專利名稱：一種靈芝多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靈芝多糖的制備方法，尤其涉及一種靈芝大分子多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
從靈芝中分離提取水溶性多糖目前普遍采用乙醇分步沉淀法，易于大規(guī)模生產(chǎn)，其主要原理是通過降低水溶液的介電常數(shù)使多糖脫水，從而產(chǎn)生沉淀來達(dá)到分離多糖的目的，適用于大多數(shù)水溶性多糖，但得到的多糖雜質(zhì)多，有效成分含量低，特異性不高。如進(jìn)一步采用不同濃度的乙醇分步沉淀來純化，選擇性較差，回收率低，得到多糖含量在30％左右，且是多糖的混合物，同時(shí)要使用大量的有機(jī)溶劑，提高了成本。另外，也有一些實(shí)驗(yàn)室的研究，水提物通過去除蛋白和透析后得到靈芝多糖，但工藝復(fù)雜，需要加入氯仿和正丁醇等有機(jī)溶劑，不易成為工業(yè)化生產(chǎn)。
靈芝大分子多糖成分的免疫調(diào)節(jié)的作用已有大量的研究報(bào)道，并可通過提高機(jī)體的免疫功能而達(dá)到抗癌作用，是抗癌作用的有效成分。但往往一種植物或真菌中含有多種多糖成分，分子量的大小也各不相同，其活性也各不相同，靈芝中也含有不同的分子量段的多糖成分，為提高多糖的效果，須將無活性或活性不高的成分去除，富集有活性的多糖部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種靈芝大分子多糖的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中提取的多糖純度低、特異性不高、難以工業(yè)化生產(chǎn)的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的原理是將靈芝提取物中有活性的多糖部分用合適的超濾膜來富集的原理，去除沒有活性的多糖成分。
本發(fā)明的提供的一種靈芝大分子多糖的制備方法，包括如下步驟
1.靈芝的粗提以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入5-15倍重量的水中，常溫浸泡10-60分鐘，加熱至60-100℃，保持此溫度60-120分鐘，過濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取1-2次，合并濾液。
2.靈芝粗提液的粗濾濾液用50-200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過濾。
3.靈芝濾出液超濾使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜的分子量截留值為50萬道爾頓，壓力低于0.3Mpa，濾液被分為二部分，大于50萬分子量的部分和小于50萬分子量的部分。
4.干燥大于50萬分子量的部分直接干燥，即獲得所需的大分子多糖。
通過上述制備方法可獲得質(zhì)量穩(wěn)定、有效成份含量高、且平均分子量被嚴(yán)格控制在大于50萬道爾頓的靈芝多糖成分，本方法不僅保持了多糖的抗腫瘤活性，而且靈芝多糖的含量得到提高，多糖含量超過50％。所以本制備方法是一種簡(jiǎn)便、快速、高效、成本低、無污染、多糖純度高的適合工業(yè)生產(chǎn)的方法。
制備所得的大分子靈芝多糖的生物活性檢測(cè)根據(jù)Stanley報(bào)道的方法，選擇8～10周齡、體重(28±1)g的Balb/c小鼠，處死，抽取小鼠大腿、小腿骨中的骨髓，分散后培養(yǎng)于含10％L929細(xì)胞培養(yǎng)上清(L929細(xì)胞株培養(yǎng)3d后，去除細(xì)胞的培養(yǎng)基)的完全DMEM培養(yǎng)基中。3d后，去除貼壁的細(xì)胞，將非貼壁細(xì)胞置于添加10％L929細(xì)胞培養(yǎng)上清的完全DMEM培養(yǎng)基中。繼續(xù)培養(yǎng)3d后，去除非貼壁的細(xì)胞，收集貼壁的細(xì)胞，即為小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞。小鼠巨噬細(xì)胞激活率測(cè)定將1×105個(gè)/mL的巨噬細(xì)胞懸浮液加至96孔板中，每孔加入180μL，并加入樣品20μL。于37℃、5％的CO2條件下培養(yǎng)3天，加入20μL AlamarBlue試劑，再培養(yǎng)6hr，用ELISA自動(dòng)讀板儀測(cè)定570nm和600nm處的吸光度，然后根據(jù)Alamar Blue試劑的公式計(jì)算各種樣品對(duì)巨噬細(xì)胞的激活率。計(jì)算公式為巨噬細(xì)胞激活率(％)＝[80856×Aλ570(樣品)-11726×Aλ600(樣品)]/[80856×Aλ570(對(duì)照)-11726×Aλ600(對(duì)照)]×100％。
分子量大于50萬部分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞激活率大于200％，可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。
多糖含量的檢測(cè)用苯酚-濃硫酸法，精密稱取本品0.5g置100ml燒杯中，加水約80ml，煮沸提取1小時(shí)后冷卻至室溫，加入100ml容量瓶中。用水稀釋至刻度，搖勻，再稀釋25倍。精密吸取樣品1.0ml，置15ml試管中，分別加入苯酚-硫酸試劑，在490nm處測(cè)定吸收度A。以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算總糖的含量，并用DNS測(cè)定還原糖含量，多糖的含量等于總糖減還原糖。分子量大于50萬部分的多糖含量大于50％以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.靈芝的粗提以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入5倍重量的水中，常溫浸泡60分鐘，加熱至60℃，保持此溫度60分鐘，過濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取一次，合并濾液。
2.靈芝粗提液的粗濾濾液用100目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過濾。
3.靈芝濾出液超濾使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜的分子量截留值為50萬道爾頓，壓力低于0.3Mpa，濾液被分為二部分，大于50萬分子量的部分和小于50萬分子量的部分。
4.干燥大于50萬分子量的部分噴霧干燥，即獲得所需的多糖。
制備的多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞激活率為320％。多糖含量為55％。
實(shí)施例21.靈芝的粗提以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入10倍重量的水中，常溫浸泡30分鐘，加熱至70℃，保持此溫度60分鐘，過濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取一次，合并濾液。
2.靈芝粗提液的粗濾濾液用200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過濾。
3.靈芝濾出液超濾使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜的分子量截留值為50萬道爾頓，壓力低于0.3Mpa，濾液被分為二部分，大于50萬分子量的部分和小于50萬分子量的部分。
4.干燥大于50萬分子量的部分直接冷凍干燥，即獲得所需多糖。
制備的多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞激活率為290％。多糖含量為53％。
權(quán)利要求
1.一種靈芝多糖的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟①靈芝的粗提以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入5-15倍重量的水中，常溫浸泡10-60分鐘，加熱至60-100℃，保持此溫度60-120分鐘，過濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取1-2次，合并濾液。②靈芝粗提液的粗濾濾液用50-200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過濾。③靈芝濾出液超濾使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜的分子量截留值為50萬道爾頓，壓力低于0.3Mpa，濾液被分為二部分，大于50萬分子量的部分和小于50萬分子量的部分。④干燥大于50萬分子量的部分直接干燥，即獲得所需的大分子多糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種靈芝大分子多糖的制備方法，該方法包括對(duì)靈芝進(jìn)行粗提、粗濾、超濾和干燥四個(gè)步驟，該制備方法可以得到分子量大于50萬的靈芝大分子多糖，多糖含量超過50％，而且抗腫瘤活性和免疫增強(qiáng)活性增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1618819SQ20041006730
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月20日
發(fā)明者唐慶九, 張勁松, 楊焱, 賈薇, 劉艷芳, 唐傳紅 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院