專利名稱：：包囊體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種包囊體系，包括用于活細胞的免疫隔離或治療的藻酸鹽生物膠囊。特別地，但不唯一地，包囊體系可以用于同種異體或異種移植。本發(fā)明也涉及制造和使用包囊體系的方法。
背景技術(shù)：
：細胞移植在實驗和臨床上日益取得更大成功。一種細胞移植的迭代(iteration)受益于材料科學、細胞生物學、和藥物輸送的發(fā)展以發(fā)展微囊包封和大囊包封(micro-andmacro-encapsulated)的細胞治療平臺。這些包括二維和三維組織工程構(gòu)造，其包括不易侵蝕的(nonerodible)熱塑性聚合物、生物可侵蝕(bioerodible)材料、和雜種組合。這些構(gòu)造使得用于急性或慢性疾病處理的治療分子可以受控制地輸送，但是由于需要經(jīng)常施用可侵蝕材料，和不可降解材料的恢復(retrieval)和慢性生物相容性組織而得不到廣泛使用。在生物可降解材料的情況下，包囊的細胞治療的成功很大程度上依賴于材料穩(wěn)定性的理解，一旦移植，最終穩(wěn)定性怎樣沖擊移植(graft)的能力以支持細胞存活、蛋白質(zhì)分泌和擴散、免疫隔離(immimoisolation)、生物相容性、物理布置和固定、降解、和分泌產(chǎn)物的效力和藥效學。用于這種細胞治療的生物膠囊的最普通的材料是藻酸鹽，一種生物可侵蝕碳水化合物。很久以來藻酸鹽作為生物材料在生理和治療應(yīng)用中得到廣泛的研究。其作為生物相容性移植材料的潛力首先在1964年在人工擴展血漿容積(plasmavolume)的外科應(yīng)用中得到開發(fā)(1)。十多年以后，藻酸鹽作為細胞載體的基體功能在生物體的一系列實驗中得到認識，所述的實驗說明微生物細胞存活23天(2)。在過去的20年間，用于糖尿病(3-10)、慢性疼痛(11)、血友病(12;13)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)紊亂(14-24)及其它的治療的藻酸鹽細胞微囊包封已經(jīng)取得了很大的進步。盡管在許多的動物模型(animalmodel)中和有限的臨床同種異體移植(allotransplantation)中取得成功，已經(jīng)存在變化的降解動力學沖擊擴散、免疫隔離，且最終導致移植成活的損失和排斥。已經(jīng)進行一些良好設(shè)計的研究以表征和控制藻酸鹽在體外(25-30)和體內(nèi)(31;32)降解的某些方面，但是從嚴格的材料觀點上講藻酸鹽-聚陽離子膠囊在體內(nèi)穩(wěn)定性通常的理解是有限的，且這反之又限制了它們的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是有利于進一步理解藻酸鹽-聚陽離子生物膠囊的穩(wěn)定性，以生產(chǎn)體內(nèi)應(yīng)用的更穩(wěn)定的生物膠囊，和/或為公眾提供有用的選擇。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明概要本發(fā)明涉及生物耐久(biodurable)組合物，其包括含有高的甘露糖醛酸含量的藻酸鹽，和用于生產(chǎn)微膠囊的多分散性指數(shù)<1.5的聚陽離子。這些微膠囊可以通過標準方法生產(chǎn)。本發(fā)明的組合物比已知的組合物更有優(yōu)勢，因為它可以用來生產(chǎn)比已知的微膠囊更耐久的微膠囊，因此如果用膠囊封包異種細胞(discordantcell)，就可以延長針對宿主免疫系統(tǒng)的保護。在本文中這說明，為何對包括本發(fā)明的組合物的微膠囊觀察到降低的體內(nèi)降解速率。微膠囊也表現(xiàn)出增強的表面形態(tài)，且可以在之前為高炎癥位置施用，如下所述。第一方面，本發(fā)明提供一種組合物，包括含有約50%至約95%，優(yōu)選約50%至約90%，更優(yōu)選約50%至約70%，和最優(yōu)選約60%至約70%的甘露糖醛酸殘基的藻酸鹽，和如聚-L-鳥氨酸的聚陽離子。在一個優(yōu)選的具體實施方式中，高甘露糖醛酸藻酸鹽和聚陽離子的比率為約5:1至約10:1，優(yōu)選約7:1。此外，本發(fā)明的組合物可包括氯化鈣和氯化鈉。在一個具體實施方式中，該組合物可包括高甘露糖醛酸藻酸鹽，濃度為約80%至約90%，優(yōu)選約85%至約90%，更優(yōu)選約87%;聚-L-鳥氨酸，濃度為約10%至約15%，優(yōu)選約13%;濃度小于約1%的氯化鈣；和濃度小于約1%的氯化鈉。聚陽離子，如聚-L-鳥氨酸，以相對純的形式存在于所述組合物中，這樣分子量種類(molecularweightspecies)的范圍是有限的，且多分散性指數(shù)(即平均MW除以中值MW)小于1.5，優(yōu)選小于1.2，最優(yōu)選小于1.1。第二方面，本發(fā)明提供用本發(fā)明的組合物制備的生物相容性微膠囊，其包括用交聯(lián)劑(如鈣離子)交聯(lián)的高甘露糖醛酸藻酸鹽的核層，多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子形成半透膜的中間層，和高甘露糖醛酸藻酸鹽外層。核層和外層可包括相同或不同的高甘露糖醛酸藻酸鹽。微膠囊在核層中可進一步包括活細胞。細胞可包括自然存在或基因工程化的細胞(geneticallyengineeredcell),其可以單細胞或細胞簇的形式存在，選自P胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞(如脈絡(luò)叢細胞、垂體細胞、嗜鉻細胞、軟骨細胞)、或能分泌在疾病或癥狀的處理中有用的因子的任何其它細胞類型。第三方面，本發(fā)明包括制備生物相容性微膠囊的方法，包括以下步驟a)將含高甘露糖醛酸的藻酸鹽溶于等滲鹽水中；b)在大約5至30分鐘，優(yōu)選5至10分鐘內(nèi)將步驟a)的藻酸鹽溶液通過基于空氣或頻率的液滴產(chǎn)生器(frequency-baseddropletgenerator)噴灑入交聯(lián)劑過量的攪拌溶液，如約15至約120mM，更優(yōu)選約40至約110mM，還更優(yōu)選約90至約llOmM的氯化鈣中，以形成凝膠膠囊；c)在約5至30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，在濃度為約0.02至約0.01%(w/v)，優(yōu)選0.05%(w/v)下，用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子，如聚-L-鳥氨酸，包覆步驟b)的凝膠膠囊；d)在約5至30分鐘(優(yōu)選約5至10分鐘)內(nèi)，用最終的高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆步驟c)的微膠囊；和e)收集微膠囊；其中在歩驟a)和d)中使用的藻酸鹽是相同或不同的，含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基，優(yōu)選約50%至約90%，更優(yōu)選約50%至約70%，最優(yōu)選約60%至70%的甘露糖醛酸殘基。步驟a)的藻酸鹽溶液包括約1.0%至2.0%w/v的藻酸鹽濃度。步驟d)的藻酸鹽溶液包括約0.01至1.7%w/v的藻酸鹽濃度。第四方面，本發(fā)明包括制備微囊包封的細胞的方法，包括以下步驟a)用含高甘露糖醛酸的藻酸鹽的等滲鹽水溶液培養(yǎng)活細胞；b)在約5至約30分鐘(優(yōu)選約5-10分鐘)內(nèi)將步驟a)的細胞-藻酸鹽溶液通過基于空氣或頻率的液滴產(chǎn)生器噴灑入交聯(lián)劑過量的攪拌溶液，如約15mM至約120mM(優(yōu)選110mM)的氯化鈣中，以形成含有細胞的凝膠膠囊；c)在約5至30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，在濃度為約0.02%至0.1%(w/v)(優(yōu)選0.05%w/v)下，用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子，如聚-L-鳥氨酸包覆步驟b)的含有細胞的凝膠膠d)在約5至30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，用最終的藻酸鹽包覆步驟c)的含細胞的膠囊；和e)收集含細胞的微膠囊；其中在步驟a)和d)中使用的藻酸鹽是相同或不同的，含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基，優(yōu)選約50%至約90%，更優(yōu)選約50%至約70%，最優(yōu)選約60%至70%的甘露糖醛酸殘基。步驟a)的藻酸鹽溶液包括約1.0%至2.0%w/v的藻酸鹽濃度。步驟d)的藻酸鹽溶液包括約0.01至1.7%w/v的藻酸鹽濃度。第五方面，本發(fā)明提供包覆不可降解細胞傳遞構(gòu)造的方法，其包括步驟a)將不可降解細胞傳遞構(gòu)造沉浸在藻酸鹽和等滲鹽水的溶液中，該藻酸鹽含有約50至約95%甘露糖醛酸殘基(優(yōu)選約50至90%，更優(yōu)選約50至70%和最優(yōu)選約60%至70%的甘露糖醛酸)；b)在約5至約30分鐘(優(yōu)選約5至10分鐘)內(nèi)，通過在過量的交聯(lián)劑中培養(yǎng)(incubating)來交聯(lián)甘露糖醛酸殘基，該交聯(lián)劑如15mM至120mM(優(yōu)選110mM)氯化鈣溶液，以形成凝膠包覆層；c)在約5至30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，在濃度為約0.02至0.1%w/v(優(yōu)選0.05%w/v)下，用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子，例如聚-L-鳥氨酸，進一步包覆歩驟b)的凝膠構(gòu)造；d)在約5至30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，用最終的藻酸鹽包覆以產(chǎn)生免疫隔離膜包覆的不可降解細胞傳遞構(gòu)造；和e)分離最終的免疫隔離膜包覆的不可降解細胞傳遞構(gòu)造。步驟a)的藻酸鹽溶液包括約1.0%至2.0%w/v的藻酸鹽濃度。步驟d)的藻酸鹽溶液包括約0.01至1.7%w/v的藻酸鹽濃度。第六方面，本發(fā)明提供將小分子、蛋白質(zhì)或DNA治療劑包囊的方法，其包括步驟a)將治療劑分散在藻酸鹽溶于等滲鹽水的溶液中，該藻酸鹽含有高比例的甘露糖醛酸殘基；b)在約5至30分鐘(優(yōu)選約IO分鐘)內(nèi)，通過在過量的交聯(lián)劑中培養(yǎng)來交聯(lián)甘露糖醛酸殘基，該交聯(lián)劑如15mM-120mM(優(yōu)選110mM)氯化鈣溶液，以形成含治療劑的凝膠膠囊；c)在約5至30分鐘(優(yōu)選10分鐘)內(nèi)，在濃度為約0.02至0.1%w/v(優(yōu)選0.05。