專利名稱：一種紫芝菌絲體胞內多糖及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種靈芝胞內多糖，特別涉及一種采用深層液體發(fā)酵的紫芝 發(fā)酵方法制得的紫芝菌絲體胞內多糖及其制備方法和應用，該紫芝菌絲體胞 內多糖具有高抗腫瘤活性。
背景技術：
靈芝[Gawofifem2" /w"V/wm(Leys ex Fr.)Karst]為f旦子菌纟岡、多孑L菌禾斗、靈 芝屬真菌。靈芝味甘、性溫、無毒，可補心、肝、脾、肺、腎之氣，具滋補 強身、扶正固本之功效。有效成分主要有多糖類(即靈芝多糖)、三萜類 (主要為靈芝酸)等。靈芝多糖的藥用價值主要有抗癌、降血糖、免疫調節(jié)、 促進蛋白質和核酸的合成、消炎和輻射保護作用；靈芝酸的藥用價值主要有 護肝和排毒、降低膽固醇、抑制組織胺的釋放、抑制血管緊張肽轉化等。中 國古代根據(jù)靈芝特征把靈芝分為赤芝、紫芝、黃芝、白芝、黑芝、青芝等六 類。因為在自然界中野生的靈芝十分稀少，遠不能滿足人們的需要。而人工 栽培靈芝收獲時間長，占地面積大，且靈芝的產(chǎn)量與質量易受環(huán)境氣候及蟲 害的影響。同人工栽培靈芝相比，發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝有效成份由于生產(chǎn)周期短、 勞動力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點。目前使用和研究較多的赤芝 [Gawoder, /mc油附 (Leyss. Ex Fr.) Karst.]。
然而，不同種類靈芝的發(fā)酵培養(yǎng)條件有所差異，所得到的有效成分及藥 效方面也有所不同。由于紫芝資源稀少，對其進行上述研究更為重要。然而 目前有報道的研究不多，其中張衛(wèi)國等(張衛(wèi)國，趙云濤，劉欣.固體發(fā)酵 9519紫芝菌絲體多糖分子量的分布；韶關學院學報，2003; 24 (6) : 70-73) 報道了紫靈芝固體發(fā)酵菌絲體多糖的分子量分布；公開號CN1436842A的中
國專利(
公開日期2003年8月20日)公開了一種高產(chǎn)多糖的紫芝及其發(fā) 酵生產(chǎn)工藝，主要采用半固態(tài)發(fā)酵方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種成本低、發(fā)酵周期短的采用深層液 體發(fā)酵的紫芝發(fā)酵方法，和由其制得的紫芝菌絲體，以及具有抗腫瘤高活性 的該紫芝菌絲體的胞內多糖及其制備方法。
本發(fā)明人通過諸多試驗，發(fā)現(xiàn)在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)中，紫芝菌絲細胞能 在反應器內處于最適溫度、酸堿度和氧氣等環(huán)境下生長，不受外界環(huán)境的影 響，菌絲生長分裂迅速，能在短時間內生產(chǎn)大量菌絲體，成分與天然相當甚 至優(yōu)于天然，而且液體深層發(fā)酵成本低，產(chǎn)量大，可實現(xiàn)規(guī)?；?、工業(yè)化。 在對發(fā)酵產(chǎn)物進行進一步分離和藥效分析后，發(fā)現(xiàn)采用深層液體發(fā)酵方法得 到的紫芝菌絲體，其胞內多糖具有較高抗腫瘤活性。本發(fā)明重點篩選出了適 合大多數(shù)紫靈芝菌株液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基和工藝條件。
因此，本發(fā)明紫芝菌絲體胞內多糖的制備方法的技術方案為其包括將
紫芝發(fā)酵制得的紫芝菌絲體采用常規(guī)的多糖提取方法進行提取，其中紫芝發(fā)
酵的方法包括將紫芝[G^"o&m2"ya/ o"/cw附(Fr.) Lloyd或Ga"ocfer附"57'"erae Zhao, Xu et Zhang]菌株依次進行PDA (土豆葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基的斜面培 養(yǎng)、 一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的深層液體發(fā)酵，其中一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基 為含有豆餅粉1~3%、葡萄糖1.5~5%、無水硫酸鎂0.1-0.3%、磷酸二氫鉀 0.1~0.4%的液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有蔗糖2.5~6%、蛋白胨 0.2~0.6%、酵母膏0.1~0.3%、無水硫酸鎂0.1-0.3%、磷酸二氫鉀0.2~0.5%、 pH5.5-6.5的液體培養(yǎng)基，所述的一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)；上 述百分比均為重量百分比。
根據(jù)本發(fā)明，所述的紫芝菌株可以是現(xiàn)市場上可以購買得到的菌株，例 如中國科學院微生物研究所分離的紫芝[G^"o&rm"力/ om'cww (Fr.) Lloyd]，
中國普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號CGMCC5.69;
