專利名稱：用親電子基團修飾的大分子及其制備和使用方法
用親電子基團修飾的大分子及其制備和使用方法
背景技術(shù)：
在藥物應(yīng)用中，大分子的使用已受到相當多的關(guān)注。有時，需要偶聯(lián)兩 種以上的大分子來制備具有多重活性的新的大分子骨架。然而，用于偶聯(lián)兩 種以上大分子的現(xiàn)有的技術(shù)存在很多困難。例如，制備具有高的機械強度的 水凝膠所需要的堿性條件或高溫麻煩而且苛刻。盡管使用交聯(lián)劑來制備大分 子骨架已獲得了一些成功，但交聯(lián)劑通常是相對小的、細胞毒素的分子，且 所得到的骨架必須進行提取或廣泛地洗滌以除去痕量的未反應(yīng)的反應(yīng)物和
副產(chǎn)物(Hennink， W. E.; van Nostrum, C. R爿A. Z>wg Z)e/. i ev. 2002, 54， 13-36)，因此排除了在許多醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的使用。在作為有用的治療輔助物前， 需要能以直接的方式制備的生理上相容的大分子骨架。

發(fā)明內(nèi)容
本文描述了用親電子基團修飾的大分子及其制備和使用方法。更具體地 說，為了制備"無交聯(lián)劑"的水凝膠，本文描述了HA的巰基反應(yīng)性的親電 子衍生物的制備。本文描述了在溫和的條件下能偶聯(lián)兩種以上分子(如大分 子)的化合物和方法。具體公開了在大量存在于HA聚合物上的羥基上引入 反應(yīng)性的溴乙酸酯官能團和碘乙酸酯官能團。
本文描述的化合物和組合物具有許多應(yīng)用，包括但不限于藥物輸送、小 分子輸送、傷口愈合、燒傷愈合、組織再生/組織工程、細胞培養(yǎng)、和生物人 造材料。
本發(fā)明的有益之處將在隨后的描述中部分地闡明，且該描述中部分闡明 的有益之處將是顯而易見的，或者通過下面描述的方面的實踐可以認識到本 發(fā)明的有益之處。借助于隨附的權(quán)利要求書中特別指出的要素和組合，可以認識到并獲得下面描述的有益之處。可以理解的是，前面的概括描述和下面 的詳細描述都僅僅是示例性的和說明性的而不是限制性的。


結(jié)合于本說明書內(nèi)并構(gòu)成本說明書的一部分的

了下面描述的 幾個方面。
圖l:溴乙酸酯衍生的HA的合成示意圖。
圖2:在D20中HA-BA的！H-NMR譜。
圖3:通過芬克爾斯坦反應(yīng)(Finkelstein reaction)而合成碘乙酸酯衍生 的HA的示意圖。
圖4:在D20中HA-IA的ifi-NMR譜。
圖5:透明質(zhì)酸衍生物的SAMSA衍生化。A—SAMSA熒光素的結(jié)構(gòu)。
B —在UV光下，SAMSA衍生的化合物的熒光。C一A495nm數(shù)據(jù)。D—結(jié)合
了 SAMSA的化合物的紫外/可見光(UV/VIS)掃描。
圖6:在鹵代乙酸酯HAs存在下，T31成纖維細胞的生存能力。黑條一 未處理的對照物；白條一HABA處理；灰條一HAIA處理(*p< 0.005、 ** p < 0.5和*** p > 0.05，與未處理的對照物對比)。柱表示平均值士標準偏差 (S.D.)， n=6。
圖7:含有HA鹵代乙酸酯的水凝膠的示意圖。A. HA鹵代乙酸酯與 CMHA-S的交聯(lián)提供了非細胞粘著(non-cytoadhesive)的水凝膠。B. HA鹵 代乙酸酯與CMHA-S和Gtn-DTPH的交聯(lián)提供了細胞粘著(cytoadhesive)
的水凝膠。
圖8:由MTS比色分析所測定的在鹵代乙酸酯HA水凝膠上培養(yǎng)的成纖 維細胞的生存能力。白條一沒有Gtn-DTPH的水凝膠；灰條一有Gtn-DTPH 的水凝膠(*p< 0.001、 ** p< 0.05禾口***口> 0.05，與用黑條表示的對照物相比)。插圖一在無Gtn-DTPH的鹵代乙酸酯HA水凝膠上培養(yǎng)的成纖維細 胞的A49o值的放大(*p<0.05，與CMHA-S相比)。所表示的數(shù)值為平均值 士標準偏差(S.D.)， n=6。
圖9:在存在或不存在HAse (225 U/mL)的條件下，水凝膠的降解速 率。每個數(shù)據(jù)點表示平均值士標準偏差(S.D.)， n=3。
具體實施例方式
在公開和描述本發(fā)明的化合物、組合物和/或方法前，需要理解的是， 下面所描述的方面并不限制于具體的化合物、合成方法、或者用途，因為這 些當然可以變化。還可以理解的是本文所使用的術(shù)語是僅僅出于描述特定的 方面的目的，并非出于限制的目的。
在本說明書和隨后的權(quán)利要求書中，將提到定義為具有下列含義的很多
術(shù)語
必須提到的是，在說明書和所附的權(quán)利要求書所使用的單數(shù)形式"一 個"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)的所指之物，除非上下文明確表示其它含義。 因此，例如，"一種藥物載體"的含義包括兩種以上這樣的載體的混合物等。 "任選的"或"任選地"表示隨后描述的事件或情況能或者不能發(fā)生， 并且該描述包括該事件或情況發(fā)生的實例和不發(fā)生的實例。例如，短語"任 選取代的低級烷基"表示該低級烷基能或者不能被取代，并且該描述包括未 被取代的低級烷基和被取代的低級烷基兩種。
在組合物或制品中特定要素或組分的"重量份"表示在該組合物或制品 中該要素或組分與其它任何要素或組分的重量關(guān)系，對于該組合物或制品來
說，表達了按重量計的一份。因此，在含有2重量份組分X和5重量份組分 Y的化合物中，X和Y以2: 5的重量比存在，且不管在該化合物中是否含 有另外的組分都是以這個比例存在。除非特別有相反的陳述，組分的重量百分比是基于含有該組分的制劑或 組合物的總重量。
化學(xué)物類的"殘基"表示這樣的部分，所述部分是在特定的反應(yīng)方案或 者后續(xù)制劑或化學(xué)產(chǎn)物中的該化學(xué)物類產(chǎn)生的產(chǎn)物，不管該部分是否實際上 獲得自該化學(xué)物類。例如，含有至少一個-OH基團的多糖可以用式Y(jié)-OH表 示，其中Y為多糖分子的殘余部分(即殘基)。
在整個申請中使用的變量如RLR5、 A'、 A1、 A2、 G'、 L、 o、 R、 R'、 X、 X'、 Y、 Y'、和Z為與以前定義的相同的變量，除非有相反的陳述。
本文所使用的術(shù)語"烷基"為1-24個碳原子的支鏈或非支鏈的飽和烴 基團，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、 己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十垸基、二十四垸基等。 "低級烷基"基團為含有一至六個碳原子的垸基。
本文所使用的術(shù)語"全氟烷基"或"氟代烷基"表示1-24個碳原子的 支鏈或非支鏈的飽和烴基團，其中至少一個氫原子用氟取代。全氟垸基還可 以表示該烷基的所有的氫原子被氟取代。
本文所使用的"芳基"為任何碳基的芳族基團，包括但不限于苯、萘等。 術(shù)語"芳族"還包括"雜芳基"，它被定義為具有至少一個被引入至芳族基 團的環(huán)內(nèi)的雜原子的芳族基團。雜原子的例子包括但不限于氮、氧、硫和磷。 所述芳基可以為取代的或未取代的。所述芳基可以被一個或多個基團取代， 所述基團包括但不限于烷基、炔基、鏈烯基、芳基、鹵化物、硝基、氨基、 酯、酮、醛、羥基、羧酸、或垸氧基。
本文所使用的術(shù)語"鹵素"為氟、氯、溴或碘。
本文所使用的術(shù)語"聚亞垸基"(polyalkylene group)或"聚鏈烯基" (polyalkdenyl group)為具有兩個以上互相鍵連的CH2基團的基團。聚亞烷 基可以用式-(CH2)n-表示，其中n為2-25的整數(shù)。本文所使用的術(shù)語"聚醚基"為具有式-[(CHR)nO]m-的基團，其中R為
氫或者低級垸基，n為l-20的整數(shù)，且m為1-100的整數(shù)。聚醚基的例子包 括聚氧化乙烯、聚氧化丙烯和聚氧化丁烯。
本文所使用的術(shù)語"聚硫醚基(polythioether group)"為具有式 -[(CHR)nS]m-的基團，其中R為氫或低級烷基，n為l-20的整數(shù)，且m為1-100
的整數(shù)。
本文所使用的術(shù)語"聚亞氨基"(polyimino group)為具有式 -[(CHR)nNR]m-的基團，其中每個R獨立地為氫或低級垸基，n為l-20的整 數(shù)，且m為1-100的整數(shù)。
本文所使用的術(shù)語"聚酯基"為通過具有至少兩個羧酸基團的化合物與
具有至少兩個羥基的化合物之間的反應(yīng)而制備的基團。