/。w/v)下，用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子，例如聚-L-鳥氨酸，包覆含治療劑的凝膠膠囊；d)在5至30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，用最終的藻酸鹽包覆步驟c)的含治療劑的膠囊；和e)收集含治療劑的微膠囊。其中在步驟a)和d)中使用的藻酸鹽是相同或不同的，含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基，優(yōu)選約50%至約90%，更優(yōu)選約50%至約70%，最優(yōu)選約60%至70%的甘露糖醛酸殘基。步驟a)的藻酸鹽溶液包括約1.0%至2.0%w/v的藻酸鹽濃度。步驟d)的藻酸鹽溶液包括約0.01至1.7%w/v的藻酸鹽濃度。第七方面，本發(fā)明提供改善或治療動物(包括人)體內(nèi)的疾病或癥狀的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的含細胞微膠囊移植入所述的動物體內(nèi)，其中所述細胞分泌對改善或治療所述疾病或癥狀有效的治療劑。第八方面，本發(fā)明提供改善或治療動物(包括人)體內(nèi)的疾病或癥狀的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的含治療劑微膠囊移植入所述動物體內(nèi)，其中所述治療劑對改善或治療所述疾病或癥狀有效。第九方面，本發(fā)明提供藻酸鹽和聚陽離子在制備用于同種異體或異種移植應(yīng)用的微膠囊制劑中的應(yīng)用，所述藻酸鹽含有約50至約95%的甘露糖醛酸殘基。可以將本發(fā)明的微膠囊制劑施予受試者。此處使用的"受試者"指人或脊椎哺乳動物(vertebratemammal)，包括但不限于，狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、或靈長類，如猴。微膠囊制劑包括分泌治療劑的細胞或本身包含治療劑，并足量施予從而為受試者提供有效量的治療劑。特定試劑的有效量取決于如試劑的種類、施用的目的、(如果治療疾病)疾病的嚴重程度等因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定有效量。本說明書和權(quán)利要求書中所使用的術(shù)語"包括"指"至少部分由......組成"，也就是說如果解釋包括該術(shù)語的獨立權(quán)利要求，在每個權(quán)利要求中以該術(shù)語作為開端的特征都需要存在，但是其它的特征也可以存在?，F(xiàn)在，參考說明書本發(fā)明，其中圖1所示為在9(TC藻酸鹽的蛋白質(zhì)NMR波譜，其中由于溫度和藻酸鹽的化學結(jié)構(gòu)(見插入的方框，具有對應(yīng)NMR峰的質(zhì)子的位置)，峰往低場移動；圖2a所示為在包囊前材料組分的FTIR，放大部分為羰基區(qū)域的吸收(見插入的方框)；圖2b所示為含有變化的聚-L-鳥氨酸(PLO)濃度的藻酸鹽混合物，其中強調(diào)區(qū)域代表PLO酰胺II的吸收；圖2c所示為FTIR定量測定PLO酰胺吸收與藻酸鹽共吸收之比；圖3所示為移植前的VPMG膠囊的5倍放大相襯圖4所示為不同種類的藻酸鹽的60天外植體(explant)樣品5倍放大相襯顯微照片；圖5所示為圖4的60天外植體樣品的交聯(lián)-部分均勻性(A)和％初始直徑(B)，平均ISD。(△)VPMG;()VPLG;(-)pKel;(□)pFlu;(參)pMan;圖6所示為在90天研究期后，每個膠囊群的FTIR1590cm—1和1550cm-1峰；圖7所示為FTIR定量分析的穩(wěn)定性指數(shù)，即測量藻酸鹽羧酸(alginatecarboxylicacid)峰與鳥氨酸酰胺II峰的比，(△)VPMG;()VPLG;(-)pKel;(□)pFlu;(*)pMan;圖8所示為在90天研究期后，每個藻酸鹽類型VPMG、VPLG、pKel、pFlu、pMan凍干的藻酸鹽膠囊表面的顯微照片；和圖9所示為更大放大倍數(shù)的顯微照片以顯示在30天時pKel微膠囊的表面點蝕。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于活細胞和治療劑的包囊體系，以及當將包囊的細胞和治療劑移植入受試者時，具有改進的生物穩(wěn)定性的治療劑。這種改進的生物穩(wěn)定性使包囊的(encapsulated)細胞和治療劑在活體內(nèi)比當前情況能保持更長時期，其導致改進的治療劑傳遞，因而改進了治療效果。包囊體系包括生物耐久性組合物，其包括藻酸鹽，該藻酸鹽含有高甘露糖醛酸。藻酸鹽是一種多糖，其包括用(1,4)-01-禾n-p-(糖)苷鍵連接的guluronic(G)和甘露糖醛(M)酸(見圖1中插入的方框)。這些單體的比率分布與多糖的某些物理特性有關(guān)。據(jù)首次發(fā)現(xiàn)，一旦陽離子交聯(lián)(cationicallycrosslinked)，G含量高的藻酸鹽由于a(l-4)鍵形成更多的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有更高的彈性模量，變得更脆，而M含量高的那些，具有更多的線性(3(l-4)連接，表現(xiàn)出降低的3維交聯(lián)，更大的彈性并在體內(nèi)試驗時形成非常穩(wěn)定的微膠囊。因此，本發(fā)明提供一種組合物，其包括特定地含有約50%至95%的甘露糖醛酸殘基的高甘露糖醛酸藻酸鹽，和多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子，如聚-L-鳥氨酸。優(yōu)選地，含高甘露糖醛酸的藻酸鹽含有約50%至90%的高甘露糖醛酸殘基，更優(yōu)選約50%至70%的高甘露糖醛酸殘基，和最優(yōu)選約60%至70%的高甘露糖醛酸殘基。在一個優(yōu)選的具體實施方式中，高甘露糖醛酸藻酸鹽和聚陽離子的比率以重量計為約5:1至10:1，優(yōu)選以重量計約7:1。此外，本發(fā)明的組合物可包括氯化鈣和氯化鈉。優(yōu)選地，所述組合物包括濃度為約80%至約90%，優(yōu)選約87%，的高甘露糖醛酸藻酸鹽，濃度為約10%至約15%，優(yōu)選約13%的聚丄-鳥氨酸，濃度小于約1%的氯化鈣，和濃度小于約1%的氯化鈉。藻酸鹽的平均分子量大于約400KDa，優(yōu)選大于約600KDa。在本發(fā)明中以比例使用的含高甘露糖醛酸的藻酸鹽可包括約10至約40。/。的glucoronicacid含量。因此，用于本發(fā)明的藻酸鹽中M:G的比率為約1.55:1至9.5:1。藻酸鹽源是純化的且含有小于1內(nèi)毒素單元/毫升的1.7%(w/v)藻酸鹽。適用于本發(fā)明的商業(yè)上可獲取藻酸鹽的例子包括KeltoneLVCR和PronovaSLM20。但是，具有合適的高甘露糖醛酸含量(或合適的M:G比率)的任何其他藻酸鹽可以用作用于本發(fā)明的原材料。當溶解在1.7%(w/v)鹽水中時，藻酸鹽的pH可為7.0士0.4。聚陽離子的分子量對本發(fā)明的微膠囊的結(jié)構(gòu)和功能組合物也是重量要的。據(jù)首次發(fā)現(xiàn)，多分散性指數(shù)小于約1.5，優(yōu)選小于約1.2和更優(yōu)選小于1.1的聚陽離子，與高甘露糖醛酸藻酸鹽可得更好的微膠囊，該微膠囊高度穩(wěn)定，在體內(nèi)能保留長時間以及確定保留一個月以上。包括高多分散性指數(shù)因而包括寬范圍的MW種類(MWspecies)的聚陽離子劑會得到較差的微膠囊。據(jù)認為這是由于更大MW的分子造成的，其不能分散在藻酸鹽包衣(coat)中，從而得到脆弱的包衣。另一方面，較小MW的分子可以很快地分散進入藻酸鹽包衣，并能滲透進入核并置換核中的細胞或珠(bead)。已表明具有有限范圍的MW種類的聚陽離子可得更好的微膠囊。例如，當聚陽離子是聚-L-鳥氨酸或聚-L-賴氨酸時，聚陽離子的優(yōu)選平均分子量為10至40KDa，更優(yōu)選15至30KDa，和最優(yōu)選約20-25KDa。優(yōu)選地，聚-L-賴氨酸或聚-L-鳥氨酸將含有小于約20%的MW為10KDa或更小的分子，更優(yōu)選含有小于約10。/。的MW為10KDa或更小的分子。本發(fā)明進一步提供用本發(fā)明的組合物制備的生物相容性微膠囊，其包括用陽離子交聯(lián)劑交聯(lián)的高甘露糖醛酸藻酸鹽的核層，多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子形成半透膜的中間層，和高甘露糖醛酸藻酸鹽外層。高甘露糖醛酸藻酸鹽可包括約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基，優(yōu)選為約50%至約90%，更優(yōu)選為約50%至約70%，和最優(yōu)選為約60%至約70%的甘露糖醛酸殘基。用于核層和外層的藻酸鹽可以是相同的或不同的。核層可包括包含50-70%的甘露糖醛酸殘基的藻酸鹽，外層可包括包含10-40%的甘露糖醛酸殘基的藻酸鹽。陽離子交聯(lián)劑可選自下列的鹽Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、H+、K+、Li+、Mg2+、Mn2+、Na+、NH4+、Ni2+、Pb2+、Sn2+或Zn2+。陽離子交聯(lián)劑優(yōu)選為氯化鈣。優(yōu)選交聯(lián)劑過量，例如，15mM至120mM的氯化藥。更優(yōu)選llOmM的氯化鈣。