專利名稱：使用分子篩控制聚合物中所選組分含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于控制在一種或多種聚合物中所選組分含量的方法。
背景技術(shù)：
聚合物和它們的衍生物廣泛用于各種應(yīng)用。尤其感興趣的是能夠用在食 物、化妝品、醫(yī)藥工業(yè)中的生物聚合物。為了滿足這些不同的應(yīng)用，通常有 必要將聚合物純化以去除多于的組分，并且進(jìn)一步控制終產(chǎn)品中組分的平衡。
人體最豐富的雜多糖是糖胺聚糖(glycosaminoglycan)。糖胺聚糖是無支鏈 的糖聚合物，由重復(fù)的二糖單元組成(僅硫酸角質(zhì)素(keratan sulphate)在糖的核 心區(qū)是分支的)。所述二糖單元通常包含兩種修飾的糖一N-乙酰半孔糖胺 (GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之一，作為第一糖單元。另一單元通常是 糖醛酸，例如葡糖醛酸(GlcUA)或艾杜糖醛酸(iduronate)。
糖胺聚糖是帶負(fù)電的分子，并且在溶液中(in solution)具有賦予高粘性的 延伸構(gòu)象。糖胺聚糖主要位于細(xì)胞表面上或胞外基質(zhì)中。糖胺聚糖在溶液中 還具有低壓縮性，并因此是理想的生理潤滑液體，例如關(guān)節(jié)(joim)。糖胺聚糖 的剛性為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)的整體性并且提供細(xì)胞之間允許細(xì)胞遷移的通道。具 有最高生理重要性的糖胺聚糖是乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan)、硫酸軟骨素、肝 素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和硫酸角質(zhì)素。多數(shù)糖胺聚糖通過特異的寡 糖結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合至蛋白聚糖核心蛋白。乙酰透明質(zhì)酸與某些蛋白聚糖形成大 聚集體(large aggregate),但例外是游離糖鏈與蛋白聚糖形成非共價(jià)復(fù)合體。
已鑒定乙酰透明質(zhì)酸在體內(nèi)的許多作用(參見，Laurent T. C. and Frasei'J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404;和Toole B.P.， 1991， "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation." In: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E. D., ed" Plenum, New York)。 乙酰透明 質(zhì)酸存在于透明軟骨、滑膜關(guān)節(jié)液(synovial joint fluid)以及真皮和表皮皮膚組 織中。還猜測乙酰透明質(zhì)酸在許多生理功能中具有作用，例如粘附、發(fā)育、 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、癌、血管發(fā)生和傷口愈合。由于乙酰透明質(zhì)酸獨(dú)特的物理和生
物特性，將其使用在眼和關(guān)節(jié)外科中，并且正在其它醫(yī)學(xué)方法中對(duì)其進(jìn)行評(píng) 估。
HA在生物體中扮演重要的角色，作為許多組織，例如皮膚、腱、肌肉和 軟骨的細(xì)胞的機(jī)械支持，其是胞間基質(zhì)的主要成分。HA在生物過程中還扮演 其它重要的角色，例如組織的潤濕和潤滑作用。
HA可從上迷天然組織中提取，盡管現(xiàn)今優(yōu)選通過微生物方法制備HA以 最小化傳遞傳染劑(infectious agent)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并且提高產(chǎn)品的均勻性、質(zhì) 量和可用性。
已將HA和它不同分子大小的級(jí)分和它們各自的鹽用作藥物，特別在治 療關(guān)節(jié)病方面；作為天然器官和組織的輔助和/或替代物，特別在眼科學(xué)和美 容手術(shù)方面；以及作為化妝品制劑中的試劑(agent)。也已開發(fā)乙酰透明質(zhì)酸 的產(chǎn)品用于整形外科學(xué)(orthopaedics)、風(fēng)濕病學(xué)(rheumatology)和皮膚病學(xué) (dermatology)。
HA還可用作用于衛(wèi)生和外科物品的多種聚合材料，例如聚氨酯、聚酯等 的添加劑，其具有使這些材料生物相容的效果。
由于生物聚合物用途的廣泛多樣性，特別是HA用途及其衍生物的廣泛 多樣性，其中某些在上文中提到，并且由于在藥用組合物或外科物品中HA 的頻繁使用以及適合于特定應(yīng)用的HA，通常有必要提供高純度的、應(yīng)在終產(chǎn) 品中基本上不存在其它污染組分的HA產(chǎn)品。所述聚合物的(特別是HA的) 非f么合物含量(non-polymer content)和離子纟且成(ionic composition)也是重-要 的。通常，HA的鈉鹽優(yōu)選作為最生物相容的形式，并且避免其它HA鹽(Fe, Ca, Cu， Zn, Al, Mg， Mn),特別是區(qū)的〔3++鹽。盡管在某些應(yīng)用中，偏愛 HA另外的鹽或創(chuàng)造反荷離子(counter ion)的受控平衡可能是期望的。例如， 受控的鈣水平在某些創(chuàng)傷護(hù)理應(yīng)用中確實(shí)是期望的，已提出將受控的鋅水平 用于抗擊足潰瘍(foot ulcer) (ref diabetologia Croatica 30-3, 2001)和用于抗菌性 質(zhì)(ActaPharmHung. 2002;72(1):15-24);有時(shí)將受控的鐵水平用于控制某些類 型的透明質(zhì)酸凝膠中的流變性質(zhì)(CN 1473572A; WO 95/04132),然而，低鐵 水平對(duì)于降低HA聚合物對(duì)降解的易感性通常是期望的。
就常規(guī)而言，主要具有鈉鹽為形式、低或無Ca十+含量且低或無其它金屬 離子含量的聚合物(包括HA)，是通過在發(fā)酵處理步驟期間和后續(xù)的純化步驟 期間謹(jǐn)慎地避免鈣和其它不想要的離子來提供。期望的離子平衡通常通過首
先創(chuàng)造高鈉離子濃度環(huán)境來達(dá)成，例如，通過添加鈉鹽諸如乙酸鈉、氯化鈉、 硫酸鈉等。將高鈉離子濃度用于從HA分子竟?fàn)幹脫Q鈣。然后可通過多種常
