專利名稱：：一種提取聚唾液酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：種提取聚唾液酸的方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：唾液酸是一類神經(jīng)氨酸的衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是一個含有9個碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，系統(tǒng)命名為5-氨基-3,5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。根據(jù)5號碳位上不同的連接基團構(gòu)成了不同的唾液酸衍生物，最主要的兩種唾液酸為5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(NANA，Neu5Ac，N—乙酰神經(jīng)氨酸)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)，其余的唾液酸均是由這兩種衍生而成。其中，N—乙酰神經(jīng)氨酸在脊椎動物體內(nèi)更為常見，如魚類、兩棲類、爬行類、鳥類等動物。哺乳動物體內(nèi)普遍存在唾液酸，相對而言在腦脊液和粘液中最多。嬰兒在幼年期唾液酸含量較高，對其身體發(fā)育具有重要意義。聚唾液酸(Polysialicacid，Colominicacid)是唾液酸以a-2，8和/或a-2，9酮苷鍵連接的線性同聚物，是少數(shù)幾種細菌的胞外多糖組分。1957年Barry和Goebel首先在Esc/^n'c/w'aco//K-235和K-l中發(fā)現(xiàn)該聚合物，以后又陸續(xù)在7Ve&sen'G附/"/"g"/cfcB,5"a/mowe〃a她cra048,C"raZflcter戶ew"(i"05中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。a-2，8酮苷鍵連接的聚唾液酸末端相鄰的兩個單體形成內(nèi)酯(甲單體的羧基和乙單體的9號碳位上的羥基脫水縮合形成)，對聚唾液酸的穩(wěn)定起到一定的作用，這也是大多數(shù)的聚唾液酸以a-2，8酮苷鍵連接的主要原因之一。<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage3</formula>聚唾液酸是無色的，易溶于水，在水溶液中很穩(wěn)定，4t:時貯藏數(shù)月不發(fā)生變化。如果溶液中含有非常微量的有機酸或者pH大于10，其穩(wěn)定性就受到很大的影響。游離的唾液酸能有效地抑制感冒病毒和其他病原微生物入侵紅細胞。唾液酸的類似物Zanamivir(N-乙酰基-2，3-二脫氧-4-胍基唾液酸)和Tamiflu(oseltamivirphosphate)的抗流感機理一樣，可以抑制流感病毒上唾液酸酶唾液酸的一般結(jié)構(gòu)的活性，己經(jīng)被美國FDA正式批準為治療禽流感的特效藥。唾液酸衍生物SialylLewiSx作為重要的抗粘附藥物，可有效阻止白細胞過量聚集，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克等疾病。同時，唾液酸是一種止咳祛痰劑，對于中心和外周神經(jīng)性疾病以及脫髓鞘病均有療效。如唾液酸膽固醇可以治療老年癡呆癥。此外，唾液酸在腦中的含量很高，可能作為神經(jīng)傳導(dǎo)質(zhì)，參與離子外流和神經(jīng)興奮。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯對于治療腦缺血、帕金森癥和神經(jīng)創(chuàng)傷有一定功能。近年來發(fā)現(xiàn)，唾液酸還具有免疫抑制作用。以唾液酸為先導(dǎo)進行生物活性物質(zhì)的探索已經(jīng)成為新藥研究的一個新領(lǐng)域。聚唾液酸可以作為一些藥物的緩釋劑，也可以用于固定酶以用于診斷，或?qū)σ恍┧幬锂a(chǎn)品進行化學(xué)修飾。聚唾液酸可以用作治療一些疾病的疫苗而避免其它細胞組分如脂多糖或蛋白質(zhì)引起的副作用。近年來，生物可降解聚合物在藥物傳遞系統(tǒng)研究領(lǐng)域越來越受矚目，部分聚合物已應(yīng)用于各種劑型。目前比較成功用于多肽與蛋白質(zhì)類藥物傳遞系統(tǒng)的是聚乙二醇(PEG);但是，PEG是人工合成、在體內(nèi)不可降解的，容易在膀胱積累，而且還可能產(chǎn)生抗PEG的抗體。在尋找替代PEG的可降解聚合物中，a-2，8連接的聚唾液酸(PSA)是目前發(fā)現(xiàn)最好的多肽與蛋白類藥物的控釋劑。