專利名稱：：用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒及其制備方法用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒及其制備方法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒(WSC-NP)及其制備方法，更準(zhǔn)確地，涉及用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒及其制備方法，所述水溶性殼聚糖納米顆粒通過(guò)在高度反應(yīng)性胺基位置引入官能團(tuán)而具有靶向所需要區(qū)域的功能，并且由于它的胺基的非常強(qiáng)的正電荷(+)，所述水溶性殼聚糖本身可以與具有負(fù)電荷(-)的DNA結(jié)合，故所述水溶性殼聚糖納米顆粒利用水溶性殼聚糖(WSC)而變成極佳的基因載體?，F(xiàn)有技術(shù)描述殼聚糖是通過(guò)葡糖胺的吡喃糖單體的|3-1，4鍵形成，其具有超過(guò)5，000個(gè)的葡糖胺殘基。它的分子量超過(guò)一百萬(wàn)。作為屬于具有聚陽(yáng)離子的多糖的生物聚合物，殼聚糖是從水產(chǎn)品諸如甲殼綱動(dòng)物(CVwtoc^)如蟹或蝦和魷魚中提取的。它具有與纖維素，一種多糖，相似的分子結(jié)構(gòu)，這表明它具有極好的生物相容性，而不受免疫反應(yīng)的排斥。因此，殼聚糖已經(jīng)廣泛用于醫(yī)藥工業(yè)，并且最近由美國(guó)FDA檢驗(yàn)證明為安全食品。因此，預(yù)計(jì)殼聚糖將成為在21世紀(jì)適用于生物產(chǎn)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)工業(yè)的相關(guān)物質(zhì)。特別地，已知具有從20,000到100,000范圍的分子量的殼聚糖具有很強(qiáng)的生理活性，因此所述殼聚糖可以用于生產(chǎn)健康食品、食品和飲料、化妝品、衛(wèi)生和醫(yī)藥供應(yīng)品。盡管殼聚糖上述有前途的特性，但是由于與相鄰分子的強(qiáng)的氫鍵，它在水中難溶，并且必須使用有機(jī)酸，包括乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、抗壞血酸和酒石酸，和無(wú)機(jī)酸，包括鹽酸、硝酸和硫酸，來(lái)溶解殼聚糖，所以它尚未成功地用于生物工業(yè)。為了克服這一問(wèn)題，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了水溶性殼聚糖，并且申請(qǐng)了專利(韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?001-0059282和2001-0070052)。在上述專利中，報(bào)道了具有1,000IOO，OOODa范圍的分子量的純水溶性游離胺殼聚糖的制備方法，所述方法包括步驟1)將殼聚糖寡糖的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸鹽溶液用三垸基胺處理，2)將有機(jī)溶劑添加到上述溶液中，以分離與形成三醇胺鹽的殼聚糖寡糖連接的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸，并且然后，回收沒(méi)有有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽的殼聚糖寡糖，3)將沒(méi)有酸的殼聚糖寡糖的溶液用無(wú)機(jī)酸處理，并且通過(guò)活性炭/離子交換樹脂柱進(jìn)行純化，獲得具有1,000~IOO，OOODa分子量的純水溶性游離胺殼聚糖。盡管與其它常規(guī)抗癌劑相比，由美國(guó)FDA于1992年證明的紫杉醇具有極好的抗癌活性，但是它具有嚴(yán)重的副作用問(wèn)題，該副作用是由于紫杉醇是疏水性的以致它在水中根本不分散，故它必須分散在聚氧乙烯蓖麻油(聚乙氧基化油)和乙醇(50:50)的混合溶液中以用作注射劑而產(chǎn)生的。