聚陽離子劑可以選自殼聚糖谷氨酸鹽(chitosanglutamate)、殼聚糖二醇、改性的葡聚糖、溶菌酶、聚-L-賴氨酸、聚-L-鳥氨酸、鮭精蛋白硫酸鹽、魚精蛋白硫酸鹽、聚丙烯酰亞胺、聚丙烯酰亞胺-共聚-甲基丙烯酰氧乙基三甲基銨溴化物(polyacrylimide-co-methacryloxyethyltrimethylammoniumbromide)、聚烯丙胺、聚酰胺、聚胺、聚凝胺、聚丙烯酸丁酯-共聚-甲基丙烯酰氧乙基三甲基銨溴化物(80/20)、聚-3-氯-2-羥丙基甲基丙烯酰-氧乙基二甲基,安氯{七物(Poly-3-chloro-2-hydroxypropylmethacryl-oxyethyldimethylammoniumChloride)、聚二j:希丙基二甲基銨、聚二j:希丙基二甲基銨氯化物(PolydiallyldimethylammoniumChloride)、聚二烯丙基二甲基銨氯化物-共聚-丙烯酰胺、聚二烯丙基二甲基銨氯化物-共聚-N-異丙基丙烯酰胺、聚二甲基胺-共聚-環(huán)氧氯丙垸、聚二甲基氨乙基丙烯酸酯-共聚-丙烯酰胺、聚二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯(Polydimethylaminoethylmethacrylate)、聚二甲基氨乙基甲基丙j;希酸酉旨(PolydimethylaminoethylMethacrylate)、聚乙j:希亞月安(Polyethyleneimine)、聚乙烯亞胺-環(huán)氧氯丙烷改性的、聚乙烯亞胺、聚-2-羥基-3-甲基丙烯酰氧丙基三甲基銨氯化物、聚-2-羥基-3-甲基丙烯酰氧乙基、三甲基銨氯化物、聚hdroxyproply甲基丙烯酰氧乙基二甲基銨氯化物、Polyimadazoline(四價的)、聚-2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基銨溴化物、聚niethacryl氧乙基三甲基銨溴化/氯化物、聚甲基二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯-共聚-丙烯酰胺、聚-l-甲基-2-乙烯基吡啶鎗(pyridinium)溴化物、聚-l-甲基-4-乙烯基吡啶鎗溴化物、聚亞甲基-共聚-鹽酸胍、聚乙烯胺、聚-N-乙烯基吡咯烷酮-共聚-二甲基aminoelhyl-甲基丙烯酸酯、或聚-4-乙烯基芐基三甲基銨氯化物、或聚-4-乙烯基節(jié)基三甲基銨氯化物。優(yōu)選地，聚陽離子劑是聚-L-鳥氨酸，濃度為0.02。/。至0.1。/。wv。聚-L-鳥氨酸優(yōu)選是純化的以除去較高和/或較低MW種類以得到優(yōu)選小于1.2，更優(yōu)選小于1.1的多分散性指數(shù)。特別地，聚-L-鳥氨酸聚陽離子劑的平均MW為10至40KDa，更優(yōu)選為15至30KDa，和最優(yōu)選為約20至25KDa。通過透析和其它已知的方法可以除去任何分子量在10KDa以下和40KDa以上的分子。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的聚-L-鳥氨酸包括小于約20%的具有10KDa或更小MW的分子，更優(yōu)選包括小于10%的具有10KDa或更小MW的分子。由包圍核層的聚陽離子形成的中間層包括厚度為約10至約80微米的半透膜。核層的藻酸鹽可以是固體，或可以通過螯合劑解聚以形成空核。合適的螯合劑的例子是檸檬酸鈉和EDTA。據(jù)認為藻酸鹽(脫膠(degdling))核的螯合作用溶解膠囊的內(nèi)部結(jié)構(gòu)支撐，因而不利地影響微膠囊的耐久度。在現(xiàn)有技術(shù)中，通過不進行螯合步驟來克服這個問題，以致于核是固體(例如見US6，365,385)。但是，即使當核被螯合作用液化，本發(fā)明的微膠囊中含高甘露糖醛酸的藻酸鹽的使用，和多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子的使用顯著地增加了微膠囊的耐久度。本發(fā)明的微膠囊也可具有固體核以進一步提高穩(wěn)定性和耐久度。核層藻酸鹽與聚陽離子劑的比率以重量計為約7:1至約8:1。外層藻酸鹽與聚陽離子劑的比率以重量計為約1.5:1至約1.4:1。當置于生物體外在生理學條件下約1個月或更長，形成的微膠囊體積膨脹約10%或更大。微膠囊的膨脹被認為是由剩余的二價陽離子引發(fā)滲透梯度導致吸收水引起的。其可以是成問題的并導致微膠囊的分解?？梢酝ㄟ^用陰離子除掉多余的陽離子來克服這個問題(例如US6,592,886)。但是，在本發(fā)明中，含高甘露糖醛酸的藻酸鹽的使用和多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子劑的使用導致較少的剩余陽離子，本發(fā)明的微膠囊高度穩(wěn)定，降解的可能性更小，雖然如上所述有一些有限的膨脹。微膠囊的表面在形成時是離子中性表面。微膠囊可進一步包括核層中的活細胞。細胞可包括自然存在或基因工程化的細胞，其可以以單細胞和/或細胞簇的形式存在，選自卩胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞(如脈絡(luò)叢細胞、垂體細胞、嗜鉻細胞(chromafmcdl)、軟骨細胞)、或能分泌在疾病或癥狀的處理中有用的因子的任何其它細胞類型。例如，細胞可以是能分泌適用于糖尿病治療的胰島素的胰島細胞。細胞可可選擇地包括能分泌對于治療肝臟疾病或紊亂有用的肝臟分泌因子的肝細胞或非肝細胞。細胞可可選擇地包括神經(jīng)元細胞(如脈絡(luò)叢、垂體細胞、嗜鉻細胞(chromoffmcell)、軟骨細胞)、和能分泌在神經(jīng)元疾病的處理中有用的神經(jīng)元因子的任何其它細胞，神經(jīng)元疾病如帕金森病、阿爾茨海默病、癲癇、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington'sdisease)、腦卒中(stroke)、運動神經(jīng)元病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、老化、血管疾病、MenkesKinkyHairSyndrome、威爾遜病、對神經(jīng)系統(tǒng)的創(chuàng)傷或損傷。本發(fā)明的微膠囊的直徑可以為50至2000微米。優(yōu)選微膠囊的直徑為100至1000微米，更優(yōu)選直徑為500至700微米。期望本發(fā)明的微膠囊在受試者體內(nèi)在很長一段時間內(nèi)保持功能，并確定在長于一個月的時間內(nèi)保持功能。微膠囊的功能持續(xù)時間可以通過一個或多個下列方法進行控制通過改變用于微膠囊的內(nèi)和/或外層的藻酸鹽范圍的多分散性；通過改變內(nèi)和/或外藻酸鹽層的總蛋白質(zhì)含量；通過誘導藻酸鹽層的鈣化；通過改變聚陽離子劑的分子量范圍和分布通過改變聚陽離子未反應(yīng)污染物的濃度為約0.01%至約0.25%Cw/w)^通過改變聚陽離子濃度的均勻性，在微膠囊的中間層產(chǎn)生梯度；通過用抑制劑如包括pluronicsF127的表面活性劑、抗纖維化劑(anti-fibrotics)和其它的合適的制劑包覆外表面來改變細胞表面相互作用的量。本發(fā)明進一步提供制備本發(fā)明的生物相容性微膠囊的方法，包括以下步驟a)將含高甘露糖醛酸的藻酸鹽溶于等滲鹽水中；b)在約5至30分鐘(優(yōu)選5至10分鐘)內(nèi)，將步驟a)的藻酸鹽溶液通過基于空氣或頻率的液滴產(chǎn)生器噴灑入交聯(lián)劑過量的攪拌溶液中，以形成凝膠膠囊；c)在5至30分鐘(優(yōu)選10分鐘)內(nèi)，在濃度為0.01至0.2%w/v(優(yōu)選0.05。/。w/v)下用多分散性指數(shù)小于約1.5的聚陽離子，如聚-L-鳥氨酸包覆步驟b)的凝膠膠囊；d)在約5至30分鐘(優(yōu)選5至10分鐘)內(nèi)，用最終的高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆步驟c)的膠囊；和e)收集微膠囊；其中在步驟a)和d)中使用的含高甘露糖醛酸的藻酸鹽是相同或不同的，含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基，優(yōu)選50%至90%，更優(yōu)選約50%至70%，最優(yōu)選約60%至約70%的甘露糖醛酸殘基。步驟a)的藻酸鹽溶液包括約1.0%至2.0%w/v的藻酸鹽濃度。步驟d)的藻酸鹽溶液包括約0.01至1.7%w/v的藻酸鹽濃度。交聯(lián)劑可選自以上列出的，且優(yōu)選約110mM的氯化鈣。最終的藻酸鹽包衣優(yōu)選含有約10至約40%的甘露糖醛酸殘基。核層的藻酸鹽可以是固體，或可如上所述用螯合劑解聚以形成空本發(fā)明進一步提供制備微囊包封的細胞的方法，包括以下步驟a)用含高甘露糖醛酸的藻酸鹽的等滲鹽水溶液培養(yǎng)活細胞；b)在約5至30分鐘(優(yōu)選5至10分鐘)內(nèi)，將步驟a)的細胞-藻酸鹽溶液通過基于空氣或頻率的液滴產(chǎn)生器噴灑入陽離子交聯(lián)劑過量的攪拌溶液中，例如約15mM至120mM(優(yōu)選110mM)的氯化鈣，以形成含細胞的凝膠膠囊；c)在5至約30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，在濃度為約0.02%至0.1%w/v(優(yōu)選0.05。/。w/v)下，用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子，優(yōu)選聚-L-鳥氨酸包覆歩驟b)的含細胞的凝膠膠囊；d)在5至30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，用最終的藻酸鹽包覆歩驟c)的含細胞的膠囊；禾口e)收集含細胞的微膠囊；其中在步驟a)和d)中使用的藻酸鹽是相同或不同的，含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基，優(yōu)選約50%至約90%，更優(yōu)選約50%至約70%，最優(yōu)選約60%至70%的甘露糖醛酸殘基。步驟a)的藻酸鹽溶液包括約1.0%至2.0%w/v的藻酸鹽濃度。步驟d)的藻酸鹽溶液包括約0.01至1.7%w/v的藻酸鹽濃度。細胞可包括自然存在或基因工程化的細胞，其可以單細胞和/或細胞簇的形式存在，選自p胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞(如脈絡(luò)叢細胞、垂體細胞、嗜鉻細胞、軟骨細胞)、或能分泌在疾病或癥狀的處理中有用的因子的任何其它細胞類型。為用于同種異體移植，可以從相同種中分離作為受體宿主的細胞；或為了在異種移植中的應(yīng)用，可以從不同的種中分離。細胞優(yōu)選包含于核藻酸鹽層中，但是可以可選擇地或另外地包含于外藻酸鹽層中。本發(fā)明進一步提供包覆不可降解細胞傳遞構(gòu)造的方法，其包括歩驟a)將不可降解細胞傳遞構(gòu)造沉浸在藻酸鹽和等滲鹽水溶液中，該藻酸鹽含有約50至約95%甘露糖醛酸殘基；b)在約5-30分鐘(優(yōu)選5-10分鐘)內(nèi)，通過在過量的交聯(lián)劑中培養(yǎng)中來交聯(lián)甘露糖醛酸殘基，該交聯(lián)劑例如約15mM至120mM(優(yōu)選110mM)的氯化鈣溶液，以形成凝膠膠囊；c)在約5至30分鐘(優(yōu)選約10分鐘)內(nèi)，在濃度為約0.02至0.1%w/v(優(yōu)選0.05。/。w/v)下，用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子，優(yōu)選聚-L-鳥氨酸進一步包覆歩驟b)的凝膠構(gòu)造；d)用最終的藻酸鹽包覆約5至30分鐘，以形成免疫隔離膜包覆的不可降解細胞傳遞構(gòu)造；和e)分離最終的免疫隔離膜包覆的不可降解細胞傳遞構(gòu)造。