英國的LipoXen公司臨床試驗了聚唾液酸化干擾素、胰島素、天冬酰胺酶和人紅細胞生長素等，發(fā)現(xiàn)其效果比PEG化的效果好、半衰期更長；其中主要應(yīng)用分子量約為7000Da15000Da、a-2，8連接的聚唾液酸。隨著基因工程與蛋白質(zhì)工程在醫(yī)藥領(lǐng)域的快速發(fā)展，未來越來越多的藥物將是各種蛋白質(zhì)和多肽類藥物，因此聚唾液酸作為醫(yī)藥中間體在未來將會有巨大的市場潛力。而且目前世界上還沒有任何公司能夠進行聚唾液酸的規(guī)?；a(chǎn)，因此開發(fā)高純度聚唾液酸分離純化的技術(shù)具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提取聚唾液酸的方法，以提高聚唾液酸的純度，達到化妝品和醫(yī)藥生產(chǎn)的要求，使其競爭力更強。本發(fā)明的技術(shù)方案一種提取聚唾液酸的方法，以一株大腸桿菌(^C^enW2^co//)K235-JYlI-74的發(fā)酵液為原料，經(jīng)過板框過濾去除菌體，上清液加入適量氯化鈉和乙醇溶劑沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，再用板框過濾去除變性蛋白質(zhì)，濾液經(jīng)過堿性蛋白酶處理、氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨絡(luò)合沉淀并解離后，再用適量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超純水溶解，通過層析柱進行分級純化，收集洗脫液經(jīng)過透析，冷凍干燥得聚唾液酸產(chǎn)品；各步驟工藝條件為(1)過濾發(fā)酵液中加入1020g/L的80200目的珍珠巖助濾劑，發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾去除菌體，過濾方式選擇110目工業(yè)濾布；(2)沉淀過濾去除菌體后的清液加入氯化鈉，使氯化鈉質(zhì)量濃度達2%~5%，溶解后再加入24倍體積的95%質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75%質(zhì)量濃度的乙醇洗滌24次；(3)溶解、過濾聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，加入1020g/L的80200目的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾或者硅藻土過濾機進行過濾，通過過濾去除部分變性蛋白質(zhì)；(4)酶處理過濾去除部分變性蛋白后的濾液加入堿性蛋白酶進行處理，其工藝為堿性蛋白酶活力25萬U/mL，pH7~8，加量為10mL/kg聚唾液酸，3070'C酶解37小時；(5)絡(luò)合沉淀酶處理過的聚唾液酸溶液加入過量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨進行絡(luò)合沉淀，氯代十六垸基吡啶或十六垸基三甲基溴化銨加量為13g/g聚唾液酸，溫度為1015°C;(6)解離經(jīng)過絡(luò)合得到的聚唾液酸沉淀加入24倍量0.50.8M的氯化鈉溶液，406(TC水浴解離38小時；(7)乙醇沉淀解離后的溶液再加入24倍體積的95%質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75%質(zhì)量濃度的乙醇洗滌24次；(8)溶解、柱層析乙醇沉淀出的聚唾液酸用超純水溶解后進行層析分離，其工藝為層析柱填料為DEAE-纖維素或者葡聚糖凝膠，層析柱用0.010.05M磷酸鹽緩沖液進行平衡，洗脫液為0.020.08M氯化鈉溶液，洗脫速度為l5mL/min,分別收集分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸；(9)透析層析收集得到的分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸分別用截留分子量為7000Da、1200014000Da透析膜進行透析4872小時；(10)冷凍干燥兩種透析液體分別經(jīng)過冷凍干燥得到兩種規(guī)格的聚唾液酸產(chǎn)品。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提出一種有效的聚唾液酸分離純化方法。發(fā)酵液用過量乙醇使聚唾液酸和蛋白質(zhì)同時沉淀下來，沉淀溶解后用板框過濾使得變性的蛋白質(zhì)更容易去除，有利于后續(xù)提取純化。