規(guī)聚合物分離方法的任一種，將從HA分子釋放的鈣離子從HA分子去除， 反之亦然。最普遍的情況是，將所述聚合物(或特別是HA)用化學(xué)方法和/或通 過添加有^/L溶劑如乙醇、異丙醇、丙酮、氯仿、CETAB等沉淀或結(jié)晶，由此 將釋放的并且不想要的離子留在上清液中(CZ 9700350; WO 84/ 03302; EP 0694616A2和EP 0144 019正是此方法的一些實(shí)例)。也可通過滲濾4支術(shù) (dia-filtration techniques)的超濾法將釋放的離子從聚合物分離(WO 95/04132; GB2249315A)。還可使用水提取(aqueous extraction)和其它普通聚合物分離技 術(shù)。
從聚合物置換不期望組分(通常是Ca十+)的其它方法包括使用螯合劑例如 EDTA、磷酸鹽的螯合(CN 85103674A)等，或應(yīng)用離子交換吸附樹脂(EP 0694616A2)。
依賴于所選的方法和所用的活性劑，上述技術(shù)中固有的缺點(diǎn)在于通常 需要重復(fù)應(yīng)用以達(dá)到期望的組分平衡(例如重復(fù)沉淀和重懸或廣泛滲濾 (extensive dia-filtration));和/或組分選擇性的貧乏；和/或組分的能力的貧乏； 和/或置換或螯合效率低；和/或方法引入了后續(xù)難以去除的和/或毒性的其它 組分；和/或工業(yè)生產(chǎn)液流(process stream)條件需要才喿縱以達(dá)到期望的組分平 衡。
因此，由于上述對(duì)于控制最終聚合物產(chǎn)品中組分平衡的常規(guī)手段的困難， 用于操作與聚合物相關(guān)的組分平衡的可替換的方法是期望的。本發(fā)明提供這 樣的方法，此外提供了如下所述的幾種優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明簡述
本發(fā)明在第一個(gè)方面提供用于控制在一種或多種聚合物中所選組分含量 的方法，其通過
(a) 將聚合物與至少一種分子篩接觸；和任選地
(b) 從分子篩分離聚合物。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供用于控制聚合物中不期望組分或所選組分含量的方法，其通
過去除所述組分或用更期望的組分置換該組分和/或通過操作與所述聚合物 相關(guān)的組分平衡來進(jìn)行。去除或操作組分通過將聚合物產(chǎn)品與合適的分子篩 接觸一段足以去除或交換或操作組分平衡的時(shí)間來進(jìn)行。在某些應(yīng)用中，將
分子篩留在聚合物產(chǎn)品中一起可能是方便的；然而，期望的是可將分子篩從 聚合物分離。
術(shù)語"聚合物"在本上下文中是由許多重復(fù)的較小的化學(xué)單元或分子組
成的物質(zhì)。聚合物可以是天然的或合成的。
在本上下文中，術(shù)語"聚合物"也包括液體聚合物或聚合物的懸浮液。 待去除或操作的"組分"包括原子、分子、離子或化合物。 在本上下文中，表述"控制"的意思是去除(完全地或部分地)、交換和/
或平衡聚合物中的組分含量或具有聚合物的液體中的組分含量。
分的許多應(yīng)用
i) 例如，對(duì)于生物相容性，透明質(zhì)酸優(yōu)選為鈉形式。此外，對(duì)具體應(yīng)用 的限定通常是期望的，例如，含鈣聚合物本身可以是不溶的(例如藻酸鈣 (calcium alginate))或可以在普通磷酸緩沖液中產(chǎn)生有問題的沉淀(problematic precipitation),或與活性成分或配制化學(xué)品(formulation chemical)產(chǎn)生有害反應(yīng) (adverse reaction)。相反，已經(jīng)指定了在某些應(yīng)用中受控的鈣水平，例如，指 定藻酸鹽用于傷口護(hù)理產(chǎn)品。類似地，F(xiàn)e、 Ca、 Cu、 Zn、 Al 、 Mg、其它離 子和其它組分。
ii) 離子含量和離子類型能夠影響聚合物的粘度和其它性質(zhì)；對(duì)于其它組 分類似。離子含量必需受到謹(jǐn)慎和精確的控制，例如，對(duì)于含鋅水凝膠的產(chǎn) 生。
iii) 可將聚合物去穩(wěn)、定分子(polymer destabilising molecule)諸如Fe和Cu
去除、控制或由其它較無害的離子取代。
iv) 聚合物產(chǎn)品通常需要去除氣味或顏色分子。
本發(fā)明提供許多相較于常規(guī)應(yīng)用的操作組分平衡的方法的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)本 發(fā)明的分子篩能夠應(yīng)用在制造過程的任何點(diǎn)上，包括應(yīng)用于原料；在制造期 間應(yīng)用或作為聚合物產(chǎn)品的后處理(post-treatment)。此外方法條件例如pH 、 溫度、聚合物濃度等不像在其它常規(guī)應(yīng)用的方法中 一樣關(guān)鍵
分子篩對(duì)于具體組分或組分的集合可以是高選擇性的。反應(yīng)平衡通常迅 速達(dá)到，意味著較快的處理和根據(jù)與聚合物相關(guān)的組分平衡較精密的產(chǎn)品特
性控制。分子篩顯示出對(duì)于待操作組分的高能力(capacity),并且因而通常僅 需要單獨(dú)的分子篩處理。分子篩簡單的添加、接觸和后續(xù)通過常規(guī)固-液分離 方法的去除，意味著無需專用設(shè)備并且無需后續(xù)去除可溶的反應(yīng)物或添加物。 可將分子篩留在聚合物溶液中，這進(jìn)一步筒化了方法。由于本發(fā)明的方法使 得含有終產(chǎn)品中不期望組分的原料能夠用于上游步驟中，例如將自來水(含 0&++)而非去離子水用于發(fā)酵和稀釋，因此還能夠?qū)⑻幚沓杀窘档?。此外，?常能夠?qū)⒎肿雍Y直接添加而無需預(yù)平衡或預(yù)處理。分子篩通常為低毒性。
高分子量污染物/雜質(zhì)
由于將本發(fā)明的方法應(yīng)用于從聚合物產(chǎn)品去除組分，因此甚至可在上游 處理步驟中添加組分而對(duì)于下游純化步驟不卩1起任何問題。
由于將本發(fā)明的方法方便地應(yīng)用于從聚合物產(chǎn)品去除鈣，因此甚至可在 上游處理步驟中添加0&++而對(duì)于下游純化步驟不引起任何問題。
鈣或其它二價(jià)鹽的添加使得在早期純化步驟中通過絮凝作用 (flocculation)來去除高分子量污染物/雜質(zhì)成為可能；同樣可能將這些雜質(zhì)從 感興趣的糖胺聚糖的無細(xì)胞制備物中去除。這在WO2004/001054有進(jìn)一步的 描述。在上游處理步驟期間添加組分的可能性，特別是添加鈣的可能性，構(gòu) 成了本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比的另 一個(gè)優(yōu)勢(shì)。
