專(zhuān)利名稱(chēng)：穩(wěn)定地制造微孔膜的方法、以及該微孔膜在核酸分離純化方法中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定地制造微孔膜的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及穩(wěn)定地制造一種核酸吸附性微孔膜的方法，該微孔膜用于從含核酸的樣品溶液中分離并純化核酸的方法中；并且本發(fā)明還涉及所述微孔膜在核酸分離純化方法中的用途。
背景技術(shù)：
醋酸纖維素微孔膜在市場(chǎng)上出售已經(jīng)有很長(zhǎng)時(shí)間了，并被廣泛地用作分離膜或?yàn)V膜。人們已提出了用于制造醋酸纖維素微孔膜的多種方法(如專(zhuān)利文獻(xiàn)JP-B-43-15698和JP-B-55-6406)。此外，人們還提出了這樣一種制造方法，該制造方法包括對(duì)醋酸纖維素微孔膜進(jìn)行皂化處理從而制成纖維素微孔膜(如專(zhuān)利文獻(xiàn)JP-B-45-4633)。這種纖維素微孔膜已在市場(chǎng)上出售，并被用作耐溶劑濾膜。
眾所周知的是，核酸已經(jīng)以各種形式應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域中。例如，在核酸重組技術(shù)領(lǐng)域中，需要將核酸以探針、基因組核酸或質(zhì)粒核酸的形式使用。
核酸還用于診斷領(lǐng)域的各種方法中。例如，核酸探針日常用于檢測(cè)和診斷人類(lèi)病原體。核酸還用于檢測(cè)遺傳性疾病或食品污染物。此外，核酸日常也因各種目的而用于確定預(yù)定核酸的位置、或者鑒定或分離這些預(yù)定核酸，其中所述目的包括基因圖譜的制備以及通過(guò)克隆或基因重組進(jìn)行的基因表達(dá)。
然而，在多數(shù)情況下，只有極微量的核酸可以利用。核酸的分離和純化需要復(fù)雜的操作過(guò)程，因此要使用大量時(shí)間。這種耗時(shí)的復(fù)雜步驟可能容易導(dǎo)致核酸損失，從而產(chǎn)生不利結(jié)果。此外，在對(duì)血清、尿或由細(xì)菌培養(yǎng)所得的樣品中所含的核酸進(jìn)行純化的過(guò)程中，還會(huì)伴隨有污染物產(chǎn)生或形成假陽(yáng)性結(jié)果的問(wèn)題。
作為一種用來(lái)解決上述問(wèn)題的簡(jiǎn)捷有效的核酸分離純化方法，在(例如)專(zhuān)利文獻(xiàn)JP-A-2003-128691中公開(kāi)了一種方法，該方法包括使得核酸被吸附到多孔膜上、或是從多孔膜上解吸附，其中所述的多孔膜是由其表面上含有羥基的有機(jī)聚合物(例如纖維素)制成的。

發(fā)明內(nèi)容
然而，在核酸分離純化過(guò)程中使用上述核酸吸附性微孔膜產(chǎn)生了一些問(wèn)題。具體地說(shuō)，按照相關(guān)技術(shù)方法制成的微孔膜的諸如孔徑之類(lèi)的特征隨著長(zhǎng)度方向上的位置變化而有輕微差異。因此，當(dāng)使用相關(guān)技術(shù)的微孔膜對(duì)懸浮物含量相對(duì)較高的核酸樣品進(jìn)行處理時(shí)，隨著所選取的膜試樣在微孔膜的長(zhǎng)度方向上的位置的不同，核酸純化所需的時(shí)間會(huì)出現(xiàn)一些差異，或者是發(fā)生堵塞而喪失純化能力。此外，盡管不會(huì)導(dǎo)致完全堵塞，但是分離和純化核酸仍要花費(fèi)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。因此，需要通過(guò)改善核酸吸附性微孔膜的制造方法來(lái)解決這些問(wèn)題，以提供性能比以前的產(chǎn)品更為穩(wěn)定的微孔膜，其中膜的諸如孔徑之類(lèi)的特征隨著長(zhǎng)度方向上的位置變化沒(méi)有差異。
因此本發(fā)明的目的是提供一種核酸吸附性微孔膜、以及制造該膜的方法，所述微孔膜的諸如孔徑之類(lèi)的特征隨著長(zhǎng)度方向上的位置變化而產(chǎn)生的差異被降低，因此其性質(zhì)比以前更為穩(wěn)定。
本發(fā)明人對(duì)各種因素進(jìn)行了大量的研究以解決上述問(wèn)題。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用由以下多孔膜制造方法制成的多孔膜可以消除膜的特征隨著長(zhǎng)度方向上的位置變化而產(chǎn)生的差異，并解決上述的諸如堵塞及純化時(shí)間不定的問(wèn)題，而這些問(wèn)題都是在此前從懸浮物含量相對(duì)較高的樣品中純化核酸的過(guò)程中已經(jīng)發(fā)生過(guò)的，所述多孔膜制造方法包括以下步驟使溶液在載體上流延，該溶液是通過(guò)將聚合物溶解于由良溶劑、不良溶劑和非溶劑形成的混合物中而制成的；使流延薄膜干燥；然后對(duì)流延薄膜進(jìn)行相分離。在所述方法中，多孔膜的制造是采用以下條件來(lái)實(shí)施的，所述條件為使流延表面的溫度預(yù)定為低于聚合物溶液的溫度、并且聚合物溶液的溫度變化和流延表面的溫度變化分別被保持在±3.0℃之內(nèi)。本發(fā)明是基于這些認(rèn)識(shí)而完成的。換言之，本發(fā)明包括以下方面。
(1)一種制造多孔膜的方法，該方法包括使聚合物溶液在載體上流延，從而形成經(jīng)流延的聚合物溶液，在流延之前的所述聚合物溶液中，聚合物被溶解于由良溶劑、不良溶劑和非溶劑形成的混合物中；使所述的經(jīng)流延的聚合物溶液干燥，從而形成流延薄膜；以及對(duì)所述的流延薄膜進(jìn)行相分離，其中，所述的多孔膜是采用以下條件制備的流延表面的溫度低于所述聚合物溶液的溫度，并且所述聚合物溶液的溫度變化和所述流延表面的溫度變化分別被保持在±3.0℃之內(nèi)。
(2)如上述(1)所述的方法，其中，所述的聚合物溶液是由纖維素的酯類(lèi)衍生物形成的聚合物溶液。
(3)如上述(2)所述的方法，其中，所述的纖維素的酯類(lèi)衍生物含有選自纖維素羧酸酯、纖維素硝酸酯、纖維素硫酸酯、纖維素磺酸酯、纖維素磷酸酯、纖維素膦酸酯和纖維素焦磷酸酯中的至少一種。
(4)如上述(2)所述的方法，其中，所述的纖維素的酯類(lèi)衍生物是醋酸纖維素。
(5)如上述(4)所述的方法，其中，所述的醋酸纖維素是三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。
(6)如上述(1)到(5)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的良溶劑是二氯甲烷，所述的不良溶劑是甲醇，而所述的非溶劑是水。
(7)一種制造多孔膜的方法，該方法包括對(duì)通過(guò)如上述(2)到(6)中任意一項(xiàng)所述的方法制成的多孔膜進(jìn)行皂化處理。
(8)如上述(1)到(7)中任意一項(xiàng)所述的方法，
其中，所述多孔膜的最小孔徑為0.1μm或更大。
(9)如上述(1)到(8)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的多孔膜具有彼此不對(duì)稱(chēng)的前表面和后表面。
(10)如上述(1)到(9)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的最大孔徑與最小孔徑之比為2或更大。
(11)如上述(1)到(10)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的厚度為10μm到500μm。
(12)如上述(1)到(11)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的孔隙率為50％到95％。
(13)如上述(1)到(12)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的泡點(diǎn)為0.1kgf/cm2到10kgf/cm2。
(14)如上述(1)到(13)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的壓力損失為0.1kPa到100kPa。
(15)如上述(1)到(14)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在25℃的溫度和1kg/cm2的壓力下，所述多孔膜的透水度為每分鐘1mL/cm2到5000mL/cm2。
(16)如上述(1)到(15)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，每毫克所述多孔膜的核酸吸附量為0.1μg或更多。
(17)一種通過(guò)如上述(1)到(16)中任意一項(xiàng)所述的方法制成的多孔膜在核酸分離純化方法中的用途，所述的核酸分離純化方法包括(1)使含核酸的樣品溶液穿過(guò)所述的多孔膜，使得所述核酸被吸附到所述多孔膜的內(nèi)部；(2)在所述核酸吸附在所述多孔膜上時(shí)，使洗滌液穿過(guò)所述多孔膜，從而洗滌該多孔膜；以及(3)使回收液穿過(guò)所述多孔膜，使得所述核酸從所述多孔膜的內(nèi)部解吸附。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是用于實(shí)施本發(fā)明的多孔膜制造方法的生產(chǎn)設(shè)備的示意圖；
