專利名稱：季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，具體是一種季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖是一種帶正電荷的天然多糖，無(wú)毒、無(wú)刺激性、無(wú)致敏性、無(wú)致突變作用，具有良好的生物相容性和生物降解性。由于殼聚糖分子量大，所以只停留在膜的表面，不會(huì)滲透到膜的內(nèi)部，所以無(wú)毒副作用。殼聚糖的正電性特點(diǎn)使其在液態(tài)介質(zhì)中可與帶負(fù)電荷的聚合物、大分子甚至一些聚陰離子相互作用，由此發(fā)生的溶膠凝膠轉(zhuǎn)變過程則可方便地用于載藥納米微粒的制備。殼聚糖作為藥物載體可以控制藥物釋放、延長(zhǎng)藥物療效、降低藥物毒副作用，提高疏水性藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性和藥物的穩(wěn)定性及改變給藥途徑，還可以大大加強(qiáng)制劑的靶向給藥能力。近年來殼聚糖在靶向給藥輸送方面受到人們的關(guān)注。
然而，在中性或生理環(huán)境下(pH＝7.4)，殼聚糖將從溶液中沉淀出來，失去其正點(diǎn)特性。研究表明只有帶正電的，水溶性的殼聚糖才可打開上皮細(xì)胞的緊密聯(lián)結(jié)。季胺鹽改性的殼聚糖由于其具備永久正電性和生理環(huán)境下的水溶性引起了廣泛的研究興趣。殼聚糖的一些水溶性衍生物如N-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖(HTCC)，羧甲基殼聚糖以及它們的納米粒子已經(jīng)被制備和研究。其中季胺鹽殼聚糖因?yàn)槠淇咕院湍承┌邢蛐栽谥扑帉W(xué)上有更加廣泛的應(yīng)用。但是，由于殼聚糖C2-NH2跟環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)的反應(yīng)，殼聚糖制備的HTCC失去了殼聚糖本來的C2位上正電氨基。為了克服這個(gè)問題，我們合成了一種新型的殼聚糖季胺鹽O-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖(O-HTCC)，其合成條件是，保護(hù)殼聚糖的二位氨基的前提下，C6-OH跟GTMAC反應(yīng)。
保護(hù)殼聚糖二位氨基然后對(duì)殼聚糖六位上的羥基進(jìn)行季銨鹽改性，不僅克服了其在生理環(huán)境下的非溶解性，而且因?yàn)橐肓烁嗟恼姾?，被保護(hù)了的氨基也會(huì)在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下帶正電荷，所以將殼聚糖的季銨鹽制成載藥納米粒子后對(duì)藥物的包埋和負(fù)載以及在體內(nèi)的特意性靶向有更深的意義。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Yongmei Xu等在Biomaterials(《生物材料》)2003年24期5015-5022頁(yè)上發(fā)表的“Preparation and modification of N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan chloride nanoparticle as a protein carrier”(作為一種蛋白質(zhì)載體的N-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖納米粒子的制備和修飾)，該文中利用殼聚糖的二位氨基和環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)反應(yīng)，生成一種季胺鹽改性的殼聚糖即HTCC，其結(jié)果是在很大程度上提高了蛋白藥物的包封率，但是有較高的藥物突釋，用海藻酸鈉鹽和聚乙二醇改性后的HTCC納米粒子減少了蛋白藥物的突釋。其不足之處是由于二位氨基上的季胺化改性，此種季胺鹽(HTCC)納米粒子在溶液中喪失了二位氨基上的正電性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法。殼聚糖季胺鹽O-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖(O-HTCC)及其納米粒子，用其負(fù)載蛋白類大分子藥物以及小分子藥物，使其在獲得對(duì)多種藥物的緩釋效果的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)靶向釋放，不僅制備了殼聚糖季銨鹽載藥納米粒子，而且提高了殼聚糖納米粒子載藥以及單個(gè)和兩個(gè)季銨鹽殼聚糖載藥納米粒子釋放和載藥性能。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明具體包括如下步驟步驟一，首先是在保護(hù)2位氨基的條件下，在殼聚糖的6位羥基上引入季胺基團(tuán)，完成對(duì)殼聚糖上的C6-OH基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性，得到單季胺鹽改性殼聚糖(O-HTCC)或雙季胺鹽改性殼聚糖(Dia-O-HTCC)；步驟二，接著是在三聚磷酸鈉(TPP)存在下，且控制使季胺鹽改性殼聚糖/TPP＝6/1～3/1，室溫包藥2小時(shí)，完成制備載藥納米粒子。