本文所使用的術(shù)語"聚酰胺基"為通過具有至少兩個羧酸基團的化合物 與具有至少兩個未取代的或單取代的氨基的化合物之間的反應(yīng)而制備的基團。
短語"用……取代"(如在"用X取代"中)表示例如垸基的基團，如 -013基團，其中一個或多個氫原子"用基團X取代"或"用基團X置換" 并且形成基團-CH2-X。
實施方式的詳細描述
合成并表征了兩種具有鹵代乙酸酯基團的新型HA衍生物。當添加到正
常的細胞培養(yǎng)基中時，在高劑量下兩種物質(zhì)都引起細胞毒素作用。當使上述 兩種新的聚合物與CMHA-S (—種巰基修飾的HA衍生物)反應(yīng)時，所得到 的水凝膠不支持細胞附著并且還引起輕微的細胞毒素作用。相反，CMHA-S 加Gtn-DTPH與HA鹵代乙酸酯的共交聯(lián)得到了支持細胞附著和生長的水凝 膠。因此，HA卣代乙酸酯平臺為獲取細胞粘著材料或用于細胞附著的細胞 相容性的隔離物(barrier)均提供了途徑。此外，含HA鹵代乙酸酯的水凝膠顯示了很慢的HAse-媒介降解速率(HAse-mediated degradation rate),這
使它們適合于體內(nèi)的應(yīng)用。總之，我們的結(jié)果表明新材料用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用特別 是用于防止粘連和醫(yī)療裝置涂料的適應(yīng)性和潛能。
HABA由HA和溴乙酸酐直接制備，但對于HAIA，由于在所使用的堿 性條件下氫氧化物競爭碘化物的親核取代，因此避免使用碘乙酸酐。作為代 替，通過由碘化物對溴化物的簡單SN2取代而由HABA制備HAIA。如預(yù)期 的，所述HA鹵代乙酸酯顯示出劑量依賴性的細胞毒素作用，并用培養(yǎng)的 T31人氣管瘢痕成纖維細胞(human tracheal scar fibroblast)測試。對于體內(nèi) 的研究，這些初級的人體細胞更相關(guān)，然而仍然捕獲了成纖維細胞系的應(yīng)答， 所述成纖維細胞系的應(yīng)答通常應(yīng)用于體外的生物相容性實驗和體外的3-D 細胞相容性實驗。
HA鹵代乙酸酯與親核大分子的反應(yīng)提供了可細胞相容的水凝膠。依賴 于組成，該水凝膠可以防止或促進細胞粘著、擴散和增殖。然而，對于大多 數(shù)3-D細胞的封裝方案來說，延長含HA鹵代乙酸酯的水凝膠的凝膠化時間 使該水凝膠不實用。然而，該水凝膠可以用于將細胞接種在水凝膠上部的假 3-D培養(yǎng)物。
同樣，在高水平的透明質(zhì)酸酶的存在下，化學(xué)修飾的HA水凝膠3天內(nèi) 在體外完全降解。那些皮下植入的凝膠在體內(nèi)的滯留時間測定為超過2周。 依此類推，可以外推在相似的酶條件下得到的我們的降解數(shù)據(jù)，推理出含有 HA鹵代乙酸酯的水凝膠具有近4周的滯留時間。用于這些體外分析的透明 質(zhì)酸酶的濃度比生理酶單位(在血清中約2.6U/mL)高約100倍。
對于非粘著的HA鹵代乙酸酯水凝膠的一個潛在的應(yīng)用可以為防止粘 連。諸如腸梗阻、盆腔疼痛(pelvic pain)甚至不孕的狀況可能是不希望的 手術(shù)后粘連的結(jié)果。已經(jīng)配制了一些HA水凝膠來處理此問題。例如，負載 了藥物的水凝膠(如絲裂霉素-C交聯(lián)的水凝膠)用于防止粘連已試驗成功。已經(jīng)臨床試驗了 Seprafilm (—種碳二亞胺修飾的HA/羧甲基纖維素基的材 料)并證明成功地降低了婦科治療后粘連的形成。通過預(yù)防疤痕和基于ECM 的發(fā)音困難，已經(jīng)顯示Carbylan -SX (PEGDA交聯(lián)的CMHA-S水凝膠) 在聲襞修復(fù)中有效。另外，此復(fù)合物用于防止手術(shù)后腹內(nèi)粘連和盆腹腔 (abdominopdvic)粘連?；贖A鹵代乙酸酯的材料還可以進一步用于改
進當前可用的抗粘連生物材料的性能。
醫(yī)療裝置涂料是能從HA鹵代乙酸酯型生物材料的使用中受益的另一個
領(lǐng)域。吸附、離子偶合、交聯(lián)、光化學(xué)固定、共價連接或生物專一固定是用 于醫(yī)療裝置的HA涂料的普通的步驟。例如，用于經(jīng)皮冠狀動脈介入 (percutaneous coronary interventions)的腔內(nèi)金屬支架(endoluminal metallic stents) —般用生物相容性材料涂覆，因為在接受了未涂覆的支架的患者中支 架內(nèi)再狹窄(in-stentrestenosis)的發(fā)病率相當高(在外科手術(shù)介入后6個月 內(nèi)為20-40%)。以前將碳、碳化硅、金或磷酸膽堿涂覆的支架用于防止新生 內(nèi)膜增生(neointimalhyperplasia)。還開發(fā)了含有肝磷脂(抗血栓形成)、地 塞米松(抗炎)或紫杉酚(抗增生(anti-prolifemtive))的藥物涂覆的支架。 制備這些涂覆的材料，防止或減輕血栓形成、炎癥性反應(yīng)以及異常的細胞粘 著和增生。盡管有前途，但許多涂覆材料在外科手術(shù)介入后幾個月或者甚至 幾年引起新生內(nèi)膜增生，導(dǎo)致再狹窄和過度的炎癥性反應(yīng)。
基于HA鹵代乙酸酯的涂料材料的使用可以提供用于預(yù)防再狹窄的備用 解決方案(awaited solution)。已經(jīng)表明未修飾的HA可以粘著到許多支架上， 因此，我們想到HA鹵代乙酸酯恰好可以很輕松地固定在通常使用的外科支 架(surgical scaffold)上。另外，基于HA鹵代乙酸酯的生物材料的組合物 容許外科手術(shù)后纖維化反應(yīng)的調(diào)節(jié)。它們的"活的"結(jié)構(gòu)進一步使得這些材 料以專一應(yīng)用(application-specific)的方式進行化學(xué)修飾和調(diào)整。
I、交聯(lián)劑及其制備該交聯(lián)劑包括式I，
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其中，
Y'為選自由低聚核苷酸、核酸或核酸的代謝穩(wěn)定的類似物、多肽、糖蛋 白、糖脂、多糖和蛋白質(zhì)組成的組中的大分子的殘基； X'為-O-、 -S-、 -NH-、或-NR"-;
R'為氫、垸基、全氟垸基、芳基、雜芳基(heteroaryl)、或鹵素；
R"為氫或CL5垸基；并且
A'為離去基團。
所述大分子是具有至少一個親核基團的任何化合物，該親核基團可以取 代離去基團并形成新的共價鍵。親核基團的例子包括但不限于羥基、巰基、 和取代的或未取代的基團。參見式I， X'為-O-、 -S-、 -NH-、或-NR"-。另一 方面，X'為-O-或-NH-。
另一方面，X'為親核基團的殘基。當親核基團為羥基或氨基時，所述羥 基或氨基為游離羥基或游離氨基或者分別衍生自羧酸或酰胺。 一方面，所述 大分子為低聚核苷酸、核酸或核酸的代謝穩(wěn)定的類似物、多肽、糖蛋白、或 糖脂。另一方面，所述大分子為多糖或蛋白質(zhì)。另一方面，所述大分子為合 成的聚合物。本文所使用的代謝穩(wěn)定的類似物指這樣的類似物，在該類似物 中通過化學(xué)修飾將對酶降解或非酶降解不穩(wěn)定的特定官能團改變?yōu)樵隗w內(nèi) 和體外更穩(wěn)定的不同的官能團，從而延長該類似物的生物半衰期
在本文描述的方法中有用的多糖具有至少一個親核基團，例如羥基。一 方面，該多糖為糖胺聚糖(GAG)。糖胺聚糖可以是硫酸化的或未硫酸化的。
本文描述了親電子的交聯(lián)劑。 一方面，GAG是具有許多交替的亞單位的一個分子。例如，HA是(GlcNAc-GlcUA隱)x。其它GAGs是在不同的糖上硫酸化的。 一般地，GAG由式A-B-A-B-A-B表示，其中A為糖醛酸，且B為O-硫酸化的氨基糖或N-硫酸化的氨基糖，其中關(guān)于差向異構(gòu)體含量或硫酸鹽化作用，A單位和B單位可以是不均勻的。可以使用含有糖醛酸的任何天然的或合成的聚合物。 一方面，式I中的Y'是硫酸化的GAG。
有許多具有通常熟知的結(jié)構(gòu)的不同類型的GAGs，例如在已公開的組合物中，如硫酸軟骨素、皮膚素、乙酰肝素、肝素、硫酸皮膚素、和硫酸乙酰肝素。本領(lǐng)域已知的任何GAG都可以用于本文所描述的任何方法中。褐藻酸、果膠、殼聚糖、和羧甲基纖維素是其它在本文所描述的方法中有用的多糖。