圖2是用于對(duì)纖維素酯微孔膜進(jìn)行皂化的裝置的示意圖；圖3是核酸分離純化單元的概念圖；以及圖4是核酸分離純化單元的實(shí)例的剖面圖；其中，1表示帶有溫控裝置的料液儲(chǔ)槽；2表示供液泵；3表示流延模頭；4表示PET基膜；5表示環(huán)形帶；6表示溫控轉(zhuǎn)筒；7表示干燥裝置；8表示干燥裝置；A表示PET基膜進(jìn)料輥；B表示PET基膜+微孔膜的卷取輥；C表示帶有切刀的放卷機(jī)；D表示剝離桿；E表示PET基膜卷取輥；F表示微孔膜卷取輥；10表示皂化單元；11表示纖維素酯微孔膜；12表示皂化膜；15表示皂化單元；16表示中和單元；17表示漂洗單元；18表示干燥裝置；25表示轉(zhuǎn)筒；26表示傳送帶；500表示核酸分離純化單元的容器；100表示主體；200表示蓋；300表示固相(經(jīng)表面皂化的三醋酸纖維素微孔膜)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式按照以下方式來(lái)實(shí)施本發(fā)明的微孔膜制造過(guò)程。
首先，制備溶液(料液)，該溶液是通過(guò)將聚合物溶解于由良溶劑、不良溶劑和非溶劑形成的混合物中而制成的。作為本發(fā)明制造方法中待使用的原料聚合物，可以使用含羥基聚合物的酯化產(chǎn)物。具體地說(shuō)，具有多糖結(jié)構(gòu)的聚合物所形成的酯類(lèi)衍生物、聚乙烯醇的酯類(lèi)衍生物等是優(yōu)選的。
本發(fā)明可使用的具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料的具體實(shí)例包括纖維素、半纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、糊精、直鏈淀粉、淀粉精、淀粉、糖原、支鏈淀粉、甘露聚糖、葡甘露聚糖、地衣淀粉、異地衣淀粉、昆布糖、角叉菜膠、木聚糖、果聚糖、褐藻酸、透明質(zhì)酸、軟骨素、甲殼素和殼聚糖。此外，本發(fā)明可用的具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料的實(shí)例還包括某些上述多糖結(jié)構(gòu)的衍生物。具體地說(shuō)，這些多糖結(jié)構(gòu)的酯類(lèi)衍生物是優(yōu)選的。本發(fā)明不限于上述示例性的材料，只要使用了多糖結(jié)構(gòu)及其衍生物即可。
構(gòu)成多糖結(jié)構(gòu)的酯類(lèi)衍生物的酯優(yōu)選選自羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯中的一種或多種。
上述具有多糖結(jié)構(gòu)的羧酸酯優(yōu)選選自烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯中的一種或多種。
構(gòu)成上述具有多糖結(jié)構(gòu)的烷基羰基酯的酯基優(yōu)選選自乙?；?、丙酰基、丁?；?、戊?；⒏；⑿刘；⒐秕；⑹轷；?、十三烷?；⑹轷；褪送轷；械囊环N或多種。
構(gòu)成上述具有多糖結(jié)構(gòu)的烯基羰基酯的酯基優(yōu)選選自丙烯?；图谆；械囊环N或多種。
構(gòu)成上述具有多糖結(jié)構(gòu)的芳香基羰基酯的酯基優(yōu)選選自苯?；洼刘；?naphthaloyl)中的一種或多種。
具有多糖結(jié)構(gòu)的硝酸酯的優(yōu)選實(shí)例包括硝酸纖維素、硝酸半纖維素、硝酸葡聚糖、硝酸瓊脂糖、硝酸糊精、硝酸直鏈淀粉、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支鏈淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸異地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜膠、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明質(zhì)酸、硝酸軟骨素、硝酸甲殼素和硝酸殼聚糖。
上述具有多糖結(jié)構(gòu)的硫酸酯的優(yōu)選實(shí)例包括硫酸纖維素、硫酸半纖維素、硫酸葡聚糖、硫酸瓊脂糖、硫酸糊精、硫酸直鏈淀粉、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支鏈淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸異地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜膠、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸甲殼素和硫酸殼聚糖。
上述具有多糖結(jié)構(gòu)的磺酸酯優(yōu)選選自烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯中的任意一種或多種。
具有多糖結(jié)構(gòu)的磷酸酯的優(yōu)選實(shí)例包括磷酸纖維素、磷酸半纖維素、磷酸葡聚糖、磷酸瓊脂糖、磷酸糊精、磷酸直鏈淀粉、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支鏈淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸異地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜膠、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明質(zhì)酸、磷酸軟骨素、磷酸甲殼素和磷酸殼聚糖。
上述具有多糖結(jié)構(gòu)的膦酸酯的優(yōu)選實(shí)例包括膦酸纖維素、膦酸半纖維素、膦酸葡聚糖、膦酸瓊脂糖、膦酸糊精、膦酸直鏈淀粉、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支鏈淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸異地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜膠、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明質(zhì)酸、膦酸軟骨素、膦酸甲殼素和膦酸殼聚糖。
上述具有多糖結(jié)構(gòu)的焦磷酸酯的優(yōu)選實(shí)例包括焦磷酸纖維素、焦磷酸半纖維素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸瓊脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸直鏈淀粉、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支鏈淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸異地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜膠、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明質(zhì)酸、焦磷酸軟骨素、焦磷酸甲殼素和焦磷酸殼聚糖。
通過(guò)以任意取代度對(duì)任何上述多糖結(jié)構(gòu)的羥基進(jìn)行醚化而得到的那些化合物也是優(yōu)選使用的。在使用纖維素作為多糖的情況下，本發(fā)明可使用的醚類(lèi)衍生物的實(shí)例包括甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素、羧乙基-氨基甲酰乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素、氰乙基纖維素和氨基甲酰乙基纖維素。在這些醚類(lèi)衍生物中，羥甲基纖維素和羥乙基纖維素是優(yōu)選的。然而，本發(fā)明不限于這些醚類(lèi)衍生物，也不限于所述的多糖和醚的種類(lèi)。
通過(guò)以任意取代度對(duì)任何上述多糖結(jié)構(gòu)的羥基進(jìn)行鹵代而得到的那些化合物也是優(yōu)選使用的。
作為具有多糖結(jié)構(gòu)的聚合物的酯類(lèi)衍生物，可優(yōu)選使用纖維素的酯類(lèi)衍生物(例如三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋酸纖維素，特別是三醋酸纖維素)。更優(yōu)選的是，三醋酸纖維素和二醋酸纖維素混合使用。
以纖維素的酯類(lèi)衍生物為例，上文所述的良溶劑是能夠溶解纖維素的酯類(lèi)衍生物的溶劑。本發(fā)明可使用的良溶劑的實(shí)例包括鹵代烴類(lèi)(例如亞甲基氯(等于二氯甲烷)和氯仿)、酯類(lèi)(例如醋酸甲酯、醋酸乙酯、甲酸甲酯和乙二醇單甲醚乙酸酯(methyl glycol acetate))和酮類(lèi)(例如丙酮和甲乙酮)。在這些良溶劑中，二氯甲烷是優(yōu)選的。
上文所述的不良溶劑是這樣一種溶劑，其能與上述良溶劑互溶、并且其沸點(diǎn)高于上述良溶劑，其僅能使纖維素的酯類(lèi)衍生物溶脹，但基本不能使纖維素的酯類(lèi)衍生物溶解。本發(fā)明可使用的不良溶劑的實(shí)例包括醇類(lèi)(例如甲醇、乙醇和丁醇)、醚類(lèi)(例如異丙醚)和四氫呋喃。在這些不良溶劑中，甲醇是優(yōu)選的。
上文所述的非溶劑是這樣一種溶劑，其能與上述良溶劑或不良溶劑互溶、并且其沸點(diǎn)高于上述良溶劑，其不能使纖維素的酯類(lèi)衍生物溶解或溶脹。本發(fā)明可使用的非溶劑的具體實(shí)例包括烴類(lèi)(例如庚烷、癸烷和甲苯)、多價(jià)醇類(lèi)(例如乙二醇和乙二醇單乙醚)、多價(jià)醇的醚以及水。在這些非溶劑中，水是優(yōu)選的。
