí)、純化聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的不同成分。
1)Ame M.Ryan，Timothy G.Terrell“Biotechnology and its products”in (Eds)Handbookof Toxicologic pathology，Second Edition，Volume 1，Acadamic Press，New York，20022)Walsh G.Biopharmaceutical Benchmarks.Nat.Biotechnol.，2000，18831-833.
3)EF.Davis，a.m.Kazo，M.L.Nucci，A.Abuchowski，Reduction of immunogenicity andextension of circulating half-life of peptide and protein，inV.H.L Lee(Ed.)，Peptide andProtein Drug Delivery，Marcel Dekker，New york，19904)J.M.Harris，S.Zalipsky(Eds)，Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications，ACS Symposium Series NO.680，American Chemical Society，Washington，DC，19975)Veronese F M，Harris J M.Introduction and Overview of Peptide and Protein PegylationAdvanced Drug Delivery Reviews，2002，54453-4566)Zalipsky，F(xiàn)unctionalized poly(ethylene glycol)for preparation of biologically relevantconjugates，Bioconjugate Chem，6；150-165，19957).Zalipsky，Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules，Advanced Drug deliveryreviews，16；157-180，19958)M.J.Roberts，M.D.Bentley，J.M.Harris，Chemistry for peptide and protein PEGylation，54；459-476，2002發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了具有生理活性的如下圖所示的重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物
其中，R1為低級(jí)烷基，例如甲基、乙基、丙基等；R2為-O-或-NH-；R3為N-R4、S、O；R4為低級(jí)烷基或氨基酸；m和n為大于等于1的整數(shù)。
定義在本發(fā)明的上下文中應(yīng)用了以下的定義術(shù)語“重組人復(fù)合干擾素”是指通過基因重組技術(shù)合成的I型干擾素，具有166個(gè)氨基酸殘基，其中大約30％位置上的氨基酸與IFN-β相同，60％以上的氨基酸與FN-γ相同，只有20個(gè)位置上的氨基酸與臨床上最常使用的IFN-α2a的相應(yīng)位置的氨基酸不同。
術(shù)語“偶聯(lián)物”是指由一個(gè)或多個(gè)多肽，通常為單獨(dú)一個(gè)多肽與一個(gè)或多個(gè)非多肽分子，例如聚合物分子，共價(jià)連接形成的分子。術(shù)語“共價(jià)連接”是指多肽組分與非多肽組分通過化學(xué)反應(yīng)在兩者之間形成共價(jià)鍵而將兩者連接在一起。
術(shù)語“聚合物分子”是由多個(gè)單體分子共價(jià)連接形成的大分子，可以是人或動(dòng)物的血清白蛋白或免疫球蛋白，也可以是人工合成的高分子材料，例如聚乙二醇。
術(shù)語“多肽分子上的可反應(yīng)基團(tuán)”是指多肽分子表面的各種可以與非多肽組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，例如賴氨酸殘基的α和ε氨基、N末端氨基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基等。
術(shù)語“體內(nèi)功能半壽期”是指在體內(nèi)多肽或偶聯(lián)物仍然存在50％生物學(xué)活性的時(shí)間。確定體內(nèi)功能半壽期的另一種方法是確定“血清半壽期”，即50％的多肽或偶聯(lián)物在被清除之前在血液循環(huán)中時(shí)間。“血清半壽期”與其它術(shù)語同義，例如“血漿半壽期”、“循環(huán)半壽期”、“血液清除率”、“血漿清除率”、“清除半壽期”等等。
