專利名稱：海帶硫酸多糖的降解方法
技術領域：
本發(fā)明屬于海洋生物技術領域，具體來說涉及海洋藥物的研究與開發(fā)，特 別涉及一種海帶硫酸多糖的降解方法。
背景技術：
海帶硫酸多糖(Laminariapolysaccharide sulfate, LPS)是一種含有多種 單糖和硫酸基的水溶性雜多糖。海帶中LPS的含量隨其種類、產(chǎn)地、季節(jié)和 植物體不同部位而變化，LPS具有多種生物學功能，如抗腫瘤、抗病毒、降血 糖血脂作用、免疫調節(jié)作用及調節(jié)細胞增殖作用。
不同來源的LPS，其結構、單糖組成和硫酸基含量各有差異。LPS的生物 活性不僅與鏈中硫酸基的含量有關，而且與其分子質量密切相關。LPS分子質 量越大，分子體積越大，越不利于多糖跨越多重細胞膜障礙進入生物體內發(fā)揮 生物學活性。天然的LPS由于分子量大(從幾十萬至兒百萬)，其溶解性差， 導致其應用受到很大的限制。
將大分子質量的海藻硫酸多糖降解后， 一般能顯著提高其活性，如低分子 量的螺旋藻多糖的硫酸酯化物比高分子量的具有更良好的體外抗腫瘤活性。又 如，普通肝素經(jīng)化學解聚或酶催化降解后，得到的低分子量肝素(LMWH) 及肝素寡糖，由于其分子量減小至(2 8) X103，因而表現(xiàn)出較好的生物藥 效，并且減少了毒作用。與普通肝素比較，LMWH作用時間長，生物利用度 高，超低分子肝素被認為能夠抑制冠狀和外周動脈硬化的形成。因此，制備低 分子質量的多糖及其硫酸酯化物，成為新藥篩選的一個重要方向。但關于低分 子量海帶硫酸多糖(LPS)的研究還未有報道。
目前，國內外對多糖降解一般采用酸解法、堿解法、酶解法和超聲波降解 法。這些方法均存在以下不足
1、酸解法在酸性條件下，多糖降解產(chǎn)品分子量分布較難控制，特別是 硫酸基損失較大。 2、 堿解法在堿性條件下，往往引起酸性多糖的改性及硫酸基的脫落， 影響產(chǎn)品的活性，因此不適用于海藻硫酸多糖。
3、 酶解法是利用專一性糖苷酶通過開裂多糖中的某一糖苷鍵來達到降 解的目的。但是由于酶的專一性強，因此不具有廣泛的適用性，而且酶生產(chǎn)周 期長，成本高，容易失去活性。這些缺點都使得該法目前無法推廣應用。
4、 物理降解法包括超聲波和微波等方法。這兩種方法由于能耗高，儀 器設備條件要求高，樣品處理量小，目前無法應用于工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種海帶硫酸多糖的降解方 法，該方法降解速度快，試劑用量極少，工藝簡單，成本低廉，多余過氧化氫 容易分解去除，硫酸基和總糖含量基本保持不變，且分子量分布集中，分子量 范圍可以控制。
本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn) 一種海帶硫酸多糖的降解方法，其 特征在于首先從海帶中提取并分離海帶硫酸多糖，然后通過過氧化氫降解得到 低分子量海帶硫酸多糖。
上述海帶硫酸多糖的過氧化氫降解方法，包括下述具體步驟
(1) 海帶硫酸多糖的分離純化
取海帶用水浸泡溶脹后將海帶粉碎，于95 10(TC加熱提取2 6h，冷卻
后過濾，取濾液加入氯化鈣后離心，取上清液，向上清液中加入質量分數(shù)為
2% 6%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液與海帶硫酸多糖結合得到懸 浮液，所加入的十六烷基三甲基溴化銨的質量為多糖質量的30% 150%。將 上述懸浮液加入離心機中離心沉淀，收集十六烷基三甲基溴化銨-海帶硫酸多 糖沉淀物，加入氯化鈣鹽解，使海帶硫酸多糖游離釋放出來，然后加入乙醇使 海帶硫酸多糖析出，離心沉淀得沉淀物，將所得沉淀物干燥即得到純凈的海帶 硫酸多糖；
(2) 海帶硫酸多糖的過氧化氫降解
取經(jīng)步驟(1)純化后的海帶硫酸多糖溶解于水中，制成一定濃度的海帶 硫酸多糖溶液；然后向海帶硫酸多糖溶液加入過氧化氫，攪拌均勻后使體系中 過氧化氫的質量分數(shù)為5% 10%;使其在80 95。C下降解0.5 3小時；反
應完畢后，冷卻至室溫，用0.1 5 mol/L NaOH溶液調節(jié)多糖溶液pH值至6.0 8.0;將上述多糖溶液濃縮至原體積的1/2 1/4;冷卻后用3 5倍量無水乙醇 沉淀多糖，放置過夜后抽濾得到的沉淀物干燥，得到平均分子量為2000 20000的低分子量海帶硫酸多糖產(chǎn)物。
