專利名稱：用于組織工程學(xué)和用作活性物質(zhì)載體的多糖混合物水凝膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水凝膠(或3D基體)及其生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的用途，所述水凝膠通 過適于和膠凝因子成為凝膠的酸性多糖和堿性多糖衍生物(例如殼聚糖寡糖 衍生物)混合物的水溶液而得。
背景技術(shù)：
多糖作為常用生物醫(yī)學(xué)聚合物，被廣泛研究并用在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用作生 物活性物質(zhì)以及生物體(例如用于組織工程學(xué)的細(xì)胞)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知其封裝或微膠囊工藝，即將被運(yùn)載的生物材料內(nèi)含在由材料本身的三 維聚合物基體組成的系統(tǒng)中。使得多糖適于成微膠囊的特性是其已知的在水 溶液和特定條件下形成水凝膠(被認(rèn)為是立體聚合物基體)的能力。特別的， 組織工程學(xué)領(lǐng)域使用多糖封裝細(xì)胞仍然是被廣泛研究的，也是生物工程研究 中最具創(chuàng)新的主題。這一技術(shù)源自從替代型移植手術(shù)到使用可再生的同一組 織細(xì)胞的再生型手術(shù)的需要，以便于原始組織結(jié)構(gòu)和生理恢復(fù)以及移植細(xì)胞 生成對新組織完全恢復(fù)代謝活動并與周圍組織生理及功能整合。
一些組織工程學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，對于特定治療領(lǐng)域這個(gè)方法可以依賴于經(jīng)驗(yàn) 的整理(例如人造皮膚)。在生物工程領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步使得組織工程學(xué)巨大進(jìn) 步，包括很少探索的領(lǐng)域。這些包括細(xì)胞工程學(xué)在關(guān)節(jié)軟骨虛弱病的治療中 的應(yīng)用。
在這個(gè)醫(yī)療領(lǐng)域，除了已周知在重建手術(shù)的軟骨球體中生物適用系統(tǒng)可 以再建細(xì)胞成長和繁殖的最佳空間和代謝條件的問題，一個(gè)明顯的問題是提 供體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的方法，該方法可以使得細(xì)胞在自我移植前得以保 持和擴(kuò)展。另外，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)是研究在生理?xiàng)l件或病理?xiàng)l件下伴隨不 同過程和代謝以及功能改變的分子過程的最有效的手段。使用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 培養(yǎng)的主要限制是這些細(xì)胞從其基體分離出來后，具有明顯去分化成為纖維 細(xì)胞的趨勢。與分化過程相關(guān)的因素主要是附著的培養(yǎng)系統(tǒng)，低細(xì)胞密度，存在促炎因素(例如細(xì)胞因子)，細(xì)胞永生化。在這些條件下，幾天后，細(xì)胞 快速損失典型的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞圓形顯型并呈現(xiàn)纖維細(xì)胞典型的拉長形狀。顯 型的改變伴隨特定關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞標(biāo)記(例如膠原質(zhì)II和膠原質(zhì)X)表達(dá)下調(diào)，
高分子量蛋白多糖(例如聚蛋白多糖(aggrecan))，同時(shí)膠原質(zhì)I和低分子量蛋 白多糖(例如雙糖鏈蛋白多糖(Biglycan)或核心蛋白多糖(Decorin))表達(dá)增加。 為避免或限制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分化過程，過去20年已經(jīng)做了很多努力以建立 有效的培養(yǎng)方法。這些方法主要包括3D藻酸鹽、瓊脂糖或膠原質(zhì)基體內(nèi)的 培養(yǎng)系統(tǒng)(而不是簡單地附著上)。盡管這些方法可以改善保持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 顯型，這些方法中，細(xì)胞顯示非常低的生長和繁殖率因而可用但損失大量細(xì) 胞材料。
最常用的將細(xì)胞包埋在微膠囊中的材料是藻酸鹽。術(shù)語"藻酸鹽"描述了 一個(gè)多糖族，由海藻和細(xì)菌制成(Sabra W.等Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2001,56,315-25 )。其由p-D-甘露糖醛酸和a-L-古羅糖醛酸組成，通過設(shè)置 在多糖鏈的塊結(jié)構(gòu)的1—4鍵連接在一起。由于存在羧基，藻酸鹽和其他具 有羧基的多糖一樣，在生理pH值是聚陰離子。此外，這種多糖是完全生物 相容性的(Uludag H.等Adv. Drug Deliv. Rev., 2000, 42, 29-64)，而其在工業(yè)和 生物領(lǐng)域應(yīng)用最相關(guān)的特性是其與含有二價(jià)離子(典型的是^)的溶液接觸 形成水凝膠的能力。在此方面，用所述離子簡單處理濃縮的藻酸鹽溶液立即 形成水凝膠。正是這一特性用于包埋細(xì)胞和組織于水凝膠中。已知細(xì)胞微膠 囊技術(shù)包括將藻酸鹽和細(xì)胞懸浮液滴加到含鈣的浴中，并通過不同的物理方 法控制微膠囊直徑。凝膠的即時(shí)形成使得細(xì)胞被包埋其中。在用于修復(fù)關(guān)節(jié) 軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞微膠囊這種情況下，使用藻酸鹽的限制主要因?yàn)榧?xì)胞進(jìn) 入其中后缺少繁殖能力。
基于這個(gè)情況，近來其它多糖顯示出可應(yīng)用于生物材料微膠囊，其為生 物相容性的并可如藻酸鹽般大量可用。這就是殼聚糖。殼聚糖是一種堿性多 糖，其分子量為50-1500 kDa,由通過l一4鍵連接間布N-乙?；?葡萄糖胺 單元?dú)埢腄-葡萄糖胺(GlcNH2)組成。其通常在中性和堿性水溶液中不 溶；在pHS5的酸性溶液中游離胺基被質(zhì)子化使得聚合物可溶。這個(gè)聚合物 已經(jīng)廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域，其顯示出低免疫、病理和感染反應(yīng)(Suh FrancisJ.K., Matthew H.W.T. Biomaterials, 2000, 21, 2589-2598; Miyazaki S.等Chem. Pharm. Bull.,1981, 29, 3067-3069)。殼聚糖理化特性使其具有用作生物材料的 全部理想特性，這些理化特性例如溶液中高陽離子電荷密度，以及由于其多 孔性使得細(xì)胞可植入其中而帶來的高加工性能。最近的研究集中在提高增加 殼聚糖生物效果的方法。特別重要的效果在于增加聚合物陽離子或通過(生 物)化學(xué)改性來改變其生物利用特性。其衍生物使得殼聚糖具有作為生物材 料所需的這些特性。近期研究顯示特別是殼聚糖乳糖衍生物是生物相容性的 并可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在原始培養(yǎng)中的聚合以及刺激軟骨組織特征標(biāo)記例 如膠原質(zhì)II和聚蛋白多糖的形成(Donati, I.等Biomaterials 26, 2005, 987—998)。