另一方面，式I中的多糖Y'為透明質(zhì)酸(HA)。 HA是未硫酸化的GAG。透明質(zhì)酸是已知的、自然產(chǎn)生的、水溶性的多糖，由兩種交替鍵合的糖，D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺組成。在比較低的溶質(zhì)濃度下水溶液中，該聚合物是親水的并且是高度粘性的。它經(jīng)常作為鈉鹽(透明質(zhì)酸鈉)天然存在。制備商業(yè)上可利用的透明質(zhì)酸及其鹽的方法是已知的。透明質(zhì)酸可以從Seikagaku Company 、 Novozymes Biopolymer、 Novomatrix、 Pharmacia Inc,、Sigma Inc.和其它供應(yīng)商商購得到。對于高分子量透明質(zhì)酸，通常為100-10,000個二糖單位。另一方面，透明質(zhì)酸分子量的下限為10,000、20,000、30,000、 40,000、 50,000、 60,000、 70,000、 80,000、 90,000或100,000，且上限為200,000、 300,000、 400,000、 500,000、 600,000、 700,000、 800,000、 900,000或1,000,000，其中任何下限都可以與任何上限組合。
一方面，式I中的Y'還可以為合成的聚合物。所述合成的聚合物具有至少一個親核基團。 一方面，式I中的該合成的聚合物殘基包括聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、聚乙二醇、聚丙二醇、多元醇、聚胺、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的三嵌段聚合物、聚乙二醇的星形聚合物、或者聚乙二醇的樹枝狀聚合物。
另一方面，式I中的Y'是蛋白質(zhì)。本文中有用的蛋白質(zhì)包括但不限于胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、化學(xué)修飾的胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、或者胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的部分水解的衍生物。所述蛋白質(zhì)可以是天然存在的或者擁有細胞相互作用區(qū)域的重組多肽。所述蛋白質(zhì)還可以為蛋白質(zhì)的混合物，其中一種以上的蛋白質(zhì)是修飾的。蛋白質(zhì)的具體例子包括但不限于膠原蛋白、彈性蛋白、飾膠蛋白聚糖、層粘連蛋白或纖連蛋白。
式I中的R'包括氫、烷基、全氟垸基、芳基、雜芳基或鹵素。 一方面，R'為氫。另一方面，R'為甲基。
式I中的A'含有離去基團。離去基團是可以由親核體取代的任何基團。
幾種離去基團是本領(lǐng)域已知的。例子包括但不限于鹵素、醇鹽、活性酯等。
一方面，式I中的A'為氯、溴或碘。
一方面，Y'包括N-乙酰-葡糖胺的殘基，其中N-乙酰-葡糖胺殘基的至少一個C-6伯羥基被基團-C(0)CH(R)(A')取代(或者連接到該基團上)。另一方面，Y'包括N-乙酰-葡糖胺的殘基，其中N-乙酰-葡糖胺殘基的至少一個C-6伯羥基被基團-C(O)CH(R)(A')取代，并且至少 一 個仲羥基被基團-C(O)CH(R')(A')取代。在更進一步的方面，Y'包括N-乙酰-葡糖胺的殘基，其中N-乙酰-葡糖胺殘基的至少一個C-6伯羥基被基團-C(O)CH(R')(A')取代，并且其中N-乙酰-葡糖胺殘基的一個C-6伯羥基至約100。/?；蛘呋旧纤械腃-6伯羥基被基團-C(O)CH(R')(A')取代。另一方面，Y'是透明質(zhì)酸的殘基，其中至少一個羥基被-C(0)CH2Ci、 -C(0)CH2Br、或-C(0)CH21取代。
本文描述了用于制備具有式I的化合物的方法。 一方面，該方法包括含有至少一個親核基團的大分子與包括式XV的化合物反應(yīng)，R'包括氫或烷基；并且
A1和A2含有相同或不同的離去基團。具有式xv的化合物包括可以與大分子反應(yīng)的許多不同的分子。例子包括但
不限于活性酯、酰鹵、酸酐等。
一方面，式XV中的R'為氫。另一方面，式XV中的八1形成式乂￥1的化合物，
R'包括氫或烷基，其中兩個R'為相同的基團；且AZ含有如上所述的相同的離去基團。
式XVI包括對稱的酸酐；然而，如以上所討論的，可以考慮混合的酸酐(例如其中的R'和/或AS不是相同的)。 一方面，式XVI中的R'為氫。另一方面，XVI中的AZ含有鹵素(例如氯、溴、或碘)。在更進一步的方面，含有式XV的該化合物為氯乙酸酐、溴乙酸酐、或者碘乙酸酐。
本文描述的任何大分子都可以與具有式XV的化合物反應(yīng)以制備親電子的大分子。在某些方面，存在于該大分子上的親電子基團為羥基、或者取代的氨基或未取代的氨基。 一方面，該大分子包括糖胺聚糖，例如透明質(zhì)酸。
其中，另一方面，該大分子為透明質(zhì)酸，且具有式XV的化合物為氯乙酸酐、溴乙酸酐、或碘乙酸酐。
該大分子與具有式XV的化合物之間的反應(yīng)可以在各種反應(yīng)溫度和時間下進行，依據(jù)所選擇的起始原料而變化。溶劑的選擇也隨著起始原料的溶解
性而變化。在某些方面，希望在大于7的pH下進行該反應(yīng)。例如，當該大分子具有一個或多個羥基時，可以需要堿性介質(zhì)來使一定數(shù)量的羥基去質(zhì)子化，并促進該大分子與具有式XV的化合物之間的反應(yīng)。
本文描述的任何化合物可以是其藥學(xué)上可接受的鹽或酯。 一方面，藥學(xué)上可接受的鹽通過用適量的藥學(xué)上可接受的堿來處理游離酸而制備。代表性的藥學(xué)上可接受的堿為氫氧化銨、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化亞鐵、氫氧化鋅、氫氧化銅、氫氧化鋁、氫氧化鐵、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、賴氨酸、精氨酸、組氨酸等。 一方面，在約0-10(TC下，如室溫下，該反應(yīng)在單獨的水中進行，或在水與惰性的、水混溶性的有機溶劑的組合中進行。在某些可應(yīng)用的方面，選擇本文描述的化合物與使用的堿的摩爾比來提供任何特定的鹽所需要的比例。例如，為了制備游離酸起始原料的銨鹽，可以用約一當量的藥學(xué)上可接受的堿來處理該起始原料以獲得中性
i卜
另一方面，如果該化合物擁有堿性基團，那么該化合物可以用如HC1、HBr或H2S04的酸質(zhì)子化，以制備陽離子鹽。 一方面，在約0-100'C下，如室溫，該化合物與酸或堿的反應(yīng)在單獨的水中進行，或在水與惰性的、水混溶性的有機溶劑的組合中進行。在某些可應(yīng)用的方面，選擇本文描述的化合物與使用的堿的摩爾比以提供任何特定的鹽所需要的比例。例如，為了制備游離酸起始原料的銨鹽，可以用約一當量的藥學(xué)上可接受的堿來處理該起始原料以獲得中性鹽。通常制備酯衍生物作為該化合物酸形式的前體。 一般地，這些衍生物可以為低級垸基酯，如甲基、乙基等?？梢酝ㄟ^含有羧酸的化合物與氨或取代
的胺的反應(yīng)來制備酰胺衍生物-(CO)NH2、 -(CO)NHI^n-(CO)NR2，其中R為如上所定義的烷基。II、大分子的偶聯(lián)
具有式I的化合物為親電子的，且可以與擁有親核基團的一個或多個大分子反應(yīng)以偶聯(lián)該大分子。 一方面，用于偶聯(lián)兩個以上大分子的方法包括使含有式I的第一大分子與含有至少一個親核基團的第二大分子反應(yīng)?？梢灶A(yù)計的是含有式I的第一大分子可以具有多個親電子基團，且第二大分子可以具有多個親核基團。因此，可能產(chǎn)生不同大分子的矩陣(matrix)或網(wǎng)絡(luò)。
一方面，所述第二大分子具有式n，
Z為大分子的殘基，且
L為聚亞垸基、聚醚基、聚酰胺基、聚亞氨基、芳基、聚酯或聚硫醚基。所述大分子殘基Z可以為上面描述的任何大分子。 一方面，該第二大分子可以為具有至少一個巰基的蛋白質(zhì)。在此方面，該蛋白質(zhì)可以為自然存在的或合成的。 一方面，該蛋白質(zhì)包括胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或化學(xué)修飾的胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。另一方面，該蛋白質(zhì)包括膠原蛋白、彈性蛋白、飾膠蛋白聚糖、層粘連蛋白、或纖連蛋白。 一方面，該蛋白質(zhì)包括具有附加的巰基的遺傳工程蛋白質(zhì)(如半胱氨酸殘基)。在更進一步的方面，該蛋白質(zhì)包括合成的多
肽，所述合成的多肽可以為具有附加的巰基(如半胱氨酸殘基)的支鏈的合成的多肽(如樹枝狀聚合物)或線形的合成的多肽。
24另一方面，式II中的L為聚亞垸基團。另一方面，式II中的L為-CH2-