所述步驟(1)中海帶硫酸多糖的平均分子量在5萬 150萬之間，硫酸 基含量為3% 30%。
所述歩驟(2)中海帶硫酸多糖溶液中海帶硫酸多糖的質量分數(shù)為2% 8%。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下突出的優(yōu)點及有益效果
(1) 本發(fā)明所使用的方法降解速度快，試劑用量極少，工藝簡單，成本
低廉；
(2) 多余過氧化氫容易分解去除，沒有引入新的雜質，純度高；
(3) 硫酸基和總糖含量基本保持不變，且分子量分布集中，分子量范圍 可以控制；
(4) 由于過氧化氫的漂白作用，所得低分子量硫酸多糖樣品外觀潔白。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1 (1)海帶硫酸多糖的分離純化
取海帶加水浸泡2h，溶脹后的海帶粉碎成海帶漿。于95。C加熱提取6h， 冷至室溫進行過濾。取濾液加入氯化鈣，離心去除海藻酸鈣。向上清液中加入 濃度為3%(質量分數(shù))的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)溶液與LPS結合沉 淀，CTAB的加入質量為多糖質量的40%。 3 000 min離心10 min，收集 CTAB-LPS沉淀物。加入氯化鈣進行鹽解，將LPS游離釋放出來，然后加入 乙醇使LPS析出，經(jīng)離心烘干得純凈的LPS。其平均分子量為17.2萬，主要 為ct -1,4-L古羅糖醛酸和3 -1，4-0-甘露糖醛酸為單體構成的嵌段共聚物、a -L-巖藻糖-4-硫酸酯的多聚物和P -D-吡喃葡萄糖的多聚物組成，硫酸基含量為 25%。 (2)海帶硫酸多糖的過氧化氫降解
稱取上述海帶硫酸多糖12g，加熱溶解于300mL蒸餾水中，攪拌均勻制 成海藻硫酸多糖溶液；然后迅速加入100mL質量分數(shù)為30%過氧化氫，攪拌 均勻后最終體系中過氧化氫濃度為5%;控制降解反應的溫度為S5。C，降解 2.5小時；冷卻后用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)多糖溶液pH值至7.0，在65°C 減壓旋轉蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/4，用3倍量無水乙醇沉淀降解產(chǎn)物。抽濾， 沉淀真空干燥，得到小分子量海帶硫酸多糖，其平均分子量為3200，硫酸基 含量為24%。
實施例2
(1) 海帶硫酸多糖的分離純化 取海帶加水浸泡2h，溶脹后的海帶粉碎成海帶漿。于ioo r:加熱提取2h，
冷至室溫進行過濾。取濾液加入氯化鈣，離心去除海藻酸鈣。向上清液中加入
濃度為4%(質量分數(shù))的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)溶液與LPS結合沉 淀，CTAB的加入質量為多糖質量的110%。 3 000 r/min離心10min，收集 CTAB-LPS沉淀物。加入氯化鈣進行鹽解，將LPS游離釋放出來，然后加入 乙醇使LPS析出，經(jīng)離心烘干得純凈的LPS。其平均分子量為25.3萬，主要 為a -1,4-L古羅糖醛酸和P -1,4-0-甘露糖醛酸為單體構成的嵌段共聚物、a -L-巖藻糖-4-硫酸酯的多聚物和3 -D-吡喃葡萄糖的多聚物組成，硫酸基含量為 16%。
(2) 海帶硫酸多糖的過氧化氫降解 稱取上述海帶硫酸多糖24g，加熱溶解于300mL蒸餾水中，攪拌均勻制
成海藻硫酸多糖溶液；然后迅速加入200mL質量分數(shù)為30Q/c)過氧化氫，攪拌 均勻后最終體系中過氧化氫濃度為10%;控制降解反應的溫度為90°C，降解 l小時；冷卻后用3 mol/L的NaOH溶液調節(jié)多糖溶液pH值至6.0，在55°C 減壓旋轉蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/2，用5倍量無水乙醇沉淀降解產(chǎn)物。抽濾， 沉淀真空干燥，得到小分子量海帶硫酸多糖，其平均分子量為9550，硫酸基 含量為15%。
實施例3