關(guān)于“體內(nèi)功能半壽期”或“血清半壽期”所用的術(shù)語“增加的”是指偶聯(lián)物的相應(yīng)的半壽期經(jīng)可比條件下的測(cè)定，相對(duì)于參考分子，例如未經(jīng)修飾的重組人干擾素的半壽期在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上是增加的。例如，相應(yīng)半壽期可能至少增加大約25％、或50％、或100％等等。
術(shù)語“腎臟清除”是指腎臟通過腎小球的過濾，腎小管的分泌或腎小管的排泄進(jìn)行的任何清除。腎臟清除依賴于多肽或偶聯(lián)物分子的物理特征，例如分子大小(直徑)、對(duì)稱性、剛性和電荷。
制備本發(fā)明重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物所選用的聚合物與多肽分子偶聯(lián)的聚合物分子可以是任何一種適當(dāng)?shù)木酆衔锓肿?，例如均聚物或雜聚物，通常與多肽偶聯(lián)的聚合物的分子量在300到100,000Da，例如500-20,000Da，優(yōu)選1000-15,000Da，更優(yōu)選2000-12,000Da。
適當(dāng)?shù)木酆衔锓肿拥膶?shí)例包括各種聚環(huán)氧烷(PAO)，例如聚亞烷基二醇(PAG)，聚乙二醇(PEG)和聚丙烯乙二醇(PPG)，聚乙烯醇(PVA)等。通常選用的聚合物是生物相容的、無毒、無抗原性、無免疫原性的水溶性高分子。
聚乙二醇(PEG)是優(yōu)選的聚合物分子，單甲氧基聚乙二醇(mPEG)是更優(yōu)選的聚合物分子。由于mPEG一端的羥基被甲氧基取代，所以可以避免在與多肽偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)造成多肽分子之間的交聯(lián)。所選用的聚乙二醇可以是線性的或者是具有分支或者星行結(jié)構(gòu)的聚乙二醇。
為了實(shí)現(xiàn)聚合物分子和多肽分子的共價(jià)連接，提供的聚乙二醇分子的末端羥基必需先轉(zhuǎn)變?yōu)槟撤N形式的活潑基團(tuán)，以利于聚合物分子和多肽分子的偶聯(lián)反應(yīng)。適當(dāng)?shù)幕罨垡叶挤肿涌梢允欠蓟垡叶荚噭?，例如mPEG-二氯三嗪(mPEG-dichlorotriazine)和2，4-二(單甲氧基聚乙二醇)-6-氯-均-三嗪(2，4-bis-(methoxypolyethylene glycol)-6-chloro-s-triazine)；?；垡叶荚噭鏢ucCINFnimidyl SucCINFnate-mPEG、SucCINFnimidylCarboxymethylate-mPEG、SucCINFnimidyl Amino aCINFd-mPEG、p-Nitro phenylCarbonate-mPEG；烷基化聚乙二醇試劑，例如Tresylate-mPEG、mPEG-acetaldehyde、FMP-mPEG。適當(dāng)?shù)幕罨垡叶挤肿舆€可以是分支形的或星形的聚乙二醇，例如mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、mPEG2-MAL、multi-armsmPEG。為了得到特異性修飾的偶聯(lián)產(chǎn)物，優(yōu)選mPEG-acetaldehyde、mPEG-MAL等。為了以最少的修飾位點(diǎn)得到最大的分子量，優(yōu)選mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、mPEG2-MAL、multi-arms mPEG等。
制備本發(fā)明重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的方法多肽和活化的聚乙二醇分子的偶聯(lián)可通過任何適用的方法，例如液相自由修飾和固相輔助修飾等。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講，根據(jù)選用的活化聚乙二醇試劑而采用適當(dāng)?shù)男揎椃磻?yīng)是非常容易的。聚乙二醇與多肽的偶聯(lián)可以是發(fā)生在任何可反應(yīng)基團(tuán)上的，也可以特異性發(fā)生在某個(gè)或某些可反應(yīng)基團(tuán)上的。
為了制備最佳的偶聯(lián)物，針對(duì)偶聯(lián)的PEG分子的數(shù)量，每個(gè)分子的分子量和形狀(例如，這些分子是線性還是分支)，PEG與多肽的偶聯(lián)位置等因素可以對(duì)PEG修飾進(jìn)行設(shè)計(jì)。對(duì)使用的聚乙二醇的分子量的選擇要考慮到期望達(dá)到的效果。例如如果偶聯(lián)的主要目的是獲得高分子量和較大分子量的偶聯(lián)物(例如降低腎臟清除速率)，那么可以選擇與一個(gè)或兩個(gè)高分子量的聚乙二醇分子偶聯(lián)。但是，如果多肽分子上存在多個(gè)免疫位點(diǎn)需要遮蔽，可以應(yīng)用足夠數(shù)量的低分子量聚乙二醇分子以有效地遮蔽所有或大部分多肽表面的免疫位點(diǎn)。