由于在水中的不溶性，紫杉醇，一種具有抗癌活性的天然物質(zhì)，在用作注射劑的應(yīng)用中具有局限性。因此，已經(jīng)提議了許多使得紫杉醇的注射成為可能的體系。例如，將可生物降解的并且與紫杉醇強(qiáng)結(jié)合的人血清白蛋白(HSA)與紫杉醇結(jié)合，然后按照常規(guī)方法聲波振蕩、高壓勻漿并且微觀流體化，產(chǎn)生適用作為注射劑的乳劑。在美國(guó)專利號(hào)5,439,686,5，498，421，5,560,933和WO94/18954中報(bào)道了由VivoRx制藥公司利用提供低于10[im的平均顆粒大小的聲波振蕩技術(shù)而生產(chǎn)的紫杉醇和人血清白蛋白顆粒的組合而制備的可應(yīng)用的注射劑。然而，在上述專利中報(bào)道的制備方法不能用在大的工業(yè)規(guī)模上。并且，由上述方法獲得的顆粒太大而不能施用給患者。在美國(guó)專利號(hào)5,916,596,6,096,331,WO98/14174以及WO99/00113中還進(jìn)行了其它報(bào)道，所述報(bào)道涉及通過(guò)將凍干的粉末溶解在無(wú)菌的0.9%NaCl溶液和無(wú)菌的人血清白蛋白納米-乳劑中而獲得具有低于0.2pm的平均大小的紫杉醇。根據(jù)上述報(bào)道，通過(guò)高壓勻漿獲得的納米-乳劑中的顆粒在大小上是均一的，并且隨時(shí)間過(guò)去不形成納米顆粒沉淀，這表示納米-乳劑的穩(wěn)定性。然而，通過(guò)與人血清白蛋白混合而制備的紫杉醇混懸劑還不能用作工業(yè)規(guī)模的注射劑。因此，本發(fā)明人研究了利用殼聚糖作為成功適用于醫(yī)藥工業(yè)的紫杉醇載體的方法，原因是當(dāng)施用時(shí)，殼聚糖具有極好的生物相容性而不被免疫反應(yīng)排斥，并且通過(guò)建立所述方法而完成了本發(fā)明。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供水溶性殼聚糖納米顆粒及其制備方法，所述水溶性殼聚糖納米顆?？梢岳镁哂杏坞x胺基的高度水溶性的殼聚糖作為紫杉醇載體。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供有效遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒及其制備方法，其中將水溶性殼聚糖用作抗癌劑載體的基本組分，由于具有很強(qiáng)的正電荷(+)的殼聚糖的胺基，通過(guò)與具有負(fù)電荷(-)的DNA結(jié)合，水溶性殼聚糖本身成為優(yōu)秀的基因載體，并且所述載體通過(guò)在高度反應(yīng)性游離胺基中引入官能團(tuán)而提供靶向所需要的區(qū)域的功能。附圖簡(jiǎn)述參考附圖將最好地理解本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的應(yīng)用，其中圖1是顯示W(wǎng)SC的MTT試驗(yàn)結(jié)果的圖，圖23是顯示與MEPGp-NP綴合的WSC的FT-IR光譜的一組圖，圖4~6是顯示其中親水基團(tuán)MEPGp-NP與疏水基團(tuán)膽甾醇氯甲酸酯綴合的WSC的'H-NMR光譜的一組圖，圖7和圖8是顯示用TEM和AFM拍攝的本發(fā)明的WSC-NP的表面的照片，圖9~10是顯示在包封紫杉醇前(圖9)和包封紫杉醇后(圖10)熱分析的結(jié)果的一組圖，圖1112是顯示包封在WSC-NPT中的紫杉醇和標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇的質(zhì)量分析結(jié)果的一組圖，圖13是顯示按照不同藥物處理的小鼠存活率的圖，圖14是顯示在給小鼠施用藥物后腫瘤生長(zhǎng)的圖，圖15是顯示在給移植腫瘤的小鼠施用藥物后重量變化的圖。優(yōu)選實(shí)施方案詳述在下文中，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明提供一種用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒(WSC-NP)，其通過(guò)在水溶性殼聚糖鏈中引入疏水基團(tuán)如膽固醇和甲氧基聚(乙二醇)對(duì)-硝基苯基碳酸酯(MPEGp-NP)而制備。