良溶劑與不良溶劑的用量比可預(yù)定為5∶5到8∶2，優(yōu)選為6∶4到7∶3。可加入的非溶劑的量為1質(zhì)量％到8質(zhì)量％，優(yōu)選為4質(zhì)量％到6質(zhì)量％。(在本說(shuō)明書(shū)中，質(zhì)量％等于重量％。)纖維素的酯類(lèi)衍生物以1％到30％、優(yōu)選為5％到10％的濃度溶解于這種混合溶劑中。
關(guān)于溶劑(特別是良溶劑和不良溶劑)使用方法的詳細(xì)情況，可參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)JP-B-55-31418、JP-A-50-12256、JP-A-51-76360等。
上文所述的料液可含有各種添加劑(例如增塑劑、抗靜電劑、防劣化劑、防紫外線(xiàn)劑、表面活性劑、脫模劑、著色劑、增強(qiáng)劑和交聯(lián)劑)，根據(jù)不同的目的將這些添加劑加入到料液中。這些添加劑可以在料液制備過(guò)程中的任何時(shí)間加入。然而，也可在料液制備的最終步驟中引入一個(gè)加入添加劑的步驟?？晒┻x用的另一種方式是，可以使用這些添加劑來(lái)浸漬由此制備的膜。
優(yōu)選的是，將上述料液通過(guò)濾紙過(guò)濾，然后進(jìn)行脫氣。

以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的多孔膜制造方法的實(shí)施方式進(jìn)行描述。
圖1是用于實(shí)施本發(fā)明的多孔膜制造方法的生產(chǎn)設(shè)備的示意圖。
以下說(shuō)明該生產(chǎn)設(shè)備的操作使由料液儲(chǔ)槽(1)經(jīng)供液泵(2)供應(yīng)的料液通過(guò)流延模頭(3)在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)基膜(4)上流延，然后進(jìn)行干燥，其中，從PET基膜進(jìn)料輥(A)將所述基膜輸送到流延裝置中的環(huán)形帶(5)上。把由此形成的流延薄膜與PET一起從環(huán)形帶(5)上剝離下來(lái)、在干燥裝置(8)中干燥、然后將其卷在用于卷繞PET基膜和微孔膜的輥(B)上。
在所述的生產(chǎn)設(shè)備中，將設(shè)置有溫控裝置的料液儲(chǔ)槽(1)中的料液控制為預(yù)定溫度±3.0℃。隨后，將被控制為基本恒定溫度的料液從料液儲(chǔ)槽(1)經(jīng)供液泵(2)供入，然后通過(guò)流延模頭(3)使其在被輸送到流延帶上的PET基膜(4)上流延。在這個(gè)操作過(guò)程中，將PET基膜的流延表面的溫度控制在低于料液溫度的一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)。
料液的溫度優(yōu)選被控制在處于5℃到50℃范圍內(nèi)的一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)，更優(yōu)選的是被控制在處于15℃到40℃范圍內(nèi)的一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)，例如35.0℃±3.0℃。
為了將料液儲(chǔ)槽中的料液的溫度精確地控制在一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)，可以為料液儲(chǔ)槽設(shè)置溫控裝置。
為此，可以使用帶夾套的不銹鋼容器作為料液儲(chǔ)槽，所述夾套使得恒溫的液體介質(zhì)圍繞所述容器流動(dòng)。不銹鋼容器可連接有其溫度精度為±2.0℃、循環(huán)泵能力為10L/分鐘或更高的恒溫循環(huán)裝置(例如，東京理化器械株式會(huì)社生產(chǎn)的NCC-2100型恒溫循環(huán)裝置)，使得恒溫的液體介質(zhì)可循環(huán)通過(guò)不銹鋼容器。可供選用的另一種方式是，將循環(huán)泵能力為10L/分鐘或更高的泵與溫度精度被控制為±2.0℃的浴槽連接，使得恒溫的液體介質(zhì)可循環(huán)通過(guò)所述的浴槽。然而，本發(fā)明不限于這些構(gòu)造，只要料液儲(chǔ)槽中的料液的溫度可以被控制在一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)即可。
流延表面的溫度優(yōu)選被控制在處于-10℃到47℃范圍內(nèi)的一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)(比料液的溫度低3.0℃到60℃)，例如10.0℃±3.0℃；更優(yōu)選的是，被控制在處于0℃到45℃范圍內(nèi)的一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)(比料液的溫度低5℃到50℃)；甚至更優(yōu)選的是，被控制在處于15℃到25℃范圍內(nèi)的一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)(比料液的溫度低5℃到15℃)。
為了將流延表面的溫度精確地控制在一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)，可以為輸送轉(zhuǎn)筒設(shè)置能夠?qū)⑥D(zhuǎn)筒表面的溫度精確地控制在一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)的溫控裝置，其中，所述的輸送轉(zhuǎn)筒被設(shè)置在料液通過(guò)流延模頭而在PET基膜(4)上流延的位置處。
為此，可以使用具有雙筒式空心轉(zhuǎn)筒結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)筒作為輸送轉(zhuǎn)筒，該結(jié)構(gòu)在外空心轉(zhuǎn)筒和內(nèi)空心轉(zhuǎn)筒之間具有間隙，并且在內(nèi)轉(zhuǎn)筒的端部形成有用于使液體流過(guò)的孔。輸送轉(zhuǎn)筒連接有其溫度精度為±2.0℃、循環(huán)泵能力為10L/分鐘或更高的恒溫循環(huán)裝置(例如，東京理化器械株式會(huì)社生產(chǎn)的NCC-2100型恒溫循環(huán)裝置)。在這種構(gòu)造中，液體介質(zhì)從軸承流入介于外轉(zhuǎn)筒和內(nèi)轉(zhuǎn)筒之間的間隙中，并且液體介質(zhì)可在內(nèi)轉(zhuǎn)筒的所述端部從該間隙進(jìn)入內(nèi)轉(zhuǎn)筒中。然后液體介質(zhì)向軸承側(cè)排出。由此，可以使恒溫的液體介質(zhì)循環(huán)。可供選用的另一種方式為，可以將循環(huán)泵能力為10L/分鐘或更高的泵與溫度精度被控制為±2.0℃的浴槽連接。在這種構(gòu)造中，液體介質(zhì)從軸承流入介于外轉(zhuǎn)筒和內(nèi)轉(zhuǎn)筒之間的間隙內(nèi)，并且液體介質(zhì)可在內(nèi)轉(zhuǎn)筒的所述端部從該間隙進(jìn)入內(nèi)轉(zhuǎn)筒中。然后液體介質(zhì)向軸承側(cè)排出。由此，可以使恒溫的液體介質(zhì)循環(huán)。然而，本發(fā)明不限于這些結(jié)構(gòu)，只要輸送轉(zhuǎn)筒的溫度被控制在一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)即可。
通過(guò)上述方式將料液溫度和流延表面的溫度各自控制在一個(gè)恒定值的±3.0℃以?xún)?nèi)，就可以消除由此制成的微孔膜的諸如孔徑之類(lèi)的特征隨著長(zhǎng)度方向上的位置變化而產(chǎn)生的差異，從而可以得到性質(zhì)比以前的產(chǎn)品更穩(wěn)定的核酸吸附性微孔膜。
然后將如此流延而得到的微孔膜進(jìn)行干燥。關(guān)于干燥條件，優(yōu)選將微孔膜在30℃到110℃下干燥15分鐘到50分鐘，更優(yōu)選的是在40℃到100℃下干燥20分鐘到40分鐘。
然后將如此干燥而得到的微孔膜卷繞在卷取輥(B)上。
本發(fā)明的微孔膜優(yōu)選為經(jīng)皂化的纖維素的酯類(lèi)衍生物的微孔膜。
經(jīng)皂化的纖維素的酯類(lèi)衍生物的微孔膜優(yōu)選為經(jīng)表面皂化的醋酸纖維素微孔膜。如上文所述，醋酸纖維素可以是單醋酸纖維素、二醋酸纖維素和三醋酸纖維素中的任意一種，尤其可以是三醋酸纖維素。更優(yōu)選的是，將三醋酸纖維素和二醋酸纖維素混合使用。
為了制備經(jīng)皂化的微孔膜，優(yōu)選的是，使用堿性皂化溶液(例如NaOH、KOH)只在膜結(jié)構(gòu)的與堿性皂化溶液接觸的表面上進(jìn)行皂化處理。而膜結(jié)構(gòu)材料中的醋酸纖維素不必發(fā)生改變?？臻g中羥基的量(密度)可由表面皂化度(表面皂化率)和微孔膜的結(jié)構(gòu)來(lái)控制。因?yàn)槟そY(jié)構(gòu)是由醋酸纖維素構(gòu)成的，所以可以得到堅(jiān)固的固相。用于僅僅向膜結(jié)構(gòu)的表面引入羥基的醋酸纖維素表面皂化處理是指僅僅使膜結(jié)構(gòu)的表面轉(zhuǎn)化成纖維素，而該結(jié)構(gòu)的其余部分中的醋酸纖維素沒(méi)有發(fā)生變化。因?yàn)槔w維素如果用作原材料的話(huà)是不能被溶解的，所以在工業(yè)上不可能將其制成多孔膜或平膜。
例如，作為三醋酸纖維素微孔膜，市售的有FM500型微濾膜(由富士膠片株式會(huì)社制造)。
為了對(duì)微孔膜進(jìn)行表面皂化處理，可將微孔膜浸漬在堿性水溶液中。為了改變表面皂化率，可以改變堿性水溶液的濃度或浸漬時(shí)間。例如，可將微孔膜在濃度為0.1摩爾/L到1.0摩爾/L的氫氧化鈉水溶液中浸漬10分鐘到120分鐘。
皂化率可由任何已知的方法容易地測(cè)量。例如，殘留乙酰基的量可由乙酰度滴定法或者是利用測(cè)量?jī)x器(例如NMR、IR和XPS)進(jìn)行的結(jié)構(gòu)分析法來(lái)定量地測(cè)量。