步驟a)的藻酸鹽溶液包括約1.0%至2.0%w/v的藻酸鹽濃度。步驟d)的藻酸鹽溶液包括約0.01至1.7%w/v的藻酸鹽濃度。不可降解細胞傳遞構(gòu)造可選自中空纖維膜裝置、平板、細胞內(nèi)生長的多孔支架、及其它新支架，這些是技術(shù)人員都熟悉的。不可降解細胞傳遞構(gòu)造可包括活細胞，細胞可以是以單細胞和/或細胞簇的形式存在的自然存在或基因工程化的細胞，選自P胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞(如脈絡(luò)叢細胞、垂體細胞、嗜鉻細胞、軟骨細胞)、或能分泌在疾病或癥狀的處理中有用的因子的任何其它細胞類型。本發(fā)明進一步提供將小分子、蛋白質(zhì)或DNA治療劑包囊的方法，其包括步驟a)將治療劑分散在高甘露糖醛酸藻酸鹽溶于等滲鹽水的溶液中；b)在約5至約30分鐘內(nèi)，通過在過量的交聯(lián)劑中培養(yǎng)來交聯(lián)甘露糖醛酸殘基，優(yōu)選在約15mM至120mM(優(yōu)選110mM)氯化鈣溶液中，以形成含治療劑的凝膠膠囊；c)在約5至30分鐘內(nèi)，在濃度為約0.02至0.1%w/v(優(yōu)選0.05。/。w/v)下，用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子，優(yōu)選聚-L-鳥氨酸包覆含治療劑的凝膠膠囊；d)在5至30分鐘內(nèi)用最終的藻酸鹽包覆步驟c)的含治療劑的膠囊；和e)收集含治療劑的微膠囊。步驟a)的藻酸鹽溶液包括約1.0%至2.0%w/v的藻酸鹽濃度。步驟d)的藻酸鹽溶液包括約0.01至1.7%w/v的藻酸鹽濃度。小分子、蛋白質(zhì)或DNA治療劑優(yōu)選包含于核藻酸鹽層中，但可以可選擇地或另外地包含于外藻酸鹽層中。可選擇地，小分子、蛋白質(zhì)或DNA治療劑可以限制在外藻酸鹽層中，或可以包含于(聚陽離子)中間層中。合適的蛋白質(zhì)治療劑的例子包括促紅細胞生成素、胰島素、CNTF、BDNF、GDNF、GH、及其它，這些是技術(shù)人員所熟悉的。在某些方面，希望利用含有約50%至約90%甘露糖醛酸殘基的藻酸鹽，在某些具體實施方式中，為約50%至約70%甘露糖醛酸殘基，優(yōu)選60%至70%甘露糖醛酸殘基。相似地，在本發(fā)明的某此方面，希望應(yīng)用濃度為約0.05%至約0.20%w/v的最終的藻酸鹽包衣。如以上所提及的，噴灑、包覆、然后使用藻酸鹽包覆的時間可以為基本上比約10分鐘更短或更長的時間，且在某些情況下也可要求每一個步驟約1至約45分鐘，同時在本發(fā)明的一些應(yīng)用中，這些步驟的每一步可以在約5至約20分鐘的時間內(nèi)進行。本發(fā)明進一步提供改善或治療動物(包括人)體內(nèi)的疾病或癥狀的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的含細胞微膠囊移植入所述動物體內(nèi)，其中所述細胞分泌對改善或治療所述疾病或癥狀有效的治療劑。本發(fā)明進一步提供改善或治療動物(包括人)體內(nèi)的疾病或癥狀的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的含細胞免疫隔離膜包覆的非降解細胞傳遞構(gòu)造移植入所述動物體內(nèi)，其中所述細胞分泌對改善或治療所述疾病或癥狀有效的治療劑。本發(fā)明進一步提供改善或治療動物(包括人)體內(nèi)的疾病或癥狀的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的含治療劑微膠囊移植入所述動物體內(nèi)，其中所述治療劑對改善或治療所述疾病或癥狀有效。在這些治療方法中，可以以能傳遞足夠治療劑以致能有效地抵抗疾病的量施用本發(fā)明的微膠囊或包覆的傳遞構(gòu)造。例如，在糖尿病的治療中，一毫升的微膠囊含有約10,000-60,000p胰島當量和將約l-10毫升微膠囊/千克體重移植入受試者體內(nèi)以分泌要求量的胰島素以控制血糖水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠試驗在體外特定的治療劑從微膠囊分泌出的分泌速率，且為了任何特定病人的需要，能計算為了有效治療特定的病人需要多少微膠囊。本發(fā)明的微膠囊可為同種異體或異種移植配方，取決于活細胞和/或治療劑源。本發(fā)明的微膠囊可以在根據(jù)可及性和功效在最希望的身體組織或體內(nèi)充滿流體的空間中移植。例如，如果微囊中的活細胞是(3胰島細胞，其可以在腹腔中移植。如果微膠囊中的活細胞是脈絡(luò)叢細胞且是為了治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病(neurologicaldisorder)，細胞分泌的任何治療劑必須與腦周圍的腦脊液接觸，可以將這些微膠囊移植入或移植至腦?？蛇x擇地，微膠囊可以為口服或局部用藥而配制，當它們含有治療生物活性劑，如抗生素時尤其如此。本發(fā)明提供含有約50%至95%的甘露糖醛酸殘基的藻酸鹽和聚陽離子在制備用于同種異體或異種移植應(yīng)用中的微膠囊的生產(chǎn)中的應(yīng)用。這些微膠囊可包括活細胞，該活細胞包括自然存在或基因地或基因工程化的細胞，其可以單細胞和/或細胞簇的形式存在，選自(3胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞(如脈絡(luò)叢細胞、垂體細胞、嗜鉻細胞、軟骨細胞)、或能分泌在疾病或癥狀的處理中有用的因子的任何其它細胞類型。可選擇地，微膠囊可包括治療劑。本發(fā)明也可以如所述廣泛地由應(yīng)用說明書中所指的或顯示的部分、要素、和特性組成，它們可以單獨地或集合地出現(xiàn)，且包括任何兩個或多個所述部分、要素、和特性的任何或所有的組合，且其中在此提及特定的整數(shù)，其在本發(fā)明涉及的領(lǐng)域具有已知的當量，如果以前單獨提到，這些已知的當量在此并入全文。本發(fā)明包括前述的內(nèi)容，也包括以下僅給出實施例的解釋。具體實施例方式實施例本發(fā)明包括前述的內(nèi)容，也包括以下僅給出實施例的解釋。包括以下實施例來說明本發(fā)明的具體實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在實施例中公開的技術(shù)，隨后發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實踐中發(fā)揮好功效的代表性技術(shù)，因此可以認為其組成其實踐的優(yōu)選模式。但是，根據(jù)本發(fā)明的公開本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知道，可以對公開的特定具體實施方式進行許多變化，且仍然獲得相當或相似的結(jié)果，這不偏離本發(fā)明的精神和范圍。實施例1藻酸鹽-聚鳥氨酸微膠囊在鼠腹膜內(nèi)的穩(wěn)定性FTIR和SEM分析材料和方法研究設(shè)計由5種不同類型的藻酸鹽制成單分散性藻酸鹽-PLO微膠囊，并注入Long-Evans大鼠腹腔內(nèi)。在移植之前，在體外表征材料甘露糖醛酸與guluronicacid的比率(M:G比率)，內(nèi)毒素和蛋白質(zhì)水平，粘度、和分子量。在14、30、60、和90天后，從每個動物重新得到膠囊。對重新得到的膠囊的幾何形狀進行評估，并且用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)對膠囊進行化學完整性分析和用掃描電子顯微鏡(SEM)對其進行表面形態(tài)分析。包囊材料源和純化購買未加工的或純化的形式的5種源的凍干的藻酸鹽。2種源由制造商以純化的形式提供(見以下)，其它3種以未加工的形式收到，后續(xù)用溶劑萃取法(33)進行純化。簡而言之，將1%(W/V)溶液溶解在l.OmM的EGTA鈉溶液中，并連續(xù)地通過更多限制性的膜(5.0、1.5、0.8、0.45和0.22微米過濾器)進行過濾。逐漸降低pH值至1.5，且在0.01NHC1+20mMNaCl中洗三次沉淀的藻酸鹽。在30分鐘內(nèi)進行劇烈搖晃，用氯仿和丁醇提取蛋白質(zhì)3次。在返回中性pH值后，重復有機提取且藻酸鹽在乙醇中沉淀，過濾，用二乙醚清洗，再凍干至少72小時。在微膠囊形成前，將所有的藻酸鹽溶解在1.5%(W/V)不含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(Gibco，USA)溶液中，并為無菌(sterility)通過0.22微米過濾器。藻酸鹽指定為基于供應(yīng)商特定的約G-部分的供應(yīng)商純化的中等G(VPMG)、供應(yīng)商純化的低G(VPLG)、純化的KeltoneLVCR(pKel)、純化的Fluka(pFlu)、和純化的Manucol(pMan)。Keltone和Manucol藻酸鹽從ISPCorporation(USA)處獲得，F(xiàn)luka從Sigma-Aldrich訂購。將聚鳥氨酸氫溴酸鹽(Polyornithinehydrobromide)(MW=5-15KDa，Sigma-Aldrich，USA)溶解于不含鈣鎂的PBS，并在制造膠囊前立即進行無菌化過濾。所有的包囊試劑，包括氯化鈣、檸檬酸鈉、和氯化鈉，購自Sigma-Aldrich，且在包囊當天制成無菌溶液。膠囊材料藻酸鹽表征用多種技術(shù)分析藻酸鹽以區(qū)分重要的化學性質(zhì)，其中包括核磁共振波譜法(NMR)、FTIR、粘度測定法、和凝膠滲透色譜(GPC)。也可以確定每份藻酸鹽溶液的蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的相對水平。NMR波譜法使用NMR波譜法來確定甘露糖醛酸與guluronicacid殘基在碳水化合物共聚物中的比率。部分水解樣品以減少粘度并達到如Gmsdalen等人所述NMR的合適的分辨率(34)。簡而言之，將1.0%(w/v)藻酸鹽調(diào)至pH3.0并在10(TC下保持回流30分鐘。使用BuchiRotavapor(Switzerland)除去大部分水，同時剩余物被凍干以完全干燥。然后將樣品溶解(20mg/mL)在重水中，并在BrukerNMR(300MHz，卯。C)上分析。高溫有效地使水峰向低場移動，以顯露出積分用的目的峰。使用BrukerXWIN-NMR測量這些峰(對Gl5-5.7ppm，對Ml和GM5為5.3ppm，對GG5為4.9ppm)下的面積。計算Gl下的面積除以M1/GM5+GG5下的面積的比率以得出G-部分。樣品用這種方法測三次。