所引入的膽甾醇氯甲酸酯密封待運(yùn)載的紫杉醇，一種疏水性藥物，并且MPEG增加膽固醇的溶解性，這導(dǎo)致使得紫杉醇在血液中長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)，并且保護(hù)所述納米顆粒免受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)和巨噬細(xì)胞的攻擊。本發(fā)明還提供用于遞送包含疏水核的抗癌劑的水溶性納米顆粒的制備方法，所述方法包括下述步驟1)將甲氧基聚(乙二醇)對(duì)-硝基苯基碳酸酉旨(MPEGp-NP)添加到水溶性殼聚糖中，以形成酰胺鍵，并且消除副產(chǎn)物，對(duì)-硝基苯基基團(tuán)；和2)將膽甾醇氯甲酸酯添加到上述反應(yīng)溶液中，以在所述水溶性殼聚糖的游離胺基和膽甾醇氯甲酸酯之間形成另一個(gè)酰胺鍵。通過(guò)用冰水透析而消除對(duì)-硝基苯基基團(tuán)，步驟l)的副產(chǎn)物，并且通過(guò)用無(wú)水乙醇純化而完全消除殘留的副產(chǎn)物。在本發(fā)明中，為了生產(chǎn)具有癌癥治療作用的水溶性殼聚糖納米紫杉醇，將親水基團(tuán)甲氧基聚(乙二醇)對(duì)-硝基苯基碳酸酯(MPEGp-NP)和疏水基團(tuán)膽甾醇氯甲酸酯與水溶性殼聚糖的游離胺基結(jié)合，而獲得水溶性殼聚糖納米顆粒。然后，將紫杉醇用所述納米顆粒有效地包封，獲得可以容易地重新分散在水中的水溶性殼聚糖納米紫杉醇(WSC-NPT)。更準(zhǔn)確地，所述水溶性殼聚糖納米紫杉醇可以如下述生產(chǎn)。在第一步中，將甲氧基聚(乙二醇)對(duì)-硝基苯基碳酸酯(MPEGp-NP)添加到水溶性殼聚糖中，以形成酰胺鍵，并且通過(guò)用冰水透析48小時(shí)而消除副產(chǎn)物"對(duì)-硝基苯基基團(tuán)"。殘留的副產(chǎn)物通過(guò)用無(wú)水乙醇純化反應(yīng)溶液而完全消除。在下一步中，將膽甾醇氯甲酸酯添加到上述反應(yīng)溶液中，以在游離胺基和膽甾醇氯甲酸酯之間形成另一個(gè)酰胺鍵，這獲得具有疏水核的水溶性殼聚糖納米顆粒(見(jiàn)方案l)。最后，為上述反應(yīng)溶液提供抗癌劑(紫杉醇)，然后，將所述藥劑包封在膽固醇中，上述水溶性殼聚糖納米顆粒的疏水基團(tuán)，這導(dǎo)致水溶性殼聚糖納米紫杉醇的產(chǎn)生。<方案1>本發(fā)明中用作抗癌劑載體的水溶性殼聚糖適合遞送抗癌劑，由于它含有髙反應(yīng)性游離胺基。與使用對(duì)人類有害的有機(jī)溶劑的其它制備方法不同，本發(fā)明的水溶性殼聚糖納米顆粒的制備在溫和條件下在PBS(磷酸緩沖鹽水)溶液(pH7.08.0)中進(jìn)行，這表明這一過(guò)程是安全和簡(jiǎn)單的。通常已知，聚合物藥物在腫瘤細(xì)胞中比在正常細(xì)胞中積聚更多，原因在于它的EPR(增強(qiáng)的滲透性和保留作用)。與其它常規(guī)抗癌劑載體相比，在本發(fā)明中使用水溶性殼聚糖制備的水溶性殼聚糖納米顆粒在腫瘤細(xì)胞中也比在正常細(xì)胞中積聚更多，這說(shuō)明它極佳的抗癌作用。通常，癌癥細(xì)胞比相鄰細(xì)胞稍微更酸一些。具有6.5pKa的水溶性殼聚糖在弱酸中穩(wěn)定更好，這表明它能夠靶向癌癥細(xì)胞而不是正常的細(xì)胞。因此，所述水溶性殼聚糖納米顆粒更多積聚在癌癥細(xì)胞中。其中包含紫杉醇的水溶性殼聚糖納米紫杉醇特征在于，在冷凍干燥后在蒸餾水中的極佳的再分散力，并且還具有天然聚合材料如水溶性殼聚糖的其它優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)在將在下文中更充分地描述本發(fā)明的示例性的、非限制性的實(shí)施方案。然而，本發(fā)明可以以許多不同的形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)該解釋為受限于本文提出的示例性實(shí)施方案。