專利名稱：一種以基因優(yōu)化方法獲得的抗草甘膦基因及其表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因優(yōu)化的方法，以此方法獲得的抗草甘膦的EPSP合成酶基因，含有此基因的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化子。
草甘膦是使用最為廣泛的廣譜除草劑，具有對人畜基本無毒，雜草難以對它產(chǎn)生抗性，低土壤殘留量等特點，市場潛力巨大。為適應(yīng)大規(guī)模機械化生產(chǎn)及施用草甘膦的需要，從二十世紀八十年代中期開始，人們?yōu)榕嘤共莞熟⑥r(nóng)作物作了大量的工作。目前，通過農(nóng)業(yè)基因工程技術(shù)獲得了許多抗草甘膦作物，它們具有如下特點(1)改變了農(nóng)業(yè)傳統(tǒng)耕作方式，使耕作管理更加容易；(2)除草效果更加明顯；(3)減少除草劑用量，有利于保護環(huán)境；(4)增產(chǎn)增收?？共莞熟⒆魑锏姆N植將大大減少除草劑的使用量，1996年美國種植抗草甘膦的大豆，每公頃除草劑用量減少9％至39％；1996年加拿大種植抗草甘膦的作物，使平均每公頃的除草劑用量比常規(guī)減少了1.0千克。美國孟山都公司開發(fā)的抗草甘膦作物，也即抗農(nóng)達系列，已經(jīng)被大面積種植，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益。
由aroA基因編碼的EPSP合成酶僅存在于微生物和植物中，在芳香族氨基酸代謝途徑中起作用，催化莽草酸-3-磷酸(S-3-P)與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)作用，生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)。已鑒定的EPSP合成酶可分為兩類第一類可由大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌等產(chǎn)生(下稱第一類EPSP合成酶或第一類酶)；第二類在根瘤農(nóng)桿菌CP4、無色細菌LBAA及假單胞菌PG2982中發(fā)現(xiàn)(下稱第二類EPSP合成酶或第二類酶)。這兩類EPSP合成酶的同源性不高，氨基酸的相似性少于50％，第二類酶不能與第一類酶的單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，而且兩者的酶學(xué)性質(zhì)也有區(qū)別。
由于草甘膦具有與PEP相似的結(jié)構(gòu)，可作為競爭性抑制劑，形成EPSP合成酶·S-3-P·草甘膦復(fù)合物，阻遏PEP與酶的結(jié)合，從而阻斷芳香族氨基酸的的合成，殺滅絕大多數(shù)的植物，雜草和農(nóng)作物皆不例外。
過去，獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物研究遵循的途徑主要有一、導(dǎo)入過量表達的EPSP合成酶基因，以此抵御草甘膦的競爭性抑制；二、通過定點突變，獲得對草甘膦低親和性或無親和性的EPSP合成酶，從而消除草甘膦的抑制作用。因為細菌的EPSP合成酶對草甘膦的抗性比植物來源的酶高兩個數(shù)量級左右，所以，用基因工程的方法，把細菌的EPSP合成酶基因?qū)胫参镏?，可使植物獲得一定的抗性。為提高抗性水平，可采用提高外源EPSP合成酶基因的表達量或通過定點突變降低該酶對草甘膦親和力等措施。Comai，L.等人將鼠傷寒沙門氏桿菌的aroA基因作定點突變，使EPSP合成酶的第101位脯氨酸變成絲氨酸，用突變后的基因轉(zhuǎn)化煙草，可使煙草對草甘膦表現(xiàn)出較強的抗性；Padgette SR等人將大腸桿菌的aroA基因表達蛋白的第96位甘氨酸改成丙氨酸，突變后的EPSP合成酶無論存在于大腸桿菌內(nèi)還是在豌豆內(nèi)，都因?qū)Σ莞熟⒂H和力的降低而表現(xiàn)出較高水平的草甘膦抗性。此外，把來源于農(nóng)桿菌變種CP4的抗草甘膦的EPSP合成酶基因引入甜菜、棉花和大豆中，均成功獲得具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因作物。
但是，外源基因過量表達必然會影響植物自身的生長。而由于對酶活性中心附近氨基酸殘基的作用并不明了，所以，定點突變的效果十分有限。目前，遇到的困難是，定點突變后的EPSP合成酶對草甘膦親和力的下降也伴隨著對原底物親和力的下降，也即影響了酶的催化活性。
本發(fā)明的目的是提供一種基因優(yōu)化的方法，以此方法可以人為加大發(fā)生基因突變的幾率；并通過該基因優(yōu)化方法獲得發(fā)生修飾突變的高活性的抗草甘膦的EPSP合成酶基因，以及含有此基因的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化子。該基因編碼的EPSP合成酶具有較高的抗草甘膦的水平，可作為培育抗草甘膦農(nóng)作物新品種的優(yōu)良材料。
本發(fā)明的基因優(yōu)化方法是同時用兩個或兩個以上同源性大于50％的基因序列作為源模板，設(shè)計與源模板序列相對應(yīng)的兩端引物，并采用兩步擴增反應(yīng)的PCR擴增方法，從而得到一系列具有多點突變的基因片段。