FTIR光譜用附加水平衰減全反射(H-ATR)附件的Perkin-ElmerSeries1600FTIR進行所有的測試。將藻酸鹽粉末或凍干的膠囊置于ZnSe晶體上，直至將其完全覆蓋，并將100psi壓力加在樣品上。要求掃描4000-650cm—1(N=32)，對得到的光譜進行ATR校正。通過用Perkin-ElmerSpectrum5軟件測量目的峰下的面積來進行定量評估(35)。為了表征和定量增加PLO對所得光譜的影響，用80%、60%，40%、35%、30%、25%、21%、17%、10%和5%(W/W)的PLO濃度將PLO:藻酸鹽一起沉淀。為了得到均勻的樣品，將PLO在dH20中的溶液置于冷凍的藻酸鹽整分式樣上。使用探頭超聲處理，PLO逐漸反應(yīng)并與融化的藻酸鹽一起沉淀，直至整個混合物融化并且不透明。進行超聲處理直至得到均勻地不透明溶液。然后，在液氮中將樣品閃凍(flash-frozen)，并立即凍干。這些干燥的樣品測三次，光譜平均經(jīng)過N二32次掃描。粘度測定法用Brookfidd錐/板粘度計測定粘度。杯與轉(zhuǎn)軸間的間隙在每次測量前設(shè)定為0.013毫米以消除與樣品水平相關(guān)的噪音。將1毫升的0.1%(W/V)藻酸鹽樣品加入樣品杯中，并在杯底部排除空氣氣泡地分布成薄層。插入轉(zhuǎn)軸以評估在1至20rpm范圍內(nèi)的各種轉(zhuǎn)速下的轉(zhuǎn)動阻力。不同剪切速度下的轉(zhuǎn)矩為25至95%，在粘度計最佳的工作范圍內(nèi)。動態(tài)粘度通過改變探頭不同速度下的阻力來計算。所有的測量在室溫(25°C)下進行。GPC將藻酸鹽樣品溶解成0.17%(W/V)的濃度，并將50微升注入裝于Perkin-ElmerGPC儀器(裝有Isocratic250泵，101爐，LC30RI檢測器和900系列界面)上的Waters(USA)超水凝膠線型柱(UltrahydrogelLinearColumn)中。校正的標準是溶于PBS緩沖劑濃度也為0.17%(W/V)的分子量為932、571、177和70KDa的聚(環(huán)氧乙烷)。使用NelsonTurbochrom軟件計算Mw、Mn、和Mz。將多分散性指數(shù)，或分子量種類的多態(tài)性(polymorphism)程度計算為Mw/Mn。藻酸鹽蛋白質(zhì)含量藻酸鹽樣品中的總蛋白質(zhì)通過MicroBCAProteinAssay(Pierce,USA)來測量。在約100%準確度和稀釋線性為約95%的尖峰(spike)和恢復實驗后，將1毫升1.7%(W/V)藻酸鹽樣品稀釋2、5、10和20倍并與工作試劑在37。C下培養(yǎng)2小時以進行培育(development)。培育的試劑在96孔盤上用紫外-可見分光光度計在562納米進行檢測，并用牛血清白蛋白相對(against)線性標準曲線定量。使用LimulusAmebocyteLysate(LAL)CL-1000ChromogenicLALEndpointAssay(Cambrex,USA)定量研究中藻酸鹽的總內(nèi)毒素含量。為了內(nèi)毒素提取物，將1.7%(W/V)樣品在dH20中稀釋10倍在5(TC培養(yǎng)18小時，并在設(shè)定的時間內(nèi)在標準濃度下(againststandardconcentration)進行反應(yīng)(36)。最終產(chǎn)品在Beckman-CoulterDTX-880UV-VIS分光光度計上分析。該測定的檢測范圍為l-50EU/mL。藻酸鹽微囊包封使用裝在InotechIE-50R靜電包囊機器(Switzerland)上的60毫升注射器收集30毫升1.7%(W/V)滅菌的藻酸鹽溶液。使用注射器泵以約8毫升/分鐘的速度將溶液通過以約卯0Hz振動的噴嘴進行加料。由于各種藻酸鹽溶液的比濃對數(shù)粘度不同，根據(jù)需要稍微改變這些參數(shù)以保持最佳的機器操作。流體流通過具有約1.5千伏的外加電流的靜電環(huán)(electrostaticring)，并進入無旋渦攪拌的300毫升100mMCaCb與50mMNaCl浴中。在交聯(lián)5分鐘后，移出膠囊并立即與100毫升0.05%(W/V)PLO反應(yīng)10分鐘，然后在3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)緩沖劑中洗2次。然后通過在0.05%藻酸鹽中攪拌膠囊5分鐘進行外藻酸鹽層包覆，且包覆的膠囊再在MOPS緩沖劑中洗2次。新鮮地制備膠囊，并在移植前將其制成37'C在滅菌的PBS中的1毫升等分試樣。保留等分試樣以進行移植前分析。膠囊表征顯微鏡和圖像分析通過相襯法光顯微鏡以及ScionImage(USA)形態(tài)測量儀表征膠囊?guī)缀瓮庑?。將PBS中懸浮的膠囊加入24孔盤中，確認只有一層膠囊保持在孔底部。和用相襯法的5倍透鏡，得到具有大視野和清晰顯示的膠囊外形圖像。在相同的處理中，獲得校正已知距離用的血細胞計31數(shù)儀的圖像。在ScionImage中，使用校正圖像設(shè)定合適的比例測量膠囊直徑，如果偏離球形，測量約最大直徑和最小直徑。為了簡化至2維參數(shù)，用基于較小半徑的面積除以基于較大半徑的面積X100，測量交叉部分均勻性％。在每個時間點每組中至少測量100顆膠囊。動物應(yīng)用將重250克至350克的雄性Long-Evans大鼠成對地關(guān)在屋內(nèi)，并控制在12:12小時光-黑循環(huán)環(huán)境內(nèi)。所有的動物應(yīng)用和處理在符合或超過NIH指南的嚴格標準下進行。此外，所有的程序預先經(jīng)過BrownUniversityIACUC管理機構(gòu)的同意。研究中每個材料組(N=5)每個時間點(N=4)有5只動物，一共100只動物。用3%異氟垸(isoflunme)氣體瞬間麻醉大鼠，通過16號針將懸浮于1毫升不含鈣鎂的PBS(2毫升總體積)中的1毫升膠囊施藥入中線的腹膜內(nèi)。程序結(jié)束后使動物恢復知覺并返回籠中。時間0(移植前)材料和圖像分析隊列(cohort)也通過16號針進行。在移植14、30、60和90天后，用二氧化碳過量殺死動物，并使用移液管和PBS從所有的象限(quadrant)收集自由漂浮的膠囊，在顯微鏡下回收膠囊。記錄位置、豐度、和大體形態(tài)(grossappearance)。然后，用圖像分析表征合并的樣品，洗滌和閃凍以凍干。移植后膠囊表征在72小時的凍干后，用FTIR和SEM分析膠囊的表面化學和形態(tài)。對FTIR使用與前述對原材料相似的程序，除了對凍干的珠目測整體性以限制分析至膠囊的外表面而不是本體，并確認粘附的細胞剝落以最小化組織干擾。將約20顆膠囊置于ATR晶體上以完全覆蓋并在100psi下得到光譜。從不同膠囊測得多個光譜以確認樣品群的均勻性并組合。將用于SEM測試的樣品置于線性排列的具有粘合劑涂裝的碳盤的鋁架(aluminummount)上，并且用金-鈀靶在真空下在氬氣氣氛中濺射涂裝。包覆的樣品用Hitachi2700在加速電壓5至8kV下檢測。在整個過程中使用數(shù)字抓圖。結(jié)論包囊前表征在包囊前，表征藻酸鹽各自的M:G比，蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素水平、粘度、和分子量。結(jié)果如以下表l所示表1.包囊前藻酸鹽表征。廠商說明作為對照包括于此。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>通常，除了pMan藻酸鹽的guluronicacid含量比預期的高以外，廠商提供的粗約的說明與用NMR得到的結(jié)果相似。各組的粘度(分子量的指標)相似，測定動態(tài)粘度。2種商業(yè)上純化的藻酸鹽在1.0%和25。C粘度最低(VPMG:25Cp;VPLG:22Cp)，但是室內(nèi)純化的藻酸鹽分別具有增加的較高粘度。所有組的蛋白質(zhì)也相對一致，除了pMan，其在86微克/毫升，具有其它材料的至少兩倍量。內(nèi)毒素水平趨于相似，觀察到pFlu和pMan組具有最高水平。由在9(TC測得的NMR譜積分的峰如圖1所示。該譜在90°C由其中一個樣品測得，示出較早所述的三個峰，其中峰A代表G1的質(zhì)子共振，峰B代表M1和GM5，和峰C代表GG5。溶劑HDO中存在的質(zhì)子峰如所示為4.7ppm。應(yīng)當注意，為了進一步闡明藻酸鹽峰，除HDO峰以外在9(TC的整個光譜相對室溫條件向低場移動0.8ppm。分子量用GPC評估，并列于上表l中。通常，重均分子量Mw與粘度很相關(guān)，如Sakurade-Houwink方程["=,"]所預測。pMan具有最高的分子量609KDa，其它組的分子量范圍為317-534KDa。如期望的對天然合成的生物聚合物，這些樣品的多分散性指數(shù)，或Mw/Mn說明樣品的多態(tài)性有所變化。此處VPMG、VPLG、和pKel組顯示出最窄的分布，而pFlu和pMan具有最高的多分散性。使用ATR-FTIR表征官能團。除了使用來自以前報道發(fā)現(xiàn)的吸收值，還使用FTIR來研究藻酸鹽和聚陽離子膠囊(35)，我們確認關(guān)于均勻凍干的PLO:藻酸鹽沉淀以及原材料的報道的發(fā)現(xiàn)范圍。為了正確評估隨時間的表面變化，可以進行這些以表征膠囊的外表面的兩種組分的相關(guān)性。原材料光譜如圖2a所示，在兩個樣品中顯示出的許多峰。以下表2列出一些在這些樣品中檢測到的相關(guān)峰，以及藻酸鹽和藻酸鹽-PLO中的相關(guān)官能團。圖2b示出目的臨界面積的不同，特別是與PLO的酰胺II鍵相關(guān)的羰基區(qū)域(1550cm—1)，以及糖醛酸的羧酸部分(1590cm—1)。與單獨的藻酸鹽相比，藻酸鹽/PLO的-NH和-CH2吸收存在不同，但程度較低。表2.藻酸鹽和藻酸鹽-PLO樣品的FTIR峰。對應(yīng)的官能團如最右列所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>增加PLO對樣品表面的影響如圖2c和2d所示。圖2c所示的光譜說明隨著樣品中的PLO減少，與PLO酰胺II在1550cm"的吸收相關(guān)的峰的振幅減少。定量地，這種關(guān)系可以通過酰胺n吸收曲線下的面積與藻酸鹽COCT吸收曲線下的面積的比表示。隨著樣品中的PLO增加，比率線性增加，如圖2d所示。這些樣品不含鈣，但是移植的膠囊含有它，其可以影響光譜位移(35)和吸收峰的準確位置。無論如何，這種觀察表示可以用這種方法檢測到相關(guān)組合物中的小變化。微囊包封表征在凍干前分析在包囊后新鮮收集的膠囊的幾何和形態(tài)。用圖像分析測量直徑、交叉部分均勻性和壁厚(下表3)。微膠囊配方尺寸上相似，且直徑上跨越約170微米的范圍。相似地，壁厚范圍較窄，為18.0至19.7微米。表3.