步驟一中，所述的對(duì)殼聚糖上的C6-OH基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性，具體通過以下兩種方法中任一種進(jìn)行其方法(1)在酸性環(huán)境中乙醇做溶劑的條件下，苯甲醛同殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行Schiff堿(唏呋堿)反應(yīng)，然后用2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨與其C6-OH基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性，最后用濃鹽酸乙醇溶液恢復(fù)C2-NH2。
或其方法(2)采用苯甲醛同NH2基團(tuán)進(jìn)行Schiff堿反應(yīng)，然后對(duì)C6-OH基團(tuán)進(jìn)行羧甲基化，依次與硫酸二甲酯，3-二甲基丙胺以及2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨反應(yīng)，最后得到在C6-OH基團(tuán)上引入兩個(gè)季胺鹽的殼聚糖改性產(chǎn)物。
所述的方法(1)，具體是1)將殼聚糖溶于醋酸溶液中，加入一定體積的乙醇，攪拌下30min內(nèi)逐漸滴加苯甲醛，繼續(xù)攪拌1h后烘箱中(55℃～60℃)放置20h，加稀NaOH調(diào)至中性，析出沉淀，甲醇洗滌沉淀，得淺黃色固體N-苯亞甲基殼聚糖。
2)N-苯亞甲基殼聚糖在異丙醇中與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨70℃水浴反應(yīng)16h，依次用甲醇、丙酮洗滌沉淀得乳白色固體N-苯亞甲基殼聚糖-O-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨殼聚糖。
3)N-苯亞甲基殼聚糖-O-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶于鹽酸乙醇溶液，室溫?cái)嚢?4 h，膠狀物加水溶解，再用丙酮沉淀，固體于烘箱(80℃)中烘干，得淺黃色固體O-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨殼聚糖(O-HTCC)。反應(yīng)式如下 所述的方法(2)，具體步驟如下1)N-苯亞甲基殼聚糖溶于一定體積的異丙醇中，NaOH分五次加入，室溫下磁力攪拌30min，然后將氯乙酸間隔1min，分五次加入到溶液中，溫度升到60℃后繼續(xù)攪拌3h。過濾甲醇洗滌沉淀，60℃恒溫烘箱中烘干得N-苯亞甲基-O-羧甲基殼聚糖的合成(N-苯亞甲基-O-CMC)。
2)N-苯亞甲基-O-CMC在二甲亞砜溶劑中與硫酸二甲酯，45℃下加熱反應(yīng)24h，反應(yīng)完畢后，用鹽酸甲醇溶液分離，并真空烘干得N-苯亞甲基-O-羧甲基甲酯殼聚糖。
3)將N-苯亞甲基-O-羧甲基甲酯殼聚糖和3-二甲基丙胺甲醇做溶劑的條件下，0℃下反應(yīng)4小時(shí)，升溫至25℃下反應(yīng)24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-苯亞甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖。
4)將N-苯亞甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)，室溫堿性環(huán)境中反應(yīng)4h，再恒溫25℃反應(yīng)24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到C6-OH上帶兩個(gè)季胺鹽的改性殼聚糖N-苯亞甲基-O-雙季胺鹽殼聚糖。
5)將N-苯亞甲基-O-雙季胺鹽殼聚糖溶于鹽酸乙醇溶液，室溫?cái)嚢?4 h，膠狀物加水溶解，再用丙酮沉淀，固體于烘箱(80℃)中烘干，得白色固狀物即O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)。反應(yīng)式如下