實(shí)施例l:制備水溶性殼聚糖納米顆粒1具有18kDa分子量和87%脫乙酰程度的水溶性殼聚糖由KITTOUFE有限公司提供。甲氧基聚(乙二醇)對(duì)-硝基苯基碳酸酯(MPEGp-NP)，親水部分，購(gòu)自西格瑪公司(SigmaCo.)，并且膽甾醇氯甲酸酯，疏水基團(tuán)，購(gòu)自?shī)W德里奇公司(AldrichCo.)。透析管(MWCO12,000)商購(gòu)自頻譜公司(SpectrumCo.)。所有其它化學(xué)品都是試劑級(jí)并且按原樣使用。水溶性殼聚糖納米顆粒的制備在下述步驟中進(jìn)行。在步驟1中，將0.1g水溶性殼聚糖溶解在15mlPBS(pH7.08.0)中，然后攪動(dòng)一小時(shí)。將0.5g甲氧基聚(乙二醇)對(duì)-硝基苯基碳酸酯(MPEGp-NP)溶解在PBS(pH8.0)中，在攪動(dòng)溶液時(shí)將其緩慢滴入上述殼聚糖反應(yīng)溶液中。兩小時(shí)后，將所述溶液使用分子截留12,000g/mo1的透析管對(duì)冷蒸餾水透析48小時(shí)，這導(dǎo)致形成在上清中的清澈產(chǎn)物(clearproduct)和在沉淀層中的副產(chǎn)物。將那些產(chǎn)物分離，并且將清澈上清層冷凍干燥。將在上述步驟1中通過(guò)冷凍干燥獲得的白色產(chǎn)物溶解在15mlPBS(pH7.08.0)中，然后攪動(dòng)一小時(shí)。將膽甾醇氯甲酸酯以每10份殼聚糖葡糖胺單體1.0份溶解在12ml無(wú)水DMF中。在攪動(dòng)所述反應(yīng)溶液2小時(shí)的同時(shí)，將膽甾醇氯甲酸酯溶液緩慢滴入到上述反應(yīng)溶液中。當(dāng)完成反應(yīng)時(shí)，使用蒸餾水透析24小時(shí)。然后以10，000rpm離心10分鐘，然后使用0.45pm注射器過(guò)濾器過(guò)濾并且冷凍干燥。獲得終產(chǎn)物，白色水溶性殼聚糖納米顆粒。實(shí)施例2:制備水溶性殼聚糖納米顆粒2除了使用每10份殼聚糖葡糖胺單體1.5份膽甾醇氯甲酸酯之外，用與上述實(shí)施例1中所述的相同方法制備水溶性殼聚糖納米顆粒。實(shí)施例3:制備水溶性殼聚糖納米顆粒3除了使用每10份殼聚糖葡糖胺單體1.8份膽甾醇氯甲酸酯之外，用與上述實(shí)施例1中所述的相同方法制備水溶性殼聚糖納米顆粒。實(shí)施例4:制備水溶性殼聚糖納米紫杉醇1將上述實(shí)施例1中制備的25mg水溶性殼聚糖納米顆粒分散在10mlPBS(pH7.4)中，然后在4(TC攪動(dòng)30分鐘。將4mg紫杉醇溶解在2ml乙醇中，將其緩慢滴入到上述溶液中，在這一過(guò)程中使用水型聲波振蕩器進(jìn)行聲波振蕩。通過(guò)使用棒型聲波振蕩器再對(duì)上述溶液聲波振蕩2秒，將其重復(fù)10次。在PBS(pH7.4)中進(jìn)行透析。在第二天，再在蒸餾水中進(jìn)行透析12小時(shí)，然后離心。然后，將產(chǎn)物通過(guò)0.45(im注射器過(guò)濾器過(guò)濾，并且冷凍干燥，產(chǎn)生其中包含紫杉醇的水溶性殼聚糖納米紫杉醇。實(shí)施例5:制備水溶性殼聚糖納米紫杉醇2除了使用在上述實(shí)施例2中制備的WSC-NP之外，用與上述實(shí)施例4中所述的相同的方法制備水溶性殼聚糖納米紫杉醇。實(shí)施例6:制備水溶性殼聚糖納米紫杉醇3除了使用在上述實(shí)施例3中制備的WSC-NP之外，用與上述實(shí)施例4中所述的相同的方法制備水溶性殼聚糖納米紫杉醇。實(shí)驗(yàn)例1:MTT檢測(cè)進(jìn)行MTT檢測(cè)以研究本發(fā)明中使用的水溶性殼聚糖的毒性。將293T細(xì)胞以5><104個(gè)細(xì)胞/孔置于96孔平板，然后培養(yǎng)24小時(shí)。以0.1100昭/ml的濃度向每孔中加入具有不同重量平均分子量(Mw)(分別為10,000，20,000和50，000)的水溶性殼聚糖，然后在37"培養(yǎng)4小時(shí)。向其中加入以3mg/ml的濃度制備的50(ilMTT，然后進(jìn)一步在37匸培養(yǎng)4小時(shí)。去除上清。向96孔平板的每個(gè)孔中加入lOO(ilDMSO，將其放置10分鐘。