首先，要選擇兩個或兩個以上同源性大于50％的基因序列作為源模板，并設(shè)計出與源模板序列相對應(yīng)的兩端引物。第一步擴增的目的是通過一端引物與源模板的隨機結(jié)合，交錯延伸，合成一系列序列各異的重組的DNA單鏈。引物的用量較少，大約是1pmol-5pmol即可。DNA鏈延伸的時間也較短，可取1-5秒，即每次引物與模板退火結(jié)合后，最多只延伸幾十bp，便進入下一個變性-復(fù)性-延伸的循環(huán)。由于DNA具有同源重組的特性，所以，在每一次退火時，引物與各模板間的結(jié)合機會是相等的。引物與模板結(jié)合的隨機性，就造成了延伸的DNA鏈的不均一性。為增大延伸中的DNA鏈與模板結(jié)合的機會，本發(fā)明設(shè)計了兩個循環(huán)程序，第一個循環(huán)只進行5-10次，退火溫度較低，約40-50℃，以保證起始引物與模板的退火結(jié)合；第二個循環(huán)進行30-60次，并且退火溫度也要相應(yīng)提高到50-60℃，使上述循環(huán)中合成的短DNA鏈與模板的結(jié)合比起始引物與模板的結(jié)合更有優(yōu)勢。在每一次循環(huán)中，延伸鏈在各模板間隨機結(jié)合，隨機讀取各模板序列信息，指導(dǎo)自身的合成。最終，合成出一系列不均一地攜帶了各源模板序列信息的新的DNA片段。
以第一步擴增所獲得的產(chǎn)物作為模板，加入根據(jù)源模板設(shè)計的兩端引物，進行第二步擴增。熱循環(huán)所需的各溫度時間參數(shù)按常規(guī)要求即可。30次循環(huán)后，便可獲得一系列發(fā)生多點突變的完整的基因片段。
本發(fā)明的基因優(yōu)化方法的具體條件和操作步驟如下第一步擴增反應(yīng)反應(yīng)系統(tǒng)1×taqDNA聚合酶緩沖液，4種dNTP各200umol/L，根據(jù)各模板5-端設(shè)計的引物各1pmol-5pmol，各源模板DNA約102-104拷貝，taqDNA聚合酶約0.5-5U。
反應(yīng)程序及參數(shù)變化范圍[1]預(yù)變性94℃，5-10分鐘；[2]循環(huán)194℃ 60秒，40-50℃ 60秒，72℃ 1-5秒，循環(huán)5-10次；[3]循環(huán)294℃ 60秒，50-60℃ 60秒，72℃ 5秒，循環(huán)30-60次；[4]72℃ 10分鐘。
第二步擴增反應(yīng)反應(yīng)系統(tǒng)1×taqDNA聚合酶緩沖液，4種dNTP各200umol/L，根據(jù)各模板5’-端和3’-端設(shè)計的引物各10pmol-50pmol，取上述第一步擴增反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物1ul作為模板，taqDNA聚合酶約0.5-5U。
反應(yīng)程序及參數(shù)變化范圍[1]94℃ 5分鐘；循環(huán)94℃ 90秒，45-55℃ 30-90秒，72℃ 60-240秒，循環(huán)30次；[3]72℃ 10分鐘。
按照上述本發(fā)明的基因優(yōu)化方法，選擇大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌的EPSP合成酶基因序列為源模板，并設(shè)計出如下三條與該兩個模板相對應(yīng)的兩端引物引物15’-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3’，引物25’-CGCGGATCCTCAGGCTGCCTGGCTAATCC-3’，引物35’-CGCGGATCCTTAGGCAGGCGTACTCATTC-3’；即可合成突變的EPSP合成酶基因。產(chǎn)物包括命名為aroAM12的DNA序列和命名為aroAM13的DNA序列，它們分別如序列表1和序列表2所示。
將上述得到的aroAM12DNA序列插入到質(zhì)粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位點之間，即可得到含有aroAM12 DNA序列的質(zhì)粒pET-aroAM12，其結(jié)構(gòu)如

圖1所示；將上述得到的aroAM13 DNA序列插入到質(zhì)粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位點之間，即可得到含有aroAM13 DNA序列的質(zhì)粒pET-aroAM13，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。
用上述得到的質(zhì)粒pET-aroAM12轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)，即可獲得命名為BL21(aroAM12)的具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)化子；用上述得到的質(zhì)粒pET-aroAM13轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)，即可獲得命名為BL21(aroAM13)的具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)化子。
下面通過實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
圖1是pET-aroAM12質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖；圖2是pET-aroAM13質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖；圖3是轉(zhuǎn)化子在含20mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中的生長曲線；圖4是轉(zhuǎn)化子在含30mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中的生長曲線；圖5是轉(zhuǎn)化子在含60mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中的生長曲線；圖6是各轉(zhuǎn)化子的蛋白電泳圖；圖7是EPSP合成酶表達載體的構(gòu)建圖。