糖類側(cè)基改性殼聚糖，例如通過還原胺化反應(yīng)插入乳糖單元，是已知的 并使得多糖衍生物具有更大水溶性，這是記載在專利US4,424，346 (Hall, L.D. 和Yalpani, M.)中的。US4,424,346也提到了殼聚糖乳糖衍生物在濃度大于 3-5%的水溶液中形成剛性凝膠，但是其在與鹽或酸(特別是Ca,Cr,Zn氯化 物，K鉻酸鹽，硼酸)混合和結(jié)合即不形成凝膠也不沉淀。引述的專利還提到 其它寡糖(纖維二糖)衍生的殼聚糖在水溶液中其自己不形成凝膠，而是在于 藻酸鹽混合時(shí)形成剛性凝膠。這個(gè)凝膠的形成是因?yàn)榈木坳栯x子正電荷同聚 陰離子的負(fù)電荷之間強(qiáng)烈相互作用，使得系統(tǒng)凝聚，限制微膠囊的過程。
為獲得適于結(jié)合生物材料或生物活性物質(zhì)的立體聚合物基體，這些基體 優(yōu)選具有良好水溶性，這樣的基體需要在任何情況下在水溶液中具有一定的 分散性而沒有不溶性沉淀，進(jìn)而確保適于微膠囊的立體結(jié)構(gòu)。
為克服這一點(diǎn)，不同的系統(tǒng)被描述，其包括使用多糖混合物，包括改性 的和/或交聯(lián)的，以改善這些基體的理化特性。
特別是，WO94/25080 (Griffith-Cima, L.等)描述使用合并其它多糖(基本 上是透明質(zhì)酸)的藻酸鹽的可注射多糖-細(xì)胞組合物被用來得到適于封裝用 于組織工程學(xué)的細(xì)胞的水凝膠。適于形成移植單個(gè)細(xì)胞的水凝膠的聚合物是 多種多樣的，并與交聯(lián)劑交聯(lián)，交聯(lián)劑由離子(優(yōu)選為2價(jià)或3價(jià))pH下和 溫度下的電荷組成。交聯(lián)的離子濃度不低于0.005 M。水凝膠也可由聚陽離 子絡(luò)合并穩(wěn)定，聚陽離子選自合成聚胺，例如聚亞乙基胺、聚乙烯胺、聚烯
8丙胺和聚賴氨酸。
類似的，專利申請W096/40304 (Hubbell, J)描述與交聯(lián)齊IJ(由離子、pH 和溫度電荷、自由基引發(fā)劑和酶組成)交聯(lián)的聚合物形成的水凝膠。聚合物 包括多糖，多糖選自改性藻酸鹽、改性透明質(zhì)酸、結(jié)冷膠(gellan)和卡拉膠。
專利US 6,224,893 (Langer, R.S.等)描述了用于藥物傳輸和組織工程學(xué) 的互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)(IPNs)或半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)。所述的IPNs由溶液組成， 溶液的形式優(yōu)選為親水型、離子型或共價(jià)型交聯(lián)聚合物水凝膠，離子交聯(lián)聚 合物包括透明質(zhì)酸、右旋糖酐、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、肝素、藻酸 鹽、結(jié)冷膠和拉膠，共價(jià)型交聯(lián)聚合物包括與異硫氰酸鹽交聯(lián)的殼聚糖。IPNs 由兩個(gè)聚合物組分形成，組分是交聯(lián)的但沒有相互交聯(lián)，而半IPNs包括兩 個(gè)組分，其中只有一個(gè)是交聯(lián)的且組分彼此不交聯(lián)。優(yōu)選的，但不是排他的， 聚合物交聯(lián)是通過自由基光引發(fā)劑的光活化實(shí)現(xiàn)的。在此方面，聚合物組合 物可由共價(jià)型交聯(lián)聚合物通過光敏引發(fā)劑形成或者共價(jià)型和離子型交聯(lián)聚 合物混合物或親水聚合物形成半IPNs。
專利US 5,620,706 (Severian, D.等)報(bào)道了酸性和堿性多糖離子絡(luò)合物 特別是殼聚糖和黃原膠的凝聚，黃原膠是一種側(cè)鏈有負(fù)電荷的多糖被用來形 成不溶性水凝膠。
WO2005/061611 (White, B丄等)描述制備互穿或半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)，該 網(wǎng)絡(luò)由組合物組成，所述組合物包括交聯(lián)的水溶性堿性多糖衍生物和一個(gè)非 交聯(lián)的陰離子多糖。特別的，所述IPNs是通過混合透明質(zhì)酸同交聯(lián)的N-羧甲基、O-羧甲基、O-羥乙基殼聚糖衍生物，或部分乙酰化的殼聚糖而得。 基于該專利，這些殼聚糖衍生物可在溶液中與透明質(zhì)酸混合，它們在使得鏈 上無任何正電荷的pH條件下可溶，這樣可以避免形成離子絡(luò)合物。由于完 全移除或補(bǔ)償一個(gè)聚合物上的電荷避免了聚陰離子凝聚。因此是聚陰離子/ 中性多糖或聚陰離子/聚兩性電解質(zhì)的溶液。
盡管這樣，提供結(jié)合細(xì)胞并維持細(xì)胞顯型同時(shí)使其生長和繁殖的生物適 用系統(tǒng)仍然沒有解決，正如前述討論的。
本發(fā)明第一目的是建立生物相容性的系統(tǒng)用于組織工程學(xué)中作為細(xì)胞 載體，其不僅可以確保細(xì)胞存活還維持其生長和繁殖生理特性。本發(fā)明另一目的是通過使用市售多糖得到所述系統(tǒng)，無需將多糖進(jìn)行化 學(xué)處理，無需絡(luò)合以制備所述系統(tǒng)。
本發(fā)明再一 目的是提供水凝膠或3D基體形式的生物相容性系統(tǒng)，用作 細(xì)胞載體，在各種用途中很容易使用無需衛(wèi)生技術(shù)人員進(jìn)一步處理。
本發(fā)明還一目的是提供水凝膠或3D基體生物相容性系統(tǒng)作為藥物載 體，其可根據(jù)不同需要易于使用。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)前述目的，本發(fā)明人已經(jīng)確定適合的堿性多糖衍生物，在適當(dāng)?shù)?條件下，所述多糖水溶液與陰離子多糖物理混合不會產(chǎn)生不溶性凝聚。
混合物水溶液可以通過適當(dāng)?shù)哪z凝因子形成凝膠，得到立體水凝膠或基 體，其中結(jié)合有被運(yùn)載的細(xì)胞或藥物。用于制備本發(fā)明的基體的多糖混合物 包括陰離子多糖和殼聚糖寡糖衍生物。
令人驚訝的，除了使得所述聚陰離子多糖和聚陽離子多糖衍生物物理混 合物組合物可溶于水，所述組合物用適當(dāng)?shù)目扇苄阅z凝因子處理時(shí)使得水凝 膠可微膠囊化細(xì)胞并且細(xì)胞在其中維持顯型并可繁殖。
盡管使用藻酸鹽具有很多優(yōu)點(diǎn)，微膠囊技術(shù)可有所有離子型多糖來實(shí) 施，所述離子型多糖在與離子(溶致)溶液或冷卻的溶液(熱致)接觸時(shí)立即形 成水凝膠。初始類多糖包括例如果膠、卡拉膠以及藻酸鹽。第二類多糖包括 例如瓊脂糖(部分硫酸鹽化)、結(jié)冷膠以及卡拉膠。
本發(fā)明第一方面是水凝膠組成的組合物，特征在于是由至少一個(gè)溶致或 熱致陰離子多糖與至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物的混合物的水溶液制得，其
中所述殼聚糖衍生物的衍生度至少40%，其中所述水溶液的離子強(qiáng)度至少 為50 mM且不超過175 mM， pH至少為7，所述多糖混合物水溶液由試劑 處理，該試劑可使得混合物中溶致或熱致聚陰離子多糖成凝聚。 本發(fā)明的另一方面是制備所述組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步方面是所述組合物在組織工程學(xué)用細(xì)胞微膠囊或活性物 質(zhì)微膠囊中的用途，及其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。


