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      靈芝多糖的制備方法及應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):3691752閱讀:277來源:國知局
      專利名稱:靈芝多糖的制備方法及應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種從靈芝孢子中提取多糖的方法,以及由此方法提取的多糖的應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      靈芝在我國具有悠久的藥用歷史,隨著人工栽培靈芝技術(shù)的成功和推廣,對(duì)靈芝的研究也進(jìn)入了一個(gè)新的進(jìn)程,從以前的粗放型的將靈芝直接剪煮使用到現(xiàn)在的努力精確提取有效成分的使用,由于靈芝孢子的有效成份主要存在于靈芝孢子雙層壁內(nèi),粗放型使用對(duì)靈芝的利用率極低,造成對(duì)靈芝的極大浪費(fèi)。而孢子粉雖然具有很高的藥用價(jià)值,由于由幾丁質(zhì)等成份構(gòu)成的雙層孢壁結(jié)構(gòu)不僅十分堅(jiān)硬,還有極強(qiáng)的耐酸及耐堿能力,因此必須對(duì)孢子粉進(jìn)行進(jìn)一步的加工,以提取孢內(nèi)的活性成份。目前對(duì)靈芝孢子的加工主要集中在破壁上,即破壞孢子堅(jiān)硬的外殼,以破壞孢子的整體性,其主要包括生物酶解法,超聲波破碎法、超音速氣流粉碎法、微波加熱技術(shù)等,這幾種處理方法雖然具有很高的破壁率,但由于靈芝孢子多糖多存在于堅(jiān)硬的雙層壁殼內(nèi),因此對(duì)于多糖提取率和應(yīng)用未見顯著提高,且這幾種技術(shù)還會(huì)對(duì)多糖的營養(yǎng)成份或活性成份造成損害,故這種處理方法仍未能達(dá)到理想的提取效果。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種即可充分提取靈芝中的多糖的方法,及由此方法提取的多糖的應(yīng)用。
      本發(fā)明提供的提取靈芝多糖的方法是1)將靈芝孢子粉原料中加入中性鹽溶液充分?jǐn)嚢杈鶆蚴够旌弦喊l(fā)生滲透作用,2)將振蕩后的混合液進(jìn)行離心分離,取上清液,3)將上清液濃縮后用具有一定親水性、較強(qiáng)的親脂性的有機(jī)溶濟(jì)進(jìn)透析或膜分離后、低溫干燥得多糖。
      本發(fā)明采用滲透法,利用滲透的原理使孢子內(nèi)活性物質(zhì)通過滲透交換平衡,從而將孢子內(nèi)的活性物質(zhì)主要成分如蛋白多糖、蛋白、核酸、三萜類物質(zhì)等等大分子物質(zhì)以及氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、微量元素等小分子活性物質(zhì)或其他相結(jié)合物質(zhì)由固相轉(zhuǎn)到液相中,或通過高濃度鹽類,由孢內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入孢外特定的溶液中。
      所述的靈芝孢子粉與中性鹽溶液理想的重量份數(shù)比為1∶10~15。