步驟二中，所述的制備載藥納米粒子是通過下面任一方法實(shí)現(xiàn)的其方法(1)用粒子交聯(lián)法制備負(fù)載親水性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液將親水性藥物溶于三聚磷酸鈉(TPP)中，滴加三聚磷酸鈉溶液到季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液中進(jìn)行交聯(lián)。水溶性藥物阿司匹林溶于三聚磷酸鈉(TPP)中，三聚磷酸鈉(TPP)濃度為(1.0mg/ml-4.0mg/ml)，親水性藥物用量為10 mg～50mg；將季胺鹽改性殼聚糖溶于去離子水中，其濃度為(1.0mg/ml-4.0mg/ml)，將溶有藥物的三聚磷酸鈉(TPP)滴入到季胺鹽改性殼聚糖水溶液中，磁力攪拌2小時(shí)既得親水性藥物阿司匹林負(fù)載的季胺鹽改性殼聚糖納米溶液。
或其方法(2)用微乳化法制備負(fù)載親油性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液將親油性藥物溶于易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，然后將其滴加到季胺鹽改性殼聚糖的水溶液中，形成水包油(O/W)微乳液，緩慢滴加三聚磷酸鈉(TPP)溶液，得到負(fù)載親油性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液。季胺鹽改性殼聚糖水溶液濃度為(1.0mg/ml-4.0mg/ml)，親油性藥物(PRO)用量為(5.0 mg-45mg)，三聚磷酸鈉(TPP)濃度為(1.0mg/ml-4.0mg/ml)。
或其方法(3)用微乳化法制備同時(shí)負(fù)載親油性藥物和親水性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液將親油性藥物溶于易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，然后將其滴加到溶有親水性藥物的季胺鹽改性殼聚糖的水溶液中，形成O/W微乳液，緩慢滴加三聚磷酸鈉(TPP)溶液，得到同時(shí)負(fù)載親油性藥物和親水性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液。季胺鹽改性殼聚糖水溶液濃度為(1.0mg/ml-4.0mg/ml)，兩種藥物用量分別為親油性藥物(PRO)用量為5.0mg-45mg，親水性藥物用量為10mg～50mg，三聚磷酸鈉(TPP)濃度為(1.0mg/ml-4.0mg/ml)。
所述的親水性藥物為阿司匹林、蛋白質(zhì)類藥物中的任一種；所述的親油性藥物為普羅布考、紫杉醇、雷帕霉素中的任一種。
所述的殼聚糖，其脫乙酰度為92％，分子量40萬(wàn)。
本發(fā)明的方法原理是本發(fā)明的季胺鹽改性殼聚糖，用殼聚糖作為基體材料，采用季胺鹽改性產(chǎn)生帶電荷的一個(gè)或多個(gè)氨基基團(tuán)(NR3+基團(tuán))，其結(jié)構(gòu)如下 然后在TPP存在下用粒子交聯(lián)法制備藥物負(fù)載的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明所使用殼聚糖是可在體內(nèi)降解的高分子醫(yī)用材料，對(duì)人體無(wú)害；而藥物被包埋在殼聚糖納米粒子內(nèi)，可以得到更好的保護(hù)，提高藥物穩(wěn)定性和利用率?？梢愿淖儼被臄?shù)目來改變基體所帶的正電荷數(shù)以及分子鏈的長(zhǎng)度。
本發(fā)明對(duì)殼聚糖上的-C6-OH基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性，使其產(chǎn)生能夠帶正電的穩(wěn)定的氨基基團(tuán)，包括一個(gè)季胺基團(tuán)和多個(gè)季胺基團(tuán)。本發(fā)明新型的水溶性殼聚糖在較寬的pH值范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的電正性。這些特點(diǎn)使其在液態(tài)介質(zhì)中可與帶負(fù)電荷的聚合物、大分子甚至一些聚陰離子相互作用，由此發(fā)生的溶膠凝膠轉(zhuǎn)變過程則可方便地用于載藥納米微粒的制備；在酸性和中性環(huán)境中能夠溶解，因此制成的載藥納米粒子將有更廣泛的應(yīng)用；從生物藥劑角度來看，殼聚糖納米微?？梢愿街金つさ谋砻?，并能打開上皮細(xì)胞的緊密聯(lián)結(jié)，這使得它尤其適用于粘膜藥物的靶向輸送，因此，殼聚糖可以作為大分子藥物的載體促進(jìn)這類分子通過組織上皮，增加大分子藥物在組織內(nèi)的吸收，也可以用于很多小分子藥物的輸送。具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。


圖1是實(shí)施例2和實(shí)施例3中分別負(fù)載阿司匹林和普羅布考的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的體外釋放的曲線示意圖。