10圖1:基于例6的二元聚合物溶液所得微膠囊的光學(xué)顯微鏡照片，所述 溶液是藻酸鹽和殼聚糖乳糖衍生物(下稱基察克)在NaCl 0.15M， Hepes 10 mM,pH7.4下制備的。總聚合物濃度2%，聚陰離子比聚陽離子的重量比為 3:1 。微膠囊通過滴加二元溶液到下述溶液中而得，該溶液含有CaCl2 50 mM, 甘露醇0.15M,Hepes 10mM, pH7.4。靜電珠發(fā)生器條件電壓5kV,針頭 內(nèi)徑0.7mm,凝膠預(yù)和針頭間距離4cm， 二元聚合物溶液流速10 mL/min。 平均膠囊直徑870±20 ^im。
圖2:23G針頭注射器所得微膠囊，起始于下述二元多糖溶液A)藻酸 鹽和基察克，滴入含有CaCl2 50 mM的凝膠浴(例2); B) K-卡拉膠和基察克， 低于含有KC1 100 mM的凝膠浴(例4); C)瓊脂糖(部分硫酸鹽化)和基察 克，滴入水冷卻到30'C所得凝膠浴(例5)。在所有這些情況下，總多糖濃度 是3%，聚陰離子和基察克重量比為1:1。
圖3:'H-NMR質(zhì)子分析藻酸鹽(1.5%)和基察克(0.5%)二元混合物，基 于例6，分析是在(A)微膠囊形成之前以及(B)微膠囊形成之后進(jìn)行，從中可 看到基察克存在于所有情況。
圖4:藻酸鹽溶液(聚合物濃度1.5G/。,NaC10.15M,Hepesl0mM,pH7.4) 彈性模數(shù)(0'=翻)和粘性模數(shù)(G"-口)時(shí)間變化圖，藻酸鹽和基察克二元溶 液(總聚合物濃度2%,藻酸鹽與基察克重量比3:1， NaCl 0.15 M, Hepes 10 mM, pH 7.4)彈性模數(shù)和粘性模數(shù)(G，-^ G"-o)時(shí)間變化圖。通過原位法用 CaC03 15 mM和GDL 30 mM得到凝膠(例9)。
圖5:測量圓柱型水凝膠抗壓模數(shù)(E)，該水凝膠通過原位法得到，起 始于藻酸鹽溶液(1.5%濃度)以及起始于藻酸鹽和基察克二元溶液(總聚合 物濃度2%,藻酸鹽與基察克重量比3:l)(例9)。在所有溶液中NaC10.15M， Hepes 10mM,pH7.4。
圖6: A)比色法(二甲基亞甲基藍(lán))測量藻酸鹽膠囊和藻酸鹽基察克膠 囊(例12制備)中培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白聚糖含量。B)通過合并^H-脯氨 酸]測定評估藻酸鹽膠囊和藻酸鹽基察克膠囊(例12制備)中培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟 骨細(xì)胞中膠原質(zhì)合成水平。
圖7:RT-PCR分析藻酸鹽膠囊和藻酸鹽:基察克膠囊(例12制備)中生長的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的膠原質(zhì)I、膠原質(zhì)II和聚蛋白多糖表達(dá)。從關(guān)節(jié)軟骨細(xì)
胞提取的RNA，圖A是封裝2天后進(jìn)行，圖B是封裝17天后進(jìn)行的。
圖8: pH-胸苷]繁殖測定。上部曲線顯示例12所制備藻酸鹽/基察克膠 囊中細(xì)胞的結(jié)果，其顯示到培養(yǎng)第15天具有增加的繁殖水平。下部曲線顯 示藻酸鹽膠囊中細(xì)胞繁殖能力低。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清楚無疑顯示培養(yǎng)第一天以后 藻酸鹽膠囊中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞阻止繁殖，與之相反，在混合膠囊中觀測到細(xì)胞 繁殖，繁殖期可達(dá)培養(yǎng)的頭兩個(gè)星期。
具體實(shí)施方案 定義
術(shù)語"水凝膠"或"水凝膠復(fù)數(shù)"是指高含水半固體結(jié)構(gòu)，其可以保持形態(tài) 和尺寸而不變形。水凝膠從適當(dāng)?shù)慕宦?lián)多糖濃縮溶液而得。
術(shù)語"3D基體"或"立體基體"是指固體或半固體結(jié)構(gòu)，其可以保持形態(tài) 和尺寸而不變形。3D基體可通過適當(dāng)?shù)慕宦?lián)多糖濃縮溶液得到。
相應(yīng)的，術(shù)語"水凝膠"或"3D基體"在本發(fā)明的描述中可認(rèn)為是相同的。
術(shù)語"微膠囊化"是指一種在水凝膠中內(nèi)含物質(zhì)(可為生物材料或其它) 的工藝，通常但非排他的，為微米級球形，是溶致或熱致多糖由適當(dāng)離子(溶 致多糖情況下)和冷卻溶液(熱致多糖情況下)處理所得。
描述
本發(fā)明所得的至少成凝膠多糖二元溶液所得立體基體在下述水凝膠的 非限制性實(shí)施例的詳細(xì)描述中更容易理解，它們的理化特性與它們同封裝于 其中的單個(gè)細(xì)胞的生物相容性/生物特性一同被描述。
為實(shí)現(xiàn)目的， 一些想法被用來確定和設(shè)計(jì)用于具有那些特征(稱為生理 學(xué)標(biāo)記)的細(xì)胞封裝的生物材料，他們與那些用于發(fā)展更有效的細(xì)胞培養(yǎng)方 法(特別是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)的細(xì)胞外基體的特征非常相似。己經(jīng)廣泛用于組 織工程學(xué)的特定生物聚合物，即酸性多糖，例如前述藻酸鹽和寡糖改性殼聚 糖。陰離子多糖和堿性多糖的結(jié)合如前述可以導(dǎo)致系統(tǒng)凝聚進(jìn)而失去適于內(nèi) 含生物材料的立體結(jié)構(gòu)。凝聚的形成構(gòu)成了生物材料或生物活性物質(zhì)微膠囊的缺陷。對于微膠囊，由于對本領(lǐng)域人員而言通過滴加聚合物溶液到含有適 宜交聯(lián)離子的溶液中誘捕生物材料(例如細(xì)胞或不同特性化合物)于水凝膠 中是可能的，起始多糖的可溶性形式是非常重要的。如果凝聚存在或形成于 聚合物溶液中，當(dāng)與交聯(lián)離子溶液接觸時(shí)會形成纖維沉淀，這就不能包含生 物材料了 。因此識別二元多糖混合物溶解性窗口的重要性會影響水凝膠的形 成，該混合物適于由膠凝因子(含離子溶液或冷卻的溶液)處理。
因此，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，并與US4,424,346所記載的相反，為得到 本發(fā)明3D基體所需的多糖組合物，包括至少一種陰離子多糖和一種殼聚糖 寡糖衍生物的二元混合物，特征在于在適當(dāng)?shù)臈l件下，可溶于水性溶液而不 產(chǎn)生不溶性凝聚。在此方面，發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)包括至少一個(gè)陰離子多糖和 至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物水溶液，所述殼聚糖衍生物衍生度至少 40% ，所述水溶液pH值在生理學(xué)范圍內(nèi)，特別是7-8，并有適宜的離子強(qiáng) 度，特別是至少50mM且不超過175mM，兩種多糖沒有凝聚都保留在溶 液中。在這些條件下直到總聚合物濃度達(dá)到3%，陰離子和陽離子多糖在水 性環(huán)境中不凝聚或沉淀。
本發(fā)明的客體載其全部優(yōu)選方面以及從其衍生的，是描述在未決的意大 利專利申請PD2006A000202中，在這里結(jié)合該申請作為參考。
立體水凝膠或基體的形成是通過適當(dāng)?shù)目蓪⒕坳庪x子多糖成凝膠的膠 凝因子處理所述二元溶液得到的。