      可作為鹽析滲透的中性鹽有很多,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等。本發(fā)明優(yōu)先選用氯化鈉,其理想濃度為1.0~1.8%。
      所述的用于透析(多糖沉淀)的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、乙醚等。
      本發(fā)明的方法還包括靈芝孢子粉在使用中性鹽溶液提取后余下的殘?jiān)屑尤胗袡C(jī)酸進(jìn)行提取后,將兩種不同的提取劑提取的上清液合并后進(jìn)行處理而得多糖,由于不同的提取劑提取所獲得的多糖的成份摩爾比是不一樣的,由中性鹽溶液提取所獲得的多糖的單糖成份主要包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖等,摩爾比為26.79∶1.60∶6.83,由有機(jī)酸提取的多糖中單糖成分摩爾比為3.78∶1.89∶0.99。
      所述的靈芝孢子粉有機(jī)酸溶液理想的重量份數(shù)比為1∶10~15。
      有機(jī)酸溶液為草酸溶液,其濃度為1%~5%。
      除了草酸外,其它的蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、乙酸等等有機(jī)酸均可以作為提取劑。
      所述的制備方法還包括將用有機(jī)酸提取后的孢子粉殘?jiān)屑尤肴鯄A溶液進(jìn)行提取。將由弱堿溶液提取出的上清液與其它提取劑提取出的上清液進(jìn)行合并,經(jīng)濃縮后進(jìn)行透析或膜分離,而得復(fù)合多糖。
      本方法還包括將所得的多糖溶于水后,將水溶液進(jìn)行透析,截留分子量5000以上的多糖,通過DEAE柱層精制處理,得純度90.85%以上的多糖。
      本發(fā)明的上述各種提取劑的提取步驟中,還包括將加入提取劑后的混合液置入超聲波振蕩器中進(jìn)行振蕩,從而使孢子粉內(nèi)的活性成份或營養(yǎng)成份能更好的分離出來,所述的超聲振蕩的理想溫度為60~80℃,超聲功率在40-100%之間,時(shí)間1-2h。
      本發(fā)明的離心采用離心機(jī)進(jìn)行分離,離心機(jī)的理想轉(zhuǎn)速為2800-3500r/mim,時(shí)間20分鐘。
      本發(fā)明的孢子粉可以是未破壁的,也可以是破壁的,兩者的區(qū)別僅在于提取后的多糖中的成份略有不同,后者的多糖中多一個(gè)核糖。
      由本發(fā)明方法所制備得到的多糖可制備抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的輔助制劑。
      本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明采用滲透法,使孢子內(nèi)活性物質(zhì)通過滲透交換平衡,達(dá)到孢子內(nèi)活性物質(zhì)更容易釋放。
      2.本發(fā)明孢子殘?jiān)^續(xù)分別,采用有機(jī)酸和微堿性的溶劑復(fù)合提取,把不同溶劑提取的多糖,組成為復(fù)合多糖,以獲得更好的藥用價(jià)值。
      破壁孢子粉的油脂成分,通過本法處理后順利排除,其多糖不含有脂肪氧化變質(zhì),影響產(chǎn)品保存的問題。