移植前微膠囊的幾何評估<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>在每個樣品群中，移植前膠囊形態(tài)特征在于具有均勻尺寸分布的好的圓形性(well-rounded)、光滑表面。有任何樣品組中，在膠囊壁的整個周長上交叉部分厚度是常數(shù)，且注意到?jīng)]有總體缺陷。在實驗開始，最單一分散的膠囊群是VPLG組，僅有0.07%的變化，pMan組變化最大，但是僅為1.6%。除了直徑以外，各組之間沒有觀察到明顯的形態(tài)差別。起始劑量膠囊(VPMG)的等分試樣的反襯法顯微圖像如圖3所示。此處，膠囊制備的對稱性和單一分散性本質(zhì)是明顯的。在實驗的開始，這對所有的組具有較高的代表性。移植的微膠囊的總體觀察和幾何在所有的組在所有的時間點發(fā)現(xiàn)移植入腹膜的膠囊位于網(wǎng)膜、肝門、腸系膜(intestinalmesentery)、和骨盆。偶爾在肝或腹腔后壁附近發(fā)現(xiàn)聚集物。在后一種情況下，膠囊聚集物作為二維餅或三維簇存在。僅將以自由漂浮形式重新得到的膠囊用于FTIR和SEM表征，其說明樣品的大多數(shù)。在14天時，所有的動物含有自由漂浮的處于以上所述區(qū)域的單個膠囊。在14天時，在pFlu和pMan組中觀察到膠囊的清晰度和圓形大大降低。它們在后來的每個時間點繼續(xù)變得更明顯。移植90天后，重新得到pMan組是困難的，因為發(fā)現(xiàn)大部分膠囊在1至3個的無定形的聚集物中，具有不確定的形狀和3維構(gòu)造。pFlu在相同的時間框架下變得更無定性化，但是程度比pMan低。在60天時，在pKd和VPLG組中都觀察到這種形態(tài)上的明顯變化，其中群的一部分除了內(nèi)部輕微的不透明外，還表現(xiàn)出變形。對照地，VPMG組在實驗期間保持形態(tài)，且即使90天也顯示沒有表明穩(wěn)定性喪失的表面總體不規(guī)則。在這個組中，在60天時開始存在一些內(nèi)部不透明。對照地，在60天時緊隨移植之后的代表性顯微圖像如圖4所示。測量膠囊以表征直徑以及交叉部分均勻性或同心度(concentricity)隨時間的變化。數(shù)據(jù)繪于圖5中。交叉部分均勻性，如圖5A所示，所有的組最初為100%，說明開始產(chǎn)品完全同心。經(jīng)過一定時間后，每個組中該值顯著下降，雖然VPMG組在整個期間保持在90。/。以上。交叉部分均勻性變化可以歸結(jié)于材料降解引起的變形，失去穩(wěn)定性和變得更易受物理壓力的影響。在pMan、pFlu和VPLG組中的這種變化的幅度最大。直徑隨時間的變化如圖5B所示。所有的組的直徑隨時間小幅增大，pMan組表現(xiàn)出最大的增大，在60天達到108%。直徑變化最初歸結(jié)于凝膠基體的膨脹，但也因為交叉部分均勻性降低，且一些基團發(fā)生變形，這也影響整個直徑。這也似乎是pMan組大幅增大的原因。最后，pKel組在60天至90天直徑縮小，支持導致膠囊縮小的降解機理。移植微膠囊表面的FTIR分析在凍干后移植的時間點，在每組膠囊的表面進行ATR-FTIR測量。如直觀地確認和用電子顯微鏡所示，粘于表面的細胞在凍干過程中脫粘(detach)，因此不影響表面。在整個期間，使用原材料產(chǎn)生的光譜以及其它地方報道的信息(35)來比較膠囊。特別地，如以前表2中所提及和強調(diào)的，使用1590cm—1/1640cm—1和1550cm"處(分別為藻酸鹽COO—和聚鳥氨酸C007酰胺II)的峰來區(qū)分最外層的表面化學性。暴露的與聚鳥氨酸相關(guān)的其它峰，例如在3062cm—1的-NH峰和在2920cm—1的-CH2峰強度較低，因此更難得到能重復的由積分得到的定量結(jié)果。圖6中對照示出相關(guān)峰。隨時間從時間0(頂)至90天(底)顯示峰。除了VPMG組，在所有的組中，表面上聚鳥氨酸的酰胺II組分的小肩峰成為清楚的第二峰，和在1640cm"的PLO峰出現(xiàn)，說明藻酸鹽和PLO的突出物在表面上發(fā)生表面侵蝕。在pMan和pFlu的情況下，36在30天時這種出現(xiàn)是清楚的，且在60天時達到它的最大振幅。pKd和VPLG提供附加的穩(wěn)定性，因為酰胺II峰直至60天沒有完全出現(xiàn)。重要地，VPMG組保持一致的表面化學性，證據(jù)是在90天時出現(xiàn)酰胺II肩峰。它的振幅的確隨時間慢慢增加，但是沒有觀察到完全離散的峰。為了定量表征這些化學吸收中的變化，隨時間將藻酸鹽-COO—和聚鳥氨酸-酰胺II峰下的面積積分并進行比較。計算在藻酸鹽峰下的面積與在聚鳥氨酸峰下的面積的比，如圖7所示。假設(shè)表面上藻酸鹽的量與表面上PLO的量的比與這兩個峰的比相關(guān)，及與在1640cm—1處的PLO羧基峰的總消失和出現(xiàn)的點相關(guān)，可以賦予表面上藻酸鹽降解數(shù)量相關(guān)的值作為相對穩(wěn)定性指數(shù)。使用該指數(shù)作為每個壁的多少出現(xiàn)在表面上的量度，其應(yīng)用由下述事實作為例證總體PLO:藻酸鹽樣品說明組合物和該比率間存在線性，且這些膠囊包括藻酸鹽和PLO的清楚的壁。如圖7所示，對所有的組這些峰的比率以相似的值(0.25±0.03)起始，在時間0時表現(xiàn)出均勻性。經(jīng)過90天峰振幅的變化(圖6)直接反映在此處計算的指數(shù)上。有3個組的材料，30天較快降解的那些材料(pMan，pFlu)，保持穩(wěn)定性至60天的那些材料(VPLG，pKel)，和在實驗期間是穩(wěn)定的那些材料(VPMG)。除了VPMG所有的組最初經(jīng)歷適度的降低，然后增加至約0.7至0.8。在該段時間內(nèi)VPMG的穩(wěn)定性指數(shù)表現(xiàn)出緩慢、連續(xù)地增加，至90天為0.4。這種聚鳥氨酸官能團對藻酸鹽官能團的相對比例的逐漸增加是線性的，且可以指示表面侵蝕機理。移植的微膠囊形態(tài)分析移植的微膠囊形態(tài)學的SEM分析包覆凍干的隊列，且用SEM掃描表面。最初放大100至200倍進行總體膠囊分析(bulkcapsuleanalysis)，然后在1000至2000倍進行表面的顯微分析。材料允許，如要求在5000至15000倍得到高倍放大圖像。在降解的材料的情況下，由于電子束對材料的損害常常不能達到這么高的放大倍數(shù)。在一些情況下，凍干過程中產(chǎn)生的碎片是不可避免的且包括在某些圖像中。將中等放大倍數(shù)圖像(1至2千倍)用作對照分析的總體，且列于圖8。通常，這些發(fā)現(xiàn)支持相反襯法光顯微鏡和表面穩(wěn)定性FTIR分析的總體形態(tài)學上的觀察。使用的放大倍數(shù)進一步允許表面上的微點和形態(tài)學中的微小變化的可視性。在第一個14天后所有的組具有極其光滑的表面，然后在各個時間點出現(xiàn)表面缺陷。侵蝕30天，pMan和pFlu都表現(xiàn)出表面極度的降解，持續(xù)降解至90天。在30天，表面中的小孔逐漸變大，且離散的藻酸鹽和PLO層分開。這種侵蝕最初可能出現(xiàn)在14天至30天，但是在形態(tài)上沒有捕捉到。pKd和VPLG顯示相似的表面侵蝕進展，但是，在30天時間點揭示表面凹坑形式的降解的開始。在90天內(nèi)，這些凹坑，如圖9以高倍放大顯示的，發(fā)展成小洞尺寸連續(xù)增加。在實驗期間，雖然表面的表面明顯起皺現(xiàn)象的水平在60天進一歩在90天增加，VPMG保持完全光滑的表面。這可能是凍干過程中產(chǎn)生的人造品，但可能與膠囊隨時間的物理完整性相關(guān)。在這些時間點，其它材料也是如此高度降解，這可能掩蓋整體變形。實施例2:聚陽離子PLO(聚-L-鳥氨酸)的表征藻酸鈣的聚陰離子(polyanionic)核要求聚陽離子包覆以對強度和生物相容性膠囊的半透特征做出貢獻。聚陽離子作為混合的各種長度(因此為各種分子量的)分子種類的群存在。進行研究以確定優(yōu)選的PLO分子量種類。如實施例l所述，用不同批的PLO制造生物膠囊以得到其中包囊的細胞或珠處于中心且不損害膠囊壁的膠囊。高MW種類如下表4所概述的，當PLO的組合物不含有大于42KDa的高分子量種類時，生物膠囊是任選地完整無缺的。平均MW為42KDa和56KDa的PLO產(chǎn)生相互粘接形成塊的不能接受的膠囊。表4使用低分子量PLO的最優(yōu)膠囊PLO平均Mw包囊的細胞的位置膠囊整體性23KDa裝滿:SL01674細胞處于中心位置，且不突出進入膠囊壁，僅6°/。的膠囊具有處于周圍的細胞，但沒有一個突出在膠囊壁上膠囊的2%隱藏(pockets)，沒有膠囊成塊42KDa細胞處于中心位置，且不突出進入膠囊壁膠囊成塊56,4KDa細胞處于中心位置，且不突出進入膠囊壁膠囊成塊38超低MW種類:使用具有阻攔10KDa分子量的膜的透析盒(Pierce,Slide-A-LyzerDialysisCassette,GammaIrradiated,10KMZCO，12-30ml，Rockford,IL61105，USA)，對預期MW為23KDa的一批性能差的PLO進行透析。用已經(jīng)透析以移除小于10KDa的多肽的PLO批次得到高級膠囊。如表5所示。表5使用不含超低分子量種類的PLO得到的最優(yōu)膠囊<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>分子量多分散性各批PLO的多分散性分析顯示聚陽離子是作為一定分子量范圍的多肽的混合物供應(yīng)的(表6)。以用不同批的PLO制造的生物膠囊的質(zhì)量計，PLO批的分子量分布的曲線應(yīng)排除在分子尺寸范圍的兩極的分子量種類?？赡艿贸鼋Y(jié)論最優(yōu)PLO組合物具有小于1.5多分散性比率(定義為平均Mw與中值Mw的比率)，優(yōu)選小于1.1。表6PLO的多分散性(MW/MN)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>討論在膠囊?guī)缀魏退鼈兊哪途眯砸约绑w內(nèi)功能性方面，含最高水平的甘露糖醛酸殘基(VPMG)的純化的藻酸鹽和多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子劑生產(chǎn)出優(yōu)于其它現(xiàn)有技術(shù)微膠囊以及其它試驗的純化的藻酸鹽的微膠囊。工業(yè)應(yīng)用為了疾病或不適的治療，本發(fā)明的組合物可用于形成免疫隔離微膠囊，該微膠囊用于傳遞能分泌治療劑的活細胞，或傳遞治療劑本身。上述僅有的實施例不是用來限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，可進行許多變化而不偏離權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的范圍。