實施例1、突變EPSP合成酶基因的合成根據(jù)從GENE BANK中查知的大腸桿菌(Escherichia coli)和鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)的EPSP合成酶基因的DNA序列，并通過比較發(fā)現(xiàn)，這兩個序列的同源性為79％，符合基因優(yōu)化法的要求，可作為源模板。由于該兩個序列的5’-端序列是相同的，所以，5’-端引物也可相同。根據(jù)基因優(yōu)化法的要求，設(shè)計出三條引物引物15’-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3’，引物25’-CGCGGATCCTCAGGCTGCCTGGCTAATCC-3’，引物35’-CGCGGATCCTTAGGCAGGCGTACTCATTC-3’；上述帶下劃線處，表示相應(yīng)的酶切位點。其中，引物1是在前面加有一個Nco I酶切位點的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌的EPSP合成酶基因的相同的起始序列。引物2和引物3分別是大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌的EPSP合成酶基因1284bp前的序列加上BamHI的酶切位點。
合成反應(yīng)包括兩步PCR擴增，可按如下步驟和條件進行第一步擴增反應(yīng)反應(yīng)系統(tǒng)在反應(yīng)液中有兩個模板(大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌的核DNA)各約102-104拷貝以及1.5pmol引物1，各種dNTP 200umol/L，1×taqDNA聚合酶緩沖液，taqDNA聚合酶約0.5-5U。
反應(yīng)條件[1]預(yù)變性94℃，10分鐘；[2]循環(huán)194℃ 60秒，45℃ 60秒，72℃ 5秒；循環(huán)5次；[3]循環(huán)294℃ 60秒，55℃ 60秒，72℃ 5秒；循環(huán)30次；[4]72℃ 10分鐘。
第二步擴增第一步擴增反應(yīng)完畢，取反應(yīng)液1微升作為第二輪反應(yīng)的模板，并以1×taqDNA聚合酶緩沖液，4種dNTP各200umol/L，引物1-3各15pmol，taqDNA聚合酶約0.5-5U構(gòu)成反應(yīng)系統(tǒng)。
反應(yīng)條件[1]94℃ 5分鐘；[2]循環(huán)94℃ 90秒，55℃ 90秒，72℃ 120秒；循環(huán)30次；[3]72℃ 10分鐘。
兩步擴增反應(yīng)進行完畢后，瓊脂糖電泳鑒定PCR擴增結(jié)果。發(fā)現(xiàn)經(jīng)PCR擴增，獲得長約1.3kb左右的DNA片段，與預(yù)期的EPSP合成酶基因的大小相吻合。由于采用了特定的基因優(yōu)化方法，所以，所獲得的DNA片段并非序列均一的野生型的大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏桿菌的EPSP合成酶基因，而是不同程度地攜帶著兩源模板序列信息的，也即發(fā)生了不同程度突變的一組重組的EPSP合成酶基因。
實施例2、EPSP合成酶表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的獲得把上述實施例1經(jīng)PCR擴增后所獲得的序列不均一DNA片段走瓊脂糖凝膠電泳，并割下含有大小約為1.3kb的DNA的凝膠帶，用QIAGEN公司的“QIAquick Gel Extration Kit”，分離純化這些DNA片段。分離完畢，與質(zhì)粒pET 11d同時分別用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI酶切，再把兩者按載體∶插入片段＝1∶3的比例混合，用T4連接酶在16℃連接12小時。
取部分連接液，用標準氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)點到含有30mM草甘膦和1mM IPTG的M9固體培養(yǎng)基上，篩選能在該培養(yǎng)基上生長的具草甘膦抗性的轉(zhuǎn)化子。把這些初步篩選獲得的抗性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)點到含有60mM草甘膦和1mM IPTG的M9固體培養(yǎng)基上，得到了兩個具有較強抗草甘膦活性的轉(zhuǎn)化子，分別命名為BL21(aroAM12)和BL21(aroAM13)。
用QIAGEN公司的“QIAprep Spin Miniprep Kit”從轉(zhuǎn)化子BL21(aroAM12)和BL21(aroAM13)中提取質(zhì)粒，分別命名為pET-aroAM12、pET-aroAM13(其結(jié)構(gòu)分別如圖1、圖2所示)。以NcoI和BamHI雙酶切這兩個重組質(zhì)粒，瓊脂糖電泳分析，得到大小分別約為5.7kb和1.3kb的片段。電泳結(jié)果說明，在這兩個質(zhì)粒的NcoI和BamHI兩酶切位點間，分別含有PCR擴增所獲得的1.3Kb片段。用ABI377測序儀測定插入片段的DNA序列，進一步證明克隆到載體pET 11d的NcoI和BamHI兩酶切位點間的，是發(fā)生突變的EPSP合成酶基因。我們把這兩個突變的基因片段，分別命名為aroAM12和aroAM13。aroAM12和aroAM13的DNA序列及其所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶的氨基酸序列分別見序列表1和序列表2。
同時，用上述實施例1的引物1-3，以大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌的核DNA為模板，采用標準的PCR擴增法，獲得野生型的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌的EPSP合成酶基因，分別命名為EcaroA和StaroA，分別克隆到質(zhì)粒pET-11d的NcoI和BamHI酶切位點間。重組質(zhì)粒分別命名為pET-EcaroA和pET-StaroA，用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，所得轉(zhuǎn)化子分別命名為BL21(EcaroA)和BL21(StaroA)，作為上述含突變基因的轉(zhuǎn)化子的對照。