在使用經(jīng)皂化的微孔膜來(lái)分離核酸的情況下，微孔膜中的羥基的數(shù)量?jī)?yōu)選為盡可能地大以提高分離核酸的效率。例如，由醋酸纖維素(例如三醋酸纖維素)制成的微孔膜優(yōu)選具有約5％到100％的表面皂化率，更優(yōu)選具有10％或更高的表面皂化率。其表面皂化率滿(mǎn)足上述限定范圍的微孔膜在用作核酸分離純化的吸附材料時(shí)表現(xiàn)出充足的吸附性。為了得到上述限定的皂化率，微孔膜浸漬在0.4摩爾/L氫氧化鈉水溶液中的時(shí)間優(yōu)選為10分鐘或更長(zhǎng)。
以下將參照附圖來(lái)說(shuō)明對(duì)纖維素微孔膜進(jìn)行皂化的實(shí)施方式。
圖2是用于對(duì)纖維素酯類(lèi)微孔膜進(jìn)行皂化的裝置的示意圖。設(shè)置皂化裝置10，使得纖維素酯類(lèi)微孔膜11(下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)為“纖維素酯類(lèi)薄膜”)在以薄片的形式被相繼輸送、或者是以連續(xù)的形式被連續(xù)輸送的同時(shí)經(jīng)受預(yù)定的處理，從而形成皂化膜12。皂化裝置10包括皂化單元15、中和單元16、漂洗單元17和干燥單元18。
皂化單元15中設(shè)有皂化罐(圖中未示出)。皂化罐中裝有用于對(duì)纖維素酯類(lèi)薄膜11進(jìn)行皂化的堿性水溶液，從而形成皂化膜12。
中和單元16中設(shè)置有中和層(圖中未示出)。中和層中裝有酸性水溶液，該溶液用于中和殘留在經(jīng)皂化反應(yīng)制成的皂化膜12的表面上或內(nèi)部中的堿性水溶液。
漂洗單元17中設(shè)有帶攪拌裝置的漂洗機(jī)器(圖中未示出)。漂洗機(jī)器中設(shè)有吸水口和排水口。洗滌用水由供水部分20經(jīng)吸水口適當(dāng)?shù)剌斔偷狡礄C(jī)器中。只有使用過(guò)的水通過(guò)排水口被適當(dāng)?shù)嘏欧诺狡礄C(jī)器外。
干燥單元18包括轉(zhuǎn)筒25來(lái)作為用于加熱皂化膜12的加熱單元。干燥單元18還具有用于輸送皂化膜12的傳送帶26，使得皂化膜12插入轉(zhuǎn)筒25和傳送帶26之間，以提高加熱皂化膜12的效率。干燥單元18還具有用于移動(dòng)傳送帶26的輸送輥27。轉(zhuǎn)筒25設(shè)有用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)筒25轉(zhuǎn)動(dòng)的電機(jī)25a、以及溫控裝置25b，該溫控裝置用于檢測(cè)轉(zhuǎn)筒25的表面溫度，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果來(lái)控制轉(zhuǎn)筒25的表面溫度。干燥單元18還包括室31，室31上形成有用于排放內(nèi)部空氣的排出口31a?？諝馐峭ㄟ^(guò)室31的進(jìn)口而進(jìn)入室31的，其中皂化膜12經(jīng)過(guò)該進(jìn)口而進(jìn)入室31。
在皂化單元15中，使用堿性水溶液來(lái)皂化纖維素酯類(lèi)薄膜11。例如，將纖維素酯類(lèi)薄膜11在常溫(15℃到35℃)下在攪拌的、濃度為0.1摩爾/L到1.0摩爾/L的氫氧化鈉水溶液中浸漬10分鐘到120分鐘。
優(yōu)選的是，在皂化反應(yīng)后盡可能快地對(duì)如此皂化所得到的薄膜12進(jìn)行中和處理。中和步驟中使用的酸的濃度和種類(lèi)、以及中和作用的時(shí)間都是任意的，只要這些條件足以使皂化步驟中附著在膜12上的堿性水溶液被中和即可。例如，可將皂化膜在濃度為0.1摩爾/L到1.0摩爾/L的水溶液中浸漬10分鐘到60分鐘，以進(jìn)行中和處理。皂化膜的中和處理也可以通過(guò)任何其它方法進(jìn)行，例如，將酸性水溶液噴射到皂化膜12上。
隨后，在漂洗單元17中，對(duì)皂化膜12進(jìn)行充分漂洗。連續(xù)供水，同時(shí)連續(xù)排水，使得洗滌操作可以在水流中完成。按照這種流動(dòng)水處理方法，可提高洗滌效率和洗滌效果。在用流動(dòng)水處理的情況下，漂洗時(shí)間優(yōu)選為60分鐘或更長(zhǎng)。在貯水處理的情況下，漂洗操作的時(shí)間優(yōu)選大于60分鐘，同時(shí)適當(dāng)換水。
洗滌用水是經(jīng)過(guò)過(guò)濾的水。這種經(jīng)過(guò)過(guò)濾的水不含核酸酶和粒徑為0.5μm或更大的顆粒。核酸酶是一類(lèi)能夠切割DNA和RNA的酶。使用不含核酸酶的水作為洗滌用水可以防止核酸分離純化的收率降低。
在本實(shí)施方案中，不含核酸酶的水不僅被用作漂洗步驟中的洗滌用水，而且還被用在所有其它的處理溶液(包括用于皂化步驟中的堿性水溶液和用于中和步驟中的酸性水溶液)中，從而可以更加可靠地防止核酸分離純化的收率降低。
洗滌用水可以與水溶性有機(jī)溶劑混合。水溶性有機(jī)溶劑優(yōu)選選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及其異構(gòu)體?？梢赃x擇多種水溶性有機(jī)溶劑。
以下將說(shuō)明使用干燥單元18進(jìn)行的干燥步驟。本實(shí)施方案中使用的加熱單元是如上文所述的接觸型轉(zhuǎn)筒25。通過(guò)輸送輥27的作用而連續(xù)循環(huán)的傳送帶26環(huán)繞轉(zhuǎn)筒25延伸。已經(jīng)通過(guò)漂洗單元17的皂化膜12由輸送輥21等輸送到傳送帶26上。隨后，由傳送帶26將皂化膜12引導(dǎo)到表面被加熱的轉(zhuǎn)筒25上。接著，皂化膜12在轉(zhuǎn)筒25上被加熱。在加熱期間，一邊輸送皂化膜一邊將該皂化膜插入到轉(zhuǎn)筒25和傳送帶26之間。皂化膜即使在離開(kāi)轉(zhuǎn)筒25之后仍在被加熱的傳送帶26上繼續(xù)被干燥。因此，皂化膜在離開(kāi)室31時(shí)是完全干燥的。當(dāng)皂化膜經(jīng)過(guò)了干燥步驟時(shí)，就得到纖維素微孔膜。
通過(guò)這種在皂化膜插入到轉(zhuǎn)筒和傳送帶之間的同時(shí)來(lái)加熱皂化膜的方式，可以提高加熱皂化膜12的效率；同時(shí)還可以防止膜破裂和其它問(wèn)題。這是因?yàn)檫@種加熱方法可以使皂化膜12隨著該皂化膜中所含水分的蒸發(fā)而發(fā)生的收縮受到抑制。皂化膜的破裂歸因于皂化膜的收縮。因此，按照本實(shí)施方案，可以防止皂化膜的破裂，這種破裂是迄今為止在使用框架支持的方法(其中涉及在膜的側(cè)邊對(duì)膜施加支持作用)中邊輸送皂化膜邊進(jìn)行干燥時(shí)都會(huì)發(fā)生的現(xiàn)象。
根據(jù)皂化膜12的厚度、皂化膜12的含水量和輸送速度等來(lái)確定轉(zhuǎn)筒25的溫度。根據(jù)皂化膜12的強(qiáng)度等來(lái)確定輸送速度。轉(zhuǎn)筒25的表面溫度優(yōu)選為約100℃到200℃。輸送速度優(yōu)選為0.05m/分鐘到5.0m/分鐘。當(dāng)轉(zhuǎn)筒25的表面溫度降到低于100℃時(shí)，皂化膜12受熱不充分，因此不能完全干燥。然而另一方面，當(dāng)轉(zhuǎn)筒25的表面溫度超過(guò)200℃時(shí)，皂化膜12會(huì)發(fā)生劣化。此外，當(dāng)輸送速度降到低于0.05m/分鐘時(shí)，對(duì)生產(chǎn)率不利。然而另一方面，當(dāng)輸送速度超過(guò)5.0m/分鐘時(shí)，由于會(huì)發(fā)生干燥不充分的情況，所以也是不利的。
此外，在當(dāng)輸送皂化膜12并將該皂化膜插入到轉(zhuǎn)筒和傳送帶之間的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行加熱和干燥的情況下，得到的皂化膜12可具有優(yōu)異的平整性。因?yàn)樵砘?2具有這種優(yōu)異的平整性，所以通過(guò)將皂化膜12切割成預(yù)定尺寸而得到的薄片可以被精確地容納在核酸分離純化柱中。
本發(fā)明的微孔膜的最小孔徑通常為約0.01μm到8μm。然而，如果本發(fā)明的微孔膜用于分離和純化核酸，那么為了提高提取核酸的效率，則該微孔膜的最小孔徑優(yōu)選為0.1μm或更大，更優(yōu)選為0.5μm到5μm。
可以通過(guò)泡點(diǎn)法來(lái)測(cè)量微孔膜的最小孔徑。
本發(fā)明的微孔膜中的孔的形狀可以為各種形狀。例如，微孔膜的孔的形狀表里之間可以對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)。然而，如果本發(fā)明的微孔膜用于分離和純化核酸，那么為了防止堵塞，則該微孔膜的孔的形狀優(yōu)選為表里之間不對(duì)稱(chēng)。
如果本發(fā)明的微孔膜用于分離和純化核酸，那么為了使核酸吸附到膜上并防止堵塞，則該微孔膜的最大孔徑與最小孔徑之比優(yōu)選為2或更高，更優(yōu)選為5或更高。
可以使用電子顯微鏡來(lái)測(cè)量微孔膜的最大孔徑。
如果本發(fā)明的微孔膜用于分離和純化核酸，那么為了便于膜的洗滌，則該微孔膜的厚度優(yōu)選為10μm到500μm，更優(yōu)選為50μm到250μm。
可以使用厚度計(jì)(例如數(shù)顯厚度計(jì))來(lái)測(cè)量微孔膜的厚度。
如果本發(fā)明的微孔膜用于分離和純化核酸，那么為了防止堵塞并便于核酸回收，則該微孔膜的孔隙率優(yōu)選為50％到95％，更優(yōu)選為65％到80％。
可以通過(guò)計(jì)算膜的密度來(lái)確定孔隙率。