      圖1是未經(jīng)提取處理的孢子粉顯微鏡照片從圖中可看出孢子表面是光滑的。
      圖2是未經(jīng)提取的破壁靈芝孢子粉的顯微鏡照片從圖中可看出靈芝孢子破碎、裂紋及不易分離。
      圖3是按本發(fā)明實(shí)施例4的方法提取后剩余的孢子粉殘?jiān)娘@微鏡照片圖4是按本發(fā)明實(shí)施例4提取方法提取所得多糖(Gl-SP)的氣相圖譜。
      圖5是將實(shí)施例4中的未破壁靈芝孢子粉替換成破壁孢子粉后提取所得的多糖的氣相圖譜(Gl-Bsp)。
      圖6是按本發(fā)明實(shí)施例4方法所提取得到的多糖的HPLC(高效液體色譜)其中TSKG3000PWXL柱溫35℃,以硫酸鈉溶液為流動(dòng)相,流速0.5ml/min示差折光監(jiān)測器。
      色譜峰結(jié)果

      圖7是按本發(fā)明實(shí)施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的凝膠色譜GPC8是按本發(fā)明實(shí)施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的紅外光譜9是將實(shí)施例4中的未破壁靈芝孢子粉替換成破壁孢子粉后提取所得的多糖(Gl-Bsp)的紅外光譜圖。
      圖10是按本發(fā)明實(shí)施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的光譜對(duì)照11是按本發(fā)明實(shí)施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的1H核磁共振(NMR)圖譜圖12是將實(shí)施例4中的未破壁靈芝孢子粉替換成破壁孢子粉后提取所得的多糖(Gl-Bsp)1H核磁共振(NMR)圖譜圖13是按本發(fā)明實(shí)施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的對(duì)照14是按本發(fā)明實(shí)施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的氨基酸分析結(jié)果圖。
      圖15是Gl-SP和Gl-BSP對(duì)NK細(xì)胞活性的影響圖16是Gl-SP和Gl-BSP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬NR的影響圖17是Gl-SP和Gl-BSP對(duì)雙向MLR過程中分泌IL-2、IFN-γ的影響圖18是Gl-SP和Gl-BSP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響圖19是Gl-SP和Gl-BSP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響具體實(shí)施方式
      下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
      實(shí)施例1①取1kg靈芝孢子粉置于玻璃容器中;
      ②取氯化鈉210g溶于1.5L水中,配成1.4%溶度;③取上述溶液1.2L和靈芝孢子粉,放置玻璃容器中,用攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆颍虎軐㈧`芝孢子液,置于離心機(jī)中進(jìn)行離心后,取上清液。
      而后將上清液濃縮,采用乙醇進(jìn)行透析沉淀,除去氯化鈉等其它成份,沉淀物為孢子多糖,置低溫干燥后得成品。
      本實(shí)施例中的氯化鈉可用硫酸鈉、磷酸鈉等替換,而乙醇則可用丁醇及丙酮等替換,其余方法步驟不變。
      實(shí)施例21.取1kg靈芝孢子粉或破壁靈芝孢子粉置于玻璃容器中;2.取氯化鈉270g溶于1.5L水中,配成1.8%溶度;3.取上述溶液1.5L,放置玻璃容器中,用攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆颍?.將上述玻璃容器置于超聲波振蕩器中(KQ-300DE型),溫度70℃,超聲功率在50%,時(shí)間1h。
      5.提取的靈芝孢子液,置于離心機(jī)轉(zhuǎn)速2800r/mim,時(shí)間20分鐘,取上清液。
      6.靈芝孢子殘?jiān)磸?fù)再提取一次,時(shí)間為1h,方法同上。
      兩次所得上清液濃縮,采用乙醇進(jìn)行透析沉淀,除去氯化鈉等其它成份,沉淀孢子多糖,置低溫干燥后得成品。
      本實(shí)施例還可將其中的氯化鈉重量由165g溶于1.5L水中,配成1.1%溶度,取氯化鈉溶液為1.1升,其余方法與實(shí)施例2相同。