以上所述的質(zhì)粒pET-aroAM12、pET-aroAM13、pET-EcaroA和pET-StaroA的構(gòu)建過程如圖7所示。圖7中的“aroA”代表EPSP合成酶基因aroAM12、aroAM13、EcaroA或StaroA；“pET-aroA”代表質(zhì)粒pET-aroAM12、pET-aroAM13、pET-EcaroA或pET-StaroA。
實施例3、轉(zhuǎn)化子aroAM12、aroAM13草甘膦抗性的檢驗將轉(zhuǎn)化子BL21(aroAM12)和BL21(aroAM13)以及BL21(EcaroA)和BL21(StaroA)，分別接種到含有1mM IPTG、50μg/ml氨卞青霉素以及20、30或60mM草甘膦的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以200rpm、37℃空氣浴的條件培養(yǎng)。從培養(yǎng)至16小時開始，每隔2小時測定一次培養(yǎng)液OD600，記錄其生長情況，測定結(jié)果如圖3至圖5所示。從圖3至圖5的生長曲線可以看出，攜帶突變基因的轉(zhuǎn)化子在含有60mM草甘膦的M9基本培養(yǎng)基上仍能生存，而攜帶有野生型基因的轉(zhuǎn)化子在含有20mM的草甘膦的M9基本培養(yǎng)基上的生長已受到嚴重的抑制。由此可見，突變子的抗草甘膦能力比野生型有了明顯提高。
實施例4、突變EPSP合成酶基因DNA序列的測定及與野生型基因的比較將本發(fā)明的突變基因aroAM12和aroAM13分別與野生型的EPSP合成酶基因(EcaroA和StaroA)作序列相似性的比較，發(fā)現(xiàn)aroAM12與對照StaroA相似，aroAM13與對照EcaroA相似，分別在不同位點發(fā)生突變，結(jié)果如下述序列所示。
aroAM12編碼的EPSP合成酶的氨基酸突變位點StaroAMESLTLQPIARVDGAINLPGSKSVSNRALLLAAL PCGKT AL TNLLDSDDVRHMLNALSAL 60M12LAC TVLMN 60StaroAGINYTLSADRTRCDITGNGGAL RAPGALELFLGNAGTAMRPLAAALCLGQNEIVLTGEPR 120M12LHA 120StaroAMKERPIGHLVDSLRQGGANIDYLEQENYPPLRLRGGFTGGDIEVDGSVSSQFLTALLMTA180M12 180StaroAPLAP KDTIIRVKGELVSKPY IDITLNLMKTFGVEIANHHYQQFVVKGGQ QYHSPGRYLVE 240M12 PEDYND QKY 240
StaroAGDASSASYFLAAGAIKGGTVKVTGIGRKSMQGDIRFADVLEKMGATITWGDDFIACTRGE 300M12 300StaroALHAIDMDMNHIPDAAMTIATTALFAKGTTTLRNIYNWRVKETDRLFAMATELRKVGAEVE 360M12 360StaroAEGHDYIRITPPAKLQHADIGTYNDHRMAMCFSLVALSDTPVTILDPKCTAKTFPDYFEQL 420M12 420StaroAARMSTPA 427M12 427aroAM13編碼的EPSP合成酶的氨基酸突變位點EcaroAMESLTLQPIARVDGTINLPGSK TVSNRALLLAALAHGKTVLTNLLDSDDVRHMLNALTAL 60aroAM13KSV60EcaroAGVSYTLSADRTRCEIIGNGGPLHAEGALELFLGNAGTAMRPLAAALCLGSNDIVLTGEPR 120aroAM13 120EcaroAMKERPIGHLVDALRLGGAKITYLEQENYPPLRLQGGFTGGNVDVDGSVSSQFLTALLMTA 180aroAM13 180EcaroAPLAPEDTVIRIKGDLVSKPYIDITLNLMKTFGVEIENQHYQQFVVKGGQSYQSPGTYLVE 240aroAM13 240EcaroAGDASSASYFLAAAAIKGGTVKVTGIGRNSMQGDIRFADVLEKMGATICWGDDYISCTRGE 300aroAM13 300EcaroALNAIDMDMNHIPDAAMTIATAALFAKGTT RLRNIYNWRVKETDRLFAMATELRKVGAEVE 360aroAM13 TTL 360EcaroAEGHDYIRITPPEKLNFAEIATYNDHRMAMCFSLVALSDTPVTILDPKCTAKTFPDYFEQL 420aroAM13 420EcaroAARISQAA 427aroAM13 427
從上述序列可見命名為aroAM12的DNA序列的特征是，其所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶的氨基酸序列與鼠傷寒沙門氏桿菌aroA基因(StaroA)所編碼的氨基酸序列相比，含有下列氨基酸置換脯氨酸35→丙氨酸；丙氨酸40→纈氨酸；蘇氨酸42→蛋氨酸；精氨酸83→組氨酸；賴氨酸185→谷氨酸；異氨酸201→天冬酰胺；谷氨酰胺230→賴氨酸。
命名為aroAM13的DNA序列的特征是，其所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶的氨基酸序列與大腸桿菌aroA基因(EcaroA)所編碼的氨基酸序列相比，含有下列氨基酸置換蘇氨酸23→絲氨酸；精氨酸330→蘇氨酸。