中國科學院微生物研究所分離的紫芝[Qmo血m^>po"/cwm (Fr.) Lloyd]: 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心ACCC，保藏號分別為ACCC50045、 ACCC50468;
以及上海農(nóng)科院分離的紫芝(Ga"ocfermas/"eraeZhao， XuetZhang)， 上海農(nóng)科院食用菌保藏中心，紫芝1號等。
其中，所述的PDA培養(yǎng)基的配方可以同常規(guī)，含有重量百分比為30~40 %的土豆、2~3%的葡萄糖、0.2~0.5%的麥芽提取物及1.4-2.0%的瓊脂；斜 面培養(yǎng)條件也可以采用靈芝菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，通常選用25C培養(yǎng)6~7天。
而所述的振蕩培養(yǎng)優(yōu)選溫度在25~28°C，頻率為190-220rpm的搖瓶培養(yǎng)。
較佳地，所述的一級種子培養(yǎng)4 6天，發(fā)酵培養(yǎng)4 7天，發(fā)酵培養(yǎng)的接 種量為5~15v/v%。
根據(jù)本發(fā)明，將上述紫芝發(fā)酵方法制得的發(fā)酵產(chǎn)物離心去除上清液即可 得到紫芝菌絲體。
較佳地，所述的離心速度優(yōu)選為4000rpm，離心次數(shù)通常為1~3次。 根據(jù)本發(fā)明，所述的提取方法較佳地包括下列步驟
① 將菌絲體用水加熱至85 95"C進行提取；
② 將提取液濃縮后，加入乙醇，過濾所得沉淀即為紫芝胞內粗多糖。 較佳地，步驟①中每次提取時菌絲體與水的重量體積比為l:3 5(g/ml)，
提取次數(shù)為1~3次，每次提取時間0.5 3小時。
較佳地，步驟②中提取液通過減壓濃縮至原體積的1/6~1/3，加入3~5 倍量85~95%的乙醇。
更佳地，本發(fā)明提取方法還可將步驟②中得到的沉淀再溶于水，過濾， 棄去水不溶物，將濾液干燥，得到初步純化的紫芝菌絲體胞內多糖。
由本發(fā)明上述制備方法制得的紫芝菌絲體胞內多糖中，胞內粗多糖中多
糖含量為18 50。/。(w/w)，初步純化的胞內多糖中多糖含量為39~75%(w/w)。 在對小鼠體內抗腫瘤試驗中，口服本發(fā)明紫芝菌絲體胞內多糖對小鼠肝癌 H22、小鼠Lewis肺癌具有較強的抑瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。 實施例l紫芝菌絲體的制備
將紫芝菌株CGMCC5.69轉接于PDA瓊脂斜面(含土豆35%、葡萄糖 2.5%、麥芽提取物0.3%及瓊脂1.7%，余量為水)，25"C培養(yǎng)6天獲得發(fā)酵 研究的種斜面；轉接于3只裝有100ml種子培養(yǎng)基的750ml搖瓶；種子培養(yǎng) 基組成為豆餅粉2%，葡萄糖2.5%，無水硫酸鎂0.15%，磷酸二氫鉀0.3 %，余量為水，pH自然；在25。C、 220rpm培養(yǎng)4天，按照10v/vX的接種 量將100ml種子液轉接于10只裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的750ml搖瓶(發(fā)酵 培養(yǎng)基組成蔗糖4%，蛋白胨0.4%，酵母膏0.2%，無水硫酸鎂0.15%， 磷酸二氫鉀0.3%，余量為水，pH6.0)， 28°C、 190rpm搖床培養(yǎng)5天。發(fā)酵 結束后，收集發(fā)酵液，4000rpm離心10min，去除上清液；加去離子水600ml 洗滌菌絲體，離心，去除上清液，菌絲體再同樣洗滌二次；稱重為0.32g/ml 發(fā)酵液(計算方法所得發(fā)酵液中菌絲體的重量g/所得發(fā)酵液的體積ml)。
實施例2紫芝菌絲體的制備
將紫芝菌株ACCC50045接種于PDA斜面培養(yǎng)基(含土豆30%、葡萄 糖3%、麥芽提取物0.5%及瓊脂1.4%)， 25t培養(yǎng)7天，轉接于4只裝有 100ml種子培養(yǎng)基得750ml三角搖瓶(種子培養(yǎng)基豆餅粉1 % ，葡萄糖5%， 無水硫酸鎂0.30%,磷酸二氫鉀0.1%， pH自然)，28°C、 200rpm培養(yǎng)6天， 按照5v/v^接種量轉接于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的10只750ml三角搖瓶， 25°C、 220rpm培養(yǎng)7天，發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖2.5%，蛋白胨0.6%，酵母膏 0.1%,無水硫酸鎂0.10%，磷酸二氫鉀0.5%， pH6.5。菌絲體分離同實施例
1;稱重為0.23g/ml發(fā)酵液。
實施例3紫芝菌絲體的制備