圖2是本實(shí)施例5的同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的體外釋放的曲線示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1本實(shí)施例1是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(一)O-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨殼聚糖(O-HTCC)的合成N-苯亞甲基殼聚糖的合成將殼聚糖(3.0g)溶于120ml 10％的醋酸溶液中，加入乙醇60ml后室溫?cái)嚢柘?0min內(nèi)逐漸滴加苯甲醛15.8g，繼續(xù)攪拌1h后膠狀物于烘箱(55℃)中放置20h，加稀NaOH溶液調(diào)至中性，析出沉淀過濾，固體用甲醇多次洗滌除去未反應(yīng)的苯甲醛，得纖維狀淺黃色固體。
O-季胺鹽-N-苯亞甲基殼聚糖的合成2.75g N-苯亞甲基殼聚糖置于圓底燒瓶中，加入異丙醇50ml和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)9.0g，水浴70℃攪拌反應(yīng)16h，過濾依次用甲醇和丙酮洗滌沉淀，得乳白色固狀物。
O-季胺鹽殼聚糖(O-HTCC)的合成將50ml 0.25mol/l的HCl乙醇溶液中加入3.0gO-季胺鹽-N-苯亞甲基殼聚糖，室溫?cái)嚢?4h后蒸去大部分乙醇，得膠狀物，加入15mlH2O充分溶解，再用丙酮沉淀，過濾，固體于烘箱(80℃)中烘干，得淺黃色固狀物。
樣品精制將上述O-季胺鹽殼聚糖1g溶于20ml水中，用足量的丙酮進(jìn)行沉淀，抽慮，得到的沉淀以少量蒸餾水溶解置于透析袋中透析48h，并時(shí)常更換蒸餾水，待濃縮到一定體積時(shí)，加入足量得丙酮重新沉淀，抽慮，固體真空干燥，既得最終產(chǎn)品。
(二)接著，完成阿司匹林負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的制備水溶性藥物阿司匹林10mg溶于3.3ml三聚磷酸鈉(TPP1.0mg/ml)中，將季胺鹽改性殼聚糖溶于20ml去離子水中，其濃度為(1.0mg/ml)，將溶有藥物的TPP滴入到季胺鹽改性殼聚糖溶液中，磁力攪拌兩小時(shí)既得親水性藥物阿司匹林(ASA)負(fù)載的季胺鹽改性殼聚糖納米溶液。離心分離、冷凍干燥，即得阿司匹林負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖納米粒子。其中，季胺鹽改性殼聚糖(O-HTCC)/TPP＝6/1。
本實(shí)施例的有益效果是本實(shí)施例利用Zeta電位分析儀觀察到阿司匹林負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的表面電荷的曲線可知，其納米粒子表面電荷為+39.2mV。本實(shí)施例的納米粒子利用原子力顯微鏡觀察到的可見，本實(shí)施例所制備的納米粒子，其粒徑約為145nm。
實(shí)施例2本實(shí)施例2是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(一)O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)的合成N-苯亞甲基-O-羧甲基殼聚糖的合成(N-苯亞甲基-O-CMC)(a)將一定質(zhì)量的N-苯亞甲基殼聚糖溶于一定體積的異丙醇中并置于500ml燒瓶中(室溫下)磁力攪拌，將25ml10NNaOH分五次加入燒瓶中(間隔25min)，堿性溶液再攪拌30min。然后將氯乙酸(60g)間隔1min，分五次加入到溶液中，溫度升到60℃后繼續(xù)攪拌3h。過濾甲醇洗滌沉淀，60℃恒溫烘箱中烘干。
在300ml圓底燒瓶中加入5.0g N-苯亞甲基-O-CMC，再加入100ml二甲亞砜和20.0ml硫酸二甲酯，45℃下加熱24h，反應(yīng)完畢后，用鹽酸甲醇溶液分離，并真空烘干得N-苯亞甲基-O-羧甲基甲酯殼聚糖(b)。
將3-二甲基丙胺置于150ml圓底燒瓶中(0℃)，然后將30mlN-苯亞甲基-O-羧甲基甲酯殼聚糖(b)甲醇溶液加入圓底燒瓶中，0℃下反應(yīng)四小時(shí)，升溫至25℃下反應(yīng)24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-苯亞甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖(c)。
先將4.0mmol(c)，置于150ml圓底燒瓶中，然后向其中加入3.0g 2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)，攪拌下加入NaOH和另外2.0g 2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)，反應(yīng)4h，再恒溫25℃反應(yīng)24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到C6-OH上帶兩個(gè)季胺鹽得改性殼聚糖N-苯亞甲基-O-雙季胺鹽殼聚糖(d)。