實施例5、各轉(zhuǎn)化子的蛋白質(zhì)表達情況的分析分別用5ml含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子BL21(aroAM12)、BL21(aroAM13)以及BL21(EcaroA)、BL21(StaroA)，以200rpm、37℃空氣浴的條件至細胞濃度達108/ml，以1％的接種量，轉(zhuǎn)接到新鮮的含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝0.75時，加入IPTG至1mM以誘導(dǎo)重組蛋白的合成。在前述條件下，繼續(xù)培養(yǎng)三小時。離心收取菌體，采用Laemmli所述的方法，先用SDS-PAGE樣品緩沖液重懸菌體，12.5％SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。電泳完畢，用20％的考馬氏亮藍染色。電泳結(jié)果如圖4所示，第一道為不含質(zhì)粒的大腸桿菌BL-21的蛋白粗提物；第二至第五道分別是含有質(zhì)粒pET-StaroA，pET-EcaroA，pET-aroAM12和pET-aroAM13的BL-21的蛋白粗提物。從蛋白圖譜上可見，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)之后，在所有含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子的蛋白樣品中均檢測到了EPSP合成酶45KD的特異性蛋白帶(如圖中箭頭所指位置)，而作為空白對照的不含質(zhì)粒的大腸桿菌BL-21，則沒有產(chǎn)生該蛋白帶。蛋白電泳結(jié)果表明，EPSP合成酶基因得到有效表達。所檢測的兩個突變基因及其對照，即分別攜帶aroAM12、aroAM13以及EcaroA、StaroA基因的轉(zhuǎn)化子，在相同培養(yǎng)條件下，對EPSP合成酶蛋白的表達水平?jīng)]有明顯不同。該結(jié)果提示我們，對草甘膦抗性的提高，不是由于EPSP合成酶表達量的提高而引起的。
實施例6、EPSP合成酶粗提物的制備分別用5ml含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子aroAM12、aroAM13以及EcaroA、StaroA，以200rpm、37℃空氣浴的條件至細胞濃度達108/ml，以1％的接種量，轉(zhuǎn)接到新鮮的含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝0.75時，加入IPTG至1mM以誘導(dǎo)重組蛋白的合成。在前述條件下，繼續(xù)培養(yǎng)三小時。離心收取菌體。用緩沖液A(50mM Tris-Cl，0.1mM DTT，pH7.2)重懸菌體。細胞懸液置-70℃凍結(jié)，再在室溫中重融。然后用Fluko公司的乳化機處理細胞懸液使其破壁。以12000rpm離心30分鐘，棄去細胞碎片。上清液即為EPSP合成酶粗提物，可用于有關(guān)該酶的各項指標的測定。
實施例7、制備S-3-P(shikimate-3-phosphate)S-3-P的制備采取P.F.Knowles等的方法，從Klebsiella pneumoniae(ATCC 25597)的培養(yǎng)液中提取。接種該菌于12升營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基(酵母提取物2.8g/L，牛肉膏7.8g/L，酪蛋白7.8g/L，葡萄糖5.6g/L，氯化鈉5.6g/L，pH7.5)中，37℃振搖培養(yǎng)90小時。離心去菌體，用鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH至3，并加入0.5ml甲苯，上30目活性炭柱，依次用2升已用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5的水；1.5％，5％和10％的乙醇洗柱。最后，用500ml沒酸化的5％乙醇洗柱子一次。然后，用2.5升5％乙醇、3升10％乙醇、2升25％乙醇洗脫所要的S-3-P。合并所有的洗脫液，用真空干燥法干燥除水，得到糖漿狀的殘留物。把該糖漿狀物溶于150ml水中，用氨水調(diào)pH至7，加入100ml乙酸鋇與之反應(yīng)，然后加乙醇至80％(v/v)的濃度，0℃放置過夜。離心收取沉淀，并用75％乙醇洗沉淀兩次，用無水乙醇洗沉淀一次，真空干燥后，便獲得S3P的鋇鹽，可用于EPSP合成酶酶活的測定。
實施例8、EPSP合成酶活力及米氏常數(shù)的測定EPSP合成酶活力的測定采用Lanzetta所述的孔雀綠顯色定量測定無機磷的方法。反應(yīng)系統(tǒng)含有50mM Hepes/NaOH，pH7.2，1mM PEP，0.5mM S-3-P，0.1mM(NH4)Mo7O24·4H2O。各組分按量加好后，先在30℃預(yù)熱5分鐘，然后加入適量上述粗提酶液，酶反應(yīng)持續(xù)20分鐘，即加入孔雀綠溶液終止反應(yīng)。精確反應(yīng)60秒，立刻加入34％檸檬酸鈉溶液，混勻后靜置15分鐘，測定OD660，所用的空白對照管的成分與反應(yīng)管起始成分相同，區(qū)別在于沒有酶作用的時間，即加入酶液后，立刻加入孔雀綠溶液，其它各步操作與酶反應(yīng)管相同。
米氏常數(shù)的測定，采用傳統(tǒng)的雙倒數(shù)作圖法。測定結(jié)果如表一所示。
表一
a.酶的比活，是在底物過量的條件下，即在含1.0mMPEP和0.5mM S-3-P的反應(yīng)系統(tǒng)中測定的酶的比活力。
b.表示底物之一PEP所對應(yīng)的米氏常數(shù)，反應(yīng)系統(tǒng)中，S-3-P的含量固定在0.5mM，而PEP則取由0.1mM至0.5mM的一系列變化值。
c.表示PEP的競爭性抑制劑草甘膦與酶的解離常數(shù)。
d.以上各數(shù)據(jù)均為對兩批EPSP合成酶粗提物，各測定三次后獲得。