      實(shí)施例31.取1kg靈芝孢子粉或破壁靈芝孢子粉置于玻璃容器中;2.取氯化鈉270g溶于1.5L水中,配成1.8%溶度;3.取上述溶液1.5L,放置玻璃容器中,用攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆颍?.將上述玻璃容器置于超聲波振蕩器中(KQ-300DE型),溫度80℃,超聲功率在85%,時(shí)間1.8h;5.提取的靈芝孢子液,置于離心機(jī)轉(zhuǎn)速3300r/mim,時(shí)間20分鐘,取上清液;6.靈芝孢子殘?jiān)磸?fù)再提取一次,時(shí)間為1h,方法同上;7.將靈芝孢子粉殘?jiān)糜谌萜髦校?.取草酸(C2H2O4)300g,加水1.5L,配成2%草酸溶液;9.取上述溶液1.3L加入盛有靈芝孢子殘?jiān)牟A萜髦校浞謹(jǐn)嚢枋怪鶆颍?0.將攪拌均勻的靈芝孢子液,置于離心機(jī)內(nèi),轉(zhuǎn)速3000r/min,時(shí)間18分鐘,取上清液;11.將靈芝孢子殘?jiān)磸?fù)提取一次,方法同上。
      將兩次氯化鈉溶液與兩次草酸提取所得上清液混合,濃縮后采用乙醇沉淀,沉淀溶于水透析液濃縮,乙醇再次沉淀多糖,沉淀孢子多糖,置低溫干燥得成品。
      實(shí)施例41.取1kg靈芝孢子粉或破壁靈芝孢子粉置于玻璃容器中;2.取氯化鈉270g溶于1.5L水中,配成1.8%溶度;3.取上述溶液1.5L,放置玻璃容器中,用攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆颍?.將上述玻璃容器置于超聲波振蕩器中(KQ-300DE型),溫度60~80℃,超聲功率在40-100%之間,時(shí)間1-2h。
      5.提取的靈芝孢子液,置于離心機(jī)轉(zhuǎn)速2800-3500r/mim,時(shí)間20分鐘,取上清液。
      6.靈芝孢子殘?jiān)磸?fù)再提取一次,時(shí)間為1h,方法同上。
      7.將步驟6提取后的靈芝孢子殘?jiān)?,置于玻璃容器中?.取草酸(C2H2O4)150g,加水1.5L,配成1%草酸溶液;9.上述溶液1.5L加入盛有靈芝孢子殘?jiān)牟A萜髦?,充分?jǐn)嚢枋怪鶆颍?0.將上述玻璃容器置于超聲振蕩器內(nèi)(KQ-300DE型),溫度70℃,超聲功率在60%之間,時(shí)間為1h;11.提取的靈芝孢子液,置于離心機(jī)內(nèi),轉(zhuǎn)速3500r/min,時(shí)間16分鐘,取上清液;12.靈芝孢子殘?jiān)磸?fù)提取一次,方法同上。
      13.將步驟12中的靈芝孢子殘?jiān)?,置于玻璃容器中?4.將氫氧化鈉(NaOH)150g,加水1.5L配成1%NaOH溶液;15.取上述溶液1.5L加入盛有靈芝孢子殘?jiān)牟A萜髦?,充分?jǐn)嚢杈鶆颍?6.將上述玻璃容器置于超聲振蕩器內(nèi),溫度30℃,時(shí)間為0.5~1h;17.提取的靈芝孢子液,置于離心機(jī)內(nèi),轉(zhuǎn)速2800-3500r/min,時(shí)間20分鐘,取上清液;18.靈芝孢子殘?jiān)磸?fù)提取一次,方法同上;19.將上述三種提取劑提取所得上清液合并,離心3000r/min,清液用醋酸調(diào)pH值6.0;20.減壓濃縮,真空度0.085Mpa;21.用三倍量95%乙醇,充分?jǐn)嚢桁o置復(fù)合多糖沉淀,放置冰箱48h;22.離心(轉(zhuǎn)速2800r/min),時(shí)間20分,留下沉淀復(fù)合多糖部分,棄去上清液。
      23.將粗多糖溶于水中,用乙醇沉淀,透析除去氯化鈉和色素等成分;24.沉淀孢子多糖經(jīng)乙醇、丙酮、乙醚洗滌,置低溫干燥得成品多糖。依照本實(shí)施例方法所獲得的多糖的特性如圖4、5、6、7、8、10、11、14及15。
      實(shí)施例5其余步驟與實(shí)施例4相同,只是將實(shí)施例4中所得的多糖溶于水,透析48h,透析袋截留分子量5000以上,以除去低分子多糖及色素等。高分子部位(5000以上)得率為2.25%,低分子得為2.42%。
      將上述所得高分子多糖,通過DEAE柱層精制處理。純度可達(dá)90.85%(見色譜結(jié)果)。
      具體方法取復(fù)合多糖(1%)上DEAE-纖維素柱純化,分別用水、0.5~1mol/L NaCl洗脫,得白色BT1,淺褐色BT2,和BT3三個(gè)組分,得率分別為69.67%;0.24%和0.76%。
      以實(shí)施例4、5中的靈芝孢子粉可用破壁靈芝粉替代其中的靈芝孢子粉原料,其所有的加工方法與未破壁的孢子粉一樣,只是在破壁孢子粉所獲得的多糖成份中多了一個(gè)核糖。由破壁靈芝孢子粉按上述方法加工所獲得的多糖的特性如圖5、9、12所示.
      應(yīng)用實(shí)施例1將本發(fā)明所制得的靈芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁靈芝孢子多糖(Gl-BSP)對(duì)BALB/c小鼠移植性S180肉瘤的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果灌胃給予Gl-SP和Gl-BSP(50,100,200mg/kg)可抑制抑制BALB/c小鼠移植性S180肉瘤的生長,抑瘤率分別為7.8%,18.1%,37.4%(P<0.05)和30.7%,40.1%(P<0.05),59.9%(P<0.01)(見表1)。
      表1靈芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁靈芝孢子多糖(Gl-BSP)對(duì)BALB/c小鼠移植性S180肉瘤的抑制作用(x±s,n=10)