如果本發(fā)明的微孔膜用于分離和純化核酸，那么為了防止堵塞并便于核酸回收，則該微孔膜的泡點(diǎn)優(yōu)選為0.1kgf/cm2到10kgf/cm2，更優(yōu)選為0.2kgf/cm2到4kgf/cm2。
可以使用泡點(diǎn)法來(lái)測(cè)量泡點(diǎn)。
如果本發(fā)明的微孔膜用于分離和純化核酸，那么為了使用壓力系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)化處理，則該微孔膜的壓力損失優(yōu)選為0.1kPa到100kPa，更優(yōu)選為0.5kPa到50kPa。
可以使用差壓計(jì)來(lái)測(cè)量壓力損失。
如果本發(fā)明的微孔膜用于分離和純化核酸，那么為了使用壓力系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)化處理，則在25℃的溫度、1kg/cm2的壓力下，該微孔膜的透水度優(yōu)選為每分鐘1mL/cm2到5,000mL/cm2，更優(yōu)選為每分鐘5mL/cm2到1,000mL/cm2。
當(dāng)本發(fā)明的微孔膜的性質(zhì)滿(mǎn)足上述限定的范圍時(shí)，該微孔膜可更優(yōu)選地用于核酸分離純化方法中。
當(dāng)本發(fā)明的微孔膜用于核酸分離純化方法中時(shí)，每毫克該微孔膜的核酸吸附量?jī)?yōu)選為0.1μg或更多，更優(yōu)選為0.9μg或更多。
本發(fā)明的微孔膜被用于核酸分離純化方法中，該方法包括以下多個(gè)步驟步驟(1)，使含核酸的樣品溶液穿過(guò)多孔膜，使得核酸被吸附在多孔膜的內(nèi)部；步驟(2)，使洗滌液穿過(guò)多孔膜，從而對(duì)核酸保持吸附在其上的多孔膜進(jìn)行洗滌；以及步驟(3)，使回收液穿過(guò)多孔膜，使得核酸從多孔膜的內(nèi)部解吸附。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”是指單鏈核酸或雙鏈核酸。對(duì)核酸的分子量沒(méi)有限定。
在核酸分離純化方法中，優(yōu)選使用具有這樣一種固相的核酸分離純化單元來(lái)進(jìn)行核酸的吸附和解吸附，該固相由微孔膜制成，所述微孔膜被容納在具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器中。
更優(yōu)選的是，使用這樣一種核酸分離純化單元來(lái)進(jìn)行核酸的吸附和解吸附，該核酸分離純化單元具有(a)由微孔膜制成的固相；(b)具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器，用于容納固相；以及(c)與所述容器的一個(gè)開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置。
上述核酸分離純化方法的第一實(shí)施方案包括以下步驟步驟(a)，將核酸分離純化單元的一個(gè)開(kāi)口插入到含核酸的樣品溶液中；步驟(b)，借助于容器內(nèi)的降低的壓力，吸入含核酸的樣品溶液，使得樣品溶液與由微孔膜制成的固相接觸，所述降低的壓力是通過(guò)使用與核酸分離純化單元的其它開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的；步驟(c)，借助于容器內(nèi)的升高的壓力，將上述吸入的含核酸的樣品溶液排出容器，所述升高的壓力是通過(guò)使用與核酸分離純化單元的其它開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的；步驟(d)，將核酸分離純化單元的一個(gè)開(kāi)口插入到核酸洗滌緩沖液中；步驟(e)，借助于容器內(nèi)的降低的壓力，吸入核酸洗滌緩沖液，使得核酸洗滌緩沖液與由微孔膜制成的固相接觸，所述降低的壓力是通過(guò)使用與核酸分離純化單元的其它開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的；步驟(f)，借助于容器內(nèi)的升高的壓力，將上述吸入的核酸洗滌緩沖液排出容器，所述升高的壓力是通過(guò)使用與核酸分離純化單元的其它開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的；步驟(g)，將核酸分離純化單元的一個(gè)開(kāi)口插入到能夠使吸附到由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液中；步驟(h)，借助于容器內(nèi)的降低的壓力，吸入能夠使吸附到由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液，使得能夠使吸附到由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液與由微孔膜制成的固相接觸，所述降低的壓力是通過(guò)使用與核酸分離純化單元的其它開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的；以及步驟(i)，借助于容器內(nèi)的升高的壓力，將上述能夠使吸附到由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液排出容器，所述升高的壓力是通過(guò)使用與核酸分離純化單元的其它開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
上述核酸分離純化方法的第二實(shí)施方案可包括以下步驟步驟(a)，由試驗(yàn)樣品制備含核酸的樣品容液，并將含核酸的樣品溶液注入到核酸分離純化單元的第一開(kāi)口中；步驟(b)，借助于容器內(nèi)的升高的壓力，將上述注入的含核酸的樣品溶液通過(guò)其它開(kāi)口排出容器，使得樣品溶液與由微孔膜制成的固相接觸，所述升高的壓力是通過(guò)與核酸分離純化單元的第一開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的；步驟(c)，將核酸洗滌緩沖液注入到核酸分離純化單元的第一開(kāi)口中；步驟(d)，借助于容器內(nèi)的升高的壓力，將上述注入的核酸洗滌緩沖液通過(guò)其它開(kāi)口排出容器，使得核酸洗滌緩沖液與由微孔膜制成的固相接觸，所述升高的壓力是通過(guò)與核酸分離純化單元的第一開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的；步驟(e)，將能夠使吸附在由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液注入到核酸分離純化單元的第一開(kāi)口中；以及步驟(f)，借助于容器內(nèi)的升高的壓力，將上述能夠使被吸附在由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液通過(guò)其它開(kāi)口排出容器，使得被吸附在由微孔膜制成的固相上的核酸從固相上解吸附，并被排出容器，所述升高的壓力是通過(guò)使用與核酸分離純化單元的第一開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
以下將進(jìn)一步說(shuō)明使用微孔膜的核酸分離純化方法。優(yōu)選的是，使含核酸的樣品溶液與由微孔膜制成的固相接觸，使得樣品溶液中的核酸被吸附到固相上。隨后，使用所需的溶液(在下文中說(shuō)明)，使被吸附到固相上的核酸從固相上解吸附。更優(yōu)選的是，含核酸的樣品溶液是通過(guò)向核酸分散體中加入水溶性有機(jī)溶劑而得到的溶液，所述核酸分散體是通過(guò)使用能夠使試驗(yàn)樣品中的細(xì)胞膜和核膜分解的溶液來(lái)處理含細(xì)胞或病毒的試驗(yàn)樣品而得到的。
對(duì)本發(fā)明使用的含核酸的樣品溶液沒(méi)有限定。然而，在診斷領(lǐng)域中，樣品溶液可以是體液，例如全血、血漿、血清、尿、糞便和唾液；或者是生物材料，例如植物(或其一部分)、動(dòng)物(或其一部分)或者它們的溶液或勻漿。
首先，使用其中含有能夠使細(xì)胞膜分解的試劑的水溶液來(lái)處理試驗(yàn)樣品，從而溶解核膜。以這樣的方式，細(xì)胞膜和核膜都被分解，從而使核酸分散在水溶液中。為了使細(xì)胞膜分解并溶解核膜，在分析樣品為全血的情況下，需要進(jìn)行以下操作(1)除去紅細(xì)胞，(2)除去各種蛋白質(zhì)，以及(3)使白細(xì)胞和核膜分解。需要進(jìn)行除去紅細(xì)胞的操作(1)和除去各種蛋白質(zhì)的操作(2)是為了防止固相的非特異性吸附，并防止多孔膜堵塞。需要進(jìn)行使白細(xì)胞和核膜分解的操作(3)是為了使待提取的核酸溶解。具體地說(shuō)，使白細(xì)胞和核膜分解的操作(3)是一個(gè)重要的步驟，在該步驟中，必須使核酸溶解。在下文所述的例子中，當(dāng)使用鹽酸胍、Triton X-100以及蛋白酶(由SIGMA公司生產(chǎn))將試驗(yàn)樣品在60℃溫育10分鐘時(shí)，便可同時(shí)滿(mǎn)足上述操作(1)、(2)和(3)的要求。
作為核酸溶解試劑，可以使用含有胍鹽、表面活性劑和蛋白水解酶的溶液。作為胍鹽，優(yōu)選使用鹽酸胍。然而，也可以使用其它胍鹽(異硫氰酸胍和硫氰酸胍)。溶液中胍鹽的濃度為不低于0.5M到不高于6M，優(yōu)選為不低于1M到不高于5M。
作為表面活性劑，可以使用Triton X-100。除了Triton X-100，還可以使用陰離子表面活性劑，例如SDS、膽酸鈉和肌氨酸鈉；非離子型表面活性劑，例如吐溫20和Megafac；以及其它各種兩性表面活性劑。優(yōu)選使用非離子型表面活性劑，例如聚氧乙烯辛基酚醚(Triton X-100)。溶液中表面活性劑的濃度通常優(yōu)選為0.05質(zhì)量％到10質(zhì)量％，特別是0.1質(zhì)量％到5質(zhì)量％。