然后，使用微量平板讀數(shù)儀(VERSAMAX)研究結(jié)果。通過(guò)下式l計(jì)算細(xì)胞生存力。<式1>細(xì)胞生存能力(％)=(00570(樣品)/0057()(對(duì)照))x100ODs7o(樣品)意指在用水溶性殼聚糖處理的孔中測(cè)量的OD值，并且OD，(對(duì)照)意指在只用PBS緩沖液處理的孔中測(cè)量的OD值。試驗(yàn)結(jié)果表示在圖1中。如圖1中所示，具有10,000-50,000范圍的重量平均分子量的水溶性殼聚糖沒(méi)有毒性。實(shí)驗(yàn)例2:FT-IR和^-NMR光譜的測(cè)量為了鑒定上述實(shí)施例1中制備的用疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)修飾的水溶性殼聚糖納米顆粒的合成，使用FT-IR(Shimadzu，F(xiàn)T-IR8700)和'H-NMR分光計(jì)(Bruker,DRX-500MHz)。對(duì)于'H-NMR測(cè)量，將水溶性殼聚糖納米顆粒以10mg/ml的濃度溶解在CDC13中，并且光譜在298K進(jìn)行。為了研究在上述實(shí)施例1中制備的水溶性殼聚糖納米顆粒的結(jié)構(gòu)特征，在CDC13和D20中檢測(cè)'H-NMR光譜。結(jié)果表示在圖2-3禾H圖46中。圖2顯示水溶性殼聚糖的FT-IR光譜，其中葡糖胺單體的胺基和酰胺基的峰分別清楚而不同地顯示在1539cm"和1635cm"。如在圖3中所示，將MPEG引入到水溶性殼聚糖中導(dǎo)致在接近2880cm"處觀察到MPEG的脂族-CH的特異性峰，在接近1539cm"處的胺基峰強(qiáng)度，水溶性殼聚糖的一個(gè)特異性峰，被水溶性殼聚糖的游離胺基和MPEG的羰基之間的酰胺鍵減小，并且與胺基的峰強(qiáng)度相比較，通過(guò)在水溶性殼聚糖和MPEG之間新的酰胺鍵，酰胺的特異性峰的強(qiáng)度增加。因此，該結(jié)果表明MPEG成功地綴合在水溶性殼聚糖中。圖4~6表示用親水基團(tuán)MPEG和疏水基團(tuán)膽固醇修飾的水溶性殼聚糖的^-NMR光譜。特別地，圖4顯示表明在大約1.5~0.5ppm處的沒(méi)有反應(yīng)的膽固醇的峰的光譜，其是在將WSC-NP溶解在CDCI3中后而沒(méi)有去除殘留的膽固醇而記錄的。特別地，在1.8ppm區(qū)域觀察到的強(qiáng)峰表明通過(guò)將膽固醇，一種疏水基團(tuán)，連接到水溶性殼聚糖鏈上而形成了疏水核。即，疏水型膽固醇的原始峰通過(guò)水溶性殼聚糖和MPEG的聚合物量的鍵阻礙，以致這些膽固醇形成在1.8ppm處的疏水核，在那里產(chǎn)生膽固醇的強(qiáng)特征性峰。圖5顯示W(wǎng)SC-NP的'H-NMR光譜，其在用乙醚純化所述顆粒消除未反應(yīng)的剩余膽固醇后記錄。如在所述圖中所示，在1.5~0.5ppm處的膽固醇的峰消失，并且清楚地顯現(xiàn)1.8ppm處的特異性峰，這表明形成了所述疏水性核。圖6顯示在將水溶性殼聚糖納米顆粒溶解在D20中后獲得的'H-NMR光譜，其也證實(shí)在WSC-NP中形成了疏水核。如在所述圖中所示，膽固醇的特異性峰完全消失，并且只觀察到水溶性殼聚糖和MPEG的特征峰，這證明所述疏水核形成。所有上述結(jié)果都表明MPEG和膽固醇成功地連接到水溶性殼聚糖的鏈上。實(shí)驗(yàn)例3:水溶性殼聚糖納米顆粒的形態(tài)觀察本發(fā)明的WSC-NP的形態(tài)用TEM(透射電子顯微鏡；JEOLJEM-2000FX-II)和AFM(原子力顯微鏡；PARK'S科學(xué)自動(dòng)探頭CP(PARK'sScienceAutoprobeCP))檢查。將一滴懸浮在0.0P/。磷鎢酸(PTA)中的殼聚糖納米顆粒置于包被在銅柵極上的碳薄膜上用于TEM。對(duì)于AFM成像分析，將蒸餾水中的0.1mg/ml的殼聚糖納米顆粒置于硅水表面，并且在室溫下用在12和24kHz之間振蕩的懸臂頻率觀察。圖7顯示用TEM研究的水溶性殼聚糖納米顆粒的表面構(gòu)造。圖7顯示水溶性殼聚糖納米顆粒的TEM照片。如在這些照片中所示，水溶性殼聚糖納米顆粒的形狀是球形，并且大小在直徑約30-150nm范圍內(nèi)。