通常，聚乙二醇與多肽分子的偶聯(lián)是在使盡可能多的可反應(yīng)基團(tuán)與聚乙二醇分子反應(yīng)的條件下進(jìn)行的。這可以通過使聚乙二醇的摩爾數(shù)適當(dāng)?shù)某^多肽的摩爾數(shù)的方式達(dá)到。通常，活化聚乙二醇與多肽的摩爾比可以是1000∶1～1∶1，例如，大約100∶1，優(yōu)選大約50∶1～1∶1，更優(yōu)選大約10∶1～2∶1。
本發(fā)明對(duì)聚乙二醇和多肽的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化?？梢岳斫?，大部分的修飾反應(yīng)是通過針對(duì)多肽分子上的親核基團(tuán)進(jìn)行的親核攻擊進(jìn)行的。因此，大部分的修飾反應(yīng)是在稍微堿性的環(huán)境下進(jìn)行的，例如pH7.0～10.0。而且在反應(yīng)的過程中不斷產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使得反應(yīng)體系的pH值降低。而反應(yīng)體系pH值的波動(dòng)不利于保持修飾反應(yīng)的重復(fù)性，從而不利于偶聯(lián)物的質(zhì)量控制。與以前公開的方法不同，例如通過向修飾體系中加入堿性物質(zhì)的方法抑制溶液pH值的降低，本發(fā)明通過將堿性物質(zhì)，例如硼砂，和聚乙二醇按一定比例壓縮成致密的片狀固體，并通過其在反應(yīng)緩沖液中緩慢溶解的過程中逐漸釋放出活化聚乙二醇試劑和堿性物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)活化聚乙二醇試劑與多肽的偶聯(lián)反應(yīng)同時(shí)抑制緩沖溶液pH值的降低。使用本發(fā)明的方法可以保持修飾反應(yīng)的重復(fù)性，從而有利于偶聯(lián)物的質(zhì)量控制。
偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行到預(yù)期的程度時(shí)，可以通過向反應(yīng)體系中加入過量的伯胺化合物，例如賴氨酸，的方法來終止偶聯(lián)反應(yīng)，也可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值的方法，例如將溶液pH值用酸調(diào)節(jié)到4.0以下，來終止偶聯(lián)反應(yīng)。
本發(fā)明重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的分離、純化方法聚乙二醇與多肽的偶聯(lián)反應(yīng)除了可以產(chǎn)生期望的偶聯(lián)產(chǎn)物之外，也會(huì)產(chǎn)生一些不希望的副產(chǎn)物，例如從活化聚乙二醇試劑上脫離的游離小分子、水解失活的聚乙二醇、未經(jīng)修飾的多肽分子等。在應(yīng)用多肽-聚乙二醇偶聯(lián)物之前，這些物質(zhì)是必需除去的。另外，偶聯(lián)反應(yīng)通常產(chǎn)生各種不同形式的偶聯(lián)物，例如一個(gè)多肽分子上偶聯(lián)一個(gè)聚乙二醇分子的偶聯(lián)物、一個(gè)多肽分子上偶聯(lián)兩個(gè)聚乙二醇分子的偶聯(lián)物等，在應(yīng)用這些偶聯(lián)物之前，最好將它們分離成單一的成分。本發(fā)明另一個(gè)方面是關(guān)于多肽-聚乙二醇偶聯(lián)物的色譜分離、純化方法的。與以前公開的分離、純化方法不同，例如，通過透析或超濾的方法除去小分子游離基團(tuán)和水解失活的聚乙二醇。通過凝膠過濾色譜或超濾將偶聯(lián)物和未反應(yīng)的多肽分離開。但是這些方法存在一些問題，例如通過透析或超濾的方法往往不能將小分子和多余的聚乙二醇分子去除完全，而凝膠過濾色譜的處理量有限，這可能限制制備規(guī)模的放大。本發(fā)明通過離子交換色譜去除反應(yīng)副產(chǎn)物并分離不同的偶聯(lián)產(chǎn)物，例如，利用脫鹽色譜柱可以很快地將游離小分子基團(tuán)完全去除，同時(shí)將產(chǎn)物的緩沖體系置換為下一步色譜分離所需的緩沖液；利用陽離子交換色譜柱可以簡(jiǎn)便地將偶聯(lián)產(chǎn)物和未經(jīng)修飾的多肽分子分開；利用陰離子交換色譜柱可以很容易的將多余的聚乙二醇分子去除，并分級(jí)、純化不同形式的偶聯(lián)物。該方法具有快速、高效、對(duì)蛋白活性無傷害的優(yōu)點(diǎn)，并且可以很容易進(jìn)行更大規(guī)模的分離制備。
本發(fā)明的重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物可以用SDS-PAGE或MALDI-TOF等方法進(jìn)行分析、鑒定。偶聯(lián)物的生物學(xué)活性通過中國生物制品規(guī)程的方法進(jìn)行測(cè)定，即通過Wish細(xì)胞(人羊膜傳代細(xì)胞)-VSV病毒(濾泡性口腔炎病毒)系統(tǒng)測(cè)定各種偶聯(lián)物的抗病毒活性。