以上優(yōu)勢(shì)由本發(fā)明的方法提供，所述方法用于控制在 一 種或多種聚合物 中所選(通常是不期望的)組分的含量，其包括如下步驟
(a) 將聚合物與分子篩接觸；和任選地
(b) 從分子篩分離聚合物產(chǎn)品。
在本發(fā)明的上下文中"控制所選組分的含量"的意思是去除(完全地或部 分地)所述組分和/或用更期望的組分置換(交換)該組分和/或操作與所述聚合 物或具有聚合物的液體有關(guān)的組分的平衡。
"分子篩"在本發(fā)明的上下文中的意思是具有分子大小的孔的材料，能
夠用于將較大的分子與較小的分開。它們包括但不限于沸石、碳分子篩、硅 膠、活性氧化鋁(activated alumina)。通常而言，分子篩具有的晶格結(jié)構(gòu)產(chǎn)生 出籠樣結(jié)構(gòu)(cage like structure),其具有僅容許小于特定大小的分子的窗口 (window)。通過使用不同來源的材料和不同的制造條件，有可能產(chǎn)生不同進(jìn) 入尺寸(differing access dimensions)的一系列分子篩。具體分子篩的尺寸通常 可以是精確的，因?yàn)樗鼈冊(cè)醋运龊Y的晶體結(jié)構(gòu)。
一些可用于(admitted by)不同分子篩的分子的實(shí)例，連同有關(guān)分子篩的其 它纟田節(jié),在來自Chemical Engineering, Volume 2， 4th Edition ; JM Coulson and JF Richardson; Pergamon Press, 1991的"Classification of Some Molecular Sieves"的表17.3中給出。分子篩的相關(guān)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的更全面數(shù)據(jù)庫由 International Zeolite Association (http:〃www. iza-online.org/) 在 (http:〃www.iza-structure.org/databases/)上提供。分子篩相關(guān)的基石出教材包括 DW Breck: Zeolite Molecular Sieves, Wiley， New York, 1974; RM Barren Hydrothermal Chemistry of Zeolites, Academic Press, 1982; Intro to Zeolite Science and Practice, H van Bekkum, EM Flannigen， PA Jacobs and JC Jansen, Studies in Surface Science, Vol 137, 1-1060, (2001) Elsevier, Amsterdam。
在具體的實(shí)施方案中分子篩是沸石。沸石的經(jīng)典定義是一種結(jié)晶的、多
孔的鋁硅酸鹽(aluminosilicate)。然而，某些相關(guān)的近期發(fā)現(xiàn)是實(shí)質(zhì)上與經(jīng)典 沸石一樣的材料，但所述材料由具有硅和鋁之外的元素的氧化物結(jié)構(gòu)組成， 這擴(kuò)展了定義。事實(shí)上目前多數(shù)研究者將所有類型的多孔氣化物結(jié)構(gòu)包括在 ^也們對(duì)沸石的定義中，所述多孔氧化物結(jié)構(gòu)由于高度結(jié)晶性而具有明確定義 的孔結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的上下文中，將以上全部包含在術(shù)語"沸石"中。在這 些我們稱為沸石的結(jié)晶材料中，金屬原子(經(jīng)典情況下是硅或鋁)由四個(gè)氧陰離 子包圍以形成近似于四面體的結(jié)構(gòu)，所述四面體由中央的金屬陽離子和四個(gè) 頂點(diǎn)的氧陰離子組成。將所述四面體金屬筒稱為T原子，然后這些四面體以規(guī) 則排列堆疊，由此形成通道。發(fā)生堆疊的可能方式實(shí)質(zhì)上是無限的，并且已 知^:百種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。
沸石通道(或孔)在顯微鏡下是小的，事實(shí)上其具有分子大小的尺寸，由此 它們通常以術(shù)語"分子篩"表示。通道的大小和形狀對(duì)于這些材料吸附過程 的性質(zhì)具有不同尋常的影響，并且這種性質(zhì)導(dǎo)致它們?cè)诜蛛x過程中的用途。 通過與組分在孔中可能的方向有關(guān)的形狀和大小效應(yīng)，和/或通過吸附強(qiáng)度的 不同，能夠?qū)⑺鼈兎珠_。因而能夠?qū)⒔M分選擇性地去除。
由于硅通常以4+氧化態(tài)存在，硅-氧四面體為電中性。然而在沸石中，鋁 通常以3+氧化態(tài)存在；因此4呂-氧四面體形成缺乏一個(gè)電子的中心。因此，沸
石骨架(framework)通常為陰離子型，而補(bǔ)償電荷的陽離子聚集于(populate)孔 以維持電中性。
在本發(fā)明具體實(shí)施方案中，分子篩選自沸石的組，其中材料的多孔性與 待去除的組分相符，在另外的實(shí)施方案中，材料的多孔性與0&++相符；在另 外的實(shí)施方案中，聚集于沸石孔以維持電中性的離子是在聚合物產(chǎn)品中期望 的那些離子；在另外的實(shí)施方案中，鈉離子是聚集于沸石孔以維持電中性的離子。
經(jīng)典分組為"4型"("Type 4")的那些分子篩具有適合于鈣離子螯合的分 子篩尺寸，其具有大約0.4nm的Linde篩4A尺寸。許多這些分子篩都具有聚集 于沸石孔以維持電中性的鈉離子。
因而在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，沸石是4型沸石。在另外的實(shí)施方案中， 分子篩的孔含有鈉離子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物是生物聚合物(biopolymer)。"生物 聚合物"是在生物體系中形成的任何聚合物質(zhì)(實(shí)例為，但不限于多糖、蛋白 質(zhì)、核酸等)。存在許多普通生物聚合物的實(shí)例，包括但不限于殼聚糖 (Chitosan)、葡聚糖、角蛋白、纖維素、明膠(gelatine)、糖胺聚糖和所有這些 聚合物的衍生物。
在具體的實(shí)施方案中，生物聚合物是多糖，并且在另外的具體實(shí)施方案 中，多糖是糖胺聚糖。
糖胺聚糖
根據(jù)本發(fā)明，糖胺聚糖可以是任何糖類聚合物，其具有至少700道爾頓的 分子量；優(yōu)選至少10,000道爾頓的分子量；更優(yōu)選至少20,000道爾頓的分子量； 甚至更優(yōu)選至少30,000道爾頓的分子量。