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丙烯酰氧乙基三甲基銨溴化物、聚烯丙胺、聚酰胺、聚胺、聚凝胺、聚丙烯酸丁酯-共聚-甲基丙烯酰氧乙基三甲基銨溴化物(80/20)、聚-3-氯-2-羥丙基甲基丙烯酰-氧乙基二甲基銨氯化物、聚二烯丙基二甲基銨、聚二烯丙基二甲基銨氯化物、聚二烯丙基二甲基銨氯化物-共聚-丙烯酰胺、聚二烯丙基二甲基銨氯化物-共聚-N-異丙基丙烯酰胺、聚二甲基胺-共聚-環(huán)氧氯丙烷、聚二甲基氨乙基丙烯酸酯-共聚-丙烯酰胺、聚二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯、聚二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯亞胺、聚乙烯亞胺-環(huán)氧氯丙烷改性的、聚乙烯亞胺、聚-2-羥基-3-甲基丙烯酰氧丙基三甲基銨氯化物、聚-2-羥基-3-甲基丙烯酰氧乙基、三甲基銨氯化物、聚hdroxypr叩ly甲基丙烯酰氧乙基二甲基銨氯化物、Polyimadazoline(四價的)、聚-2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基銨溴化物、聚niethacryl氧乙基三甲基銨溴化/氯化物、聚甲基二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯-共聚-丙烯酰胺、聚-l-甲基-2-乙烯基吡啶鐺溴化物、聚—1—甲基-4-乙烯基吡啶鎿溴化物、聚亞甲基-共聚-鹽酸胍、聚乙烯胺、聚-N-乙烯基吡咯垸酮-共聚-二甲基aminoelhyl-甲基丙烯酸酯、或聚-4-乙烯基芐基三甲基銨氯化物、或聚-4-乙烯基芐基三甲基銨氯化物。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中聚陽離子是平均分子量為約10-40KDa的聚-L-鳥氨酸。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中平均分子量為約15KDa至30KDa。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中平均分子量為20KDa至25KDa并含有小于20%的10KDa或更小的分子量種類。10、根據(jù)權(quán)利要求1至9中的任一項所述的組合物，其中甘露糖醛酸藻酸鹽與聚陽離子的比率為約5:1至約10:1。11、根據(jù)權(quán)利要求1至10中的任一項所述的組合物，其進一步包括小于約1%的氯化轉(zhuǎn)和/或氯化鈉。12、一種生物相容性微膠囊，其包括用陽離子交聯(lián)劑交聯(lián)的高甘露糖醛酸藻酸鹽的核層，聚陽離子形成半透膜的中間層，和高甘露糖醛酸藻酸鹽外層，其中核層和外層中的高甘露糖醛酸藻酸鹽是相同或不同的，且含有約50%至約95。％的甘露糖醛酸殘基。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的生物可比較微膠囊，其中高甘露糖醛酸藻酸鹽的平均分子量大于約400KDa且聚陽離子劑的平均分子量為10KDa至40KDa。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物可比較微膠囊，其中高甘露糖醛酸藻酸鹽的平均分子量大于約600KDa且聚陽離子劑的平均分子量為15KDa至30KDa。15、根據(jù)權(quán)利要求12所述的生物可比較微膠囊，其中交聯(lián)劑選自下歹U的鹽Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、HT、K+、Li+、Mg2+、Mn2+、Na+、NH4+、Ni2+、Pb2+、Sn2+或Zn2+。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的生物可比較微膠囊，其中交聯(lián)劑是氯化鈣。17、根據(jù)權(quán)利要求12至16中任一項所述的生物可比較微膠囊，其中中間層的厚度為約10微米至約80微米。18、根據(jù)權(quán)利要求12至17中任一項所述的生物可比較微膠囊，其中用螯合劑解聚核層以形成中空的核。19、根據(jù)權(quán)利要求18所述的生物可比較微膠囊，其中螯合劑選自擰檬酸鈉或EDTA。20、根據(jù)權(quán)利要求12至19中任一項所述的生物可比較微膠囊，其中核層與中間層的比率以重量計為約7:1至約8:1。21、根據(jù)權(quán)利要求12至20中任一項所述的生物可比較微膠囊，其中外層與中間層的比率以重量計為約1.5:1至約1.4:1。22、根據(jù)權(quán)利要求12至21中任一項所述的生物可比較微膠囊，其包括處于核層的活細胞。23、根據(jù)權(quán)利要求22所述的生物可比較微膠囊，其中細胞選自自然存在或基因改變的細胞。24、根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物可比較微膠囊，其中細胞以單細胞和/或細胞簇的形式存在，選自P胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞、或能分泌在疾病或癥狀的處理中有用的因子的任何其它細胞類型。25、根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物可比較微膠囊，其中神經(jīng)元細胞選自脈絡(luò)叢細胞、垂體細胞、chromafin細胞、或軟骨細胞。26、根據(jù)權(quán)利要求12至25中任一項所述的生物可比較微膠囊，其直徑為50微米至2000微米。27、制備生物相容性微膠囊的方法，包括以下步驟a)將含高甘露糖醛酸的藻酸鹽溶于等滲鹽水中，至濃度為約1.0%至2.0%W/V;b)通過基于空氣或頻率的液滴產(chǎn)生器將步驟a)的溶解的藻酸鹽溶液噴灑入交聯(lián)劑過量的攪拌溶液中，以形成凝膠膠囊；c)用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子包覆歩驟b)的凝膠膠囊；d)將高甘露糖醛酸藻酸鹽溶解于等滲鹽水中，至濃度為約0.01至約1.7。/。w/v，并最終包覆步驟c)的膠囊；和e)收集微膠囊；其中在步驟a)和d)中使用的含高甘露糖醛酸的藻酸鹽是相同或不同的，并含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基。28、根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中步驟b)包括在約15mM至約120mM氯化鈣中攪拌約5至約30分鐘。29、根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中步驟b)包括在約110mM氯化鈣中攪拌約5至約10分鐘。30、根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中步驟c)包括用聚-L-鳥氨酸在濃度為約0.02%至約0.10。/。(w/v)下在約1至約45分鐘內(nèi)包覆膠囊。31、根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為約10KDa至40KDa。32、根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為約15KDa至30KDa。33、根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為20KDa至25KDa，并含有小于20%的10KDa或更小的分子量種類。34、根據(jù)權(quán)利要求30-33中任一項所述的方法，其中步驟c)包括用聚-L-鳥氨酸在濃度為約0.05%(w/v)下，在約10分鐘內(nèi)包覆膠囊。35、根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中步驟d)中最終高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆溶液以0.02%至約1.0%w/v的濃度在約5至約30分鐘內(nèi)應(yīng)用。36、根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中歩驟d)包括將最終高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆溶液以約0.05%w/v的濃度在5至約10分鐘內(nèi)應(yīng)用。37、根據(jù)權(quán)利要求27-36中任一項所述的方法，其中步驟a)和步驟d)的高甘露糖醛酸藻酸鹽溶液是相同的或不同的，并包括約50%至約70%的甘露糖醛酸殘基。38、制備微囊包封的細胞的方法，包括以下步驟a)在濃度為約1.0%至2.0%w/v的含高甘露糖醛酸的藻酸鹽的等滲鹽水溶液中培養(yǎng)活細胞；b)通過基于空氣或頻率的液滴產(chǎn)生器，將步驟c)的含細胞的藻酸鹽溶液噴灑入交聯(lián)劑過量的攪拌溶液中，以形成含細胞的凝膠膠囊；c)用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子包覆步驟b)的含細胞的凝膠膠囊；d)將含高甘露糖醛酸的藻酸鹽溶解于等滲鹽水中，至濃度為約0.01至約1.7。/。w/v，最終包覆步驟c)的含細胞的膠囊；禾口e)收集含細胞的微膠囊；其中步驟a)和b)的含高甘露糖醛酸的藻酸鹽是相同或不同的，含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基。39、根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中步驟b)包括在約15mM至約120mM的氯化l丐中攪拌約5至約30分鐘。40、根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中歩驟b)包括在約110mM的氯化鈣中攪拌約5至約10分鐘。41、根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中步驟c)包括用聚-L-鳥氨酸在濃度為約0.02%至約0.10%(w/v)下，在約1至約45分鐘內(nèi)包覆膠囊。42、根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中步驟c)包括用聚-L-鳥氨酸在濃度為約0.05%(w/v)下，在約10分鐘內(nèi)包覆膠囊。43、根據(jù)權(quán)利要求40或41所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為10KDa至40KDa。44、根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為15KDa至30KDa。