      *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs.Model group上表說明靈芝孢子多糖(Gl-SP)和破壁靈芝孢子多糖(Gl-BSP)均可不同程度的抑制腫瘤的生長,Gl-BSP對(duì)腫瘤的生長顯示出了更明顯的抑制作用。
      ②靈芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁靈芝孢子多糖(Gl-BSP)對(duì)S180荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果灌胃給予S180荷瘤小鼠Gl-SP和Gl-BSP(50,100,200mg/kg)可明顯促進(jìn)Con A誘導(dǎo)的荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,與模型對(duì)照組的相比,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加13.2%(P<0.001),37.5%(P<0.001),47%(P<0.001)和44%(P<0.001),100.2%(P<0.001),106.1%(P<0.001)。相同濃度的Gl-BSP處理組對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的作用強(qiáng)于Gl-SP(P<0.001)。(見表2)表2靈芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁靈芝孢子多糖(Gl-BSP)對(duì)S180荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響(x±s,n=3)

      *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs.Normal group;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 vs.Model group;△△△P<0.001 vs.Gl-BSP of the same concentrations上表說明Gl-SP和Gl-BSP可改善荷瘤小鼠的免疫狀態(tài),促進(jìn)絲裂原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖作用,Gl-BSP對(duì)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖作用具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用。
      ③靈芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁靈芝孢子多糖(Gl-BSP)對(duì)S180荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞活性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果灌胃給予S180荷瘤小鼠Gl-SP和Gl-BSP(50,100,200mg/kg)可明顯增強(qiáng)荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞的殺傷活性,與模型對(duì)照組相比,NK細(xì)胞的殺傷活性分別提高了15.2%(P<0.001),17.5%(P<0.001),26.3%(P<0.001)和26.9%(P<0.001),27.8%(P<0.001),29.6%(P<0.001)。同濃度的Gl-BSP(50,100mg/kg)給藥組對(duì)NK細(xì)胞的殺傷活性的增強(qiáng)作用強(qiáng)于Gl-SP給藥組。(見表3)表3靈芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁靈芝孢子多糖(Gl-BSP)對(duì)S180荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞活性的影響(x±s,n=3)

      *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs.Normal group;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 vs.Model group;△P<0.05,△△P<0.01,vs.Gl-BSP of the same concentrations上表說明Gl-SP和Gl-BSP可增強(qiáng)荷瘤小鼠的NK細(xì)胞活性,Gl-BSP與Gl-SP相比具有更強(qiáng)的作用。
      ④Gl-SP和Gl-BSP對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖及ConA、LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果Gl-SP和Gl-BSP(0.8~12.8mg/L)可顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加15.0~39.0%和15.0~40.5%。Gl-SP(3.2~12.8mg/L)和Gl-BSP(0.2~12.8mg/L)可顯著促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加21.0~30.1%和31.7~44.7%,相同濃度的Gl-BSP對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的作用強(qiáng)于Gl-SP。Gl-SP和Gl-BSP(3.2~12.8mg/L)均可顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加10.6~22.9%和12.0~18.1%(見表4)。
      表4 Gl-SP和Gl-BSP對(duì)體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=3)Tab4 Influences of Gl-SP and Gl-BSP on lymphocyte proliferation of murinesplenocytes(x±s,n=3).

      ⑤Gl-SP和Gl-BSP對(duì)MLR的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果Gl-SP和Gl-BSP在0.2~12.8mg/L劑量范圍內(nèi)可顯著促進(jìn)雙向MLR,細(xì)胞增殖率分別增加26.8~31.6%或20.9~48.0% Gl-BSP 12.8mg/L時(shí)促增殖作用強(qiáng)于Gl-SP(P<0.05)。Gl-SP(0.2~3.2mg/L)和Gl-BSP(0.2~12.8mg/L)均可顯著促進(jìn)單向MLR,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加44.1~62.6%和71.5~120.6%,但僅在濃度為12.8mg/L時(shí),Gl-BSP促增殖作用明顯強(qiáng)于Gl-SP(P<0.001)(見表5)。
      表5Gl-SP和Gl-BSP對(duì)MLR的影響(x±s,n=3)Tab5 Influences of Gl-SP and Gl-BSP on mixed lymphocyte culture reaction ofmurine splenocytes(x±s,n=3).