優(yōu)選的糖胺聚糖是透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、軟骨素(未硫酸化)、肝素 (heparin)、硫酸肝素、硫酸皮膚素和硫酸角蛋白(keratin sulphate)。透明質(zhì)酸由 交替和重復(fù)的D-葡糖醛酸(D-glucoronic acid)和N-乙酰-D-葡糖胺單元構(gòu)成，以 形成具有多至15,000,000道爾頓的分子量的線性鏈。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的糖胺聚糖是具有從700道爾頓至15,000,000道爾頓分子 量的糖胺聚糖。
應(yīng)該注意到的是本申請(qǐng)和權(quán)利要求書中的術(shù)語"透明質(zhì)酸"可以無差別 地指其酸形式或其鹽形式的透明質(zhì)酸，例如透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明 質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鈣或其它。
術(shù)語"乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan)"或"透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)"用于 文獻(xiàn)中的意思是具有不同分子量的酸性多糖，其由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺的殘基構(gòu)成，其天然存在于細(xì)胞表面，脊推動(dòng)物結(jié)締組織的基本胞外 物質(zhì)，關(guān)節(jié)的滑液，目艮內(nèi)球液(endobulbar fluid),人臍帶組織(human umbilical cord tissue)和雞冠(cocks' comb)中。
術(shù)語"透明質(zhì)酸，，事實(shí)上通常用來指具有不同分子量的帶有交替的D-葡 糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺殘基的全系列多糖，或甚至其降解的級(jí)分，并且因 此看上去4吏用復(fù)凄史術(shù)語"透明質(zhì)酸(hyaluronic acids)"更加正確。然而該單凄t 術(shù)語將仍然用在本說明書中；另外，將頻繁地使用縮寫"HA"以代替此集合 術(shù)語。
生物聚合物例如糖胺聚糖(glucosaminoglucan),能夠從動(dòng)物組織提供，或 發(fā)酵液(fermentation broth)
糖胺聚糖可以從任何發(fā)酵液獲得。糖胺聚糖另外還可為通過包括培養(yǎng)宿 主細(xì)胞的方法產(chǎn)生的糖胺聚糖。
宿主細(xì)胞優(yōu)選可以是微生物。所述微生物可以是單細(xì)胞微生物，例如原 核生物；或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。有用的單細(xì)胞的細(xì)胞是細(xì)菌細(xì) 胞，例如革蘭氏陽性細(xì)菌，其包括但不限于芽孢桿菌屬(Sa"'〃船)細(xì)胞，例如， p耆石咸芽3包才干菌(i acz7/ws "汰a/op/zz7w力、解^定4分芽孑包^干菌(5acz'〃z^s amj;/o/z々m咖c/em1) 、 4豆芽孑包才干菌(Sac〃/z^ 6rev/力、玉不^!大芽孑包斥干菌(5oc/〃船 c/rcw/am1)、 克勞氏芽孑包4干菌C6oc/〃i c/atm'z')、)疑結(jié)芽孑包4干菌(St c/7/w,y coagw/am1)、 堅(jiān)強(qiáng)芽孑包才干菌(/^c/〃z^ //>mz )、 ；i:山'爛芽孑包沖干菌(/^c,'〃z^ /"zy/w)、 遲緩芽孑包桿菌C6ac/〃"s /e"似力、地衣芽孢桿菌(B(3"7/z^ //c/zem/or"^)、 巨大芽 孑包桿菌0B(3"'〃m1 megafen'ww)、短小芽孑包對(duì)干菌(Sacz7/^ ; mwz7m力、嗜熱月旨肪芽孑包 才亍菌(5(3cz7/ws 5tearaf/2wmop/7//ws)、沖古草芽孑包才干菌("acz'〃船sw6"fo)禾口蘇云金芽 孑包桿菌(i (3c/〃z^ Awn'wg7'em、;或鏈霉菌屬(5Yreptow，w)纟田月包，例如，淺青紫 鏈霉菌(tSV'"to7"ces /z'v/c/ora)或灰鼠鏈霉菌(5Vrepto",&s1 m鵬."—，或革蘭氏 陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種(尸^w^mo"w sp.)。在具體的實(shí)施
方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌細(xì)胞、地衣芽孢桿菌細(xì)胞、嗜熱脂肪 芽孢桿菌細(xì)胞或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。尤其適合于重組表達(dá)的突變枯草芽孢桿
菌細(xì)胞在WO 98/22598中描述。
宿主細(xì)胞可以是真核生物，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或 真菌細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國倉鼠卯巢(Chinese hamster ovary; CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)月包、幼小倉鼠腎(baby hamster kidney; BHK)細(xì)胞、COS細(xì) 胞，或任何許多其它可用的無限增殖化細(xì)胞系，例如來自美國典型培養(yǎng)物保 藏中心(American Type Culture Collection)。轉(zhuǎn)化方法、選4奪標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu) 建體的任何其它部分可選自本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并且能夠獲得的那些。
宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。"真菌"用于本文包括子嚢菌門(Ascomycota)、 擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和才妄合菌門(Zygomycota), 以及卵菌門(Oomycota)和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporic flmgi)。子囊菌門 的4戈表類群(group)包4舌，例如月永孑包菌屬(jVewrcw/ ora)、正青霉屬(￡^;^"/"7//"/77) (二青霉屬(尸e"z'c/〃z'wm))、五men.ce〃a (二曲霉屬(74s/ ergi〃M力)、散嚢菌屬(五wn9"MW) (二曲霉屬)和以下所列的真酵母(true yeast)。擔(dān)子菌門的實(shí)例包括蘑菇 (mushroom)、銹菌(mst)和黑粉菌(smut)。壺菌門的代表類群包括，例如異水 霉屬(/(〃謹(jǐn)yces1)、 小芽枝霉屬(i Azytoc/a(i/e〃a)、 雕蝕菌屬(Coe/函簡yc&s)禾口水 生真菌(aquatic fungi)。卯菌門的代表類群包括，例如Saprolegniomycetous水生 真菌(水霉)諸如綿霉屬(^c/7/戸)。有絲分裂孢子真菌的實(shí)例包括曲霉厲、青霉 屬、念珠菌屬(OwA&)和鏈格孢屬(」/fer"an'a)。接合菌門的代表類群包括， 例如根霉屬(i /n'zcpw》和毛霉屬(Mwco。。
真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。"酵母"用于本文包括產(chǎn)子嚢酵母 (ascosporogenous yeast)(內(nèi)孑包霉目 (Endomycetales))、 產(chǎn)擔(dān)子酵母 (basidiosporogenous yeast)牙口屬于半^口菌類(Fungi Imperfecti)(芽孑包纟岡 (Blastomycetes))的酵母。產(chǎn)子嚢酵母分為蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母 科(Saccharomycetaceae)。后者由四個(gè)亞科組成，分別為裂殖酵母亞科 (Schizosaccharomycoideae)(侈'H口, 裂歹直酵母屬(5b/n'zoyacc/zaramyces))、'拿遜酵 母亞牙牛(Nadsonioideae)、 油月旨酵母亞牙牛(Lipomycoideae)禾口Saccharomycoideae (例如，克魯維酵母屬(《/t^verawyce"、畢赤酵母屬(Pz'c/z/a)和釀酒酵母屬 (cSVz6'c/wraw〕T(^s'))。
產(chǎn)4旦子i酵母包4舌白冬孑包酵母屬(Aewc'as7W/'^7w)、纟工冬孢酵
母屬(7 /zo(ias/7or/fi^w )、 4貞扭卩酵母屬(S/ w,'(37o6o/M"、 網(wǎng)孑包菌屬(f7/o/，o,w'fl7w") 和線黑粉菌屬(77//0^ ^&//"。屬于半知菌類的酵母分為兩科，擲孢酵母科 (Sporobolomycetaceae)(例長口扭F孑包酵母屬(Spo廠o6o/cw少c^y)牙口布萆力5單孑包酵母屬 (Sw〃era))和隱球菌科(Cryptococcaceae)(例如，念J朱菌屬)。
在另外的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包 括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亞門的所有絲狀形式。絲狀真菌的特征在 于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖(mannan)和其它復(fù) 雜多糖所組成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長通過菌絲延長進(jìn)行，并且碳分解代謝是 專性需氧的。與此相反，酵母諸如釀酒酵母(6bcc/Mrram;;c" cerev&'ae)的營養(yǎng) 生長則通過單細(xì)胞菌體(unicellular thallus)的芽殖(budding)進(jìn)行，碳分解代謝 可以是發(fā)酵的。在更具體的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是，但不限于以 下菌屬菌種的纟田刀包4支頂孑包霉屬(力c廠e"70〃/ww)、 曲霉屑j、 鐮孑包屬(F".w/〃w)、 腐質(zhì)霉屬(//"加'"乂")、毛霉屬、毀絲霉屬(A^ce〃o/9/7/Z7ora)、脈孢菌屬、青霉屬、 才炎孑包殼屬(772/e/flv/a)、 彎頸霉屬(7b(ypoc/"(i/w/w)禾口木霉屬(7h,c/zo(ie廠ma)。
可將真菌細(xì)胞以本身已知的方式通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 和細(xì)胞壁再生的方法來轉(zhuǎn)化。
將產(chǎn)生感興趣的糖胺聚糖的微生物使用本領(lǐng)域已知方法培養(yǎng)在適合于產(chǎn) 生所述糖胺聚糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。例如，可將所述微生物通過在實(shí)驗(yàn)室中或 工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括但不限于連續(xù)、分 批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)。在包含碳源和氮源和無機(jī)鹽的合適的營養(yǎng) 培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以從商業(yè)供應(yīng) 者獲得，或可以根據(jù)已公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄 中)制備。作為產(chǎn)生在微生物中產(chǎn)生的糖胺聚糖的實(shí)例，WO2003/054163描述 了在芽孢桿菌宿主細(xì)胞中透明質(zhì)酸的產(chǎn)生。
如上所述，用于產(chǎn)生具有期望組分平衡的純化糖胺聚糖(例如鈉鹽形式的 透明質(zhì)酸)的傳統(tǒng)方法或過程包括
-在富含鈉離子的環(huán)境中沉淀聚合物；
-在富含鈉離子的環(huán)境中結(jié)晶；
-沉淀不想要的組分，例如用磷酸鹽(phosphate)并且應(yīng)用富含鈉離子的環(huán)境。
-在富含鈉離子的環(huán)境中透析或滲濾；
-螯合并且應(yīng)用富含鈉的環(huán)境；和
-用于聚合物純化的其它常規(guī)手段。
與用于去除鈣的已知方法有關(guān)的一個(gè)問題是它們幾乎總是引入可溶污染 物，該污染物需要由其它處理步驟來去除。此外這些方法經(jīng)常使用后續(xù)難以 從產(chǎn)品中去除并且可能對(duì)最終應(yīng)用有毒或有害的化學(xué)沉淀劑或其它輔助劑
(aids)。這符合例如在過量鈉離子存在下鈣的竟?fàn)幹脫Q的情況。需要將置換的 鈣和過量的鈉反荷離子去除。同樣的情況是在使用螯合劑例如EDTA時(shí)。必需 隨后將EDTA去除。用所述磷酸鹽沉淀鈣離子也需要將過量沉淀劑以及形成的 沉淀去除。