45、根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為20KDa至25KDa，并含有小于20%的10KDa或更小的分子量種類。46、根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中步驟d)中最終高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆溶液以0.02%至約1.0%w/v的濃度在約5至約30分鐘內(nèi)應(yīng)用。47、根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中步驟d)包括將最終高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆溶液以約0.05%w/v的濃度在5至約10分鐘內(nèi)應(yīng)用。'48、根據(jù)權(quán)利要求38-47中任一項所述的方法，其中步驟a)和步驟d)的高甘露糖醛酸藻酸鹽溶液是相同的或不同的，并包含約50%至約70%的甘露糖醛酸殘基。49、包覆不可降解細胞傳遞構(gòu)造的方法，其包括以下步驟a)將不可降解細胞傳遞構(gòu)造沉浸在含高甘露糖醛酸的藻酸鹽溶于等滲鹽水至濃度為1.0%至2.0%w/v的溶液中；b)將步驟a)的構(gòu)造沉浸在含過量交聯(lián)劑的溶液中，以形成凝膠包覆層；c)用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子進一步包覆歩驟b)的凝膠構(gòu)造；d)將含高甘露糖醛酸的藻酸鹽溶解于等滲鹽水中，至濃度為約0.01至約1.7%w/v，并用作最終包覆以產(chǎn)生免疫隔離膜包覆的不可降解細胞傳遞構(gòu)造；和e)分離免疫隔離膜包覆的不可降解細胞傳遞構(gòu)造；其中在歩驟a)和d)中的含高甘露糖醛酸的藻酸鹽是相同或不同的，且含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基。50、根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中歩驟b)包括在約15mM至約120mM的氯化鈣中攪拌約5至約30分鐘。51、根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中步驟b)包括在約110mM的氯化鈣中攪拌約5至約10分鐘。52、根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中步驟c)包括用聚-L-鳥氨酸在濃度為約0.02%至約0.10%(w/v)下在約1至約45分鐘內(nèi)包覆膠53、根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中步驟c)包括用聚-L-鳥氨酸在濃度為約0.05%(w/v)下在約IO分鐘內(nèi)包覆膠囊。54、根據(jù)權(quán)利要求52或53所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為10KDa至40KDa。55、根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為15KDa至30KDa。56、根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為20KDa至25KDa，并含有小于20%的10KDa或更小的分子量種類。57、根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中步驟d)中最終高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆溶液以0.02%至約1.0%w/v的濃度在約5至約30分鐘內(nèi)應(yīng)用。58、根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中步驟d)包括將最終高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆溶液以約0.05%w/v的濃度在5至約10分鐘內(nèi)應(yīng)用。59、根據(jù)權(quán)利要求49至58中任一項所述的方法，其中步驟a)和步驟d)的高甘露糖醛酸藻酸鹽溶液是相同的或不同的，并包含約50%至約70%的甘露糖醛酸殘基。60、包囊小分子、蛋白質(zhì)或DNA治療劑的方法，包括以下步驟a)將小分子、蛋白質(zhì)或DNA治療劑分散在含高甘露糖醛酸的藻酸鹽溶于等滲鹽水至濃度為1.0。/。至2.0。/。w/v的溶液中；b)通過基于空氣或頻率的液滴產(chǎn)生器，將步驟a)含治療劑的藻酸鹽溶液噴灑入交聯(lián)劑過量的攪拌溶液中，以形成含治療劑的凝膠膠囊；c)用多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子包覆步驟b)的含治療劑的凝膠膠囊；d)將溶解于等滲鹽水中至濃度為約0.01至約1.7%w/v的最終的含高甘露糖醛酸的藻酸鹽包覆層應(yīng)用到步驟c)的含治療劑的膠囊；和e)收集含治療劑的微膠囊；其中在歩驟a)和d)中的含高甘露糖醛酸的藻酸鹽是相同或不同的，并含有約50%至約95%的甘露糖醛酸殘基。61、根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中歩驟b)包括在約15mM至約120mM的氯化鈣中攪拌約5至約30分鐘。62、根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中歩驟b)包括在約110mM的氯化l丐中攪拌約5至約10分鐘。63、根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中歩驟c)包括用聚-L-鳥氨酸在濃度為約0.02%至約0.10%(w/v)下在約1至約45分鐘內(nèi)包覆膠64、根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中步驟c)包括用聚-L-鳥氨酸在濃度為約0.05%(w/v)下在約IO分鐘內(nèi)包覆膠囊。65、根據(jù)權(quán)利要求52或53所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為10KDa至40KDa。66、根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為15KDa至30KDa。67、根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中聚-L-鳥氨酸的平均分子量為20KDa至25KDa，并含有小于20%的10KDa或更小的分子量種類。68、根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中步驟d)中最終高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆溶液以0.02%至約1.0%w/v的濃度在約5至約30分鐘內(nèi)應(yīng)用。69、根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中步驟d)包括將最終高甘露糖醛酸藻酸鹽包覆溶液以約0.05%w/v的濃度在5至約10分鐘內(nèi)應(yīng)用。70、根據(jù)權(quán)利要求60至69中任一項所述的方法，其中步驟a)和步驟d)的高甘露糖醛酸藻酸鹽溶液是相同的或不同的，并包含約50%至約70%的甘露糖醛酸殘基。71、根據(jù)權(quán)利要求25至37中的任一項所述的方法制備的生物相容性微膠囊。72、根據(jù)權(quán)利要求38至48中的任一項所述的方法制備的含細胞微膠囊。73、根據(jù)權(quán)利要求49至59中的任一項所述的方法制備的免疫隔離膜包覆的不可降解的細胞傳遞構(gòu)造。74、根據(jù)權(quán)利要求60至70中的任一項所述的方法制備的含治療劑的微膠囊。75、改善或治療受試者的疾病或癥狀的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求22至25或72中任一項所述的含細胞微膠囊的植入所述受試者體內(nèi)，此時所述細胞分泌對改善或治療所述疾病或癥狀有效的治療劑。76、改善或治療受試者的疾病或癥狀的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求74所述的含治療劑微膠囊移植入所述受試者體內(nèi)，此時所述治療劑對改善或治療所述疾病或癥狀有效。77、含高甘露糖醛酸的藻酸鹽和聚陽離子在用于同種異體或異種移植的微膠囊的制備中的應(yīng)用。78、含高甘露糖醛酸的藻酸鹽、聚陽離子和活細胞在含細胞生物相容性微膠囊的制備中的應(yīng)用，該微膠囊用來治療或改善受試者需要治療或改善的疾病或癥狀，其中所述活細胞分泌對改善或治療所述疾病或癥狀有效的治療劑。79、含高甘露糖醛酸的藻酸鹽、聚陽離子和治療劑在含治療劑生物相容性微膠囊的制備中的應(yīng)用，該微膠囊用來治療或改善受試者需要治療或改善的疾病或癥狀，其中所述治療劑對改善或治療所述疾病或癥狀有效。80、根據(jù)權(quán)利要求75或78所述的方法或應(yīng)用，其中所述活細胞包括P胰島細胞，所述疾病或癥狀是糖尿病。81、根據(jù)權(quán)利要求75和78所述的方法或應(yīng)用，其中所述活細胞包括肝細胞，所述疾病或癥狀是肝的疾病或不適。82、根據(jù)權(quán)利要求75或78所述的方法或應(yīng)用，其中所述活細胞包括選自以下的神經(jīng)元細胞脈絡(luò)叢細胞、垂體細胞、chromafm細胞、軟骨細胞，和任何其它能分泌神經(jīng)元因子的神經(jīng)元細胞，且所述疾病或癥狀是神經(jīng)病學上的疾病或癥狀。全文摘要本發(fā)明涉及一種組合物，其包括含高甘露糖醛酸的藻酸鹽和多分散性指數(shù)小于1.5的聚陽離子。所述組合物在制造含有用于同種異體或異種移植的活性細胞的生物相容性微膠囊中特別有用。與現(xiàn)有技術(shù)藻酸鹽微膠囊相比，這種微膠囊具有增強的耐久性并能長期保持它們的結(jié)構(gòu)和功能整體性。文檔編號C08B37/04GK101312736SQ200680039139公開日2008年11月26日申請日期2006年10月24日優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日發(fā)明者A·瓦斯康賽洛斯,B·賓茨,C·塔諾斯,D·埃默里奇,M·S·吉尼,P·L·J·坦,S·J·M·斯金納申請人:生命細胞產(chǎn)品有限公司