將50ml 0.25mol/l的HCl乙醇溶液中加入3.0g(d)中，室溫?cái)嚢?4h后蒸去大部分乙醇，得膠狀物，加入15mlH2O充分溶解，再用丙酮沉淀，過濾，固體于烘箱(80℃)中烘干，得白色固狀物即O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)。
(二)接著，完成阿司匹林(ASA)負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的制備水溶性藥物阿司匹林30mg溶于5.0ml三聚磷酸鈉(TPP 2.5mg/ml)中，將季胺鹽改性殼聚糖溶于20ml去離子水中，其濃度為(2.5mg/ml)，將溶有藥物的TPP滴入到季胺鹽改性殼聚糖溶液中，磁力攪拌兩小時(shí)既得親水性藥物阿司匹林(ASA)負(fù)載的季胺鹽改性殼聚糖納米溶液。離心分離、冷凍干燥，即得阿司匹林負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖納米粒子。其中，O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)/TPP＝4/1。
本實(shí)施例的有益效果本實(shí)施例的利用Zeta電位分析儀觀察到阿司匹林負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的表面電荷的曲線，其納米粒子表面電荷為+37.5mV。本實(shí)施例的納米粒子利用原子力顯微鏡觀察到的可見，本實(shí)施例所制備的納米粒子，其粒徑約為170 nm。
實(shí)施例3本實(shí)施例3是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的
(一)O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)的合成膠狀物于烘箱中放置，其溫度為57℃，其他步驟和條件同實(shí)施例2的步驟(一)。
(二)接著，完成普羅布考(PRO)負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖(O-HTCC)納米粒子的制備量取2.5mg/ml的季胺鹽改性殼聚糖水溶液20ml，室溫磁力攪拌(500r/s)下，滴加6mg/ml的普羅布考二氯甲烷溶液5ml(30mg)，磁力攪拌(500r/s)1小時(shí)，待形成均勻穩(wěn)定微乳液后緩慢滴加2.5mg/ml的三聚磷酸鈉溶液5.0ml，持續(xù)攪拌1小時(shí)，得到負(fù)載普羅布考(PRO)的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液。離心分離、冷凍干燥，即得普羅布考負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖納米粒子。其中，O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)/TPP＝4/1。
本實(shí)施例的有益效果本實(shí)施例的普羅布考負(fù)載季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的表面電荷的曲線，其納米粒子表面電荷為+36.3mV。本實(shí)施例可以獲得粒徑約為150nm的納米粒子。
實(shí)施例4本實(shí)施例4是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(一)O-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨殼聚糖(O-HTCC)的合成同實(shí)施例1的步驟(一)。
(二)同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子共混體系的制備水溶性藥物阿司匹林10mg溶于季胺鹽改性殼聚糖水溶液20ml中，季胺鹽改性殼聚糖水溶液的濃度是1.0mg/ml.等藥物完全溶解后，將溶有5mg PRO的5mlCH2Cl2油溶液逐滴滴到阿司匹林的季胺鹽改性殼聚糖水溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，再向其中滴加3.3mlTPP(1.0mg/ml)，強(qiáng)烈攪拌一個(gè)小時(shí)后，得到同時(shí)負(fù)載兩種不同性質(zhì)藥物的納米溶液。即得同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子。其中，季胺鹽改性殼聚糖(O-HTCC)/TPP＝6/1。
本實(shí)施例的有益效果是本實(shí)施例中同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子共混體系的表面電荷的曲線示意圖中，納米粒子表面電荷為+46.1mV。本實(shí)施例制備的納米粒子大小，由原子力顯微鏡可觀察到，本實(shí)施例可以獲得粒徑約為420nm的納米粒子。