將紫芝菌株ACCC50468接種于PDA斜面培養(yǎng)基(含土豆40%、葡萄 糖2%、麥芽提取物0.2%及瓊脂2.0%)， 25匸培養(yǎng)7天，轉接于4只裝有 100ml種子培養(yǎng)基得750ml三角搖瓶(種子培養(yǎng)基豆餅粉3%，葡萄糖1.5%, 無水硫酸鎂0.30%，磷酸二氫鉀0.4%， pH自然)，26°C、 200rpm培養(yǎng)4天， 按照15v/v^接種量轉接于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的10只750ml三角搖瓶， 26°C、 220rpm培養(yǎng)4天，發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖6%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.3 %，無水硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.2%， pH5.5。菌絲體分離同實施例l; 稱重為0.18g/ml發(fā)酵液。
實施例4紫芝菌絲體的制備
將紫芝菌株紫芝1號接種于PDA斜面培養(yǎng)基(同實施例l)， 25'C培養(yǎng) 7天，轉接于4只裝有100ml種子培養(yǎng)基的750ml三角搖瓶(種子培養(yǎng)基同 實施例3)， 25°C、 190rpm培養(yǎng)4天，按照10v/v^接種量轉接于裝有100ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的10只750ml三角搖瓶，28°C、 220rpm培養(yǎng)6天，發(fā)酵培養(yǎng)基 同實施例l。菌絲體分離同實施例h稱重為0.46g/ml發(fā)酵液。
實施例5-8紫芝菌絲體胞內粗多糖的制備
將實施例1-4的菌絲體分別按下述方法提取胞內粗多糖菌絲體與所加 去離子水的重量體積比為1: 3~5 (g/ml)，加熱至85 95。C提取2h左右；抽 濾，再同樣煮提兩次，將三次水煮的提取液合并，減壓濃縮至300ml，加900ml 95v/vX乙醇，攪拌沉淀24h，過濾得到胞內粗多糖。實施例5 8胞內粗多糖 測定總糖(測定方法見文獻葉姜瑜，談鋒.紫芝多糖的純化和組分分析， 西南師范大學學報(自然科學版)，2002， 27 (6): 945-949)含量分別為43 %、 32%、 20%、 50%。
實施例9~12紫芝菌絲體初步純化的胞內多糖的制備
將實施例5~8的紫芝菌絲體胞內粗多糖分別溶解于約200 600ml去離
子水中，抽濾，棄去水不溶物，將溶液蒸干，得到紫芝菌絲體純化的胞內多
糖(總糖測定方法同實施例5-8)，多糖含量分別為55%、 45%、 38%、 75%。
上述實施例中本發(fā)明未特殊說明的百分比均為重量百分比。 試驗實施例紫芝菌絲體胞內多糖的抗腫瘤作用
采用小鼠移植性腫瘤模型，用腫瘤抑制率來評價抗腫瘤活性。具體方法 如下取生長良好的小鼠H22肝癌腹水、小鼠Lewis肺癌瘤塊，用生理鹽水 稀釋(細胞濃度約l-2xl(f個/ml)，每只小鼠右腋皮下接種0.2ml，隨機分組， 設空白對照組(蒸餾水)、陽性對照雙靈固本散(現(xiàn)有靈芝類抗腫瘤中藥) 組、樣品組(本發(fā)明實施例5 12)，接種后次日起給藥(給藥劑量如下表所 示)，給藥體積為0.5ml/20g體重，連續(xù)經(jīng)口灌胃7-10天。接種后10-14日脫 頸處死動物，解剖取瘤塊，比較各劑量組瘤重之大小。
根據(jù)以下公式判定結果
<formula>formula see original document page 9</formula>
結果如表l，表2所示
表1.實施例5-12所得樣品對小鼠肝癌H22的抑瘤作用
組另u劑量給藥動物數(shù)動物體重(g)瘤重(g)抑瘤率
(mg/kg)方案始纟冬(去瘤后)%
空白對照/igX7151524.70 ±1.902.35±0.60/
雙靈固本散250igX7101025.68±1.871.36±0.30**42.03
實施例540igX7101025.21 ±1.911.68±0.55*28.35
實施例640igX7101024.27±2.581.58±0.41**32.61
實施例740igX7101026.25±1.14*1.60±0.61**32.01
實施例840igX7101025.98±1.861.47±0.54**37.47
實施例940igX7101025.64±1.711,18±0.31**49.91
實施例1040igX7101025.54±1.481.04±0.39**55.67
實施例1140igX7101024.30±2.481.14±0.29**51.32
實施例1240igX7101026.15±1.卯0.99 ±0.30**57.89
與對照組比較*P<0.05， **P<0.01
表2.實施例5-12所得樣品對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
組另U劑量給藥動物數(shù)動物體重(g)瘤重(g)抑瘤率
(mg/kg)方案始纟冬(去瘤后);±SD%
空白對照/igXIO 101021.57±1.473.23 ±0.67/
雙靈固本散250igXIO6622.03 ±1.202.08±0.30**35.57
實施例540igXIO6619.72±2.362.57±0.38*20.35
實施例640igXIO6618.63±1.232.63 ±0.37**18.50
實施例740igXIO6620.45 ±1.232.59±0.42*19.99