或C2-C2Q的聚亞烷基團。另一方面，式II中的L為012012或CH2CH2CH2。一方面，Z為透明質(zhì)酸的殘基，且式II中的L為CH2CH2或CH2CH2CH2。在更進一步的方面，Z為明膠的殘基，且式II中的L為CH2CEb或CH2CH2CH2。 一方面，式II中的L獨立地為CH2CH2或CH2CH2CH2。另一方面，Z為透明質(zhì)酸的殘基。
一方面，所述第二大分子含有式XX，
<formula>formula see original document page 25</formula>
其中，
Y為大分子的殘基；
X為O、 NH、或親核基團的殘基；且
R包括取代的或未取代的C2或C3垸基。
一方面，X為O或NH，或者其中X為羥基或氨基的殘基。
式XX中的大分子Y可以為本文描述的任何大分子。 一方面，該大分子包括低聚核苷酸、核酸或核酸的代謝穩(wěn)定的類似物、多肽、糖蛋白、糖脂、或藥學(xué)上可接受的化合物。 一方面，Y包括糖胺聚糖的殘基。另一方面，Y包括透明質(zhì)酸的殘基。在更進一步的一方面，Y包括N-乙酰-葡糖胺的殘基，其中N-乙酰-葡糖胺殘基的至少一個C-6伯羥基被基團-RSH取代。此方面更進一步，至少一個仲羥基也被-RSH取代。另一方面，N-乙酰-葡糖胺殘基的一個C-6伯羥基至100%的C-6伯羥基被基團-RSH取代。
另一方面，式XX中的R為CH2CH2、CH2CH2CH2、CH2CHR5、CHR5CHR5、C(R5)2CHR5、或C(R5)2C(R5)2，其中115為烷基。 一方面，式XX中的Y為透明質(zhì)酸的殘基，其中至少一個羥基被-CH2CH2SH取代。
具有式XX的第二大分子可以通過本文描述的方法合成。 一方面，該方法包括使含有至少一個親核基團(例如羥基或氨基)的大分子與包括式XVII的化合物反應(yīng)，
s
XVII
R2 R4
其中，R1、 R2、 R3、和W獨立地為氫、烷基、全氟烷基、芳基、或雜芳基， 且o為1或2。
一方面，式XVII中的o為1。另一方面，式XVII中的o為1，并且R'-R4 為氫。另一方面，該第二大分子包括透明質(zhì)酸與具有式XVII的化合物之間 的反應(yīng)產(chǎn)物，其中o為l，并且W-I^為氫。
所述大分子與具有式XV的化合物之間的反應(yīng)可以在各種反應(yīng)溫度和時 間下進行，將依賴于起始原料的選擇而變化。溶劑的選擇也隨該起始原料的 溶解性而變化。在某些方面，希望在大于7的pH下進行該反應(yīng)。例如，當 該大分子具有一個或多個羥基時，可以需要堿性介質(zhì)來使一定數(shù)量的羥基去 質(zhì)子化，并促進該大分子與具有式XVII的化合物之間的反應(yīng)。
一方面，所述第一大分子與第二大分子的偶聯(lián)可以在7-12、 7.5-11、 7.5-10、或7.5-9.5的pH下、或者8的pH下進行。 一方面，使用的溶劑可 以為水(單獨)或者含有有機溶劑的水溶液。 一方面，當使用混合的溶劑體 系時，可以使用諸如伯胺、仲胺、或叔胺的堿。 一方面，相對于第二大分子， 使用過量的具有式I的第一大分子，以確保在反應(yīng)過程中消耗所有的第二大 分子。依賴于所述第一大分子和第二大分子的選擇、反應(yīng)的pH、和選擇的 溶劑，偶聯(lián)可以在幾分鐘至幾天的時間內(nèi)發(fā)生。
本文描述的化合物具有包括式VII的至少一個片段，
26VII
其中，
Y'為第一大分子的殘基； X'為-O-、 -S畫、畫NH畫、或醫(yī)NR"畫；
R"為氫或Q.5垸基； R'包括氫或烷基；且 G'包括第二大分子的殘基。
本文使用的術(shù)語"片段"指整個分子本身或者較大的分子的一部分或鏈 段。例如，式VII中的Y'可以為高分子量多糖，所述高分子量多糖與另一個 多糖、合成聚合物、或者巰基化的聚合物交聯(lián)以制備偶聯(lián)的化合物。該化合 物具有式VII中圖示的最小的一個單位，該單位代表至少一個第一大分子與 第二大分子之間的反應(yīng)產(chǎn)物。
與具有也是親電子的丙烯酸酯基團的其它大分子相比，具有式I的化合 物擁有具有許多優(yōu)勢的親電子基團。例如，丙烯酸酯基團為光活性的且能與 擁有丙烯酸酯基團的其它大分子反應(yīng)。具有式I的化合物互相不反應(yīng)且不受
約束地與其它大分子(例如巰基化的大分子)反應(yīng)。此外，由于存在于式 I中的離去基團，該化合物通常為可水解的。這是在生理條件下特別需要的， 在此條件下，具有式I的該化合物可以在一段時間內(nèi)被受試者水解，產(chǎn)生毒 性很小的或根本沒有毒性的化合物。 III、藥物組合物
一方面，由上述方法制得的任何化合物可以進一步含有至少一種藥學(xué)上 可接受的化合物(或生物活性劑)。得到的藥物組合物可以提供用于持續(xù)不
27變地、連續(xù)地輸送藥物和其它生物活性劑至臨近施用部位或遠離施用部位的 組織的系統(tǒng)。所述生物活性劑能在被施用的生物系統(tǒng)中提供局部的或全身的 生物的、生理的或治療的作用。例如，該試劑可以產(chǎn)生控制感染或發(fā)炎、增
進細胞生長和組織再生、控制腫瘤生長、作為止痛藥、促進抗細胞(anti-cell) 附著并增進骨骼生長以及其它功能的效果。另外，本文描述的任何化合物可 以含有兩種以上藥學(xué)上可接受的化合物的組合。
一方面，該藥學(xué)上可接受的化合物可以包括能預(yù)防生物系統(tǒng)內(nèi)的全身的
感染或缺陷部位的局部感染的物質(zhì)，例如抗炎劑，例如但不限于毛果蕓香 堿、氫化可的松、脫氫皮質(zhì)甾醇、可的松、雙氯酚酸鈉、吲哚美辛、6cx-甲 基-脫氫皮質(zhì)甾醇、皮質(zhì)甾酮、地塞米松、潑尼松等；抗菌劑包括但不限于 青霉素、頭孢菌素、桿菌肽、四環(huán)素、強力霉素、慶大霉素、氯喹、阿糖腺 苷等；止痛劑包括但不限于水楊酸、撲熱息痛、布洛芬、萘普生、炎痛喜康、 氟比洛芬、嗎啡等；局部麻醉劑包括但不限于古柯堿、利多卡因、苯佐卡因 等；用于激發(fā)抗體預(yù)防肝炎、流行性感冒、麻疹、風(fēng)疹、破傷風(fēng)、脊髓灰質(zhì) 炎、狂犬病等的免疫原(疫苗)；肽包括但不限于醋酸亮丙瑞林(leupmlide acetate)(—種促黃體生成激素釋放激素興奮劑(LH-RH agonist))、那法瑞 林等。所有的化合物都可以商購得到。
一方面，所述藥學(xué)上可接受的化合物可以為生長因子。能促進細胞與組 織的生長和生存或者加強細胞機能的任何物質(zhì)或代謝前體作為生長因子是 有用的。生長因子的例子包括但不限于神經(jīng)生長促進物質(zhì)，如神經(jīng)節(jié)苷脂、 神經(jīng)生長因子等；硬組織或軟組織生長促進劑，如纖連蛋白(FN)、人生長 激素(HGH)、集落刺激因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、血小板衍生的生長因子
(PDGF)、胰島素衍生的生長因子(insulin-derived growth factor) (IGF-I， IGF-II)、轉(zhuǎn)化生長因子-d (TGF-oO、轉(zhuǎn)化生長因子-P (TGF-卩)、表皮生長因 子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、白細胞介素-1 (IL-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、骨骼衍生的骨骼材料 (例如脫礦質(zhì)的骨基質(zhì))等；以及抗腫瘤劑，如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、
阿霉素、長春花堿、順氯氨鉑、結(jié)合至毒素的腫瘤特異抗體、腫瘤壞死因子 等。
在整體結(jié)合于此作為參考的美國專利No. 6,534,591 B2中公開的任何生 長因子都可以用于此方面。 一方面，所述生長因子包括轉(zhuǎn)化生長因子 (TGFs)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、血小板衍生生長因子(PDGFs)、 表皮生長因子(EGFs)、結(jié)締組織活化的肽(CTAPs)、成骨因子以及這些生 長因子的生物活性類似物、片段和衍生物。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)超基因家 族的成員是多功能的調(diào)節(jié)蛋白。TGF超基因家族的成員包括(3轉(zhuǎn)化生長因 子(例如TGF-卩1、 TGF-卩2、 TGF-(33);骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如BMP-1、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP陽7、 BMP陽8、 BMP-9);肝 素結(jié)合性生長因子(例如成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、 血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF));抑制素(例如