這些處理步驟較不易于控制，因?yàn)榉磻?yīng)平衡隨著可溶組分濃度的改變而 改變，達(dá)到反應(yīng)平衡通常相對(duì)較慢，組分的被操作能力通常相對(duì)較低，所述 技術(shù)僅在小范圍的處理?xiàng)l件(例如pH、離子強(qiáng)度、聚合物濃度等)下起作用。 此外它們通常是費(fèi)時(shí)的并且需要多于一種方法(application),其使得產(chǎn)品易受 降解的影響，且并非選擇性或有效控制產(chǎn)品中組分平衡的方法。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法/過程包括如下步驟將待修飾的聚合物或具有聚 合物的液體與合適類型的分子篩在合適條件下接觸；和如有必要，從聚合物 分離分子篩。
待修飾的具有聚合物的液體同分子篩之間的接觸可通過多種方法中的任 一種來完成，所述方法包括但不限于 簡單的懸浮或混合在一起
使具有聚合物的液體通過填充的(packed)、沉降的(settled)、膨脹的 (expanded),流化的(fluidised)分子篩床層(bed)。
與用作主體加料(body feed)、預(yù)涂層(pre-coat)或過濾輔助劑(aid of filtration)的分子篩接觸。
在聚合物產(chǎn)品中達(dá)到期望的組分平衡所需的分子篩的類型、數(shù)量和接觸 條件能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員簡單地確定。
根據(jù)本發(fā)明的待去除或操作的組分包括原子、分子、離子或化合物。能 夠通過具體分子篩類型去除的組分的實(shí)例包括但不限于，在Chemical Engineering, Volume 2, 4lh Edition ; JM Coulson and JF Richardson; Pergamon Press, 1991的"Classification of Some Molecular Sieves"的表17.3中給出的那些。 分子篩的相關(guān)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的更全面凄t據(jù)庫由International Zeolite Association
(http :〃www. iza-online org/)在(http :〃www. iza-structure. org/databases/)上提供。 分子篩相關(guān)的基礎(chǔ)教材包括
* DW Breck: Zeolite Molecular Sieves, Wiley， New York, 1974
* RM Barren Hydrothermal Chemistry of Zeolites, Academic Press, 1982
* Intro to Zeolite Science and Practice, H van Bekkum, EM Flannigen, PA Jacobs and JC Jansen, Studies in Surface Science, Vol 137, 1-1060, (2001) Elsevier, Amsterdam
具體而言，沸石能夠用于控制(去除或搡作)有機(jī)溶劑(包括但不限于醇、 醛、酮等)、金屬離子、陰離子、季銨化合物、SDS、 EDTA、 CETAB、 TCA、 氯化十六烷基吡啶鐵(cetyl pyrimidine chloride)等的含量。
具體而言，分子篩能夠用于去除或操作離子平衡，更具體而言陽離子的 平衡。
在一個(gè)實(shí)施方案中，離子是二價(jià)離子，更具體而言是Ca+、
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用分子篩來控制聚合物中鈣離子含
量的方法。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用分子篩來控制聚合物中的鈣和鈉 離子含量的方法。
可將待去除或部分去除的組分懸浮在包含聚合物的液體中，或可將組分 結(jié)合或存在于聚合物上。
在另外的實(shí)施方案中，將組分交換成另外的組分。例如可將Ca離子交換 成Na離子。
在另外的實(shí)施方案中，產(chǎn)品中的組分平衡受到控制。 在具體的實(shí)施方案中，分子篩是沸石。
"合適的條件"在本文中的意思是用于實(shí)現(xiàn)組分去除或操作的工業(yè)生產(chǎn) 液流(process stream)的那些條件和能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員簡單決定的那些條 件。合適的條件可包括但不限于分子篩類型、分子篩劑量(molecular sieve dosing)、溫度、pH、聚合物濃度、離子強(qiáng)度、溶劑濃度、混合、溫育時(shí)間等。 在更具體的實(shí)施方案中，聚合物是糖胺聚糖。
可通過多種方法中的任一種將分子篩從聚合物去除，所述方法例如但不 限于過濾、離心、浮選(floatation)、沉降、相排阻(phase exclusion)等。在某
些情況下，可能不需要去除，或?qū)⒎肿雍Y留在具有聚合物的液體中是期望的。 可將本發(fā)明的具體的組分去除或操作方法進(jìn)行最優(yōu)化或改進(jìn)，其通過例
如但不限于操作pH、溫度、粘度、濃度、混合、離子強(qiáng)度、添加劑、成分 等。可在相同的具有聚合物的液體中處理多于一種聚合物。可將多于一種類 型的分子篩與具有聚合物的液體接觸?？蓪⒍嘤谝环N使用分子篩的處理用于 操作具有聚合物的液體。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供使用合適的沸石對(duì)具有聚合物 的液體中離子的控制(去除、交換和/或平衡)。具體而言，所述聚合物是糖胺 聚糖。
在更具體的實(shí)施方案中，所述聚合物是透明質(zhì)酸。 本身離子含量的控制。具體而言，所述聚合物是透明質(zhì)酸。 身鈣和鈉離子含量的控制。具體而言，所述聚合物是透明質(zhì)酸。
實(shí)施例
實(shí)施例l無《丐去除階段的透明質(zhì)酸純化
在本實(shí)施例中，將由重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵獲得的5 g/l透明質(zhì)酸溶液用 普通自來水稀釋，并且過濾以去除宿主細(xì)胞。隨后將濾出液相對(duì)于去離子水 廣泛地(extensively)滲析以去除大多數(shù)不在HA分子本身上的游離鈣。所得滲析 產(chǎn)品含有相對(duì)于透明質(zhì)酸質(zhì)量4.4 wt。/o的4丐。
實(shí)施例2具有常規(guī)的通過對(duì)鈉鹽滲濾的釣去除階段的透明質(zhì)酸純化 在本實(shí)施例中如實(shí)施例1中所述獲得透明質(zhì)酸。引入釣控制步驟(不涉及 本發(fā)明的分子篩)，所述步驟涉及在過量鈉離子存在下鈣的竟?fàn)幹脫Q，如下