作為蛋白水解酶，可以使用蛋白酶K。然而，還可以使用其它蛋白酶。因?yàn)榈鞍酌甘且活?lèi)酶，所以?xún)?yōu)選將其加熱到37℃到70℃、特別是50℃到65℃的溫度。
接著，向含核酸的水溶液(核酸已經(jīng)以上述方式分散在水溶液中)中加入水溶性有機(jī)溶劑，從而使核酸能夠與微孔膜接觸。以這樣的方式，樣品溶液中的核酸被吸附到微孔膜上。為了使按照本文上述過(guò)程溶解的核酸被吸附到由微孔膜制成的固相上，就必須使以上述方式溶解的核酸混合溶液與水溶性有機(jī)溶劑混合，并且使混合后的核酸溶液中含有鹽。
換言之，當(dāng)位于核酸周?chē)乃肿拥乃辖Y(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，核酸以不穩(wěn)定的狀態(tài)溶解。據(jù)信，當(dāng)核酸以這樣的狀態(tài)與由微孔膜制成的固相接觸時(shí)，核酸表面的極性基團(tuán)與固相表面的極性基團(tuán)發(fā)生相互作用，使得核酸被吸附到固相的表面。通過(guò)將按照上述方式溶解的核酸混合溶液與水溶性有機(jī)溶劑混合，并使最后得到的混合后的核酸溶液中含有鹽，就可以使核酸處于不穩(wěn)定的狀態(tài)。
本發(fā)明中可以使用的水溶性有機(jī)溶劑的實(shí)例包括乙醇、異丙醇和丙醇。在這些水溶性有機(jī)溶劑中，優(yōu)選乙醇。水溶性有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為5質(zhì)量％到90質(zhì)量％，更優(yōu)選為20質(zhì)量％到60質(zhì)量％。乙醇的濃度優(yōu)選為盡可能得高，只要不產(chǎn)生凝聚即可。
以上述方式得到的混合后的核酸溶液中所含的鹽的優(yōu)選實(shí)例包括各種離液材料(胍鹽、碘化鈉和高氯酸鈉)、氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、溴化鈉、溴化鉀、溴化鈣和溴化銨。具體地說(shuō)，胍鹽是優(yōu)選的，這是因?yàn)樗鼈兙哂惺辜?xì)胞膜分解和溶解核酸的雙重效果。
隨后，將其上吸附有核酸的微孔膜與核酸洗滌緩沖液接觸。這種核酸洗滌緩沖液能夠洗滌微孔膜，從而除去樣品溶液中與核酸一起被吸附到微孔膜上的雜質(zhì)。因此，核酸洗滌緩沖液必須具有這樣的成分，該成分使得核酸不能從微孔膜上解吸附，但是能夠使雜質(zhì)從微孔膜上解吸附。核酸洗滌緩沖液由含有主要試劑、緩沖劑和可選可不選的表面活性劑的水溶液構(gòu)成。作為主要試劑，可以使用濃度為約10質(zhì)量％到100質(zhì)量％(優(yōu)選為約20質(zhì)量％到100質(zhì)量％，更優(yōu)選為約40質(zhì)量％到80質(zhì)量％)的以下試劑的水溶液，所述試劑為甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、丁醇、丙酮等。作為緩沖劑和表面活性劑，可以分別使用現(xiàn)有的緩沖劑和表面活性劑。在這些核酸洗滌緩沖液中，優(yōu)選含有乙醇、Tris和Triton X-100的溶液。Tris和Triton X-100的濃度各自?xún)?yōu)選為10mM到100mM和0.1質(zhì)量％到10質(zhì)量％。
隨后，將上述經(jīng)過(guò)如此洗滌的微孔膜與能夠使被吸附到微孔膜上的核酸解吸附的溶液接觸。與微孔膜接觸后的溶液中含有需要的核酸。因此，回收該溶液并進(jìn)行其后的處理過(guò)程，例如，通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))使核酸擴(kuò)增。作為能夠使核酸解吸附的溶液，優(yōu)選使用鹽濃度低(特別是0.5M或更低)的溶液。作為這種溶液，可以使用純凈的蒸餾水、TE緩沖液等等。

核酸分離純化單元具有由微孔膜制成的固相，該固相被容納在具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器中。對(duì)容器構(gòu)成材料沒(méi)有特別的限定，只要其能夠容納微孔膜并具有至少兩個(gè)開(kāi)口即可。為了易于生產(chǎn)，塑料是優(yōu)選的。例如，可優(yōu)選使用諸如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、尼龍和聚碳酸酯之類(lèi)的透明或不透明的樹(shù)脂。
圖3是所述容器的概念圖。大體而言，如果容器被設(shè)置成以下方式就可以滿(mǎn)足需要，所述方式為具有能夠容納固相的固相容納部分；能夠防止在樣品溶液等的吸入和排放期間固相脫離容納部分；并且設(shè)有與其開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置，例如注射器。因此，優(yōu)選的是，當(dāng)容器容納固相以后，該容器由連接在一起的兩部分構(gòu)成。此外，為了防止固相脫離容納部分，可以在固相的頂部和底部設(shè)置由不會(huì)污染DNA的材料制成的網(wǎng)。
對(duì)將被容納在上述容器中的微孔膜的形狀也沒(méi)有特別限定。微孔膜的形狀可以是圓形、正方形、長(zhǎng)方形、橢圓形、圓筒狀、卷狀或任何其它任意的形狀。為了提高生產(chǎn)率，微孔膜優(yōu)選的形狀是諸如圓形、正方形、圓筒狀和卷狀之類(lèi)的高度對(duì)稱(chēng)的形狀。
將上述容器的一個(gè)開(kāi)口插入到含核酸的樣品溶液中，同時(shí)，從其它開(kāi)口抽吸樣品溶液，從而使樣品溶液與微孔膜接觸。然后排放樣品溶液。隨后，吸入核酸洗滌緩沖液，并將其排放。隨后，吸入能夠使吸附到微孔膜上的核酸解吸附的溶液，并將其排放。然后，將上一步驟中的排放溶液回收，以便得到所需的核酸。
還可以通過(guò)以下操作來(lái)得到所需的核酸，該操作為將微孔膜依次浸漬在含核酸的樣品溶液中、核酸洗滌緩沖液中以及能夠使吸附到微孔膜上的核酸解吸附的溶液中。
核酸分離純化單元優(yōu)選包括(a)由微孔膜制成的固相；(b)用于容納固相的具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器；以及(c)與所述容器的一個(gè)開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置。參照這種核酸分離純化單元來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
通常，以多個(gè)部件(即，主體和蓋體，其中主體用于容納由微孔膜制成的固相)的方式制備所述容器。這兩個(gè)部件各自具有至少一個(gè)開(kāi)口。其中，一個(gè)開(kāi)口被用作含核酸的樣品溶液、核酸洗滌緩沖液和能夠使吸附到固相上的核酸解吸附的溶液(下文中稱(chēng)之為“樣品溶液等”)的進(jìn)口和出口。其它開(kāi)口與能夠降低或升高容器內(nèi)的壓力的壓力差產(chǎn)生裝置連接。對(duì)主體的形狀沒(méi)有特別限定。然而，該主體優(yōu)選具有圓形部分，以便有利于生產(chǎn)該主體，以及有利于使樣品溶液等分散到固相的整個(gè)表面上。該主體部分還優(yōu)選為長(zhǎng)方形，以免產(chǎn)生所述固相的裁剪廢料。
上述蓋體必須以這樣的方式與主體連接該方式使得容器內(nèi)的壓力可以通過(guò)壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)降低或升高?？梢赃x擇任何連接方法，只要可以達(dá)到這種狀態(tài)即可。本發(fā)明可使用的連接方法的實(shí)例包括使用粘合劑、螺紋連接、裝配連接和超聲波熱熔接。
容器的內(nèi)部容積僅由待處理的樣品溶液的量來(lái)確定，但是通常由容器內(nèi)容納的固相的體積來(lái)表示。具體地說(shuō)，所述容器的尺寸優(yōu)選大到足夠容納約1個(gè)到6個(gè)固相薄片，其中所述薄片的厚度為約1mm或更薄(例如約50μm到500μm)，而直徑為約2mm到20mm。
固相的邊緣優(yōu)選為與容器的內(nèi)壁緊密接觸，使得樣品溶液等不能從固相邊緣與容器內(nèi)壁之間的間隙通過(guò)。
與用作樣品溶液等的進(jìn)口的那個(gè)開(kāi)口相對(duì)放置的固相不與容器的內(nèi)壁緊密接觸，使得在該固相以下形成空間，從而形成使得樣品溶液等盡可能均勻地分散在固相的整個(gè)表面上的排布方式。
在與其它開(kāi)口(即，與壓力差產(chǎn)生裝置連接的那個(gè)開(kāi)口)相對(duì)放置的固相上面，優(yōu)選的是，設(shè)置一個(gè)穿有孔的元件，該孔大體上位于該元件的中心部分。該元件具有在保持固相的同時(shí)有效地排放樣品溶液等作用。該元件優(yōu)選為漏斗狀或杯狀，從而使得樣品溶液等聚集在該元件的中心處。所述的孔的尺寸、傾斜的角度以及該元件的厚度都可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)待處理的樣品溶液等的量、以及用于容納固相的容器的尺寸等來(lái)適當(dāng)?shù)卮_定。在所述元件和所述開(kāi)口之間優(yōu)選形成一個(gè)用于儲(chǔ)存樣品溶液等(是指溢出固相的那部分溶液)的空間，從而防止樣品溶液等被吸入到壓力差產(chǎn)生裝置中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以適當(dāng)?shù)卮_定所述空間的尺寸。為了有效地收集核酸，優(yōu)選的是，被吸入的含核酸的樣品溶液的量等于或大于使得容器中整個(gè)固相都被浸沒(méi)時(shí)的量。