當(dāng)MPEG與葡糖胺單位的比例不變時(shí)，膽固醇的比例增加越多，由于疏水性增加導(dǎo)致殼聚糖納米顆粒的大小越小。圖8顯示水溶性殼聚糖納米顆粒的AFM觀察。在這些照片中，證實(shí)所述水溶性殼聚糖納米顆粒具有球形光滑表面，并且由于所述顆粒由膽固醇稠化，所以所述顆粒的大小隨著膽固醇，一種疏水基團(tuán)，的取代的增加而減小，這是與TEM分析獲得的結(jié)果相同的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)例4:光子相關(guān)性光譜學(xué)(PCS)測(cè)量光子相關(guān)性光譜學(xué)(PCS)使用具有633nm波長(zhǎng)的He-Ne激光束的Zetasizer3000(Malvern儀器，英國(guó))進(jìn)行測(cè)量，以確定本發(fā)明的WSC-NP的表面電荷。結(jié)果顯示在表1中。<表1><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>將水溶性殼聚糖用MEPG，一種親水基團(tuán)，和膽固醇，一種疏水基團(tuán)，修飾，以包封紫杉醇，一種疏水性抗癌劑。如在表1中所示，顆粒大小隨著膽固醇取代的增加而減小，并且臨界聚集濃度(CAC)也減小。結(jié)果表明，當(dāng)膽固醇，一種疏水基團(tuán)的水平增加時(shí)，甚至在低濃度下形成納米顆粒。作為Zeta電勢(shì)檢測(cè)的結(jié)果，證實(shí)通過(guò)用MPEG和膽固醇取代胺基，減小了水溶性殼聚糖的正電荷。實(shí)驗(yàn)例5:差式掃描量熱法(DSC)測(cè)量使用TA儀器(杜邦公司(Dupont),TA2000)在氮?dú)饬飨聹y(cè)量紫杉醇和水溶性殼聚糖納米紫杉醇的Tm。掃描速度為1(TC/分鐘，并且范圍確定為2035(TC。結(jié)果顯示在圖910中。圖910顯示在包封紫杉醇之前(圖9)和之后(圖10)熱分析的結(jié)果。通常，分別在5(TC和215'C檢測(cè)到水溶性殼聚糖納米顆粒和紫杉醇的Tm。在大約5(TC檢測(cè)到其中不含紫杉醇的WSC-NP的Tm(參見(jiàn)圖9)。同時(shí)，在其中已經(jīng)包封紫杉醇的水溶性殼聚糖納米紫杉醇的情形中，在大約5(TC檢測(cè)到WSC-NP的Tm，同時(shí)在大約24(TC觀察到紫杉醇的Tm(參見(jiàn)圖10)。包含在水溶性殼聚糖納米紫杉醇中的紫杉醇的Tm高于原始紫杉醇的Tm(215°C)，這可能是由于紫杉醇完全包封在水溶性殼聚糖納米顆粒的疏水核中。實(shí)驗(yàn)例6:定量包封的紫杉醇的HPLC測(cè)量"f吏用phenomenexsphereclone5microODS(2)250x4.6mm柱禾口75%的甲醇作為移動(dòng)相，通過(guò)HPLC定量包封在上述實(shí)施例4中制備的水溶性殼聚糖納米紫杉醇中的紫杉醇。同時(shí)，將流量設(shè)定在1.5ml/分鐘，并且溫度為5(TC。并且使用紫外檢測(cè)儀(226nm)用于測(cè)量。紫杉醇溶解在乙醇中，制成20pl用于注射。結(jié)果顯示在表2中。<表2〉<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2顯示在上述實(shí)施例4~實(shí)施例6中制備的水溶性殼聚糖納米紫杉醇中的包封的紫杉醇的負(fù)載含量和負(fù)載效率。紫杉醇的負(fù)載含量和負(fù)載效率隨著膽固醇，一種疏水基團(tuán)，在攜帶MPEG的水溶性殼聚糖鏈中的取代的增加而增加。并且結(jié)果由圖11~12中所示的通過(guò)HPLC的定量再次證實(shí)。如圖ll12中所示，圖12紫杉醇特征峰檢測(cè)在3.4分鐘，且圖ll顯示包封在水溶性殼聚糖納米紫杉醇中的定量的紫杉醇。結(jié)果表明，紫杉醇的負(fù)載含量隨著膽固醇含量的增加而增加，這是由水溶性殼聚糖納米顆粒和膽固醇之間的疏水相互作用導(dǎo)致的。實(shí)驗(yàn)例7:在腫瘤誘導(dǎo)的CT-26小鼠模型中的抗腫瘤功效將雌性BALB/c小鼠(平均重量20g)在脅下皮下注射CT-26鼠源(mourine)腫瘤細(xì)胞(5xl0"個(gè)細(xì)胞/小鼠)。