將透明質(zhì)酸溶液相對(duì)于過量鈉離子滲濾。由此將釋放的鈣離子通過流經(jīng) 滲濾膜而從溶液中去除。從透明質(zhì)酸釋放的鈣離子可能已經(jīng)通過聚合物沉淀 等同地(equally)去除。在目前的情況中，將透明質(zhì)酸溶液相對(duì)于3x體積的10 wt。/。辟iJ菱鈉溶液以恒定體積(at constant volume)滲濾，然后相對(duì)于去離子水進(jìn) 行廣泛透析以去除過量硫酸鹽和鈉離子。所得產(chǎn)品含有相對(duì)于透明質(zhì)酸1.2
Wt。/o的4丐。
實(shí)施例3使用陽離子交換樹脂控制透明質(zhì)酸的鈣含量
如上實(shí)施例1中所述產(chǎn)生透明質(zhì)酸。將鈉離子形式的具有SCV (> 2 eq/l)的 強(qiáng)陽離子交換樹脂用于操作聚合物的鈣離子含量。
交換樹脂的性能由在前文所述整個(gè)透明質(zhì)酸制造和純化方法中很可能遇 到的一系列情況來定性。
在一個(gè)實(shí)例中，將L0wt。/。交換樹脂添加至0.5 wt。/。的透明質(zhì)酸溶液，所述 溶液含有相對(duì)于透明質(zhì)酸2wt。/。的鈣。在攪拌溫育120分鐘之后，將樹脂從溶 液中過濾。所得含有透明質(zhì)酸的濾出液具有的鈣含量是相對(duì)于透明質(zhì)酸0.5 wt。/。的4丐。在相同條件下溫育240分鐘之后，相對(duì)于透明質(zhì)酸的鈣含量在檢出 值以下(below detection)。
實(shí)施例4使用陽離子交換凝膠控制透明質(zhì)酸的鈣含量
如上實(shí)施例1中所述產(chǎn)生透明質(zhì)酸。將具有磺化官能團(tuán)(2.05 eq/l)的強(qiáng)陽離 子交換凝膠用于操作聚合物的鈣離子含量。
交換凝膠的性能由在前文所述整個(gè)透明質(zhì)酸制造和純化方法中很可能遇 到的一系列情況來定性。
在一個(gè)實(shí)例中，將0.25 wt。/。交換凝膠添加至0.5 wt。/。透明質(zhì)酸溶液，所述 溶液含有相對(duì)于透明質(zhì)酸2 wt。/。的鈣。將混合物攪拌溫育并且使其在l小時(shí)中 達(dá)到平衡。將凝膠從溶液中過濾。所得含有透明質(zhì)酸的濾出液具有的鈣含量 是相對(duì)于透明質(zhì)酸0.3 wt。/。的鈣。在相同條件下，lwt。/。鈉形式的交換凝膠將相 對(duì)于透明質(zhì)酸的鈣含量降低至檢出值以下。
在另外的中試規(guī)模實(shí)例(pilot scale example)中，將0.5 wt。/。鈉形式的交換 凝膠不經(jīng)預(yù)處理添加至0.7 wt。/。透明質(zhì)酸溶液中，所述溶液含有211 ppm鈣。， 將所述混合物攪拌溫育2小時(shí)，然后將凝膠從溶液過濾。所得濾出液含有相對(duì) 于透明質(zhì)酸14ppm的鈣，其精確對(duì)應(yīng)于在相同條件下的小試規(guī)模實(shí)驗(yàn)(bench scale experiment)。在相同條件下，1 wt%的交換凝膠將相對(duì)于透明質(zhì)酸的4丐含 量降低至檢出值以下。
將用lwt。/。鈉形式的交換凝膠處理的起始材料和濾出液相對(duì)于去離子水 透析以去除游離離子。由分析所得透明質(zhì)酸發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸上的離子在用 1 wt。/。鈉形式的交換凝膠處理之后，已經(jīng)被鈉離子置換。
實(shí)施例5使用陽離子交換凝膠降低發(fā)酵液中的鐵
凝膠類型是強(qiáng)陽離子交換劑，其具有磺酸鹽(sulphonate)(2.05 eq/l)官能團(tuán)。
將過量離子交換凝膠用于降低發(fā)酵液中的鐵水平。已證明諸如鐵、銅等 離子降低透明質(zhì)酸對(duì)降解的穩(wěn)定性。
將含透明質(zhì)酸的粗發(fā)酵液(raw fermentation broth)通過用普通自來水稀釋 和去除微生物的過濾來澄清。隨后將這種澄清的肉湯與過量(IO Wt。/o)的交換 凝膠一起溫育和攪拌l小時(shí)。然后將交換凝膠從溶液中過濾。與澄清培養(yǎng)液中 的0.4 wt% (相對(duì)于透明質(zhì)酸)相比，發(fā)現(xiàn)濾出液的鐵含量在檢出值以下(< 1 ppm，相對(duì)于透明質(zhì)酸)。
接著將原始的澄清培養(yǎng)液和經(jīng)過處理以去除^t的培養(yǎng)液進(jìn)行熱處理?？?br> 液材料相比基本上更加熱穩(wěn)定。
對(duì)澄清培養(yǎng)液的處理不改變分子量分布或所含透明質(zhì)酸的濃度。 發(fā)現(xiàn)其它處理液體和組分能夠用類似于實(shí)施例3和4所示的應(yīng)用和方法來
控制。從澄清發(fā)酵液去除組分穩(wěn)定了透明質(zhì)酸的對(duì)熱降解。
實(shí)施例6使用鈉形式粉狀硅酸鋁4A型沸石控制透明質(zhì)酸的4丐含量和用 鈉離子置換透明質(zhì)酸上的離子
如上實(shí)施例1產(chǎn)生透明質(zhì)酸。將粉狀鈉形式4A型沸石用于操作聚合物的 鈣離子含量。
交換樹脂的性能由在前文所述整個(gè)透明質(zhì)酸制造和純化方法中很可能遇 到的一系列情況來定性。將所述特性以小試規(guī)模和中試規(guī)模二者重現(xiàn)，并且 測試了如實(shí)施例1中產(chǎn)生的多批透明質(zhì)酸。
當(dāng)將二者接觸時(shí)，發(fā)現(xiàn)每毫克沸石能夠從具有透明質(zhì)酸的溶液中去除大
溫度、HA濃度等)。這使得通過簡單的劑量添加沸石控制具有透明質(zhì)酸的溶 液中的鈣水平非常簡單。在所有情況下，平衡在少于15分鐘內(nèi)達(dá)到。
添加而與含有142ppm鈣的透明質(zhì)酸溶液接觸。20分鐘攪拌溫育之后，將沸石 從溶液中過濾。所得濾出液含有14 ppm鈣。在相同流程下與0.3 wt。/o沸石接觸
17
分析透明質(zhì)酸起始材料和其用0.3Wt。/。粉狀沸石處理后。發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸上
的離子在用0.3wt。/。沸石處理之后，已經(jīng)由鈉離子置換。
透明質(zhì)酸的處理不改變分子量分布或濃度，并且對(duì)經(jīng)過處理的透明質(zhì)酸 的詳細(xì)表征顯示無有害改變。
發(fā)現(xiàn)從含有透明質(zhì)酸的溶液中去除鈣的程度能夠重現(xiàn)性地預(yù)測和控制。
將透明質(zhì)酸上的離子通過鈉離子置換。對(duì)于透明質(zhì)酸不存在損害作用(adverse effect)。
實(shí)施例7使用鈉形式粉狀硅酸鋁4A型沸石減少發(fā)酵液中的鐵 已證明諸如鐵、銅等離子降低透明質(zhì)酸對(duì)降解的穩(wěn)定性。將過量鈉形式 的粉狀硅酸鋁4A型沸石用于降低發(fā)酵液中的鐵水平。