堿性蛋白酶添加到聚唾液酸溶液中可以降解剩余的蛋白質(zhì)，而氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨能夠與聚唾液酸專一性絡(luò)合形成沉淀，有利于把聚唾液酸和其他一些大分子、小分子物質(zhì)分離開。聚唾液酸進一步通過層析分離，可以收集不同分子量范圍的聚唾液酸，利用透析可以去除一些小分子物質(zhì)，經(jīng)過冷凍干燥后，聚唾液酸的純度達到97%以上。圖l聚唾液酸的提取流程示意圖。生物材料樣品說明大腸桿菌(&c/^/c/'aco//)K235-JYlI-74江南大學(xué)生物工程學(xué)院生化工程實驗室保藏和提供，該菌株已在《無錫輕工大學(xué)學(xué)報》2002，21(5)，456459公開。根據(jù)專利審査的有關(guān)規(guī)定，申請人保證該菌種從申請日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放。具體實施例方式實施例1.聚唾液酸發(fā)酵液的制備菌株大腸桿菌(^c/^WcWaco/OK235-JYlI-74。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)山梨醇20，氯化銨2.0，磷酸氫二鉀1.5，MgSO40.9,胰蛋白胨1.5，pH7.8。利用30L發(fā)酵培養(yǎng)基，在50LB.Braum機械攪拌罐上采用pH控制方法進行發(fā)酵，接種量4%，滅菌前加入少量聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚(泡敵)以控制發(fā)酵過程中的泡沫，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速300500rpm，通風(fēng)量為30L/min，表壓0.05Mpa，發(fā)酵溫度37°C。調(diào)節(jié)pH值的氨水是濃氨水，鹽酸濃度3M。菌體生長階段的pH自然下降到6.4,然后用氨水和鹽酸把pH值控制在6.4左右，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中，間隔一定時間取樣測定山梨醇濃度，發(fā)酵至第12h開始補加山梨醇。根據(jù)底物濃度的變化，估計菌體對底物的消耗速率，調(diào)整控制補料液流加速率，使碳源濃度控制在5g/L到20g/L之間。發(fā)酵培養(yǎng)60小時下罐，測定聚唾液酸產(chǎn)量達到3.5g/L。實施例2.聚唾液酸的提取取5L發(fā)酵液，經(jīng)過板框過濾去除菌體，所得過濾清液加入100-250g氯化鈉(NaCl)并攪拌使其溶解，含氯化鈉的清液再加入24倍體積的95%質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75%質(zhì)量濃度乙醇洗滌24次，然后聚唾液酸沉淀再溶解于適量的去離子水中，所得渾濁液體經(jīng)過板框過濾去除部分蛋白質(zhì)，得到的濾液調(diào)節(jié)pH78并加入約50mL堿性蛋白酶(酶活25萬U/mL)，在307(TC恒溫水浴條件下處理37小時，再加入過量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨進行絡(luò)合，隔夜靜置后，傾析或者離心收集沉淀，沉淀加入0.50.8M的氯化鈉溶液進行解離，4060"C水浴解離38小時，解離得到清液加入24倍體積的95%質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75%質(zhì)量濃度乙醇洗滌24次，然后聚唾液酸沉淀再溶解于適量的超純水中，得到澄清液體，該溶液通過蠕動泵進入平衡好的層析柱，用0.020.08M氯化鈉溶液進行洗脫，洗脫速度為15mL/min，分別收集分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸，分別用截留分子量為7000Da或1200014000Da透析膜進行透析4872小時，最后透析液體經(jīng)過冷凍干燥得聚唾液酸產(chǎn)品，純度達到97%以上。