實(shí)施例5本實(shí)施例5是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(一)O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)的合成同實(shí)施例2的步驟(一)。
(二)同時(shí)負(fù)載兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子共混體系的制備水溶性藥物阿司匹林30mg溶于季胺鹽改性殼聚糖水溶液20ml中，藥物濃度為(1.5mg/ml)，季胺鹽改性殼聚糖水溶液的濃度是2.5mg/ml.等藥物完全溶解后，將溶有30mg PRO的5mlCH2Cl2油溶液逐滴滴到阿司匹林的季胺鹽改性殼聚糖水溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，再向其中滴加5.0mlTPP(2.5mg/ml)，強(qiáng)烈攪拌一個(gè)小時(shí)后，得到同時(shí)負(fù)載兩種不同性質(zhì)藥物的納米溶液。即得同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子。其中，O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)/TPP＝4/1。
本實(shí)施例的有益效果本實(shí)施例中同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子共混體系的表面電荷的曲線，其納米粒子表面電荷為+43.2mV。本實(shí)施例制備的納米粒子大小，由原子力顯微鏡可觀察到，本實(shí)施例可以獲得粒徑約為640nm的納米粒子。
本實(shí)施例6是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(一)O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)的合成同實(shí)施例2的步驟(一)。
(二)同時(shí)負(fù)載兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子共混體系的制備水溶性藥物阿司匹林50 mg溶于季胺鹽改性殼聚糖水溶液20 ml中，藥物濃度為(2.5mg/ml)，季胺鹽改性殼聚糖水溶液的濃度是4.0mg/ml.等藥物完全溶解后，將溶有45mg PRO的5ml CH2Cl2油溶液逐滴滴到阿司匹林的季胺鹽改性殼聚糖水溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，再向其中滴加6.7mlTPP(4.0mg/ml)，強(qiáng)烈攪拌一個(gè)小時(shí)后，得到同時(shí)負(fù)載兩種不同性質(zhì)藥物的納米溶液。即得同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子。其中，O-雙季胺鹽殼聚糖(Dia-O-HTCC)/TPP＝3/1。
本實(shí)施例的有益效果是本實(shí)施例中同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子共混體系的表面電荷的曲線可知納米粒子表面電荷為+40.1mV。本實(shí)施例制備的納米粒子大小，由原子力顯微鏡可觀察到，本實(shí)施例可以獲得粒徑約為1000nm的納米粒子。
以下是對(duì)實(shí)施例2～3及實(shí)施例5的分析實(shí)施例2～3分別負(fù)載ASA和PRO的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的體外釋放(如實(shí)施例2和3所制得的納米粒子)。將實(shí)施例2和實(shí)施例3所制得的納米粒子分別置于盛有5ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，pH7.4的試管中，在36.5±0.5℃恒溫下磁力攪拌，每隔一定時(shí)間將試管中的懸浮液在室溫下超速離心30分鐘，取出3ml上層清夜，同時(shí)補(bǔ)充3ml新鮮PBS溶液。在藥物最大吸收波長(zhǎng)處(阿司匹林，295nm；普羅布考，243nm)測(cè)定吸光度，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的藥物濃度，比較兩種藥物的釋放情況。
參見圖1，圖1是實(shí)施例2和實(shí)施例3中分別負(fù)載阿司匹林和普羅布考的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的體外釋放的曲線示意圖。從圖1上可以看出，阿司匹林的大量釋放先于普羅布考，在最初的8小時(shí)，阿司匹林的突釋放已接近最大值，而普羅布考在最初的24小時(shí)才突釋完畢；但是隨后阿司匹林的釋放變得非常緩慢，而普羅布考繼續(xù)快速釋放，到240個(gè)小時(shí)的時(shí)候普羅布考幾乎釋放完畢，而阿司匹林僅釋放了60％。