為了防止樣品溶液等只集中在吸入開(kāi)口的正下方的部分處，從而達(dá)到使樣品溶液等能夠相對(duì)均勻地穿過(guò)固相，優(yōu)選的是，在所述固相和所述元件之間也形成一個(gè)空間。因此，優(yōu)選的是，該元件具有多個(gè)面向固相形成的突起。這些突起的尺寸和數(shù)量可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定，但是優(yōu)選的是，將其確定成在所述固相和所述元件之間保持充足的空間的同時(shí)，使得固相的開(kāi)放區(qū)域能夠保持盡可能得大。
不用說(shuō)，當(dāng)容器上形成有三個(gè)或更多開(kāi)口時(shí)，在伴隨壓力降低或升高的同時(shí)，必須將多出來(lái)的開(kāi)口暫時(shí)關(guān)閉，以便使溶液能夠被吸入或排出。
操作時(shí)，壓力差產(chǎn)生裝置首先降低容器(其中容納有固相)內(nèi)的壓力，以便吸入含核酸的樣品溶液。本發(fā)明可使用的壓力差產(chǎn)生裝置的實(shí)例包括注射器、移液管以及能夠吸氣和壓縮氣體的泵(例如Perista泵)。在這些壓力差產(chǎn)生裝置中，注射器適用于人工操作，而泵適用于自動(dòng)化操作。此外，移液管是有利的，因?yàn)槠浔阌趩问植僮鳌?yōu)選的是，壓力差產(chǎn)生裝置以可拆卸的方式與容器的一個(gè)開(kāi)口連接。
以下將說(shuō)明使用上述核酸分離純化單元來(lái)純化核酸的方法。首先，將上述核酸分離純化單元的第一開(kāi)口插入含核酸的樣品溶液中。隨后，使用與核酸分離純化單元的其它開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)降低純化單元內(nèi)的壓力，以便將樣品溶液吸入到容器中。以這樣的方式，使樣品溶液與固相接觸，從而使樣品溶液中的核酸被吸附到固相上。優(yōu)選的是，樣品溶液被吸入一定的量使得樣品溶液在該過(guò)程中能夠與固相的幾乎整個(gè)主體接觸。然而，當(dāng)樣品溶液被吸入壓力差產(chǎn)生裝置中時(shí)，所述裝置被污染。所以應(yīng)該以適當(dāng)調(diào)節(jié)的量吸入樣品溶液。
在吸入適量的樣品溶液之后，接著通過(guò)壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)升高所述單元內(nèi)的壓力，從而排放以上述方式吸入的溶液。在吸入操作和排放操作之間不需要設(shè)置一定的時(shí)間間隔。在樣品溶液被吸入之后，可以緊接著進(jìn)行排放樣品溶液的操作。
隨后，按照與上述相同的減壓操作和升壓操作將核酸洗滌緩沖液吸入容器中，然后排放，從而對(duì)容器的內(nèi)部進(jìn)行洗滌。這種核酸洗滌緩沖液能夠?qū)⑷萜髦杏嗔舻臉悠啡芤?、以及樣品溶液中的與核酸一起被吸附到固相上的雜質(zhì)一塊兒洗出。因此，核酸洗滌緩沖液必須具有這樣的成分該成分不會(huì)使核酸從微孔膜上解吸附，但能使雜質(zhì)從微孔膜上解吸附。核酸洗滌緩沖液由含有主要試劑、緩沖劑和可選可不選的表面活性劑的水溶液構(gòu)成。作為主要試劑，可以使用濃度為約10質(zhì)量％到90質(zhì)量％(優(yōu)選為約50質(zhì)量％到90質(zhì)量％)的甲醇、乙醇、丁醇或丙酮等的水溶液。作為緩沖劑和表面活性劑，可以分別使用現(xiàn)有的緩沖劑和表面活性劑。在這些核酸洗滌緩沖液中，優(yōu)選含乙醇、Tris和Triton X-100的溶液。Tris和Triton X-100的濃度各自?xún)?yōu)選為10mM到100mM和0.1質(zhì)量％到10質(zhì)量％。
隨后，按照與上述相同的減壓操作和升壓操作將能夠使吸附到固相上的核酸解吸附的溶液引入容器中，然后從容器中排出。如此排放的溶液含有所需的核酸。因此，可以將該溶液回收，并提供給隨后的處理過(guò)程，例如通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))使核酸擴(kuò)增。
圖4為核酸分離純化單元的實(shí)例的剖面圖。但是，圖中沒(méi)有示出壓力差產(chǎn)生裝置。用于容納固相的容器500具有主體100和蓋200，并且該容器由透明的聚苯乙烯制成。主體100容納有多孔膜作為固相300，其中該多孔膜由經(jīng)過(guò)表面皂化的三醋酸纖維素制成。主體100還具有開(kāi)口101，樣品溶液等經(jīng)由該開(kāi)口被吸入。自該開(kāi)口延伸而形成的底表面102為漏斗形。在底表面102和固相300之間形成空間121?？蚣?03與底表面102一體形成，以便支承固相300并保持空間121。
主體的內(nèi)徑為20.1mm，深度為5.9mm，而從底表面102到開(kāi)口101的長(zhǎng)度為約70mm。容納于主體中的固相300的直徑為20.0mm。固相300中的單張薄片的厚度為約50μm到500μm。例如，固相300中的單張薄片的厚度為100μm。
圖4中，漏斗狀的壓件130置于固相的上面。壓件130具有在其中心位置處形成的孔131、以及在壓件的下表面上形成的一組突起132。在壓件130和固相300之間形成空間122。為了使樣品溶液等難以由固相300與主體100的壁104之間的間隙泄露出去，以如下方式設(shè)置壁104，所述方式為使所述的壁的上部的直徑比固相的直徑大；并且將壓件130的邊緣置于臺(tái)階105上。
通過(guò)超聲波加熱將蓋200與主體100連接。蓋200具有在大體為蓋中心的位置處形成的開(kāi)口201，壓力差產(chǎn)生裝置被連接到該開(kāi)口上。在蓋200和壓件130之間形成了用于保留由孔131流出的樣品溶液等的空間123。空間123具有約0.1mL的容積。
在以下實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明不能被解釋為只限于這些實(shí)施例。
(1)制備核酸吸附性微孔膜制備纖維素酯料液。參照料液制備中所述的溶解方法，首先將聚合物成分溶解于二氯甲烷中。隨后，按比例向該溶液中加入甲醇。然后，按比例向這種溶液中加入甘油和純凈水，從而得到其中幾乎不含不溶物的料液。隨后，通過(guò)濾紙過(guò)濾料液。所述料液的配方如下。
二醋酸纖維素2.42％(乙酰度54.5％)三醋酸纖維素3.43％(乙酰度60.8％)甘油0.18％二氯甲烷55.50％甲醇33.22％純凈水 5.05％將上述料液加入帶有溫控裝置的料液儲(chǔ)槽(圖1中的(1))中。料液儲(chǔ)槽(1)的溫度被控制為35.0℃±3.0℃。隨后，使用齒輪泵(2)泵送被保持為35.0℃±3.0℃的料液，過(guò)濾，然后通過(guò)模頭(3)使料液在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜(4)上流延，其中該膜是被置于環(huán)形帶(5)上進(jìn)行輸送的。在該過(guò)程中，轉(zhuǎn)筒(6)的溫度被控制為10.0℃±3.0℃，從而將流延表面的溫度保持在±3.0℃的波動(dòng)范圍以?xún)?nèi)。然后，使用溫度為20℃到40℃的干燥空氣對(duì)如此形成的經(jīng)流延的料液(經(jīng)流延的聚合物溶液)干燥20分鐘(如參考標(biāo)號(hào)7所示)，從而形成流延薄膜。
將流延薄膜與PET一起從環(huán)形帶(5)上剝離，用溫度為80℃到120℃的熱空氣干燥15分鐘(如參考標(biāo)號(hào)8所示)，然后由卷取機(jī)器(B)卷繞。從而在PET上形成醋酸纖維素微孔膜。
使成卷的流延薄膜(B)通過(guò)帶有切刀的放卷機(jī)(C)，流延薄膜在此被切割成寬為43cm的膜。使寬為43cm并帶有PET的醋酸纖維素膜通過(guò)剝離桿(D)，所述薄膜在此被分成PET部分(E)和醋酸纖維素微孔膜(F)。如此得到的醋酸纖維素微孔膜的平均孔徑為1.2μm，平均厚度為70μm。
然后，使1.5L甲醇和13.5L不含核酸酶的水這二者的混合物被吸附到醋酸纖維素微孔膜上。使醋酸纖維素微孔膜通過(guò)皂化單元15，在該皂化單元中，用溫度為20℃到30℃的0.4摩爾/L的NaOH水溶液將所述微孔膜皂化60分鐘。
在中和單元16中，將醋酸纖維素微孔膜浸漬在溫度為20℃到30℃的0.1摩爾/L的鹽酸中，由此對(duì)醋酸纖維素微孔膜進(jìn)行中和操作。
關(guān)于醋酸纖維素微孔膜的漂洗，用自動(dòng)洗滌機(jī)作為漂洗單元17，并且用不含核酸酶的水作為漂洗用水。
隨后，使用接觸型轉(zhuǎn)筒干燥裝置18來(lái)干燥醋酸纖維素微孔膜，從而得到所需的核酸吸附性微孔膜。
(2)核酸分離純化柱的制備由高抗沖聚苯乙烯制備核酸分離純化柱容器，其中容器的內(nèi)徑為7mm，并且該容器具有用于容納核酸吸附性微孔膜的部分。在微孔膜(1)的長(zhǎng)度方向上的1m、50m、100m、150m和200m的位置處取樣，并將所選取的膜試樣分別容納在核酸分離純化柱容器內(nèi)的用于容納核酸吸附性多孔膜的位置處，從而制成核酸分離純化柱。
(3)核酸溶解試劑溶液和洗滌液的制備按照以下配方來(lái)制備核酸溶解試劑溶液和洗滌液。
(核酸溶解試劑溶液)
鹽酸胍(由Life Technology有限公司制造)382gTris(由Life Technology有限公司制造) 12.1gTrion X-100(由ICN公司制造) 10g蒸餾水 1,000mL
(洗滌液)
100mMNaCl10mM Tris-HCl65％ 乙醇