(1) 海帶硫酸多糖的分離純化
取海帶加水浸泡2h，溶脹后的海帶粉碎成海帶漿。于100 'C加熱提取4h， 冷至室溫進行過濾。取濾液加入氯化鈣，離心去除海藻酸鈣。向上清液中加入 濃度為5%(質量分數(shù))的CTAB (十六垸基三甲基溴化銨)溶液與LPS結合沉 淀，CTAB的加入質量為多糖質量的150% 。 3 000 /V min離心10 min，收集 CTAB-LPS沉淀物。加入氯化鈣進行鹽解，將LPS游離釋放出來，然后加入 乙醇使LPS析出，經(jīng)離心烘干得純凈的LPS。其平均分子量為150萬，主要 為a -1,4-L古羅糖醛酸和3 -1，4-0-甘露糖醛酸為單體構成的嵌段共聚物、a -L-巖藻糖-4-硫酸酯的多聚物和e -D-吡喃葡萄糖的多聚物組成，硫酸基含量為 5%。
(2) 海帶硫酸多糖的過氧化氫降解 稱取上述海帶硫酸多糖24g，加熱溶解于300mL蒸餾水中，攪拌均勻制
成海藻硫酸多糖溶液；然后迅速加入150mL質量分數(shù)為30Q/。過氧化氫，攪拌 均勻后最終體系中過氧化氫濃度為9%;控制降解反應的溫度為90°C，降解l 小時；冷卻后用5mol/L的NaOH溶液調節(jié)多糖溶液pH值至8.0，在50°C減 壓旋轉蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/2，用5倍量無水乙醇沉淀降解產(chǎn)物。抽濾， 沉淀真空干燥，得到小分子量海帶硫酸多糖，其平均分子量為20000，硫酸基 含量為4.5%。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1、一種海帶硫酸多糖的降解方法，其特征在于首先從海帶中提取并分離海帶硫酸多糖，然后通過過氧化氫降解得到低分子量海帶硫酸多糖。
2、 根據(jù)權利要求1所述的海帶硫酸多糖的降解方法，其特征在于包括下述具體步驟(1) 海帶硫酸多糖的分離純化取海帶用水浸泡溶脹后將海帶粉碎，于95 10(TC加熱提取2 6h，冷卻 后過濾，取濾液加入氯化鈣后離心，取上清液，向上清液中加入質量分數(shù)為 2% 6%的十六烷基三甲基溴化銨溶液與海帶硫酸多糖結合得到懸浮液，所加 入的十六烷基三甲基溴化銨的質量為多糖質量的30% 150%，將上述懸浮液 加入離心機中離心沉淀，收集十六烷基三甲基溴化銨-海帶硫酸多糖沉淀物， 加入氯化鈣鹽解，使海帶硫酸多糖游離釋放出來，然后加入乙醇使海帶硫酸多 糖析出，離心沉淀得沉淀物，將所得沉淀物干燥即得到純凈的海帶硫酸多糖；(2) 海帶硫酸多糖的過氧化氫降解取經(jīng)步驟(1)純化后的海帶硫酸多糖溶解于水中，制成一定濃度的海帶 硫酸多糖溶液；然后向海帶硫酸多糖溶液加入過氧化氫，攪拌均勻后使體系中 過氧化氫的質量分數(shù)為5% 10%;使其在80 95°C下降解0.5 3小時；反 應完畢后，冷卻至室溫，用0.1 5mol/LNaOH溶液調節(jié)多糖溶液pH值至6.0 8.0;將上述多糖溶液濃縮至原體積的1/2 1/4;冷卻后用3 5倍量無水乙醇 沉淀多糖，放置過夜后抽濾得到的沉淀物干燥，得到平均分子量為2000 20000的低分子量海帶硫酸多糖產(chǎn)物。
3、 根據(jù)權利要求2所述的海帶硫酸多糖的降解方法，其特征在于所述 步驟(1)中海帶硫酸多糖的平均分子量在5萬 150萬之間，硫酸基含量為 3% 30%。
4、 根據(jù)權利要求2所述的海帶硫酸多糖的降解方法，其特征在于所述步驟(2)中海帶硫酸多糖溶液中海帶硫酸多糖的質量分數(shù)為2% 8%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海帶硫酸多糖的降解方法，其特征在于首先從海帶中提取并分離海帶硫酸多糖，然后通過過氧化氫降解得到低分子量海帶硫酸多糖。該方法降解速度快，試劑用量極少，工藝簡單，成本低廉，多余過氧化氫容易分解去除，硫酸基和總糖含量基本保持不變，且分子量分布集中，分子量范圍可以控制。由于過氧化氫的漂白作用，所得低分子量硫酸多糖樣品外觀潔白。
文檔編號C08B37/00GK101168570SQ20071003139
公開日2008年4月30日 申請日期2007年11月15日 優(yōu)先權日2007年11月15日
發(fā)明者歐陽健明, 淼 王 申請人:暨南大學