在此方面，本發(fā)明提供組合物，其由至少一個(gè)溶致或熱致陰離子多糖和 至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物水溶液所得水凝膠,組成，其中所述殼聚 糖衍生物衍生度至少為40%，其中水溶液的離子強(qiáng)度至少為50mM且不超 過175mM， pH值至少7，通過混合物中溶致或熱致陰離子多糖與膠凝因子 成凝膠而得。通過聚陰離子多糖的成凝膠過程，殼聚糖衍生物被封裝在水凝 膠中，囚恥王少一T裕玖&乂烈玖I刊閎丁多鵬和芏少一T宂豕鵬暴概1打'王柳混 合物水溶液成凝膠所得水凝膠是通過封裝殼聚糖衍生物的網(wǎng)狀溶致或熱致 陰離子多糖形成的，其中殼聚糖衍生物衍生度至少為40 %，所述水溶液離 子強(qiáng)度至少50mM且不超過175mM， pH至少7。
為制備本發(fā)明的水凝膠，殼聚糖可由寡糖衍生，所述寡糖包括l-4個(gè)糖苷單元，優(yōu)選包括2-4個(gè)糖苷單元，更優(yōu)選的選自乳糖、纖維二糖、纖維 三糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、殼二糖、殼三糖和蜜二糖組成的組。
可用于得到所述寡糖衍生物的殼聚糖平均分子量(下稱Mw)可達(dá)1500 kDa， 優(yōu)選為400 kDa- 1000 kDa。另外，出于本發(fā)明目的，殼聚糖胺基由所述寡 糖取代的取代率超過40-45% (~ 45%)。優(yōu)選的，殼聚糖胺基由所述寡糖取代 的取代率為50% - 80°/。，更優(yōu)選為70%。
所述殼聚糖寡糖衍生物制備工藝是已知工藝，包括對殼聚糖在酸性(pH 4.5)和甲醇溶液在氰基硼氫化鈉存在下用還原糖(例如乳糖)處理。殼聚糖胺 基和乳糖醛基之間相互反應(yīng)導(dǎo)致形成不穩(wěn)定中間體，已知為西弗堿(Schiff base)。其在硼氫化物存在下被還原成穩(wěn)定的仲胺。
關(guān)于聚陰離子多糖，本發(fā)明的水凝膠可通過多糖混合物而得，所述多糖 混合物包括溶致陰離子多糖(在這種情況下優(yōu)選自卡拉膠、果膠和果膠酸鹽、 藻酸鹽、結(jié)冷膠、拉姆珊膠(rhamsan)、韋蘭膠(welan)、黃原膠或熱致陰離 子多糖(在這種情況下優(yōu)選自部分硫酸鹽化的瓊脂糖、卡拉膠、硫酸纖維素、 結(jié)冷膠、拉姆珊膠、韋蘭膠、黃原膠。多糖結(jié)冷膠、拉姆珊膠、韋蘭膠、黃 原膠已知同時(shí)具有溶致和熱致理化特性，而可用的膠凝因子可以是化學(xué)劑 (例如離子)和物理因子(例如溫度)。
聚陰離子平均分子量(Mw)可達(dá)2000kDa，優(yōu)選為100 kDa - 1000 kDa，
更優(yōu)選的平均分子量為200kDa。
另一優(yōu)選方面是多糖混合物中聚合物重量比是1:1-3:1 (聚陰離子:殼聚 糖衍生物)。
出于本發(fā)明的目的，殼聚糖衍生物和聚陰離子二元混合物總聚合物濃度 可達(dá)3% w/v(g/mL)。優(yōu)選的，所述總聚合物濃為1.5%w/v(g/mL)-3%w/v (g/mL)，更優(yōu)選的是2% w/v (g/mL)。
制備本發(fā)明水凝膠所需的至少二兀多l(xiāng)t^f pH值在生理值 OT，特別 是7-8，更優(yōu)選為pH7.4，滲透壓為250-300 mM，且離子強(qiáng)度50 mM - 175 mM，該離子強(qiáng)度優(yōu)選通過添加濃度0.05 M-0.15 M(更優(yōu)選0.15 M)的NaCl 而得。滲透壓優(yōu)選通過非離子溶質(zhì)例如甘露醇而得。
膠凝因子的選擇，基于溶致陰離子多糖選自適當(dāng)?shù)囊粌r(jià)、二價(jià)或三價(jià)離子，基于熱致多糖選自不超過40。C或不低于l(TC的溫度。
在含有殼聚糖衍生物和致聚陰離子的二元多糖溶液情況下，水凝膠通過 濃度基于陰離子多糖的適當(dāng)堿金屬或堿土金屬離子或過渡金屬或稀土金屬 處理前述溶液而得。
優(yōu)選的，當(dāng)膠凝因子為一價(jià)離子則選自鉀、銣、銫、鉈、銀及其混合物
組成的組，當(dāng)為二價(jià)離子則選自Ca2+、 Ba2+、 Sr2+、 Cu2+、 Pb2+、 Mn2+、 Zn2+ 及其混合物組成的組，當(dāng)為三價(jià)離子則選自Al3+、 Fe3+、 Gd3+、 Tb3+、 Eu3+及 其混合物組成的組。
對于例如藻酸鹽和果膠的多糖，所述離子是堿土金屬離子(不包括鎂)和 過渡金屬(優(yōu)選自鈣、鋇、鍶、鉛、銅、錳及其混合物組成的組)或稀土金屬 離子(優(yōu)選自釓、鋱、銪及其混合物組成的組)。
用于二元多糖溶液成凝膠的適宜離子的水溶液的濃度高于10 mM，優(yōu) 選為lOmM-lOOmM，更優(yōu)選為50 mM。另外成凝膠溶液可含有離子滲透 溶質(zhì)(例如NaCl)或非離子滲透溶質(zhì)(例如甘露醇)以使得成凝膠溶液的滲透 壓達(dá)0.3 M。優(yōu)選的，成凝膠溶液含有CaCl2(50 mM)和NaCl(0.075 M)或非 離子滲透溶質(zhì)(例如甘露醇)(0.15 M)。
在卡拉膠情況下，使用堿金屬離子并優(yōu)選自鉀、銣和銫，濃度不低于 50 mM，優(yōu)選為50mM-lOOmM，更優(yōu)選為0.1 M。
在含有殼聚糖衍生物和聚陰離子(可得熱致水凝膠，例如部分硫酸鹽化 瓊脂糖)的多糖溶液情況下，水凝膠的制備是通過將溫度冷卻到成凝膠的溫 度以下而得。特別的，對于熱致多糖，當(dāng)膠凝因子是溫度，則溫度優(yōu)選為 40 °C- 10°C。
在熱致多糖形成水凝膠的溫度以上制備多糖溶液。在這一溫度熱致多糖 不形成水凝膠。制備多糖溶液的溫度優(yōu)選5(TC-3(TC，更優(yōu)選37"C。通過將 多糖混合物滴加入凝膠浴同時(shí)將其冷卻到低于凝聚形成的溫度而得水凝膠。 優(yōu)選該溫度為10°C-40°C，更優(yōu)選20"C。
在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明水凝膠的制備起始于聚陰離子-聚陽離子二元 多糖混合物，其中聚陰離子優(yōu)選為藻酸鹽，聚陽離子為殼聚糖寡糖衍生物(優(yōu) 選為殼聚糖乳糖衍生物(基察克))。
15出于本發(fā)明的目的，被運(yùn)載的生物材料或活性物質(zhì)在聚合物水溶液用適 當(dāng)膠凝因子處理成水凝膠之前被加入聚合物水溶液中。
本發(fā)明的3D基體或水凝膠通過已知方法得到，特別是包括如下步驟
a) 制備至少一個(gè)溶致或熱致陰離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物 的混合物水溶液，所述殼聚糖衍生物的衍生度至少40%,所述水溶液的離 子強(qiáng)度至少50mM且不超過175mM， pH至少7，然后可選地添加細(xì)胞和 /或活性物質(zhì)到所制備的多糖溶液中；
b) 通過適當(dāng)方法(例如由針頭滴加)將步驟a)制備的溶液滴加到凝膠溶 液以得到水凝膠，所述凝膠溶液或者含有交聯(lián)離子(對溶致陰離子多糖而言) 或具有適當(dāng)?shù)臏囟?對熱致聚陰離子而言)；
c) 通過適宜的方法，例如離心法或透析發(fā)，移除所形成的水凝膠(可選 合并有細(xì)胞和/或活性物質(zhì))。
在滴加的情況下，滴的尺寸通過不同物理方法控制(例如針頭外徑的選 擇、電場的存在或與針頭同軸空氣流)，決定最終微膠囊型水凝膠尺寸。膠 囊被保持(例如在凝膠溶液中)IO分鐘，然后移走。
通過前述方法所得水凝膠，通過適當(dāng)?shù)倪M(jìn)一步處理可得到不同形式，優(yōu) 選為微膠囊，但也可是圓柱或盤狀型。
特別的，起始于二元聚合物溶液形成圓柱體水凝膠的步驟如下a)添 加有將被裝入膠囊的細(xì)胞和/或活性物質(zhì)的二元聚合物溶液被轉(zhuǎn)入圓柱或盤 狀容器且在末端由透析膜封閉；b)這些容器然后被浸沒于或含有交聯(lián)離子或 有適當(dāng)溫度的溶液中(凝膠溶液)。圓柱或盤狀容器留在凝膠溶液中大約30 分鐘，然后被移除；c)所得水凝膠膠體圓柱或圓盤在移除透析膜后從容器中 得到。