將從重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵獲得的粗發(fā)酵液用普通自來水稀釋，并且 過濾去除宿主細(xì)胞，以提供含有24ppm鐵離子的3.5g/l透明質(zhì)酸溶液。隨后將 澄清的培養(yǎng)液與過量(3 wt。/。)的粉狀沸石一起溫育并攪拌l小時(shí)。隨后將沸石 從溶液中過濾。發(fā)現(xiàn)濾出液的鐵含量在檢出值以下(< lppm,相對(duì)于透明質(zhì)
上更加熱穩(wěn)定。
對(duì)澄清培養(yǎng)液的處理不改變所含透明質(zhì)酸的分子量分布或濃度。
實(shí)施例8使用鈉形式粒狀4A型沸石控制透明質(zhì)酸的鈣含量和用鈉離子 置換透明質(zhì)酸上的離子
粒狀沸石對(duì)于4丐離子去除和使用鈉離子置換的性能由在前文所述整個(gè)透 明質(zhì)酸制造和純化方法中很可能遇到的一系列情況來定性。將所述特性以小 試規(guī)模和中試規(guī)模二者重現(xiàn)，并且測試了如實(shí)施例1中產(chǎn)生的多批透明質(zhì)酸。
通常而言，當(dāng)將粒狀4A型沸石與具有透明質(zhì)酸的溶液接觸時(shí)，每毫克這 種粒狀4A型沸石能夠從具有透明質(zhì)酸的溶液去除大約0.1 mg鈣。認(rèn)為這種比 率在很大程度上不依賴于所用的處理?xiàng)l件。這使得控制具有透明質(zhì)酸的溶液 中的4丐水平非常簡單。在所有情況下平衡在少于l O分鐘內(nèi)達(dá)到。
在通常的實(shí)例中，將0.2 wt。/o的粒狀沸石與含有220 ppm4丐的透明質(zhì)酸溶 液接觸。20分鐘攪拌溫育之后，將沸石從溶液中過濾。所得濾出液含有20ppm 鈣。在相同條件下與0.25 wt。/。沸石(II)接觸將鈣降低至檢出限以下。
分析來自起始材料的透明質(zhì)酸和來自用0.25 wt。/。的粒狀沸石處理的濾液 的透明質(zhì)酸。發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸上的離子在用0.25 wt。/。沸石處理之后，已經(jīng)被鈉 離子置換。
對(duì)透明質(zhì)酸的處理不改變分子量分布或濃度，并且對(duì)已經(jīng)處理的透明質(zhì) 酸的詳細(xì)表征顯示無有害改變。
發(fā)現(xiàn)從含有透明質(zhì)酸的溶液中去除釣的程度能夠重現(xiàn)性地預(yù)測和控制。 將透明質(zhì)酸上的離子通過鈉離子置換。對(duì)于透明質(zhì)酸不存在損害作用。
權(quán)利要求
1.一種用于控制在一種或多種聚合物中所選組分含量的方法，其通過(a)將所述聚合物與至少一個(gè)分子篩接觸；和任選地(b)從分子篩分離所述聚合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述將受到控制的組分包括原子、分子、 離子或化合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述組分是離子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述離子是二價(jià)離子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述二價(jià)離子是0&++。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)的方法，其中將所述組分從包含所述聚合物的 液體中去除或部分去除。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中將所述組分從所述聚合物中去除 或部分去除。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)的方法，其中將所述組分交換成另外的組分。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)品中的組分平衡受到控制。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中將03++交換成其它組分。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中將0&++交換成鈉。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中將0&++交換成鈉，并且所述聚合物的鈣 形式和鈉形式的比率受到控制。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物是生物聚合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述生物聚合物是多糖。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述多糖是糖胺聚糖。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述糖胺聚糖包含透明質(zhì)酸、硫酸軟 骨素、軟骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸皮膚素和硫酸角蛋白或它們的衍生物。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述分子篩是沸石。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述沸石包含4型沸石。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法，其中所述分子篩的孔包含鈉離子。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述在聚合物和分子篩之間 的接觸通過以下提供i)懸浮或混合；ii)使具有所述聚合物的液體通過分子篩 的填充的、沉降的、膨脹的、或流化的床層；或iii)與用作主體加料、預(yù)涂層
全文摘要
本發(fā)明在第一方面提供用于控制在一種或多種聚合物中所選組分含量的方法，通過(a)將聚合物與至少一種分子篩接觸；和任選地(b)從分子篩分離聚合物。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101171265SQ200680015338
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2006年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月4日
發(fā)明者埃里克·思韋茨, 波爾·巴赫, 馬丁·巴福德 申請(qǐng)人:諾維信生物聚合物公司