抑制素A、抑制素B);生長分化因子(例如GDF-1);以及激活素(例如
激活素A、激活素B、激活素AB)。
生長因子可以從例如哺乳動物細胞的天然的或自然的來源中分離，或者 可以合成制備，如通過重組DNA技術(shù)或通過各種化學(xué)方法。另外，只要它 們顯示出天然分子的至少一些生物活性，就可以使用這些因子的類似物、片 段或衍生物。例如，可以通過由位點特異性誘變或者其它遺傳工程技術(shù)改變 的基因的表達來制備類似物。
其它有用的物質(zhì)包括激素，如黃體酮、睪丸素、和促卵泡激素(FSH) (節(jié)育、生育促進)、胰島素等；抗組胺劑，如鹽酸苯海拉明等；心血管劑， 如罌粟堿、鏈激酶等；抗?jié)儎?，如異丙碘銨等；支氣管擴張劑，如硫酸異 丙喘寧(metaprotemal sulfate)、氨茶堿等；血管擴張劑，如茶堿、煙酸、米
29諾地爾等；中樞神經(jīng)系統(tǒng)劑，如安定藥、B-腎上腺素能阻斷劑、多巴胺等；
精神抑制劑，如利培酮(risperidone);麻醉藥拮抗劑，如環(huán)丙甲羥二羥嗎啡 酮、納洛酮(naloxone)、叔丁啡(buprenorphine);以及其它類似物質(zhì)。所 有的化合物都可以商購得到。
使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以制備所述藥物組合物。 一方面，通過使本文 描述的化合物與藥學(xué)上可接受的化合物混合來制備該組合物。術(shù)語"混合" 定義為將兩種組分混合在一起以便沒有化學(xué)反應(yīng)或物理相互作用。術(shù)語"混 合"還包括該化合物與該藥學(xué)上可接受的化合物之間的化學(xué)反應(yīng)或物理相互 作用。在所述化合物上可以進行共價鍵合至反應(yīng)性治療藥物，例如那些具有 親核基團的藥物。第二，在交聯(lián)的多糖中，藥物活性劑的非共價包載也是可 能的。第三，靜電的或疏水的相互作用可以促進藥學(xué)上可接受的化合物在修 飾的多糖中的保留。
可以認識到的是，在具體情況中，活性化合物的實際優(yōu)選量可以根據(jù)所 使用的具體化合物、配制的特定組合物、施用的形式、和被治療的特定的部 位與治療者而變化。用于給定受體的劑量可以使用常規(guī)的需要考慮的因素來
確定，例如通過目標化合物和己知藥劑的特異活性的通行性比較，例如 依靠適當?shù)某Ｒ?guī)的藥理學(xué)實驗方案。在本領(lǐng)域中熟悉確定藥物化合物劑量的
醫(yī)師和配方師根據(jù)標準推薦(Physicians Desk Reference (藥師臺式手冊)， Barnhart Publishing (1999))可以毫無問題地確定劑量。
本文描述的藥物組合物可以在生物系統(tǒng)或?qū)嶓w可以耐受的任何賦形劑 中配制。這些賦形劑的例子包括但不限于水、生理鹽水、林格溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液、漢克溶液(Hank's solution)、以及其它含水的生理 平衡的鹽溶液。還可以使用非水的賦形劑，例如不揮發(fā)性油、植物油(如橄 欖油和芝麻油)、甘油三酯、丙二醇、聚乙二醇以及可注射的有機酯(如油 酸乙酯)。其它有用的劑型包括含有增粘劑的懸浮液，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、或葡聚糖。賦形劑還可以含有少量的添加劑，如增強等滲性和化 學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。緩沖液的例子包括磷酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽緩沖液和三羥
甲基氨基甲烷緩沖液(Tris buffer),而防腐劑的例子包括乙基汞硫代水楊酸 鈉(thime腦l)、甲酚、福爾馬林和苯甲醇。
藥物載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。最典型的藥物載體可以為施用于人 體的標準載體，包括溶液如無菌水、生理鹽水、和生理pH下的緩沖溶液。
用于藥物輸送的分子可以配制在藥物組合物中。除了選擇的分子，藥物 組合物可以包括載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等。 藥物組合物還可以包括一種或多種活性成分，如抗微生物劑、抗炎劑、麻醉 劑等。
依賴于是否需要局部或全身治療以及治療的范圍，可以以許多方式施用 所述藥物組合物。給藥可以是局部的(包括眼的、陰道的、直腸的、鼻內(nèi)的)。
用于給藥的制劑包括消毒的水溶液或非水溶液、懸浮液、和乳狀液。非 水載體的例子包括水、醇/水溶液、乳狀液和懸浮液，包括生理鹽水和緩沖介 質(zhì)。如果需要間接的使用公開的組合物和方法，腸胃外的賦形劑包括氯化鈉 溶液、林格葡萄糖(Ringer's dex加se)、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鹽林格(lactated Ringer，s)、或不揮發(fā)性油。如果需要間接的使用公開的組合物和方法，靜脈 內(nèi)的賦形劑包括液體的和有營養(yǎng)的補充物、電解質(zhì)補充物(如基于林格葡萄 糖的電解質(zhì)補充物)等。也可以存在防腐劑和其它添加劑，如抗微生物劑、 抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體等。
局部給藥的劑型可以包括軟膏、洗液、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴劑、 液體和粉劑。常規(guī)的藥物載體、水溶液、粉末或油狀的基質(zhì)(oilybase)、增 稠劑等可以是必要的或希望的。
給藥劑量是依據(jù)所治療狀況的嚴重程度和響應(yīng)度，但正常地為每天一劑 以上，療程持續(xù)幾天至幾個月或者直到本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定給藥應(yīng)該
31停止。普通技術(shù)人員可以很容易地確定最佳的劑量、給藥的方法和重復(fù)速率。 一方面，任何化合物和藥物組合物都可以含有活的細胞?；畹募毎睦?br> 子包括但不限于干細胞、成纖維細胞、肝細胞、軟骨細胞、干細胞、骨髓、
肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)元細胞、或者胰島細胞。 IV、使用方法
本文描述的化合物和藥物組合物(例如具有式I的化合物和由具有式 I的化合物衍生的偶聯(lián)的大分子)可以用于涉及藥物輸送、小分子輸送、傷 口愈合、燒傷愈合、和組織再生/組織工程的多種用途。所公開的組合物對于 受益于含水的、細胞周的環(huán)境的情況有用，在該環(huán)境中，其它基質(zhì)組分的聚 集、生長和分化因子的表達、細胞遷移、或者組織再生是需要的。
本文描述的化合物和組合物可以改善需要改善傷口愈合的受試者體內(nèi) 的傷口愈合，包括使受試者的傷口與權(quán)利要求的一種或多種化合物接觸。由 于本文描述的化合物和藥物組合物由生物相容性的材料組成，該化合物和藥 物組合物可以直接放置于任何生物系統(tǒng)之內(nèi)或任何生物系統(tǒng)之上而無需凈 化。該化合物可以放置的部位的例子包括但不限于軟組織，如肌肉或脂肪； 硬組織，如骨骼或軟骨；組織再生的區(qū)域；沒有填滿的空間(void space), 如牙周囊(periodontal pocket);外科手術(shù)切口或其它方式形成的囊或腔；自 然的腔，如口腔、陰道腔、直腸腔或鼻腔、眼睛的盲管等；腹膜腔和包含于 其中的器官，以及該化合物可以放置于其中或之上的其它部位，包括皮膚表 面缺陷，如切口、擦傷或燒傷區(qū)域。由于損傷或退化的生理狀況或二中擇一 的狀況下，預(yù)計組織會受到損害，本文描述的化合物和組合物可以施用于未 受損害的組織以防止損傷到該組織。本發(fā)明的化合物可以是可生物降解的并 且自然存在的酶可以產(chǎn)生隨時間而降解它們的效果。該化合物的組分可以為 "可生物吸收的"，因為該化合物的組分可以被分解并被例如細胞、組織等 吸收至生物系統(tǒng)內(nèi)。另外，該化合物，特別是沒有再水化的化合物可以應(yīng)用于生物系統(tǒng)以吸收來自于關(guān)注的區(qū)域的液體。