本發(fā)明重組人干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的用途本發(fā)明的聚乙二醇修飾的重組人復(fù)合干擾素的用途是用于制備抗病毒藥物、抗癌藥物以及治療免疫功能低下和干擾素缺乏綜合癥的藥物。
本發(fā)明的聚乙二醇修飾的重組人復(fù)合干擾素能夠保持人天然干擾素的抗病毒活性，同時(shí)它又比人天然干擾素具有更好的熱穩(wěn)定性和抗酶解穩(wěn)定性，它的血漿清除率更低，體內(nèi)循環(huán)半衰期更長。因此，作為抗病毒、抗癌的藥物，它比天然的干擾素更加有效。


FIG.1聚乙二醇化復(fù)合干擾素的SDS-PAGE電泳圖譜，其中第一泳道是分子量標(biāo)準(zhǔn)；第二泳道是復(fù)合干擾素；第三泳道是聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯修飾復(fù)合干擾素的產(chǎn)物；第四泳道是FMP-PEG修飾復(fù)合干擾素的產(chǎn)物。
具體實(shí)施方法在此列出的實(shí)施方案的目的僅僅是為了更好地說明本發(fā)明，而不具有任何限制本發(fā)明范圍的意義。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講，對(duì)本發(fā)明的方法、應(yīng)用進(jìn)行更改、修改、重組的可能性都是顯而易見的，但是任何針對(duì)本發(fā)明的更改、修改和重組都不超出本發(fā)明的范圍和精神，其將在本發(fā)明的權(quán)利要求書部分進(jìn)一步得到明確。
實(shí)施例1單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(SC-PEG)的制備稱取5克單甲氧基聚乙二醇5000，并將其溶于25毫升無水二氧六環(huán)中，加熱將聚合物完全溶解；將6毫摩爾N，N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯溶于10毫升無水乙睛中；將6毫摩爾4-(二甲胺)吡啶溶于10毫升無水乙睛中；在攪拌條件下，將N，N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯的乙睛溶液緩慢的加到單甲氧基聚乙二醇的二氧六環(huán)溶液中，然后，再慢慢地向上述溶液中加入溶有4-(二甲胺)吡啶的乙睛溶液；反應(yīng)持續(xù)至少6個(gè)小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束之后，用乙醚將單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(SC-PEG)沉淀出來。用乙酸乙酯或異丙醇重結(jié)晶上述活化酯；用真空干燥器干燥活化酯，并在4℃下避光干燥的環(huán)境中保存。
FMP-mPEG的制備將250ml甲苯和50gmPEG5000加到1000ml的圓底燒瓶中，在圓底燒瓶上依次接上分水器、回流冷凝管和干燥塔，然后加熱甲苯溶液到140℃。保持回流狀態(tài)兩個(gè)小時(shí)。然后將回流裝置改為減壓蒸餾裝置，蒸出200ml甲苯。再向圓底燒瓶中加入500ml乙醚，在攪拌的條件下自然降溫，直到固體完全沉淀出來。然后過濾除去乙醚，并將沉淀物放到真空干燥器中把殘余的乙醚除去。得到干燥的無水mPEG5000。然后用卡氏水分測(cè)定儀測(cè)定干燥后無水mPEG5000中的水分含量，要求水分含量低于50ppm。用量筒稱量干燥25ml乙腈倒入500ml的圓底燒瓶中，將567mg FMP溶解于乙腈中。然后向燒瓶中加入10g分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。攪拌溶液的同時(shí)緩慢地向燒瓶中滴加三乙胺以維持溶液pH值在8～9之間。在常溫常壓的條件下反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后向乙腈溶液中加入足量的乙醚，直到?jīng)]有白色固體生成為止。用漏斗過濾乙醚和乙腈的混合溶液，并用300ml乙醚洗滌沉淀物。然后，將白色的固體重新溶于250ml異丙醇中，并加熱到55℃完全溶解固體。在攪拌的條件下自然降溫，直到固體完全沉淀出來。然后過濾除去異丙醇，并將沉淀物放到真空干燥器中干燥3個(gè)小時(shí)把殘余的異丙醇除去。得到蓬松的白色固體。
實(shí)施例2將重組人復(fù)合干擾素溶解于pH值為7.0-9.0，濃度為25mM-100mM的硼酸-硼砂緩沖液或磷酸鹽緩沖液中。將活化的聚乙二醇試劑，例如琥珀酰亞胺碳酸酯聚乙二醇(SC-PEG)和硼砂按一定的比例，例如1∶1～1∶10，混合并用強(qiáng)大的壓力將兩者壓成致密的片狀或其它形狀的固體。然后向蛋白溶液中加入該致密的片狀物，并緩慢攪拌蛋白溶液使其緩慢溶解。反應(yīng)在4-37℃下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為30-120分鐘。反應(yīng)結(jié)束通過向上述體系中加入過量的甘氨酸來終止反應(yīng)。