雖然在現(xiàn)有的報導(dǎo)中，不乏用遺傳工程的手段使第一類EPSP合成酶的草甘膦抗性提高的成功例子。但是，第一類酶卻有一個典型的特點抗性的提高，伴隨著酶與底物之一PEP的親和力的下降，也即K[PEP]的增大，從而導(dǎo)致酶的催化效率的下降。前述的較成功的例子，即將突變后的第101位脯氨酸變成絲氨酸的鼠傷寒沙門氏桿菌的aroA基因轉(zhuǎn)化煙草，使煙草對草甘膦表現(xiàn)出較強的抗性；以及將突變后的第96位甘氨酸變成丙氨酸的大腸桿菌的aroA基因轉(zhuǎn)化豌豆，因EPSP合成酶對草甘膦親和力的降低而使轉(zhuǎn)化后的豌豆表現(xiàn)出較高水平的草甘膦抗性，都屬于這種情況。由于K[PEP]的增大，降低了酶的催化效率，因此抗性的獲得，依賴于EPSP合成酶的過量表達，而這樣往往會導(dǎo)致作物產(chǎn)量的減少。
從測序結(jié)果亦可見，酶蛋白的突變，是由于氨基酸的置換而非由于氨基酸的增加或缺失而引起的。并且，發(fā)生置換的氨基酸，并不包含在前人報導(dǎo)的與酶的活性中心或酶與底物(包括PEP，S-3-P和草甘膦)的結(jié)合位點相關(guān)的氨基酸中。根據(jù)前人的研究推測，K22，R27，G96，R100和P101等氨基酸是酶與底物S-3-P結(jié)合的相關(guān)位點；而H385，C408和K411等氨基酸則和酶與PEP的結(jié)合有關(guān)。并且，本發(fā)明所涉及的氨基酸置換，也未見有關(guān)其在草甘膦抗性中起重要作用的報導(dǎo)。
本發(fā)明創(chuàng)立了一個獨特而有效的基因優(yōu)化的方法，在傳統(tǒng)PCR擴增法的基礎(chǔ)上加以改良，選用了多于一個的模板，并設(shè)計出與之相適應(yīng)的引物，通過隨機結(jié)合，交錯延伸的PCR擴增過程，克服了定點突變的局限性，增大了基因突變的幾率和幅度。并運用本方法，獲得了發(fā)生多點突變的EPSP合成酶基因，從中篩選到正向突變的兩個高抗性的突變子，與作為模板的野生型酶相比，具有高得多的酶活力(降低的K[PEP])和大大增強的草甘膦抗性(升高的Ki[草甘膦])。這是首次有關(guān)第一類EPSP合成酶具有該性質(zhì)的報導(dǎo)。aroAM12的Ki[草甘膦]比鼠傷寒沙門氏桿菌的提高了117倍，而K[PEP]卻僅為鼠傷寒沙門氏桿菌的0.047％。aroAM13的Ki[草甘膦]比大腸桿菌的提高了28倍，而K[PEP]卻僅為大腸桿菌的0.054％。aroAM12的Ki[草甘膦]/K[PEP]值比鼠傷寒沙門氏桿菌的增大了2600倍；而aroAM13的Ki[草甘膦]/K[PEP]值比大腸桿菌的增大了510倍。本發(fā)明提供的兩個突變基因，都有望成為構(gòu)建抗草甘膦農(nóng)作物新品種的優(yōu)良材料。
序列表11.序列特征長度1284bp；類型核酸及相應(yīng)蛋白質(zhì)；鏈數(shù)單鏈；幾何結(jié)構(gòu)線性；2.分子類型DNA；3.來源人工合成；4.序列描述SEQ ID NO.1ATG GAA TCC CTG ACG TTA CAA CCC ATC GCG CGG GTC GAT GGC GCC ATT 48M E S L T L Q P I A R V D G A I1 5 10 15AAT TTA CCT GGC TCC AAA AGT GTT TCA AAC CGT GCT TTG CTC CTG GCG 96N L P G S K S V S N R A L L L A20 25 30GCT TTA GCT TGT GGT AAA ACC GTT CTG ATG AAT CTG CTG GAT AGC GAT 144A L A C G K T V L M N L L D S D35 40 45GAC GTC CGC CAT ATG CTC AAT GCC CTG AGC GCG TTG GGG ATC AAT TAC 192D V R H M L N A L S A L G I N Y50 55 60ACC CTT TCT GCC GAT CGC ACC CGC TGT GAT ATC ACG GGT AAT GGC GGC 240T L S A D R T R C D I T G N G G65 70 75 80GCA TTA CAT GCG CCA GGC GCT CTG GAA CTG TTT CTC GGT AAT GCC GGA 288A L H A P G A L E L F L G N A G85 90 95ACC GCG ATG CGT CCG TTA GCG GCA GCG CTT TGT CTG GGG CAA AAT GAG 336T A M R P L A A A L C L G Q N E100 105 110ATA GTG TTA ACC GGC GAA CCG CGT ATG AAA GAG CGT CCG ATA GGC CAT 384I V L T G E P R M K E R P I G H115 120 125CTG GTC GAT TCG CTG CGT CAG GGC GGG GCG AAT ATT GAT TAC CTG GAG 432L V D S LR Q G G A N I D Y L E130 135 140CAG GAA AAC TAT CCG CCC CTG CGT CTG CGC GGC GGT TTT ACC GGC GGC 480Q E N Y P P L R L R G G F T G G145 150 155 160GAC ATT GAG GTT GAT GGT AGC GTT TCC AGC CAG TTC CTG ACC GCT CTG 528D I E V D G S V S S Q F L T A L165 170 175CTG ATG ACG GCG CCG CTG GCG CCT GAA GAC ACA ATT ATT CGC GTT AAA 576L M T A P L A P E D T I I R V K180 185 190