本文描述的化合物和組合物可以向需要輸送藥學(xué)上可接受的化合物的 患者輸送至少一種藥學(xué)上可接受的化合物，包括使能接收所述藥學(xué)上可接受 的化合物的至少一個組織與本文描述的一種或多種的組合物接觸。本文描述 的化合物可以用作很多種類的可釋放的生物活性物質(zhì)的載體，所述生物活性 物質(zhì)對于對人類或非人類的動物具有醫(yī)療或治療價值。能被該化合物負載的 這些物質(zhì)的許多在上面討論過。適合于引入至本發(fā)明的凝膠中的所包括的生 物活性材料為治療藥物，例如抗炎劑、退熱劑、用于抗炎用途的甾族的和 非甾族的藥物、激素、生長因子、避孕劑、抗病毒劑、抗菌劑、抗真菌劑、 止痛劑、催眠藥、鎮(zhèn)靜劑、安定藥、抗痙攣劑、肌肉松弛藥、局部麻醉劑、 鎮(zhèn)痙藥、抗?jié)兯?、肽興奮劑、擬交感神經(jīng)劑、心血管劑、抗腫瘤劑、低聚 核苷酸及其類似物等等。以藥學(xué)上的活性量來添加生物活性物質(zhì)。
一方面，本文描述的化合物和組合物可以用于輸送活的細胞至受試者。 本文描述的任何活的細胞都可以用于此方面。
一方面，所述化合物和組合物可以用于輸送生長因子和與生長因子相關(guān) 的分子。例如所述生長因子可以為神經(jīng)生長促進物質(zhì)，如神經(jīng)節(jié)苷脂、神 經(jīng)生長因子等；硬組織或軟組織生長促進劑，如纖連蛋白(FN)、人生長激
素(HGH)、集落刺激因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、血小板衍生生長因子(PDGF)、 胰島素衍生生長因子(IGF-I， IGF-II)、轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGF-a)、轉(zhuǎn)化生 長因子-P (TGF-P)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、 白細胞介素-1 (IL-1)。優(yōu)選的生長因子是bFGF和TGF-(3。還優(yōu)選血管內(nèi)皮 生長因子(VEGF)和角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)。
另一方面，可以使用抗炎藥，如布洛芬、萘普生、酮洛芬和吲哚美辛。 其它的生物活性物質(zhì)為肽，所述肽是自然存在的、非自然存在的或合成的多 肽或者它們的等構(gòu)物，如小的肽激素或激素類似物以及蛋白酶抑制劑。還可
33以使用殺精子劑、抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗增殖劑，如氟脫氧尿嘧
啶(fluorodeoxyuracil)和阿霉素。這些物質(zhì)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的且可以商購 得到。
本文使用的術(shù)語"治療藥物"旨在包括在聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法案 (Federal Food, Drug and Cosmetic Act)中定義的治療藥物。美國藥典(the United Sates Pharmacopeia, USP)禾卩國家處方集(National Formulary, NF)
是最普通的藥物產(chǎn)品的藥效和純度的公認的標準。
一方面，藥學(xué)上可接受的化合物為毛果蕓香堿、氫化可的松、脫氫皮質(zhì) 甾醇、可的松、雙氯酚酸鈉、吲哚美辛、6oc-甲基-脫氫皮質(zhì)甾醇、皮質(zhì)甾酮、 地塞米松和潑尼松。然而，還提供了方法，其中藥學(xué)上可接受的化合物的輸 送是出于醫(yī)療目的。醫(yī)療目的的例子包括但不限于輸送避孕藥劑、治療外科 手術(shù)后的粘連、促進皮膚生長、防止留下疤痕、敷裹傷口、進行粘彈性外科 (viscosurgery)、進行粘彈性補充(viscosupplementation)、禾卩制備組織。
藥物輸送的速率依賴于所釋放的分子的疏水性。當化合物在含水的環(huán)境 中溶脹時，疏水的分子(如地塞米松和潑尼松)緩慢地從該化合物中釋放， 而親水的分子(如毛果蕓香堿、氫化可的松、脫氫皮質(zhì)甾醇、可的松、雙氯 酚酸鈉、n引哚美辛、6oc-甲基-脫氫皮質(zhì)甾醇和皮質(zhì)甾酮)則快速釋放。該化 合物的保持緩慢地、持續(xù)不變地釋放甾族抗炎劑的的能力使本文描述的化合 物對于外傷或外科手術(shù)介入后的傷口愈合非常有用。另外，該化合物可以用 作促進細胞生長和組織再生的屏障系統(tǒng)。
在某些方法中，實現(xiàn)了涉及血管發(fā)生(angiogenesis )和血管化 (vascularization)的分子或試劑的輸送。公開了用于輸送如刺激微血管化 (microvascularization)的VEGF的試劑的方法。還公開了用于輸送能抑制 血管發(fā)生和血管化的試劑的方法，例如那些對于此目的有用的化合物和試 劑，所述化合物和試劑公開于但不限于美國專利Nos 6,174,861 "Methods ofinhibiting angiogenesis via increasingWw concentrations of endostatin protein (通過提高體內(nèi)內(nèi)皮抑制素蛋白濃度來抑制血管發(fā)生的方法)"；6,086,865 "Methods of treating angiogenesis隱induced diseases and pharmaceutical compositions thereof (治療血管發(fā)生誘導(dǎo)的疾病的方法及其藥物組合物)"； 6,024,688 "Angiostatin fragments and method of use (制管張素片段和使用方 法)"；6,017,954 "Method of treating tumors using O-substituted fbmagillol derivatives (使用O-取代的煙曲霉醇衍生物治療腫瘤的方法)"； 5,945,403"Angiostatin fragments and method of use (制管張素片段和使用方 法)"；5,892,069 "Estrogenic compounds as anti-mitotic agents (作為抗有絲分 裂劑的雌激素化合物)"；5,885，795"Methods of expressing angiostatic protein (表達制管張素蛋白的方法)"；5，861，372"Aggregate angiostatin and method of use (聚合制管張素以及使用方法)"；5，854，221"Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use (內(nèi)皮細胞增殖抑制劑及使用方法)"； 5，854,205"Therapeutic antiangiogenic compositions and methods(治療抗血管發(fā) 生的組合物及方法)"；5,837,682"Angiostatin fragments and method of use (制 管張素片段及其使用方法)"；5,792,845"Nucleotides encoding angiostatin protein and method of use (核苷編碼的制管張素及使用方法)"； 5,733,876"Method of inhibiting angiogenesis (抑制血管發(fā)生的方法)"； 5，698,586"Angiogenesis inhibitory agent (血管發(fā)生抑制劑)"； 5，661，143"Estrogenic compounds as anti-mitotic agents (作為抗有絲分裂齊U的 雌激素化合物)"；5，639,725"Angiostatin protein (制管張素蛋白)"； 5，504,074"Estrogenic compounds as anti-angiogenic agents (作為抗血管發(fā)生齊U 的雌激素化合物)"；5,290,807"Method for regressing angiogenesis using o-substituted flimagillol derivatives (使用O-取代的煙曲霉醇衍生物來退化血 管發(fā)生的方法)"以及5,135，919"Method and a pharmaceutical composition for