替換的，在藻酸鹽情況下，圓柱體可以通過添加交聯(lián)離子(例如CaC03 或Ca-EDTA絡(luò)合物/鈍性體到多糖溶液屮而得。然后添加可緩慢水解鈣鹽的 基質(zhì)，例如GDL (D-葡萄糖酸-S-內(nèi)酯)。懸濁液被轉(zhuǎn)入圓柱或盤狀容器并保 持其中24小時(shí)。水凝膠的膠體圓柱或圓盤然后從容器中移出。這個(gè)方法描 述為原位鈣釋放形成圓柱。
通過非限制性示范，下面描述的是從至少一個(gè)溶致或熱致陰離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物制二元多糖溶液備基于本發(fā)明的微膠囊型或 圓柱體型水凝膠或3D基體，以及合并有單獨(dú)細(xì)胞的微膠囊的制備。
A.從一個(gè)陰離子多糖和一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物溶液制備3D基體。 劍備錄條
溶致或熱致陰離子多糖二元混合物水溶液制備如下
a-制備一個(gè)陰離子多糖(例如藻酸鹽(Mw 130,000))溶液，離子強(qiáng)度150 mM(通過添加NaC10.15M)， HepeslOmM， pH7.4;
b-制備一個(gè)殼聚糖衍生物(例如基察克(Mw 1.5xlO")溶液，離子強(qiáng)度 150 mM(通過添加NaCl 0.15 M)， Hepes 10 mM， pH 7.4;
c-通過磁力攪拌混合兩個(gè)溶液得到含有藻酸鹽和基察克的溶液(例如重 量比為l:l，總聚合物濃度2%)。
所得水溶液全透明且無沉淀和/或凝聚。
同樣的程序可適用于其它前述提到的具有不同重量比(陰離子多糖:殼 聚糖衍生物)和不同總聚合物濃度的溶致或熱致多糖和殼聚糖衍生物，沒有 形成沉淀和/或凝聚。
下述微膠囊特定實(shí)施例的制備是基于已知方法，特別是a)使用簡單 注射器將一種陰離子多糖和一種殼聚糖寡糖衍生物二元水溶液滴加入適當(dāng) 的凝膠浴；b)使用靜電珠發(fā)生器(挪威特隆赫姆大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院Gudmund Skjik-Braek教授研發(fā)，描述在5^rarn/禁2002, / o/M/crae"cajOTM/加'o" W， )。所述系統(tǒng)有一個(gè)連接到容納在樹脂玻璃安全籠內(nèi)的耐高壓加熱針 頭的支架的靜電發(fā)生器組成，該靜電發(fā)生器電壓(可達(dá)10 kV)并由適當(dāng)開關(guān) 可調(diào)。通過籠外系統(tǒng)，包括由泵調(diào)節(jié)并連接到內(nèi)徑lmm的橡膠管注射器， 藻酸鹽溶液被滴加到一個(gè)含有凝膠溶液且其中插有電極的結(jié)晶器(位于籠內(nèi)) 中。儀器在針尖和凝膠溶液自由表面之間形成恒定電壓差，其可調(diào)節(jié)且范圍 是O-IO kV。電壓差導(dǎo)致聚合物小滴(帶負(fù)電荷)突然從針尖脫離然后得到一 個(gè)很小尺寸的膠囊(〈200iim)。膠囊尺寸可通過一些因素調(diào)節(jié)，例如針頭內(nèi)徑， 針頭和凝膠溶液表面間距，聚合物流速。
縦離沐
下面給出通過將二元多糖溶液注入圓柱或盤狀容器制備凝膠圓柱/圓盤
17的實(shí)施例。圓柱或圓盤水凝膠的尺寸依賴于容器的尺寸。圓柱容器典型尺
寸為18mm高，內(nèi)徑為16mm，當(dāng)然其他尺寸(高和內(nèi)徑)也可以。
起始于寡糖改性殼聚糖和溶致或熱致聚陰離子多糖二元多糖混合物水
凝膠制備實(shí)施例如下。
基于下述實(shí)施例制備3D基體，使用市售陰離子多糖水溶液和例1所描
述的還原胺化反應(yīng)制得的乳糖衍生殼聚糖水溶液被。 例1:合成汗乳糖殼聚糖衍生物(基察克)
殼聚糖(1.5 g，乙酰化度ll。/。)溶于110mL甲醇(55mL)、 1%乙酸緩沖 液(pH4.5)(55 mL)溶液中。向其中再添加60 mL甲醇(30 mL)、 1%乙酸緩 沖液(pH 4.5)(30 mL)含乳糖(2.2 g)和氰基硼氫化鈉(900 mg)的溶液?；旌衔?攪拌24小時(shí)，轉(zhuǎn)入透析管(切斷12,000 Da)由0.1 MNaCl (2次)和去離子水 滲析，直到導(dǎo)電率為4(iS(4'C)。最后溶液通過微孔(0.45pm)過濾器過濾，凍 干。
例2:通過注射器從藻酸鹽:基察克(3:lw/w)二元多糖溶液(2。/。 w/v (g/mL))制備微膠囊
制備二元多糖溶液，其含有基察克(例1，Mw 1500kDA)和藻酸鹽(Mw ~ 130 kDa)(總聚合物濃度2%，藻酸鹽基察克=3:1)， NaCl 0.15 M， Hepes 10 mM， pH 7.4。20 mL這個(gè)溶液使用裝配有23G針頭的注射器逐滴加入另一溶 液中，該溶液含有50 mM CaCl2和0.15 M甘露醇(凝膠浴)且保持磁力攪 拌。膠囊在攪拌下保持在凝膠浴中IO分鐘，然后被移出并由去離子水情緒。
例3:通過注射器從藻酸鹽:基察克(3:1 w/w)二元多糖溶液(2。/。 w/v (g/mL))制備微膠囊
制備二元多糖溶液，其含有基察克(例1，Mw 1500kDA)和藻酸鹽(Mw 130 kDa)(總聚合物濃度2%，藻酸鹽基察克=3:1)， NaCl 0.15 M, Hepes 10 mM， pH 7.4。20 mL這樣溶液使用裝配有23G針頭的注射器逐滴加入另一溶 液中，該溶液含有50 mM CaCl2和0.075 M NaCl (凝膠浴)且保持磁力攪 拌。膠囊在攪拌下保持在凝膠浴中IO分鐘，然后移出并由去離子水清洗。
例4:通過注射器從卡拉膠:基察克(3:1 w/w)二元多糖溶液(2n/。 w/v (g/mL))制備微膠囊制備二元多糖溶液，其含有基察克(例1, Mw 1500 kDA)和卡拉膠 (Mw ~ 300 kDa)(總聚合物濃度2%,卡拉膠基察克=3:1)， NaCl 0.15 M, Hepes 10 mM, pH 7.4。20 mL這個(gè)溶液通過裝配有23G針頭的注射器逐滴加 入一溶液中，該溶液含有l(wèi)OOmMKCl(凝膠浴)并保持磁力攪拌。膠囊在攪 拌下保留在凝膠浴IO分鐘，然后被移出并由去離子水清洗。
例5:通過注射器從部分硫酸鹽化瓊脂糖:基察克(3:1 w/w)二元多糖溶 液(2% w/v (g/mL))制備微膠囊
在60。C左右制備二元多糖溶液，其含有基察克(例1, Mw ~ 1500 kDA) 和部分硫酸鹽化瓊脂糖(低凝膠點(diǎn))(總聚合物濃度2%,(部分硫酸鹽化)瓊 脂糖基察克=3:1)， NaC10.15M,Hepes 10mM,pH7.4。 20mL這個(gè)溶液被 冷卻到大約3(TC，通過裝配23G針頭的注射器逐滴加入到另一含大約4°C 去離子水的溶液中。膠囊在攪拌下保持在冷溶液中IO分鐘，然后被移出并 由去離子水清洗。
1&通過靜電珠發(fā)生器從藻酸鹽:基察克(3:1 w/w) 二元多糖溶液(2% w/v (g/mL))制備微膠囊
制備二元多糖溶液，其含有基察克和藻酸鹽(總聚合物濃度2%,藻酸 鹽基察克=3:1)， NaC10.15M，Hepes 10mM,pH7.4。 20mL該溶液被逐滴 加入含有CaCb50 mM和甘露醇0.15 M (凝膠浴)的溶液中。液滴尺寸由靜 電珠發(fā)生器控制。典型使用條件電壓5kV，針頭內(nèi)徑0.7mm，凝膠浴與 針頭間距4cm， 二元聚合物溶液流速10mL/min。膠囊在攪拌下保持在凝膠 溶液中10分鐘，然后被移出并由去離子水清洗。
fL2l通過靜電珠發(fā)生器從藻酸鹽:基察克(3:l wAv) 二元多糖溶液(2% w/v (g/mL》制備微膠囊