      ⑥Gl-SP和Gl-BSP對(duì)NK細(xì)胞活性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果Gl-SP或Gl-BSP在0.2~3.2mg/L劑量范圍內(nèi),可顯著提高NK細(xì)胞殺傷活性,RMPI1640對(duì)照組為12.7%,Gl-SP組為23.7~53.2%,Gl-BSP組為23.5~45.1%,二者作用相似,無顯著差異(圖15)。
      ⑦Gl-SP和Gl-BSP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬NR的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果在0.2~12.8mg/L劑量范圍內(nèi),Gl-SP和Gl-BSP均可顯著增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬NR的能力,吞噬率分別增加53.0~85.3%和30.2~80.2%,二者比較無顯著差異(圖16)。
      ⑧Gl-SP和Gl-BSP對(duì)雙向MLC反應(yīng)中T細(xì)胞及亞群的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果Gl-SP和Gl-BSP在一定的濃度范圍內(nèi)可顯著增加雙向MLC反應(yīng)中CD3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞百分率,Gl-BSP在濃度為0.2~12.8mg/L或3.2~12.8mg/L時(shí),增加CD4+或CD8+T細(xì)胞的作用較Gl-SP更為顯著。在濃度為0.2~0.8mg/L時(shí),Gl-BSP組的CD4+T和CD8+T細(xì)胞的比值大于Gl-SP組(見表6)。
      表6Gl-SP和Gl-BSP對(duì)雙向MLR中T淋巴細(xì)及亞群的影響(x±s,n=3)Tab6 Influences of Gl-SP and Gl-BSP on the T-lymphocyte subpopulations in MLR(x±s,n=3).

      ⑨Gl-SP和Gl-BSP對(duì)雙向MLR過程中分泌IL-2、IFN-γ的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果Gl-SP或Gl-BSP(0.2~12.8mg/L)可顯著增加IL-2、IFN-γ的分泌,但相同濃度的Gl-BSP增加IL-2和IFN-γ分泌的作用均強(qiáng)于Gl-SP(圖17)。
      ⑩Gl-SP和Gl-BSP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果在12.8mg/L劑量時(shí),兩種多糖均可顯著促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α,在相同濃度時(shí),二者比較均無顯著差異(圖18)Gl-SP和Gl-BSP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果Gl-SP(12.8mg/L)或Gl-BSP(3.2~12.8mg/L)可顯著促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO,但在相同濃度時(shí),二者比較均無顯著差異(圖19)。
      靈芝孢子和破壁孢子多糖對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞及腹腔巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的比較1)Gl-SP和Gl-BSP對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖及ConA、LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Gl-SP和Gl-BSP(0.8~12.8mg.L-1)可顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加15.0~39.0%和15.0~40.5%。(見表7)表7Gl-SP和Gl-BSP對(duì)體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=3)

      2)Gl-SP(3.2~12.8mg.L-1)和Gl-BSP(0.2~12.8mg.L-1)可顯著促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加21.0~30.1%和31.7~44.7%。(見表8)表8 Gl-SP和Gl-BSP對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=3)

      與ConA組比較aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001;與Gl-PP組比較dP<0.05;與同濃度Gl-SP比較gP<0.05,hP<0.013)Gl-SP和Gl-BSP(3.2~12.8mg.L-1)可顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加10.6~22.9%和12.0~18.1%。(見表9)表9 Gl-SP和Gl-BSP對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=3)

      與LPS組比較aP<0.05,cP<0.001與Gl-PP組比較dP<0.054)Gl-SP和Gl-BSP對(duì)MLR的影響Gl-SP和Gl-BSP0.2~12.8mg.L-1劑量范圍內(nèi)可顯著促進(jìn)雙向MLR,細(xì)胞增殖率分別增加26.8~31.6%或20.9~48.0%,峰效應(yīng)分別出現(xiàn)在Gl-SP0.2mg.L-1和Gl-BSP12.8mg.L-1,二者比較差別顯著(P<0.05)。Gl-SP(0.2~3.2mg.L-1)和Gl-BSP(0.2~12.8mg.L-1)可顯著促進(jìn)單向MLR,淋巴細(xì)胞增殖率分別增加44.1~62.6%和71.5~120.6%,峰效應(yīng)分別出現(xiàn)在Gl-SP 3.2mg.L-1和Gl-BSP12.8mg.L-1,且二者比較差別顯著(P<0.001)(見表10)表10 Gl-SP和Gl-BSP對(duì)MLR的影響(x±s,n=3)