35the inhibition of angiogenesis (用于抑制血管發(fā)生的方法及藥物組合物)"，涉 及用于抑制血管發(fā)生的分子的材料的這些專利結(jié)合于此作為參考。
本文描述了通過使本文描述的任何化合物或藥物組合物與需要改善傷 口愈合的受試者的傷口接觸，來改善需要這種改善的受試者體內(nèi)的傷口愈合 的方法。還提供了通過使本文描述的任何化合物或藥物組合物與能接收所述 藥學(xué)上可接受的化合物的至少一個組織接觸，將至少一種藥學(xué)上可接受的化 合物輸送給需要這種輸送的患者的方法。
所公開的組合物可以用于治療受試者體內(nèi)的很多種類的組織缺陷，例 如具有空隙的組織(如牙周囊)、淺的或深的皮膚傷口、外科手術(shù)切口、 骨骼或軟骨缺陷等。例如本文描述的化合物可以為水凝膠膜的形式。所述水 凝膠膜可以應(yīng)用于骨骼組織內(nèi)的缺陷(如手臂或腿骨內(nèi)的骨折)、牙齒內(nèi)的 缺陷、關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨缺陷、耳朵、鼻或咽喉等。通過提供一個表面，細胞可 以在該表面之上生長或者通過該表面生長，由本文描述的化合物組成的水凝 膠膜還可以起到用于引導(dǎo)組織再生的屏障系統(tǒng)的作用。為了增進如骨骼組織 的硬組織的再生，優(yōu)選水凝膠膜為新生的細胞生長提供支撐，所述水凝膠膜 可以代替基質(zhì)，因為該水凝膠膜可以逐漸被體液吸收或侵蝕。
由本文描述的化合物組成的水凝膠膜可以輸送至細胞、組織、和/或器 官之上，例如通過注射、噴霧、噴射、刷、涂、包被等。輸送也可以通過插 管、導(dǎo)管、有或沒有針的注射器、壓力敷貼器(pressure applicator)、泵等。 可以以膜的形式將該化合物應(yīng)用至組織之上，例如提供一種敷裹在組織的表 面上的和/或?qū)⒔M織粘著至另一個組織或水凝膠膜的膜，以及其它應(yīng)用。
一方面，本文描述的化合物通過注射給藥。對于許多臨床應(yīng)用，當該化 合物為水凝膠膜的形式時，可注射的水凝膠因三個主要原因而優(yōu)選。第一， 可注射的水凝膠可以在創(chuàng)傷部位形成任何需要的形狀。因為最初的水凝膠可 以為溶膠或可模壓的油灰狀粘性材料，因此該系統(tǒng)可以以復(fù)雜的形狀定位，且隨后交聯(lián)成符合需要的尺寸。第二，在凝膠形成的期間水凝膠可以粘附在 組織上，且產(chǎn)生于表面微微糙的機械聯(lián)鎖可以強化組織-水凝膠界面。第三， 引入原位可交聯(lián)的水凝膠可以使用針或通過腹腔鏡方法來完成，由此將外科 手術(shù)技術(shù)的侵入力最小化。
本文描述的化合物可以用于治療牙周的疾病，可以切除覆蓋在牙齒根部 的齒齦組織以形成封套或洞，并將所述組合物輸送至該洞中并緊靠著暴露的 牙根。通過做一個經(jīng)過齒齦組織的切口以暴露牙根，也可以將化合物輸送至 牙齒缺陷，然后通過放置、刷、噴射、或其它方式將材料經(jīng)過切口施用至牙 根表面之上。
當用于治療皮膚或其它組織上的缺陷時，本文描述的化合物可以為能放 置在需要的區(qū)域之上的水凝膠膜的形式。在此方面，所述水凝膠膜是有延展 性的且可以被調(diào)整以符合組織缺陷的輪廓。
可以理解的是所公開的組合物和方法可以應(yīng)用于需要組織再生的受試 者。例如，可以將細胞引入用于植入的本文描述的化合物中。 一方面，所述 受試者是哺乳動物。所述組合物和方法施用的哺乳動物優(yōu)選是小鼠、家鼠、 母?；蚺！ⅠR、綿羊、山羊、貓、狗、白鼬、和靈長類，所述靈長類包括猿、 黑猩猩、猩猩、和人類。另一方面，本文描述的化合物和組合物可以施用于 鳥類。
當用于涉及組織再生(如傷口或燒傷愈合)的區(qū)域時，所公開的方法和 組合物消除對于一種或多種有關(guān)的已接受的治療的需要的不必要的?？梢岳?解的是，通過接受公開的組合物或方法所獲得的恢復(fù)時間的縮短或恢復(fù)質(zhì)量 的提高已經(jīng)獲得一些益處。還可以理解的是， 一些公開的組合物和方法可以 用于防止或降低作為創(chuàng)傷(如外科手術(shù))的傷口的閉合的結(jié)果而發(fā)生的纖維 化粘連。還可以理解的是由公開的組合物和化合物提供的間接效果是希望的 但不是必要的，例如改善抗菌性或減輕疼痛等。一方面，本文描述的化合物可以用于修復(fù)受試者體內(nèi)的受損的彈性組 織，包括使受損的組織與本文描述的一種或多種化合物接觸。受損組織的來 源可以是由于損傷或通過退化的生理狀況。彈性組織的例子包括但不限于聲 帶、心血管組織、肌肉、腱、韌帶、膀胱組織、尿道內(nèi)的組織、括約肌、或 者胃腸道內(nèi)的肌肉。
本文描述的化合物可以用作生長和分化細胞的基質(zhì)。例如，本文描述的 化合物和組合物可以形成層壓材料、凝膠、珠子、海綿體、膜、網(wǎng)狀物、電 紡的納米纖維、編織的網(wǎng)狀物、或者非編織的網(wǎng)狀物。 一方面，本文描述了 使多個細胞生長的方法，該方法包括(a)將母體細胞沉積在本文描述的基 質(zhì)上，以及(b)對具有沉積的細胞的基質(zhì)進行培養(yǎng)以促進細胞的生長。
另一方面，本文描述了使細胞分化的方法，該方法包括(a)將母體細 胞沉積在本文描述的基質(zhì)上，以及(b)培養(yǎng)該集群(assembly)以促進細胞 的分化。
使用本文描述的基質(zhì)可以生長和/或分化很多類型的細胞，所述可以生 長和/或分化的細胞包括但不限于干細胞、定型的干細胞、分化的細胞、和腫 瘤細胞。干細胞的例子包括但不限于胚胎干細胞、骨髓干細胞和臍帶干細胞。 用于各種實施方式中的細胞的其它例子包括但不限于成骨細胞、成肌細胞、 成神經(jīng)細胞、成纖維細胞、成膠質(zhì)細胞、生殖細胞、肝細胞、軟骨細胞、上 皮細胞、心血管細胞、角質(zhì)形成細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、結(jié)締組織細 胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、激素分泌細胞、免疫系統(tǒng)的細胞、 和神經(jīng)元。
本文中有用的細胞可以在體外(invitro)培養(yǎng)、由天然源衍生、遺傳制 造、或者通過任何其它的方式來制成?？梢允褂迷思毎蛘婧思毎娜魏?天然源。還可以預(yù)計的是細胞可以先體外后體內(nèi)(exvivo)培養(yǎng)。
本文還可以使用非典型的或變態(tài)的細胞，如腫瘤細胞。在本文描述的基
38質(zhì)上培養(yǎng)的腫瘤細胞可以提供更精確的用于評估藥物治療的機體內(nèi)的固有 的腫瘤環(huán)境的表達?？紤]到在類似于體內(nèi)的環(huán)境中開發(fā)特異性地以腫瘤為目 標的藥物，在本文描述的基質(zhì)上的腫瘤細胞的生長可以促進腫瘤的生物化學(xué) 的途徑和活性的表征，包括基因表達、受體表達、和多肽產(chǎn)生。
本文中還可以使用遺傳制造的細胞。所述制造包括編排細胞以表達一種 或多種基因、抑制一種或多種基因的表達、或者兩者都有。例如，遺傳工程 可以包括添加遺傳物質(zhì)到細胞上或從細胞上除去遺傳物質(zhì)、改變現(xiàn)有的遺傳 物質(zhì)、或者兩者都有。其中細胞被轉(zhuǎn)染或者以其它方式制造以表達基因的實 施方式可以使用瞬時或永久轉(zhuǎn)染基因、或者兩者都有?；蛐蛄锌梢允侨?或者部分長度、克隆的或者自然存在的。
另一方面，本文描述了使組織生長的方法，該方法包括(a)將母體細 胞沉積在本文描述的基質(zhì)上，所述細胞是該組織的前體，以及(b)對具有 沉積的細胞的基質(zhì)進行培養(yǎng)，以促進組織的生長。還可以預(yù)計的是能存活的 細胞可以沉積在本文描述基質(zhì)上，并在促進組織生長的條件下培養(yǎng)。預(yù)計采 用本文描述的基質(zhì)可以由上述任何細胞生長(即制造)組織。本文描述的載 體可以支撐許多不同種類的前體細胞，并且所述基質(zhì)可以引導(dǎo)新組織的發(fā) 展。組織的產(chǎn)生在傷口愈合中具有眾多應(yīng)用。使用本文描述的方法可以在體 內(nèi)或先體外后體內(nèi)進行組織生長。
本文描述的化合物可以應(yīng)用于可植入的裝置，例如縫合線、夾鉗、假