制備二元多糖溶液，其含有基察克和藻酸鹽(總聚合物濃度2%,藻酸 鹽基察克=3:1), NaCl 0.15 M, Hepes 10 mM, pH 7.4。 20 mL該溶液被滴加 到含CaCl2 50 mM和NaCl 0.075 M (凝膠浴)溶液中。膠囊尺寸依前述由靜 電珠發(fā)生器控制。膠囊中攪拌下保持在凝膠溶液中IO分鐘，然后被移出并 由去離子水清洗。
例8:通過透析從藻酸鹽:基察克(3:1 w/w)二元多糖溶液(2y。 w/v (g/mL))制備水凝膠圓柱體
制備二元多糖溶液，其含有基察克和藻酸鹽(總聚合物濃度2%,藻酸
鹽基察克=3:1)， NaC10.15M，Hepesl0mM，pH7.4。 20mL該溶液轉(zhuǎn)入塑 料圓柱體(16 mm (0) x 18 mm (h))中并在底端和頂端由透析膜封閉(切斷~ 12,000)。含有二元多糖溶液的圓柱體被浸沒于1L含有CaCl2 50 mM和NaCl 0.15M的溶液中30分鐘，然后從凝膠溶液中移出。
例9:通過原位鈣釋放從藻酸鹽:基察克(3:1 w/w)二元多糖溶液(2y。 w/v (g/mL))制備水凝膠
制備二元多糖溶液，其含有基察克和藻酸鹽(總聚合物濃度2%,藻酸 鹽基察克=3:1)， NaC10.15M,Hepes 10mM,pH7.4。 CaC03 (最終濃度15 mM)和GDL(D-葡萄糖酸-5-內(nèi)酯)(最終濃度30 mM)被添加入20 mL該溶 液中。混合物被轉(zhuǎn)入塑料圓柱體中(16mm(0)x 18mm(h))?；旌衔镏惺覝?下24小時(shí)，然后凝膠被移出。
iLl達(dá)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞封裝入從藻酸鹽:基察克(3:l w/w) 二元多糖溶液 (2% w/v (g/mL))所得微膠囊
提取自豬關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以5 x 10S細(xì)胞/mL密度懸浮在1.5% 藻酸鹽和0.5%基察克混合物中，該混合物是在0.15NaCl， 10mMHepes,pH 7.4緩沖液中制備的。細(xì)胞懸浮液被輕輕攪拌并從靜電珠發(fā)生器滴加入凝膠 溶液(CaCl2 50 mM，甘露醇0.15 M， H印es 10 mM， pH 7.4)。膠囊在輕微攪拌 下放置10分鐘以便凝膠完全，然后被收集并培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中(杜氏 (Dulbecco)改良鷹培養(yǎng)液)并在逐次時(shí)間間隔被拿出以進(jìn)行不同生化測定。
MJL1^關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞封裝入從藻酸鹽:基察克(3:1 w/w) 二元多糖溶液 (2% w/v (g/mL))所得的微膠囊中
提取自豬關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以5x 10S細(xì)胞/mL密度懸浮在1.5y。 藻酸鹽和0.5%基察克混合物中，該混合物是在0.15 NaCl， 10 mM Hepes, pH 7.4緩沖液中制得。細(xì)胞懸浮液被輕微攪拌并從靜電珠發(fā)生器滴加入凝膠溶 液(CaCb 50 mM,甘露醇0.15 M, Hepes 10 mM, pH 7.4)。膠囊這輕微攪拌下 放置10分鐘以便凝膠完全，然后被收集并培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液。
例12:通過注射器將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞封裝入從藻酸鹽:基察克(3:1 w/w)二元多糖溶液(2% w/v (g/mL))所得膠囊
提取自豬關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以5 x 10S細(xì)胞/mL密度懸浮在1.5% 藻酸鹽和0.5%基察克混合物中，該混合物是在緩沖液(0.15 NaCl, 10 mM， Hepes， pH 7.4)中制備的。細(xì)胞懸浮液被輕微攪拌并從23G注射器滴加入凝 膠溶液(CaCl2 50 mM,甘露醇，0.15 M， Hepes 10 mM, pH 7.4)。膠囊在輕微攪 拌下放置10分鐘以便凝膠完全，然后被收集并培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液。
iUl^制備藻酸鹽-羅丹明:基察克-熒光素(3:l w/w)二元多糖溶液(2。/。 w/v (g/mL))微膠囊
制備二元多糖溶液，其含有熒光素標(biāo)記的基察克和羅丹明(rhodamine) 標(biāo)記的藻酸鹽(總聚合物濃度2%,藻酸鹽:基察克=3:1), NaCl 0.15 M,Hepes 10mM，pH7.4。 20 mL該溶液被逐滴加入含CaCl2 50 mM和甘露醇0.15 M (凝膠浴)的溶液中。膠囊尺寸通過使用靜電珠發(fā)生器控制。典型使用條件 電壓5 kV,針頭內(nèi)徑0.7 mm,凝膠浴和針頭間距4 cm， 二元多糖溶液流速 10 mL/min。膠囊在凝膠溶液中攪拌10分鐘，然后被移出并由去離子水清洗。
B.表征源自陰離子多糖和殼聚糖寡糖衍生物溶液的水凝膠。
膠囊/圓柱體尺寸明確依賴于其制備工藝。圖1顯示使用靜電珠發(fā)生器 制得的微膠囊的光學(xué)顯微鏡照片，而圖2顯示的大尺寸膠囊是從聚陰離子/ 聚陽離子二元多糖混合物水溶液通過簡單注射器和逐滴加入溶液到適宜凝
膠浴而得。圓柱體制備如前述實(shí)施例，尺寸為16mm(0)xl8mm(h)。
3D基體形成過程是當(dāng)二元聚合物溶液與凝膠溶液幵始接觸(對于溶致 聚陰離子是適當(dāng)?shù)碾x子濃度，對于熱致聚陰離子是冷卻的溶液)即時(shí)發(fā)生的。 例如，當(dāng)含有多糖(特別是藻酸鹽和基察克)二元聚合物溶液開始接觸含有適 當(dāng)濃度鈣離子的凝膠溶液立刻形成水凝膠。而不構(gòu)成水凝膠結(jié)構(gòu)部分的改性 殼聚糖(即基察克)仍然陷在其中。這一點(diǎn)通過羅丹明標(biāo)記藻酸鹽和熒光素標(biāo) 記基察克二元多糖混合物制得膠囊(例13)的共焦顯微鏡分析證實(shí)。膠囊中具 有所有熒光團(tuán)，意味著兩個(gè)多糖都在最終產(chǎn)品中。此外，二元多糖溶液形成 微膠囊質(zhì)子(例6)前和后的NMR分析清楚顯示基察克在兩種情況中都存在 (圖3)。
從二元多糖溶液(含多糖，特別是基察克和藻酸鹽)所得的水凝膠的機(jī)械性能分析是通過原位技術(shù)所得圓柱型基體(例9)進(jìn)行的。流變學(xué)研究是針對
凝膠形成動力學(xué)及其彈性特性。特別的，圖4顯示從基察克和藻酸鹽二元 水溶液所得的以及只從藻酸鹽水溶液所得的水凝膠的彈性模數(shù)(G')和粘性 模數(shù)(G")隨時(shí)間變化。需要注意，改性殼聚糖(即基察克)的存在不改變水 凝膠形成動力學(xué)，因?yàn)镚'的增長率在兩種情況下是相似的，然而，需要注 意的是基察克和藻酸鹽二元溶液所得水凝膠的G'最大值更高。這意味聚合 物混合物所得水凝膠與僅含有成凝膠聚合物(例如藻酸鹽)溶液所得的水凝 膠相比具有更好機(jī)械特性。
這一點(diǎn)通過比較原位形成技術(shù)(例9)、基察克和藻酸鹽二元溶液以及單 獨(dú)藻酸鹽溶液所得的水凝膠圓柱體所測得的抗壓模數(shù)值得到證實(shí)。相似的， 基察克和藻酸鹽二元混合物水溶液所得水凝膠與僅含藻酸鹽溶液所得凝膠 相比G'、抗壓模數(shù)值更大(圖5)。