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到3mmx3mm大小時(shí)，將小鼠分成兩組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。每組具有8只具有腫瘤的小鼠，并且將它們?cè)谒鼈兊亩渖蠘?biāo)記，用來(lái)觀察。移植后15天，開始施用(靜脈內(nèi)注射)藥物和賦形劑。每種試驗(yàn)藥物以2mg/kg的低劑量和10mg/kg的高劑量施用，每3天施用4次，共12天。對(duì)對(duì)照組只施用賦形劑(聚氧乙烯蓖麻油:脫水乙醇，1:1體積比)。每天檢驗(yàn)小鼠的死亡率，并且使用卡尺式測(cè)量裝置以2或3天的時(shí)間間隔測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)。通過(guò)下式2計(jì)算腫瘤體積。<式2>腫瘤體積mm3=(長(zhǎng)x寬2)/2在腫瘤移植后兩周，將藥物或賦形劑注射到小鼠的尾部靜脈中。圖13是顯示分別施用紫杉醇和水溶性殼聚糖納米紫杉醇的小鼠的存活率的圖。對(duì)照組小鼠比任何其它組更快喪命。施用高劑量(IOmg/kg)的小鼠比其它三組在40天之內(nèi)死亡快得多，但是分別用2mg/kg和10mg/kg紫杉醇與2mg/kg水溶性殼聚糖納米紫杉醇處理的3組的存活率彼此間沒(méi)有太大不同。用高劑量(IOmg/kg)水溶性殼聚糖納米紫杉醇處理的實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間在組中表現(xiàn)出最高的存活率。圖14是顯示紫杉醇和水溶性殼聚糖納米紫杉醇對(duì)CT-26腫瘤模型的抗癌活性的圖。在腫瘤細(xì)胞移植后第15天測(cè)量腫瘤體積。當(dāng)兩種樣品，紫杉醇和水溶性殼聚糖納米紫杉醇，以2mg/kg的低劑量施用時(shí)，在它們之間腫瘤體積沒(méi)有太大區(qū)別。然而，當(dāng)所述藥物以10mg/kg的高劑量施用時(shí)，與分別只用賦形劑、2mg/kg紫杉醇和2mg/kg水溶性殼聚糖納米紫杉醇處理的其它組相比較，在用紫杉醇處理的小鼠中的腫瘤體積顯著減小。當(dāng)紫杉醇以10mg/kg施用時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)極好地得到抑制，但是30天后，腫瘤又開始生長(zhǎng)。如在圖14中所示，水溶性殼聚糖納米紫杉醇的抗癌活性以10mg/kg的劑量最高。當(dāng)施用水溶性殼聚糖納米紫杉醇時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定地得到抑制多達(dá)38天，但是在40天后開始生長(zhǎng)。圖15是顯示在給移植腫瘤的小鼠施用藥物后重量變化的圖。如所述圖中所示，在組間(對(duì)照、2mg/kg紫杉醇處理組、2mg/kg水溶性殼聚糖納米紫杉醇處理組)的重量變化沒(méi)有顯著不同。然而，用高劑量的水溶性殼聚糖納米紫杉醇處理的小鼠的重量極大減少。結(jié)果表明，以高劑量施用水溶性殼聚糖納米紫杉醇減小腫瘤的大小，這導(dǎo)致對(duì)重量增加的抑制。低劑量的水溶性殼聚糖納米紫杉醇不能抑制腫瘤生長(zhǎng)，并且也沒(méi)有更多地影響存活率，但是高劑量的藥物提高存活率，并且減小腫瘤體積，優(yōu)于原始紫杉醇。總之，高于10mg/kg的高劑量的水溶性殼聚糖納米紫杉醇具有極好的抗癌活性。如在上文中所闡述，通過(guò)利用水溶性殼聚糖將親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)引入到高反應(yīng)性游離胺基區(qū)域，本發(fā)明的用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒用來(lái)生產(chǎn)成功地將抗癌劑，紫杉醇，包封在其中的水溶性殼聚糖納米紫杉醇。由于它是基于天然聚合物"水溶性殼聚糖"而產(chǎn)生的，所以所述水溶性殼聚糖納米紫杉醇具有許多聚合物的優(yōu)點(diǎn)。詳細(xì)地，在冷凍干燥后，它容易地再分散在蒸餾水中，并且積聚在腫瘤細(xì)胞中，優(yōu)于其它抗癌劑載體。