(4)DNA分離純化的操作向200μL人全血試驗(yàn)樣品中加入200μL實(shí)施例1制備的核酸溶解試劑溶液、和20μL蛋白酶(細(xì)菌“蛋白酶”XXIV型，由SIGMA公司制造)。然后將試驗(yàn)樣品在60℃溫育10分鐘。然后，在攪拌條件下向如此溫育所得到的試驗(yàn)樣品中加入200μL乙醇，從而制成含核酸的樣品溶液。然后，通過(guò)各個(gè)核酸分離純化柱的第一開(kāi)口將含核酸的樣品溶液注入到各個(gè)核酸分離純化柱中，其中核酸分離純化柱中分別裝有在步驟(2)中制備的、在微孔膜的長(zhǎng)度方向上的不同位置處取樣而得到的核酸吸附性微孔膜。隨后，將上述開(kāi)口與壓力差產(chǎn)生裝置連接，然后通過(guò)該壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)升高核酸分離純化單元內(nèi)的壓力，使得含核酸的樣品溶液穿過(guò)核酸吸附性微孔膜，從而使所述樣品溶液與核酸吸附性微孔膜接觸。然后，由核酸分離純化柱的其它開(kāi)口將樣品溶液從核酸分離純化柱內(nèi)排出。隨后，由核酸分離純化柱的第一開(kāi)口將步驟(3)制備的洗滌液注入到核酸分離純化柱中。將壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的第一開(kāi)口連接，然后通過(guò)該壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)升高核酸分離純化單元內(nèi)的壓力，從而使上述被注入的洗滌液穿過(guò)核酸吸附性微孔膜。然后通過(guò)核酸分離純化單元的其它開(kāi)口將洗滌液從核酸分離純化單元內(nèi)排出。將該操作重復(fù)進(jìn)行3次。隨后，通過(guò)核酸分離純化柱的第一開(kāi)口向核酸分離純化柱內(nèi)注入回收液。將壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的第一開(kāi)口連接，然后通過(guò)該壓力差產(chǎn)生裝置來(lái)升高核酸分離純化單元內(nèi)的壓力，從而使上述被注入的回收液穿過(guò)核酸吸附性微孔膜。通過(guò)核酸分離純化單元的其它開(kāi)口將回收液從核酸分離純化單元內(nèi)排出，然后回收該回收液。記錄在每個(gè)核酸分離純化柱上含核酸的樣品溶液穿過(guò)核酸吸附性微孔膜所需要的時(shí)間(見(jiàn)表1)。
按照實(shí)施例1的過(guò)程實(shí)施本對(duì)比例，不同之處在于流延表面的溫度被控制為10.0℃±5.0℃。
按照實(shí)施例1的過(guò)程實(shí)施本對(duì)比例，不同之處在于聚合物溶液的溫度被控制為35.0℃±5.0℃。
表1

由上述實(shí)施例1與對(duì)比例1和2的對(duì)比可以看出，在對(duì)比例1的制造條件(聚合物溶液的溫度35.0℃±3.0℃；流延薄膜表面的溫度10.0℃±5.0℃)或?qū)Ρ壤?的制造條件(聚合物溶液的溫度35.0℃±5.0℃；流延薄膜表面的溫度10.0℃±3.0℃)下得到的微孔膜顯示出這樣的特點(diǎn)隨著所取的樣在微孔膜的長(zhǎng)度方向上的位置的不同，核酸分離純化所需要的時(shí)間極為不同。與此形成對(duì)比的是，在實(shí)施例1的制造條件(聚合物溶液的溫度35.0℃±3.0℃；流延薄膜表面的溫度10.0℃±3.0℃)下得到的微孔膜則顯示出這樣的特點(diǎn)盡管所取的樣在微孔膜的長(zhǎng)度方向上的位置不同，但核酸分離純化所需要的時(shí)間基本穩(wěn)定。因此，實(shí)施例1的微孔膜具有穩(wěn)定的性質(zhì)。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明可以得到孔性質(zhì)穩(wěn)定的膜，而與所使用的膜在膜的長(zhǎng)度方向上的位置無(wú)關(guān)。
本發(fā)明還提供了這樣一種膜的制造方法，所述的膜在作為核酸吸附性微孔膜時(shí)(特別是在從含核酸的樣品溶液中分離和純化核酸的方法中使用的情況下)具有比相關(guān)技術(shù)產(chǎn)品更為穩(wěn)定的性質(zhì)。
因此，使用本發(fā)明的微孔膜來(lái)分離和純化核酸可以解決由于膜的特征隨著長(zhǎng)度方向上的位置變化而產(chǎn)生的輕微差異所引起的相關(guān)技術(shù)問(wèn)題，這即使在以下情況下也做得到核酸樣品中的的懸浮物含量相對(duì)較高，即，核酸純化時(shí)間不一致、由于堵塞而不能進(jìn)行純化、以及即使不會(huì)導(dǎo)致完全堵塞但分離和純化核酸也需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。所以，本發(fā)明可以得到性能穩(wěn)定的核酸分離純化體系，而與所使用的膜在膜的長(zhǎng)度方向上的位置無(wú)關(guān)。
本申請(qǐng)要求的外國(guó)優(yōu)先權(quán)所對(duì)應(yīng)的各外國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容都以引用方式并入本文，如同將其全部?jī)?nèi)容在此描述一樣。
權(quán)利要求
1.一種制造多孔膜的方法，該方法包括使聚合物溶液在載體上流延，從而形成經(jīng)流延的聚合物溶液，其中，在流延之前的所述聚合物溶液中，聚合物被溶解于由良溶劑、不良溶劑和非溶劑形成的混合物中；使所述的經(jīng)流延的聚合物溶液干燥，從而形成流延薄膜；以及對(duì)所述的流延薄膜進(jìn)行相分離，其中，所述多孔膜是采用以下條件制備的流延表面的溫度低于所述聚合物溶液的溫度，并且所述聚合物溶液的溫度變化和所述流延表面的溫度變化分別被保持在±3.0℃之內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的聚合物溶液是由纖維素的酯類(lèi)衍生物形成的聚合物溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的纖維素的酯類(lèi)衍生物含有選自纖維素羧酸酯、纖維素硝酸酯、纖維素硫酸酯、纖維素磺酸酯、纖維素磷酸酯、纖維素膦酸酯和纖維素焦磷酸酯中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的纖維素的酯類(lèi)衍生物是醋酸纖維素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的醋酸纖維素是三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的良溶劑是二氯甲烷，所述的不良溶劑是甲醇，而所述的非溶劑是水。
7.一種制造多孔膜的方法，該方法包括對(duì)根據(jù)權(quán)利要求2到6中任意一項(xiàng)所述的方法制成的多孔膜進(jìn)行皂化處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的最小孔徑為0.1μm或更大。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的多孔膜具有彼此不對(duì)稱(chēng)的前表面和后表面。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的最大孔徑與最小孔徑之比為2或更大。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的厚度為10μm到500μm。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的孔隙率為50％到95％。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到12中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的泡點(diǎn)為0.1kgf/cm2到10kgf/cm2。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多孔膜的壓力損失為0.1kPa到100kPa。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在25℃的溫度和1kg/cm2的壓力下，所述多孔膜的透水度為每分鐘1mL/cm2到5,000mL/cm2。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，每毫克所述多孔膜的核酸吸附量為0.1μg或更多。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求1到16中任意一項(xiàng)所述的方法制成的多孔膜在核酸分離純化方法中的用途，所述的核酸分離純化方法包括(1)使含核酸的樣品溶液穿過(guò)所述的多孔膜，從而使得所述核酸被吸附到所述多孔膜的內(nèi)部；(2)在所述核酸吸附在所述多孔膜上時(shí)，使洗滌液穿過(guò)所述多孔膜，從而洗滌該多孔膜；以及(3)使回收液穿過(guò)所述多孔膜，使得所述核酸從所述多孔膜的內(nèi)部解吸附。
全文摘要
一種制造多孔膜的方法，該方法包括使聚合物溶液在載體上流延，從而形成經(jīng)流延的聚合物溶液，其中，在流延之前的所述聚合物溶液中，聚合物被溶解于由良溶劑、不良溶劑和非溶劑形成的混合物中；使所述經(jīng)流延的聚合物溶液干燥，從而形成流延薄膜；以及對(duì)流延薄膜進(jìn)行相分離，其中多孔膜是采用以下條件制備的流延表面的溫度低于聚合物溶液的溫度，并且聚合物溶液的溫度變化和流延表面的溫度變化分別被保持在±3.0℃之內(nèi)。
文檔編號(hào)C08J9/28GK101090764SQ20058002366
公開(kāi)日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2005年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月16日
發(fā)明者田中秀明, 牧野快彥 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社