      5)Gl-SP和Gl-BSP對(duì)NK細(xì)胞活性的影響Gl-SP或Gl-BSP在0.2~3.2mg.L-1劑量范圍內(nèi),可顯著提高NK細(xì)胞殺傷活性,RMP11640對(duì)照組為12.7%,Gl-SP組為23.7~53.2%,Gl-BSP組為23.5~45.1%,峰效應(yīng)均出現(xiàn)在3.2mg.L-1,在最高效應(yīng)之間無顯著性差別。(見表11)表11 Gl-SP和Gl-BSP對(duì)NK細(xì)胞活性的影響(x±s,n=3)

      權(quán)利要求
      1.一種靈芝多糖的制備方法,其特征在于,包括如下步驟1)將靈芝孢子粉原料中加入中性鹽溶液充分?jǐn)嚢杈鶆蚴够旌弦喊l(fā)生滲透作用,2)將振蕩后的混合液進(jìn)行離心分離,取上清液,3)將上清液濃縮后用具有一定親水性、較強(qiáng)的親脂性的有機(jī)溶濟(jì)進(jìn)透析或膜分離后、低溫干燥得多糖。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于所述的制備方法還包括在上述步驟2中的分離后所得的殘?jiān)屑尤胗袡C(jī)酸溶液攪拌均勻后,將此混合液進(jìn)行離心分離,取其上清液,而后將此上清液與中性鹽溶液提取所獲得的上清液進(jìn)行混合,濃縮后進(jìn)行透析或膜分離、低溫干燥得多糖。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于所述的制備方法還包括在上述權(quán)利要求2離心分離后所獲得的殘?jiān)屑尤肴鯄A溶液攪拌均勻后,將此混合液進(jìn)行離心分離,取上清液,而后再將此上清液與上述的上清液對(duì)應(yīng)混合,濃縮后進(jìn)行透析或膜分離、低溫干燥得多糖。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的制備方法,其特征在于所述的方法還包括在將各溶液攪拌均勻后,將其置入超聲波振蕩器中進(jìn)行振蕩。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述的方法還包括將所得的多糖溶于水后,將水溶液進(jìn)行透析,截留分子量5000以上的多糖,通過DEAE柱層精制處理,得純度90.85%以上的多糖。
      6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述的中性鹽溶液為氯化鈉溶液,其濃度為1.0~1.8%。
      7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述的有機(jī)酸溶液為草酸溶液,其濃度為1%~5%。
      8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述的弱堿溶液為氫氧化鈉溶液,其濃度為1%。
      9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述的靈芝孢子粉與中性鹽溶液、有機(jī)酸溶液及弱堿溶液的重量份數(shù)比均為1∶10~15。
      10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述的超聲振蕩的溫度為60~80℃,超聲功率在40-100%之間,時(shí)間1-2h。
      11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述的孢子粉為破壁孢子粉。
      12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述的離心的轉(zhuǎn)速為2800-3500r/mim,時(shí)間20分鐘。
      13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于所述透析用的有機(jī)溶濟(jì)為乙醇。
      14.一種由權(quán)利要求1或3的方法所制備的多糖在制備抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的輔助制劑中的應(yīng)用。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種靈芝多糖的制備方法及應(yīng)用,其采用滲透的原理,使孢子內(nèi)活性物質(zhì)通過滲透交換平衡,以使孢子內(nèi)的活性物質(zhì)充分釋放。同時(shí)本發(fā)明還將用中性鹽溶液提取后的殘?jiān)俨捎糜袡C(jī)酸和微堿性的溶劑進(jìn)行提取,通過不同溶劑提取后的多糖組合成復(fù)合多糖。依據(jù)本發(fā)明方法所獲得的多糖可用在制備抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的輔助制劑中,以增強(qiáng)這些藥物的效果。
      文檔編號(hào)C08B37/00GK1931880SQ20051009553
      公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日
      發(fā)明者林志彬, 林樹錢, 劉梅英, 王賽貞, 林樹光, 王鵬云 申請(qǐng)人:福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所, 林志彬, 林樹錢, 劉梅英, 王賽貞, 林樹光, 王鵬云
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