GGC GAA CTG GTA TCA AAA CCT TAC AAC GAT ATC ACG CTA AAT TTA ATG 624G E L V S K P Y N D I T L N L M195 200 205AAA ACC TTT GGC GTG GAG ATA GCG AAC CAT CAC TAC CAA CAA TTT GTC 672K T F G V E I A N H H Y Q Q F V210 215 220GTG AAG GGC GGT CAA AAG TAT CAC TCT CCA GGT CGC TAT CTG GTC GAG 720V K G G Q K Y H S P G R Y L V E225 230 235 240GGC GAT GCC TCG TCA GCG TCC TAT TTT CTC GCC GCT GGG GCG ATA AAA 768G D A S S A S Y F L A A G A I K245 250 255GGC GGC ACG GTA AAA GTG ACC GGG ATT GGC CGC AAA AGT ATG CAG GGC 816G G T V K V T G I G R K S M Q G260 265 270GAT ATT CGT TTT GCC GAT GTG CTG GAG AAA ATG GGC GCG ACC ATT ACC 864D I R F A D V L E K M G A T I T275 280 285TGG GGC GAT GAT TTT ATT GCC TGC ACG CGC GGC GAA TTG CAC GCC ATA 912W G D D F I A C T R G E L H A I290 295 300GAT ATG GAT ATG AAC CAT ATT CCG GAT GCG GCG ATG ACG ATT GCC ACC 960D M D M N H I P D A A M T I A T305 310 315 320ACG GCG CTG TTT GCG AAA GGA ACC ACG ACG TTG CGC AAT ATT TAT AAC 1008T A L F A K G T T T L R N I Y N325 330 335TGG CGA GTG AAA GAA ACC GAT CGC CTG TTC GCG ATG GCG ACC GAG CTA 1056W R V K E T D R L F A M A T E L340 345 350CGT AAA GTG GGC GCT GAA GTC GAA GAA GGG CAC GAC TAT ATT CGT ATC 1104R K V G A E V E E G H D Y I R I355 360 365ACG CCG CCG GCG AAG CTC CAA CAC GCG GAT ATT GGC ACG TAC AAC GAC 1152T P P A K L Q H A D I G T Y N D370 375 380CAC CGT ATG GCG ATG TGT TTC TCA CTG GTC GCA CTG TCC GAT ACG CCA 1200H R M A M C F S L V A L S D T P385 390 395 400GTC ACG ATC CTG GAC CCT AAA TGT ACC GCA AAA ACG TTC CCT GAT TAT 1248V T I L D P K C T A K T F P D Y405 410 415TTC GAA CAA CTG GCG CGA ATG AGT ACG CCT GCC TAA 1284F E Q L A R M S T P A *420 425
序列表21.序列特征長度1284bp；類型核酸及相應(yīng)蛋白質(zhì)；鏈數(shù)單鏈；幾何結(jié)構(gòu)線性；2.分子類型DNA；3.來源人工合成；4.序列描述SEQ ID NO.2ATG GAA TCC CTG ACG TTA CAA CCC ATC GCT CGT GTC GAT GGC ACT ATT 48M E S L T L Q P I A R V D G T I1 5 10 15AAT CTG CCC GGT TCC AAG AGC GTT TCT AAC CGC GCT TTA TTG CTG GCG 96N L P G S K S V S N R A L L L A20 25 30GCA TTA GCA CAC GGC AAA ACA GTA TTA ACC AAT CTG CTG GAT AGC GAT 144A L A H G K T V L T N L L D S D35 40 45GAC GTG CGC CAT ATG CTG AAT GCA TTA ACA GCG TTA GGG GTA AGC TAT 192D V R H M L N A L T A L G V S Y50 55 60ACG CTT TCA GCC GAT CGT ACG CGT TGC GAA ATT ATC GGT AAC GGC GGT 240T L S A D R T R C E I I G N G G65 70 75 80CCA TTA CAC GCA GAA GGT GCC CTG GAG TTG TTC CTC GGT AAC GCC GGA 288P L H A E G A L E L F L G N A G85 90 95ACG GCA ATG CGT CCG CTG GCG GCA GCT CTT TGT CTG GGT AGC AAT GAT 336T A M R P L A A A L C L G S N D100 105 110ATT GTG CTG ACC GGT GAG CCG CGT ATG AAA GAA CGC CCG ATT GGT CAT 384I V L T G E P R M K E R P I G H115 120 125CTG GTG GAT GCG CTG CGC CTG GGC GGG GCG AAG ATC ACT TAC CTG GAA 432L V D A L R L G G A K I T Y L E130 135 140CAA GAA AAT TAT CCG CCG TTG CGT TTA CAG GGC GGC TTT ACT GGC GGC 480Q E N Y P P L R L Q G G F T G G145 150 155 160AAC GTT GAC GTT GAT GGC TCC GTT TCC AGC CAA TTC CTC ACC GCA CTG 528N V D V D G S V S S Q F L T A L165 170 175TTA ATG ACT GCG CCT CTT GCG CCG GAA GAT ACG GTG ATT CGT ATT AAA 576L M T A P L A P E D T V I R I K180 185 190