實施例840igXIO6620.18土2.462.31 ±0.74*28.61
實施例940igXIO6619.61 ±2.291.78±0.64**45.06
實施例1040igXIO6621.04±2.122.08±0.83**35.73
實施例1140igXIO6619.30±2,49*1.85±0.82**42.74
實施例1240igXIO6620.36±1.171.75±0.50**45.89
與對照組比較*P<0.05， **P<0.01
可見，本發(fā)明紫芝菌絲體胞內多糖，特別是初步純化的胞內多糖具有較 佳的抗腫瘤活性。
權利要求
1、一種紫芝菌絲體胞內多糖的制備方法，其包括將紫芝發(fā)酵制得的紫芝菌絲體采用常規(guī)的多糖提取方法進行提取，其特征在于所述的紫芝發(fā)酵的方法包括將紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd或Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang]菌株依次進行PDA培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的深層液體發(fā)酵，其中，一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有豆餅粉1～3％、葡萄糖1.5～5％、無水硫酸鎂0.1～0.3％、磷酸二氫鉀0.1～0.4％的液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有蔗糖2.5～6％、蛋白胨0.2～0.6％、酵母膏0.1～0.3％、無水硫酸鎂0.1～0.3％、磷酸二氫鉀0.2～0.5％、pH5.5-6.5的液體培養(yǎng)基，所述的一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)；上述百分比均為重量百分比。
2、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的PDA培養(yǎng)基含有 重量百分比為30~40%的土豆、2~3%的葡萄糖、0.2-0.5%的麥芽提取物及 1.4~2.0%的瓊脂，所述的斜面培養(yǎng)為25'C培養(yǎng)6~7天。
3、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的振蕩培養(yǎng)為溫度 在25 28"C，頻率為l卯-220rpm的搖瓶培養(yǎng)。
4、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的一級種子培養(yǎng)4~6 天，發(fā)酵培養(yǎng)4 7天，發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為5 15v/v^。
5、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的紫芝菌絲體由紫 芝發(fā)酵方法制得的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過4000rpm離心1 3次去除上清液后得到。
6、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的多糖提取方法包 括下列步驟-① 將菌絲體用水加熱至80-95。C進行提??；② 將提取液濃縮后，加入乙醇，過濾所得沉淀即為紫芝胞內多糖。
7、 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟①中菌絲體與水的 重量體積比(g/ml)為1:3~5，提取次數(shù)為1~3次，每次提取時間0.5 3小時； 步驟②中提取液通過減壓濃縮至原體積的1/6~1/3，加入3-5倍量85~95%的 乙醇。
8、 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于其還可將步驟②中得到 的沉淀再溶于水，過濾，將濾液干燥。
9、 如權利要求1 8任一項所述的制備方法制得的紫芝菌絲體胞內多糖。
10、 如權利要求9所述的紫芝菌絲體胞內多糖在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫芝菌絲體胞內多糖及其制備方法。該制備方法包括將紫芝發(fā)酵制得的紫芝菌絲體采用常規(guī)的多糖提取方法進行提取，其中紫芝發(fā)酵的方法包括將紫芝菌株依次進行斜面培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的深層液體發(fā)酵。本發(fā)明通過對紫芝深層發(fā)酵工藝參數(shù)和培養(yǎng)基的改進，使獲得的紫芝菌絲體中提取的胞內多糖中多糖含量達到39～75％，并具有較強的抗腫瘤活性。
文檔編號C08B37/00GK101376904SQ200710045368
公開日2009年3月4日 申請日期2007年8月29日 優(yōu)先權日2007年8月29日
發(fā)明者琴 張, 楊義芳, 楊國紅, 胡海峰, 金雋迪 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院