表1聚唾液酸提取純化的收率〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種提取聚唾液酸的方法，其特征是以一株大腸桿菌(Escherichiacoli)K235-JYII-74的發(fā)酵液為原料，經(jīng)過板框過濾去除菌體，上清液加入氯化鈉和乙醇溶劑沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，再用板框過濾或者硅藻土過濾去除變性蛋白質(zhì)，濾液經(jīng)過堿性蛋白酶處理、氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨絡(luò)合沉淀并解離后，再用乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超純水溶解，通過層析柱進行分級純化，收集洗脫液經(jīng)過透析，冷凍干燥得聚唾液酸產(chǎn)品；各步驟工藝條件為(1)過濾發(fā)酵液中加入10～20g/L的80～200目的珍珠巖助濾劑，發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾去除菌體，過濾方式選擇110目工業(yè)濾布；(2)沉淀過濾去除菌體后的清液加入氯化鈉，使氯化鈉質(zhì)量濃度達2％～5％，溶解后再加入2～4倍體積的95％質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75％質(zhì)量濃度的乙醇洗滌2～4次；(3)溶解、過濾聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，加入10～20g/L的80～200目的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾或者硅藻土過濾機進行過濾，通過過濾去除部分變性蛋白質(zhì)；(4)酶處理過濾去除部分變性蛋白后的濾液加入堿性蛋白酶進行處理，其工藝為堿性蛋白酶活力2～5萬U/mL，pH7～8，加量為10mL/kg聚唾液酸，30～70℃酶解3～7小時；(5)絡(luò)合沉淀酶處理過的聚唾液酸溶液加入過量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨進行絡(luò)合沉淀，氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨加量為1～3g/g聚唾液酸，溫度為10～15℃；(6)解離經(jīng)過絡(luò)合得到的聚唾液酸沉淀加入2～4倍量0.5～0.8M的氯化鈉溶液，40～60℃水浴解離3～8小時；(7)乙醇沉淀解離后的溶液再加入2～4倍體積的95％質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75％質(zhì)量濃度的乙醇洗滌2～4次；(8)溶解、柱層析乙醇沉淀出的聚唾液酸用超純水溶解后進行層析分離，其工藝為層析柱填料為DEAE-纖維素或者葡聚糖凝膠，層析柱用0.01～0.05M磷酸鹽緩沖液進行平衡，洗脫液為0.02～0.08M氯化鈉溶液，洗脫速度為1～5mL/min，分別收集分子量7000～15000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸；(9)透析層析收集得到的分子量7000～15000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸分別用截留分子量為7000Da、12000～14000Da透析膜進行透析48～72小時；(10)冷凍干燥兩種透析液體分別經(jīng)冷凍干燥得到兩種規(guī)格的聚唾液酸產(chǎn)品。全文摘要一種提取聚唾液酸的方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明以一株產(chǎn)聚唾液酸大腸桿菌的發(fā)酵液為原料，經(jīng)過過濾去除菌體，上清液加入適量氯化鈉和乙醇等溶劑沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，再用過濾去除變性蛋白質(zhì)，濾液經(jīng)過堿性蛋白酶處理、氯代十六烷基吡啶(CPC)或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)絡(luò)合沉淀并解離后，再用過量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超純水溶解，用層析柱進行分級純化，收集洗脫液經(jīng)過透析，冷凍干燥得聚唾液酸產(chǎn)品。本發(fā)明提出一種有效的聚唾液酸分離純化方法，得到97％以上純度的聚唾液酸產(chǎn)品，以用做藥品和化妝品的原料。文檔編號C08B37/00GK101195661SQ20071019136公開日2008年6月11日申請日期2007年12月19日優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日發(fā)明者吳劍榮,莉朱,詹曉北,鄭志永申請人:江南大學(xué)