GGC GAT CTG GTT TCT AAA CCT TAT ATC GAC ATC ACA CTC AAT CTG ATG 624G D L V S K P Y I D I T L N L M195 200 205AAG ACG TTT GGT GTT GAA ATT GAA AAT CAG CAC TAT CAA CAA TTT GTC 672K T F G V E I E N Q H Y Q Q F V210 215 220GTA AAA GGC GGG CAG TCT TAT CAG TCT CCG GGT ACT TAT TTG GTC GAA 720V K G G Q S Y Q S P G T Y L V E225 230 235 240GGC GAT GCA TCT TCG GCT TCT TAC TTT CTG GCA GCA GCA GCA ATC AAA 768G D A S S A S Y F L A A A A I K245 250 255GGC GGC ACT GTA AAA GTG ACC GGT ATT GGA CGT AAC AGT ATG CAG GGT 816G G T V K V T G I G R N S M Q G260 265 270GAT ATT CGC TTT GCT GAT GTG CTG GAA AAA ATG GGC GCG ACC ATT TGC 864D I R F A D V L E K M G A T I C275 280 285TGG GGC GAT GAT TAT ATT TCC TGC ACG CGT GGT GAA CTG AAC GCT ATT 912W G D D Y I S C T R G E L N A I290 295 300GAT ATG GAT ATG AAC CAT ATT CCT GAT GCG GCG ATG ACC ATT GCC ACG 960D M D M N H I P D A A M T I A T305 310 315 320GCG GCG TTA TTT GCA AAA GGC ACC ACC ACG CTG CGC AAT ATC TAT AAC 1008A A L F A K G T T T L R N I Y N325 330 335TGG CGT GTT AAA GAG ACC GAT CGC CTG TTT GCG ATG GCA ACA GAA CTG 1056W R V K E T D R L F A M A T E L340 345 350CGT AAA GTC GGC GCG GAA GTG GAA GAG GGG CAC GAT TAC ATT CGT ATC 1104R K V G A E V E E G H D Y I R I355 360 365ACA CCT CCG GAA AAA CTG AAC TTT GCC GAG ATC GCG ACA TAC AAT GAT 1152T P P E K L N F A E I A T Y N D370 375 380CAC CGG ATG GCG ATG TGT TTC TCG CTG GTG GCG TTG TCA GAT ACA CCA 1200H R M A M C F S L V A L S D T P385 390 395 400GTG ACG ATT CTT GAT CCC AAA TGC ACG GCC AAA ACA TTT CCG GAT TAT 1248V T I L D P K C T A K T F P D Y405 410 415TTC GAG CAG CTG GCG CGG ATT AGC CAG GCA GCC TGA 1284F E Q L A R I S Q A A *420 42權(quán)利要求
1.一種aroAM13的DNA序列，其特征是其所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶與大腸桿菌aroA基因所編碼的氨基酸序列相比，含有下列氨基酸置換蘇氨酸23→絲氨酸和精氨酸330→蘇氨酸。
2.含有權(quán)利要求1所述的aroAM13 DNA序列的質(zhì)粒pET-aroAM13，其特征是權(quán)利要求1所述的aroAM13 DNA序列插入到質(zhì)粒pET11d的NcoI利Bam HI酶切位點之間。
3.命名為BL21(aroAM13)的具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)化子，由如權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒pET-aroAM13轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)而獲得。
全文摘要
本發(fā)明利用DNA序列同源重組的特性和傳統(tǒng)PCR擴增法的熱循環(huán)反應(yīng)，設(shè)計出以兩個或兩個以上同源性大于50％的基因序列為源模板，并采用兩步PCR擴增反應(yīng)的簡便高效的基因優(yōu)化方法。并以此方法獲得了兩個發(fā)生多點突變的，具有較強草甘膦抗性的EPSP合成酶基因。其編碼的酶具有比野生型低得多的K
文檔編號C08K9/10GK1680556SQ20051006712
公開日2005年10月12日 申請日期2001年5月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月15日
發(fā)明者徐培林, 何鳴, 楊中藝 申請人:中山大學(xué)