實(shí)施例3將反應(yīng)混合物進(jìn)行色譜分離。首先用凝膠過濾柱脫去反應(yīng)產(chǎn)生的游離小分子并將蛋白的緩沖體系置換為pH值為4.0-5.0，濃度為25mM-100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液。然后將收集到的蛋白組分用陽離子交換色譜將聚乙二醇修飾的重組人復(fù)合干擾素和未修飾的重組人干擾素分開，色譜條件為以pH為4.0-5.0，濃度為25mM-100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液為A流動(dòng)相，以pH為4.0-5.0，濃度為25mM-100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液加0.2M NaCl為B流動(dòng)相。在此色譜條件下重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物不與色譜填料發(fā)生靜電相互作用，因此在色譜的穿過峰中可以收集到偶聯(lián)物，而未反應(yīng)的重組人復(fù)合干擾素可以被吸附于色譜填料之上，用B液可以將其洗脫下來，并收集重新利用。最后用陰離子交換色譜去除多余的聚乙二醇分子并分級(jí)、純化不同形式的重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇修飾偶聯(lián)物，例如聚乙二醇單修飾的重組人復(fù)合干擾素，聚乙二醇雙修飾的重組人復(fù)合干擾素以及聚乙二醇多修飾的重組人復(fù)合干擾素。色譜條件為以pH為8.0-10.0，濃度為25mM-100mM的磷酸鹽緩沖液為A流動(dòng)相；以pH為8.0-10.0，濃度為25mM-100mM的磷酸鹽緩沖液加1M NaCl為B流動(dòng)相。在此色譜條件下多余的聚乙二醇不與色譜填料發(fā)生靜電相互作用，因此在色譜的穿過峰中可以收集到聚乙二醇，而各種不同形式的重組人復(fù)合干擾素可以被吸附于色譜填料之上，并可以利用B流動(dòng)相中的NaCl梯度將其分級(jí)、純化得到單一成分。
實(shí)施例4按中國生物制品規(guī)程(中華人民共和國衛(wèi)生部，中國生物制品規(guī)程一部，1995年版，北京中國人口出版社，1995268-269)的方法測(cè)定。
用Wish細(xì)胞(人羊膜傳代細(xì)胞)-VSV病毒(濾泡性口腔炎病毒)系統(tǒng)測(cè)定各種偶聯(lián)物的抗病毒活性。采用CPE(細(xì)胞致病效應(yīng))抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測(cè)定法，以每毫升干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞(50％)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)為干擾素單位。以國際單位(IU)表示，并用國家IFNα標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。
實(shí)施例5熱穩(wěn)定性取rhCINF、mono-mPEG-rhCINF、di-mPEG-rhCINF、poly-mPEG-rhCINF各1毫摩爾，分別置于4℃、37℃、56℃條件下，定時(shí)取樣測(cè)定干擾素的抗病毒活性。結(jié)果表明rhCINF在56℃下4-6小時(shí)，活性喪失73％；mono-mPEG-rhCINF活性喪失52％；di-mPEG-rhCINF活性喪失37％；poly-mPEG-rhCINF活性喪失22％。rhCINF在37℃下10-12小時(shí)，活性喪失51％；mono-mPEG-rhCINF活性喪失33％；di-mPEG-rhCINF活性喪失17％；poly-mPEG-rhCINF活性喪失6％。rhCINF在4℃下1周-2周，活性喪失45％；mono-mPEG-rhCINF活性喪失11％；di-mPEG-rhCINF活性喪失4％；poly-mPEG-rhCINF活性喪失0％。上述穩(wěn)定性試驗(yàn)是在液體狀態(tài)，無任何穩(wěn)定劑和保護(hù)劑的條件下進(jìn)行的，因此可以初步認(rèn)為重組人復(fù)合干擾素與聚乙二醇偶聯(lián)之后可以增加其熱穩(wěn)定性。
抗酶解穩(wěn)定性取0.1％胰蛋白酶溶液(pH8.0)2.5毫升，各加入0.3毫升rhCINF、mono-mPEG-rhCINF、di-mPEG-rhCINF、poly-mPEG-rhCINF樣品中，25℃保溫，分別在0、10、30、50、70、90分鐘的時(shí)間間隔取樣測(cè)定抗病毒活性。結(jié)果表明，rhCINF在5～7分鐘之內(nèi)活性迅速降低到原來的50％，30分鐘活性幾乎完全喪失；mono-mPEG-rhCINF在10～13分鐘之內(nèi)活性降低到原來的50％，50分鐘活性幾乎完全喪失；di-mPEG-rhCINF在50～54分鐘之內(nèi)活性降低到原來的50％，90分鐘活性幾乎完全喪失；poly-mPEG-rhCINF在82～85分鐘之內(nèi)活性降低到原來的50％。