參見圖2，圖2是本實(shí)施例5的同時(shí)負(fù)載阿司匹林和普羅布考兩種藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子的體外釋放的曲線示意圖。從圖2上可以看出，阿司匹林的釋放出現(xiàn)了三個(gè)有差別的突釋，而普羅布考出現(xiàn)兩個(gè)突釋。同時(shí)可以看出同時(shí)負(fù)載兩種藥物后加速了兩種藥物的釋放速度，釋放175個(gè)小時(shí)后，阿司匹林和普羅布考兩種藥物都基本上釋放完畢。這一結(jié)果說明所涉及的兩種藥物殼聚糖納米粒子在共混給藥情況下，不同釋放階段藥物的主要成分濃度不同，75h前主要為普羅布考，而75h后則主要為阿司匹林。這為針對(duì)于靶向性和程序性血管再狹窄的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟步驟一，首先是在保護(hù)2位氨基的條件下，在殼聚糖的6位羥基上引入季胺基團(tuán)，完成對(duì)殼聚糖上的C6-OH基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性，得到單季胺鹽改性殼聚糖或雙季胺鹽改性殼聚糖；步驟二，接著是在三聚磷酸鈉存在下，且控制使季胺鹽改性殼聚糖/TPP＝6/1～3/1，室溫包藥2小時(shí)，完成制備載藥納米粒子。
2.如權(quán)利要求1所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，步驟一中，所述的對(duì)殼聚糖上的C6-OH基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性，具體通過以下兩種方法中任一種進(jìn)行其方法(1)在酸性環(huán)境中乙醇做溶劑的條件下，苯甲醛同殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行唏呋堿反應(yīng)，然后用2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨與其C6-OH基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性，最后用濃鹽酸乙醇溶液恢復(fù)C2-NH2；或其方法(2)采用苯甲醛同NH2基團(tuán)進(jìn)行唏呋堿反應(yīng)，然后對(duì)C6-OH基團(tuán)進(jìn)行羧甲基化，依次與硫酸二甲酯，3-二甲基丙胺以及2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨反應(yīng)，最后得到在C6-OH基團(tuán)上引入兩個(gè)季胺鹽的殼聚糖改性產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求2所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，所述的方法(1)，具體是1)將殼聚糖溶于醋酸溶液中，加入一定體積的乙醇，攪拌下30分鐘內(nèi)逐漸滴加苯甲醛，繼續(xù)攪拌1h后烘箱中放置20h，加稀NaOH調(diào)至中性，析出沉淀，甲醇洗滌沉淀，得淺黃色固體N-苯亞甲基殼聚糖；2)N-苯亞甲基殼聚糖在異丙醇中與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨70℃水浴反應(yīng)16h，依次用甲醇、丙酮洗滌沉淀得乳白色固體N-苯亞甲基殼聚糖-O-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨殼聚糖；3)N-苯亞甲基殼聚糖-O-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶于鹽酸乙醇溶液，室溫?cái)嚢?4h，膠狀物加水溶解，再用丙酮沉淀，固體于80℃烘箱中烘干，得淺黃色固體O-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨殼聚糖。
4.如權(quán)利要求3所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，所述的烘箱，其溫度設(shè)置為55℃～60℃之間。