另外，水溶性殼聚糖在弱酸中穩(wěn)定性更好，以致本發(fā)明的顆粒耙向癌癥細(xì)胞而不是正常細(xì)胞，導(dǎo)致納米顆粒更好地積聚在癌癥細(xì)胞中，這表明所述顆粒具有極好的抗癌活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在前述描述中公開的觀念和具體的實(shí)施方案可以容易地用作改進(jìn)或設(shè)計(jì)實(shí)施本發(fā)明的相同目的的其它實(shí)施方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該理解，這樣的等價(jià)實(shí)施方案不背離在后附的權(quán)利要求中提出的本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1.用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒(WSC-NP)，所述用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒是通過(guò)在水溶性殼聚糖(WSC)鏈中引入疏水基團(tuán)如膽甾醇氯甲酸酯和甲氧基聚(乙二醇)對(duì)-硝基苯基碳酸酯(MPEGp-NP)而制備的。2.如權(quán)利要求1中所述的用于遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒，其中水溶性殼聚糖甲氧基聚(乙二醇)膽固醇的比例是10:2:1~1.8。3.水溶性殼聚糖納米紫杉醇，其中紫杉醇包封在通過(guò)在水溶性殼聚糖(WSC)鏈中引入疏水基團(tuán)如膽甾醇氯甲酸酯和甲氧基聚(乙二醇)對(duì)-硝基苯基碳酸酯(MPEGp-NP)而制備的水溶性殼聚糖納米顆粒中。4.用于遞送抗癌劑的水溶性納米顆粒的制備方法，所述方法包括下述步驟1)將MPEG加入到水溶性殼聚糖中以形成酰胺鍵，并且消除副產(chǎn)物，對(duì)-硝基苯基基團(tuán)；和2)將膽固醇加入到上述反應(yīng)溶液中，以在所述水溶性殼聚糖的游離胺基和膽甾醇氯甲酸酯之間形成另一個(gè)酰胺鍵。5.如權(quán)利要求4中所述的用于遞送抗癌劑的水溶性納米顆粒的制備方法，其中將所述對(duì)-硝基苯基基團(tuán)，步驟l)的副產(chǎn)物，通過(guò)用冰水透析而消除，并且將殘留的副產(chǎn)物通過(guò)用無(wú)水乙醇純化而完全消除。6.如權(quán)利要求4中所述的用于遞送抗癌劑的水溶性納米顆粒的制備方法，其中所述制備步驟是在PBS溶液中進(jìn)行的。全文摘要本發(fā)明涉及遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒(WSC-NP)及其制備方法，更準(zhǔn)確地，涉及遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒及其制備方法，WSC-NP通過(guò)在高度反應(yīng)性胺基位置引入官能團(tuán)而具有靶向需要的區(qū)域的功能，并且由于它的胺基的非常強(qiáng)的正電荷(+)，水溶性殼聚糖本身可以與具有負(fù)電荷(-)的DNA結(jié)合，故WSC-NP利用水溶性殼聚糖而變成極佳的基因載體。因此，通過(guò)在水溶性殼聚糖的高度反應(yīng)性胺基位置中引入親水和疏水基團(tuán)，本發(fā)明的遞送抗癌劑的水溶性殼聚糖納米顆粒可以有效地包封紫杉醇。如上制備的水溶性殼聚糖納米紫杉醇在冷凍干燥后在蒸餾水中具有極好的再分散力，并且由于它在腫瘤細(xì)胞中的積聚比其它抗癌劑載體的積聚更多而具有突出的抗癌作用。文檔編號(hào)C08B37/00GK101273066SQ200580051527公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2005年9月9日優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日發(fā)明者丁映日,張美卿,羅在云,鄭特來(lái)申請(qǐng)人:羅在云;鄭特來(lái);張美卿