權(quán)利要求
1.一種重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)如下圖所示 其中，R1為低級(jí)烷基，例如甲基、乙基、丙基等；R2為-O-或-NH-；R3為N-R4、S、O；R4為低級(jí)烷基或氨基酸；m和n為大于等于1的整數(shù)。CINF為復(fù)合干擾素，其特征是一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸中20％與INF-β相同，78％與INF-γ相同；并且與現(xiàn)有的任何天然干擾素相比其活性高6～11倍。
2.一種重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物，其特征是包含具有重組人復(fù)合干擾素生理活性的多肽，并且至少有一個(gè)非多肽組分與多肽組分的可反應(yīng)基團(tuán)相偶聯(lián)。
3.一種制備權(quán)利要求1、2所述的重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的方法，其特征是偶聯(lián)反應(yīng)可以是液相自由偶聯(lián)或固相輔助偶聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是將聚乙二醇和堿性物質(zhì)被壓縮成為致密的片狀或其他形狀的固體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征是通過致密固體在反應(yīng)緩沖液中的緩慢溶解來實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)反應(yīng)和抑制反應(yīng)體系pH值的降低。
6.一種權(quán)利要求1、2所述的重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的分離、純化方法，其特征是通過色譜過程去除反應(yīng)副產(chǎn)物和分級(jí)、純化偶聯(lián)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的分離、純化方法，其特征是通過脫鹽色譜或透析的方法去除反應(yīng)產(chǎn)生的游離小分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的分離、純化方法，其特征是通過陽離子交換色譜過程去除未反應(yīng)的蛋白質(zhì)，并收集利用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的分離、純化方法，其特征是通過陰離子交換色譜過程去除多余的聚乙二醇分子，并分級(jí)、純化各種不同的重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法得到的純化重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物，其特征是能夠保持人天然干擾素的抗病毒活性，同時(shí)又比天然的干擾素具有更好的熱穩(wěn)定性和抗酶解穩(wěn)定性，血漿清除率更低，體內(nèi)循環(huán)半衰期更長。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物，其特征是可以和其他藥物一起制備成為藥物組合物，可以單獨(dú)作為藥物應(yīng)用，以及可以用上述藥物組合物治療各種病毒性感染、癌癥、免疫功能低下以及干擾素缺乏綜合癥的等疾病的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人復(fù)合干擾素－聚乙二醇偶聯(lián)物，其包含具有重組人復(fù)合干擾素生理活性的多肽和非多肽組分。本發(fā)明通過可控修飾反應(yīng)來制備高質(zhì)量的蛋白質(zhì)－聚乙二醇偶聯(lián)物，并通過色譜分離方法來分分離、純化聚乙二醇－蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的重組人復(fù)合干擾素能夠保持人天然干擾素的抗病毒活性，同時(shí)它又比人天然干擾素具有更好的熱穩(wěn)定性和抗酶解穩(wěn)定性，它的血漿清除率更低，體內(nèi)循環(huán)半衰期更長。
文檔編號(hào)C08G65/00GK1673230SQ20041002957
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者蘇志國, 馬光輝, 贠強(qiáng), 楊瑞娥, 陳婷 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院過程工程研究所