C.含關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞膠囊(藻酸鹽〖1.5%)/基察克(0.5%))生物測試 例12所得微膠囊被培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，并在逐次時(shí)間間隔被拿 出以測量其生存能力，測量使用細(xì)胞毒素試劑盒(活/死細(xì)胞毒素試劑盒) 并基于兩種熒光染色(SYTO⑧10和DEAD紅TM)的活細(xì)胞和死細(xì)胞的不同滲 透性。清楚觀測到在培養(yǎng)10天后在藻酸鹽:基察克膠囊中超過90°/。細(xì)胞存 活。
在混合膠囊中和作為對照的僅由藻酸鹽制得膠囊中的細(xì)胞外基體的高 分子組分特性通過RT-PCR和生化測定來評估的。其顯示出關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞主 動合成基體，也呈現(xiàn)出II型膠原質(zhì)構(gòu)成的培養(yǎng)物中不同時(shí)間段膠原質(zhì)組分， 而蛋白多糖以聚蛋白多糖為代表(均為軟骨特定標(biāo)記)(圖6、 7)。
為進(jìn)一步證實(shí)在基察克含糖聚合物存在下這些細(xì)胞的繁殖能力，細(xì)胞中 結(jié)合的^H]-胸苷被測量。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞成長于藻酸鹽膠囊和藻酸鹽:基察克 膠囊(例12)中；卩H]-胸苷的lpCi以相應(yīng)間隔(l天、5天、10天和15天)被 導(dǎo)入培養(yǎng)基。這樣所結(jié)合的放射性在24小時(shí)后被測量。結(jié)果顯示在培養(yǎng)第 一天，在藻酸鹽膠囊中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的復(fù)制被抑制，然而混合(藻酸鹽:基察 克)膠囊中觀測到的軟骨細(xì)胞快速復(fù)制延續(xù)在培養(yǎng)的頭兩個(gè)星期(圖8)。
對例12中封裝的并通過兩個(gè)著色程序染色(一個(gè)是甲苯胺藍(lán)， 一個(gè)是鍍銀著色)的細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡分析結(jié)果再次證實(shí)這些結(jié)果。甲苯胺藍(lán)是一種
堿性染料，其即與糖胺多糖(GAGs)反應(yīng)(因?yàn)槠鋷ж?fù)電荷)以指示細(xì)胞結(jié)構(gòu)，
同時(shí)突出它們在細(xì)胞外基體中的存在。由于負(fù)電荷聚合物的基線信號藻酸鹽 膠囊的圖像具有更強(qiáng)烈的顏色。鍍銀染色使得細(xì)胞基體中的膠原質(zhì)被識別。 光學(xué)顯微鏡照片顯示環(huán)繞與膠原質(zhì)相應(yīng)的細(xì)胞的黑暈，以及環(huán)繞與糖胺多糖 相應(yīng)的細(xì)胞的紫色暈，顯示這些細(xì)胞延續(xù)到合成的基體。
從組織工程學(xué)角度看，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供與起始于陰離子多糖和改性陽離子 多糖(例如殼聚糖寡糖衍生物)二元水溶液的生物相容性立體基體的設(shè)計(jì)和 制備相關(guān)的數(shù)據(jù)。在優(yōu)選實(shí)施例中，分別是藻酸鹽和殼聚糖乳糖衍生物。前 者是一種生物相容性聚合物，具有少量或沒有形成生物響應(yīng)的能力，但是可 在適當(dāng)條件形成凝膠，后者是生物活性聚合物，其自身不能形成立體凝膠但 可以刺激繁殖且同時(shí)保持細(xì)胞外基體的綜合能力。同時(shí)這個(gè)混合組合物的 立體支架系統(tǒng)是用于培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的方法，其確保顯型被保持而同時(shí)使 其快速擴(kuò)張。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的3D基體實(shí)現(xiàn)其目的并可用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特 別是用于細(xì)胞微膠囊，即含有可用于組織工程學(xué)細(xì)胞的3D基體。事實(shí)上， 結(jié)果可延伸到用于組織工程學(xué)的各種細(xì)胞類型(無論是單個(gè)還是成團(tuán))微膠 囊的3D基體，所述細(xì)胞例如非限制性實(shí)施例中的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、 胰腺j3細(xì)胞和胰島、間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造骨細(xì)胞、角化細(xì)胞。
所述結(jié)果還可延伸到藥物或藥學(xué)活性分子的封裝，以便延遲或控制所述 物質(zhì)的釋放。在這個(gè)情形下，制備工藝與前述細(xì)胞或多細(xì)胞團(tuán)隊(duì)封裝一致， 只需將細(xì)胞懸浮液替換為溶解或懸浮在聚合物溶液中的藥學(xué)活性分子。
2權(quán)利要求
1. 水凝膠組成的組合物，特征在于其通過化學(xué)劑或物理因子處理至少一個(gè)溶致或熱致陰離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物的水溶液而得，其中所述殼聚糖衍生物衍生度至少為40％，其中所述多糖混合物水溶液的離子強(qiáng)度至少為50mM且不超過175mM，并且pH至少為7，所述化學(xué)劑或物理因子可使得混合物中所含溶致或熱致聚陰離子多糖成凝膠。
2. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中殼聚糖寡糖衍生物衍生度 為50%-80%。
3. 如權(quán)利要求2所述水凝膠組合物，其中殼聚糖寡糖衍生物衍生度 為70%。
4. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中殼聚糖寡糖衍生物由含1-4個(gè)糖苷單元的寡糖衍生殼聚糖而得。
5. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中殼聚糖寡糖衍生物由含2 -4個(gè)糖苷單元的寡糖衍生殼聚糖而得。
6. 如權(quán)利要求5所述水凝膠組合物，其中寡糖選自乳糖、纖維二糖、 纖維三糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、殼二糖、殼三糖和蜜二糖組 成的組。
7. 如權(quán)利要求6所述水凝膠組合物，其中寡糖是乳糖。
8. 如權(quán)利要求4-7所述水凝膠組合物，其中殼聚糖平均分子量達(dá)到 1500 kDa。
9. 如權(quán)利要求8所述水凝膠組合物，其中殼聚糖平均分子量為400 kDa-1000kDa。
10. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中溶致陰離子多糖選自卡 拉膠、果膠及果膠酸鹽、藻酸鹽、結(jié)冷膠、拉姆珊膠、韋蘭膠和黃原膠 組成的組。
11. 如權(quán)利要求IO所述水凝膠組合物，其中溶致陰離子多糖是藻酸±卜xm 。
12. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中熱致陰離子多糖選自部分硫酸鹽化的瓊脂糖、卡拉膠、硫酸纖維素、結(jié)冷膠、拉姆珊膠、韋蘭 膠和黃原膠組成的組。
13. 如權(quán)利要求10-12所述水凝膠組合物，其中陰離子多糖平均分子 量達(dá)到2000 kDa。
14. 如權(quán)利要求13所述水凝膠組合物，其中陰離子多糖平均分子量 為lOOkDa-謂0kDa。
15. 如權(quán)利要求14所述水凝膠組合物，其中陰離子多糖平均分子量 為200 kDa。
16. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中至少一個(gè)溶致或熱致陰 離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物包括陰離子多糖和殼聚糖 寡糖衍生物且陰離子多糖和殼聚糖寡糖衍生物重量比為3:1 - 1:1。
17. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中至少一個(gè)溶致或熱致陰 離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物水溶液的聚合物濃度達(dá)到 3% w/v。
18. 如權(quán)利要求17所述水凝膠組合物，其中至少一個(gè)溶致或熱致陰 離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物水溶液的聚合物濃度為 1.5%-3%w/v。
19. 如權(quán)利要求18所述水凝膠組合物，其中至少一個(gè)溶致或熱致陰 離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物水溶液的聚合物濃度為 2% w/v。
20. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中至少一個(gè)溶致或熱致陰 離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物水溶液pH值為7-8。
21. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中至少一個(gè)溶致或熱致陰 離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物水溶液的離子強(qiáng)度為150 mM。
22. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中所述多糖水溶液離子強(qiáng) 度通過添加NaCl而得，其中NaCl在所述水溶液中濃度為0.05 M - 0.175 M。
23. 如權(quán)利要求21所述水凝膠組合物，其中所述多糖水溶液離子強(qiáng)度通過添加NaCl而得，其中NaCl在所述水溶液中濃度為0.15 M。
24. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中至少一個(gè)溶致或熱致陰 離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍生物混合物水溶液通過進(jìn)一步添加非 離子溶質(zhì)使得滲透壓為250 mM-350 mM。
25. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中可使溶致陰離子多糖成 凝膠的化學(xué)劑是濃度為10mM的一價(jià)、二價(jià)或三價(jià)離子水溶液。
26. 如權(quán)利要求25所述水凝膠組合物，其中當(dāng)膠凝因子為一價(jià)離子 水溶液時(shí)，選自鉀、銣、銫、鉈、銀及其混合物組成的組。
27. 如權(quán)利要求25所述水凝膠組合物，其中當(dāng)膠凝因子為二價(jià)離子 水溶液時(shí)，選自鈣、鋇、鍶、銅、鉛、鎂、錳、鋅及其混合物組成的組， 并且當(dāng)陰離子多糖是藻酸鹽或果膠時(shí)二價(jià)陽離子不能是鎂。
28. 如權(quán)利要求25所述水凝膠組合物，其中當(dāng)膠凝因子為三價(jià)離子 水溶液時(shí)，選自鋁、鐵、軋、鋱、銪及其混合物組成的組。
29. 如權(quán)利要求25所述水凝膠組合物，其中一價(jià)、二價(jià)或三價(jià)離子 水溶液的濃度為10 mM - 100 mM。
30. 如權(quán)利要求29所述水凝膠組合物，其中一價(jià)、二價(jià)或三價(jià)離子 水溶液濃度為50 mM或100 mM。
31. 如權(quán)利要求25-30所述水凝膠組合物，其中通過進(jìn)一步添加離子 滲透溶質(zhì)或非離子滲透溶質(zhì)使得一價(jià)、二價(jià)或三價(jià)離子水溶液的滲透壓 達(dá)到0.3 M。
32. 如權(quán)利要求1所述水凝膠組合物，其中使得熱致陰離子多糖成 凝膠的物理因子是不超過4(TC且不低于l(TC的溫度。
33. 如權(quán)利要求32所述水凝膠組合物，其中使得熱致陰離子多糖成 凝膠的物理因子是2(TC的溫度。
34. 如權(quán)利要求1-33中任一所述水凝膠組合物進(jìn)-一步結(jié)合有細(xì)胞和/ 或活性物質(zhì)。
35. 水凝膠組合物制備工藝包括至少如下步驟a)制備至少一個(gè)溶致或熱致陰離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍 生物混合物的水溶液，所述殼聚糖衍生物的衍生度至少為40%，水溶液的離子強(qiáng)度至少為50mM且不超過175mM， pH至少為7，然后可選添 加細(xì)胞和/或活性物質(zhì)到所制備的多糖溶液中；b) 通過適當(dāng)方法將步驟a)所得溶液添加到凝膠溶液以得到所需水 凝膠，對于溶致陰離子多糖所述凝膠溶液含有交聯(lián)離子，或者對于熱致 陰離子多糖所述凝膠溶液具有適當(dāng)溫度；c) 由適當(dāng)方法移出所形成的水凝膠，所述水凝膠可選地結(jié)合有細(xì)胞 和/或活性物質(zhì)。
36. 如權(quán)利要求2-34中任一所述水凝膠組合物，其中所述水凝膠由 權(quán)利要求35所述工藝制得。
37. 制備水凝膠的工藝，包括至少如下步驟a) 制備至少一個(gè)溶致或熱致陰離子多糖和至少一個(gè)殼聚糖寡糖衍 生物混合物水溶液，所述殼聚糖衍生物的衍生度至少為40%，水溶液的 離子強(qiáng)度至少為50mM且不超過175mM， pH至少為7，然后可選添加 細(xì)胞和/或活性物質(zhì)到所得多糖溶液中；b) 通過適當(dāng)方法將步驟a)所得溶液添加到凝膠溶液中以得到所需 水凝膠，對于溶致陰離子多糖所述凝膠溶液含有交聯(lián)離子，或者對于熱 致陰離子多糖所述凝膠溶液具有適當(dāng)溫度；c) 由適當(dāng)方法移出所形成的水凝膠，所述水凝膠可選地結(jié)合有細(xì)胞 和/或活性物質(zhì)。
38. 如權(quán)利要求37所述工藝用于制備權(quán)利要求2-34所述水凝膠。
39. 如權(quán)利要求38所述水凝膠制備工藝，其中水凝膠為微膠囊、圓 柱或盤狀型。
40. 如權(quán)利要求1-36中任一所述水凝膠在人類和非人類生物醫(yī)藥領(lǐng) 域的應(yīng)用。
41. 如權(quán)利要求40所述水凝膠結(jié)合細(xì)胞在組織工程學(xué)中的用途。
42. 如權(quán)利要求40所述水凝膠結(jié)合活性物質(zhì)在延遲或控制所述物質(zhì) 釋放的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述制備水凝膠(或3D基體)，其從酸性多糖和例如殼聚糖寡糖衍生物的堿性多糖衍生物的混合物的水溶液所制得。所述溶液適于同化學(xué)或物理膠凝因子成凝膠以便封裝溶液或懸浮液中所含單獨(dú)細(xì)胞或多細(xì)胞團(tuán)或藥物學(xué)活性分子于膠囊中，以用在生物醫(yī)藥和制藥領(lǐng)域。
文檔編號C08B37/00GK101454348SQ200780018944
公開日2009年6月10日 申請日期2007年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者伊萬·多納蒂, 伊蓮諾·馬斯奇, 塞喬·保萊蒂 申請人:的里雅斯特大學(xué)