5.如權(quán)利要求2所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，所述的方法(2)，具體步驟如下1)N-苯亞甲基殼聚糖溶于一定體積的異丙醇中，NaOH分五次加入，室溫下磁力攪拌30min，然后將氯乙酸間隔1分鐘，分五次加入到溶液中，溫度升到60℃后繼續(xù)攪拌3h；過濾甲醇洗滌沉淀，60℃恒溫烘箱中烘干得N-苯亞甲基-O-羧甲基殼聚糖；2)N-苯亞甲基-O-羧甲基殼聚糖在二甲亞砜溶劑中與硫酸二甲酯，45℃下加熱反應(yīng)24h，反應(yīng)完畢后，用鹽酸甲醇溶液分離，并真空烘干得N-苯亞甲基-O-羧甲基甲酯殼聚糖；3)將N-苯亞甲基-O-羧甲基甲酯殼聚糖和3-二甲基丙胺甲醇做溶劑的條件下，0℃下反應(yīng)4小時(shí)，升溫至25℃下反應(yīng)24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-苯亞甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖；4)將N-苯亞甲基-O-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，室溫堿性環(huán)境中反應(yīng)4h，再恒溫25℃反應(yīng)24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到C6-OH上帶兩個(gè)季胺鹽的改性殼聚糖N-苯亞甲基-O-雙季胺鹽殼聚糖；5)將N-苯亞甲基-O-雙季胺鹽殼聚糖溶于鹽酸乙醇溶液，室溫?cái)嚢?4h，膠狀物加水溶解，再用丙酮沉淀，固體于80℃烘箱中烘干，得白色固狀物即O-雙季胺鹽殼聚糖。
6.如權(quán)利要求1所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，步驟二中，所述的制備載藥納米粒子是通過下面任一方法實(shí)現(xiàn)的其方法(1)用粒子交聯(lián)法制備負(fù)載親水性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液將親水性藥物溶于三聚磷酸鈉中，將溶有親水性藥物的三聚磷酸鈉滴入到季胺鹽改性殼聚糖水溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，磁力攪拌2小時(shí)既得親水性藥物負(fù)載的季胺鹽改性殼聚糖納米溶液中進(jìn)行交聯(lián)；或其方法(2)用微乳化法制備負(fù)載親油性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液將親油性藥物溶于易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，然后將其滴加到季胺鹽改性殼聚糖的水溶液中，形成水包油微乳液，緩慢滴加三聚磷酸鈉溶液，得到負(fù)載親油性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液；或其方法(3)用微乳化法制備同時(shí)負(fù)載親油性藥物和親水性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液將親油性藥物溶于易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，然后將其滴加到溶有親水性藥物的季胺鹽改性殼聚糖的水溶液中，形成水包油微乳液，緩慢滴加三聚磷酸鈉溶液，得到同時(shí)負(fù)載親油性藥物和親水性藥物的季胺鹽改性殼聚糖納米粒子溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，方法(1)中所述的粒子交聯(lián)法，或方法(2)中所述的微乳化法，或方法(3)中所述的微乳化法，反應(yīng)物涉及的參數(shù)范圍分別是三聚磷酸鈉濃度為1.0mg/ml-4.0mg/ml，季胺鹽改性殼聚糖濃度為1.0mg/ml-4.0mg/ml，親水性藥物用量為10mg～50mg，親油性藥物用量為5.0mg-45mg。
8.如權(quán)利要求6所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，方法(2)和(3)中，所述的有機(jī)溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、無(wú)水乙醇中的任一種。
9.如權(quán)利要求6或7所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，所述的親水性藥物為阿司匹林、蛋白質(zhì)類藥物中的任一種。
10.如權(quán)利要求6或7所述的季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，其特征是，所述的親油性藥物為普羅布考、紫杉醇、雷帕霉素中的任一種。
全文摘要
一種季胺鹽改性的殼聚糖載藥納米粒子的制備方法，屬于醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先是在保護(hù)2位氨基的條件下，在殼聚糖的6位羥基上引入季胺基團(tuán)，完成對(duì)殼聚糖上的C
文檔編號(hào)C08B37/00GK101085358SQ20071004171
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日
發(fā)明者萬(wàn)錒俊, 孫燕, 鄭一寧, 陳宇鵬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)