體、導(dǎo)管、金屬螺釘、骨骼托(boneplate)、釘、繃帶(如紗布)等，以提 高在植入部位內(nèi)的可植入裝置與機體的組織的相容性和/或性能或功能。所述 化合物可以用來涂覆所述可植入的裝置。例如，通過提供生物相容性的光滑 的表面降低由粗糙邊緣與鄰近組織接觸而產(chǎn)生的磨損的發(fā)生，所述化合物可 以用于涂覆可植入裝置的粗糙表面，以促進該裝置的相容性。所述化合物還 可以用于提高可植入裝置的性能或功能。例如，當所述化合物為水凝膠膜時，該水凝膠膜可以應(yīng)用于紗布繃帶，以提高與它所應(yīng)用的組織的相容性或粘附 力。所述水凝膠膜還可以應(yīng)用于通過切口插入身體內(nèi)的的裝置(例如導(dǎo)管 或結(jié)腸造口術(shù)中使用的裝置)的周圍，以便有助于確保該導(dǎo)管/結(jié)腸造口術(shù)中 使用的裝置在適當位置和/或填充該裝置與組織之間的空隙，并形成緊密的密 封以降低細菌感染和體液的損失。
還可以預(yù)計的是本文描述的化合物可以用作生物人造材料，所述生物人 造材料在受試者體內(nèi)可以用作可植入裝置。在此方面，該生物人造材料可以 模制成任何需要的形狀。 一方面，該生物人造材料含有由具有式I的一種或 多種化合物與含有至少兩個巰基的大分子反應(yīng)而得到的產(chǎn)物。 一方面，該大
分子包括具有至少兩個巰基的類似彈性蛋白(elastin-like)的肽。另一方面， 一種或多種生物人造材料可以用于制備假器官裝置。 一方面，該裝置可以為 活的假器官裝置，其中該裝置促進組織生長。依賴于生物人造材料的組成， 該裝置可以為可變形的，以適合受試者的特別需要。
可以理解的是所公開的組合物和方法的任何給定的特定方面都可以很 容易地與本文公開的具體實施例和實施方式進行比較，包括在實施例中討論 的基于非多糖的試劑。通過進行這種比較，可以很容易地確定每個特定實施 方式的相對功效。在本文的實施例中公開了特別優(yōu)選的組合物和方法，且可 以理解的是這些組合物和方法可以用本文公開的任何組合物和方法來實現(xiàn)， 而沒有必要限制。
實施例
提出下列實施例以向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員提供怎樣制備和評價本文 描述和要求的化合物、組合物和方法的完整的公開和描述，并且下列實施例 出于純粹的示例的目的且并不是出于限制發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍的目的。 關(guān)于數(shù)字(例如數(shù)量、溫度等)，已經(jīng)作出努力以確保精確性，但一些誤差和偏差應(yīng)該作出解釋。除非另有說明，份為重量份，溫度為x:或者在環(huán)境溫
度下，且壓力為在大氣壓下或接近大氣壓。存在很多反應(yīng)條件的變化和組合， 例如組分濃度、需要的溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和其它可以用于最優(yōu) 化獲得自所描述的過程的產(chǎn)品的純度和產(chǎn)率的反應(yīng)范圍和條件。為最優(yōu)化這 樣的過程條件，僅僅需要合理和常規(guī)的試驗。 原料和方法
原料和分析儀器。高分子量透明質(zhì)酸(HA， MW=824 kDa)購自Contipro CCo， Czech Republic (捷克共和國)。溴乙酸酐(BA)、來自牛睪丸的透明 質(zhì)酸酶型I-S (HAse， 451 U/mg固體)購自Sigma-Aldrich Chemical Co.， Milwaukee (密爾沃基)，WI (威斯康星州)。磷酸鹽緩沖生理食鹽水10X
(PBS)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸12.1N (HC1)、碘化鈉(Nal)、七水合磷 酸氫二鈉(Na2HP04 7H20)和SpectraPor滲析管MWCO 10.000購自Fisher Scientific, Hanover Park, IL (伊利諾斯州)。SAMSA熒光素(5-((2-(和-3)-S-乙酰巰基)琥珀?；?氨基)熒光素)混合的異構(gòu)體購自Molecular Probes Inc., Eugene (尤金)，OR (俄勒岡州)。T31人氣管瘢痕成纖維細胞來自Dr. S. L. Thibeault (Division of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Department of Surgery, University of Utah, Salt Lake City, UT (耳鼻喉-頭部和頸部外科組， 外科學(xué)系，猶他州大學(xué)，鹽湖城，猶他州)；Division of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Department of Surgery, University of Wisconsin, Madison, WI
(耳鼻喉-頭部和頸部外科組，外科學(xué)系，威斯康星大學(xué)，麥迪遜，威斯康 星州))。
iH-NMR光譜數(shù)據(jù)是使用Varian INOVA 400在400MHz下獲得的。 UV/VIS光譜和測試在Palo Alto， CA的Hewlett-Packard 8453 UV-可見光譜儀 上進行。凝膠滲透色譜(GPC)分析是使用下列部件獲得的Waters 486可 調(diào)吸光度檢測器、Waters 410差示折射計、Waters 515 HPLC泵和Ultrahydrogel
411000柱(7.8x300 mm) (Waters Corp., Milford (米爾福德)，MA (馬薩諸 塞州))。GPC的流動相由0.2MPBS緩沖液/甲醇(體積比為80: 20)組成。 用于校準該系統(tǒng)的HA標準購自Novozymes Biopolymers, Bagsvaerd, Denmark (丹麥)。OPTIMax酶標儀(microplate reader) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)用來測定用于細胞生存能力分析的490 nm吸光度值。
溴乙酸酯衍生的透明質(zhì)酸(HABA)的合成。將透明質(zhì)酸(6.0g)溶解 在600mL蒸餾水(1%重量/體積的溶液)中。通過添加1MNaOH調(diào)節(jié)該溶 液的pH至9.0。然后向該溶液中滴加溴乙酸酐(40 g， 153mmol)并且該反 應(yīng)在4r下攪拌24小時。相對于N-乙酰葡糖胺殘基的C-6伯羥基的數(shù)量， 溴乙酸酐的量相當于10當量。然后將該反應(yīng)混合物向蒸餾水滲析3天。接 著凍干并分析該樣品。通過'H-NMR和GPC來測定該樣品的純度，并用 SAMSA熒光素衍生化來測定取代度(SD) (SD 18%)。 'H-NMR (D20); 對應(yīng)于取代基的化學(xué)位移5 = 3.84 ppm (COCH2Br)。
碘乙酸酯衍生的透明質(zhì)酸(HAIA)的合成。將HABA (2.15 g)溶解在 215 mL蒸餾水中(1%重量/體積的溶液)并與10當量的NaI反應(yīng)。該反應(yīng) 在室溫下攪拌過夜。接著，將反應(yīng)混合物滲析3天(MWCO 10000)并隨后 凍干。通過iH-NMR和GPC測定修飾的透明質(zhì)酸的純度，通過SAMSA熒 光素衍生化來計算取代度(SD 19%)。 ^-NMR(D20);對應(yīng)于取代基的化 學(xué)位移S = 3.7ppm(COCH2I)。
SAMSA熒光素衍生化。將SAMSA熒光素(25 mg)溶解在2.5 mL 0.1M 的NaOH中并在室溫下放置15分鐘。然后添加6 N的HC1 (35 pL)，接著 添加0.5 mL pH7.0的NaH2P04 H20。 HA-BA與HA-IA (各5 mg)與活化 的SAMSA熒光素在室溫下反應(yīng)30分鐘。然后將該反應(yīng)混合物在用具有40 kDa的額定排除極限(nominal exclusion limit)的Bio-Gel P-30 Gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA ) 土真充的 Econo-Pac Bio-Rad 柱 (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)上分離以證實共價連接。為了測定鹵代乙酸酯 HAs的衍生度，將SAMSA熒光素-鹵代乙酸酯HA反應(yīng)混合物向dH20 (蒸 餾水)(MWCO3500)滲析3天，然后借助光譜方法測定A494。
HA鹵代乙酸酯的細胞毒性分析。將T31人氣管瘢痕成纖維細胞在 DMEM/F12 +10%新生小牛血清+2111]^1^-谷氨酰胺中，以1(^細胞/mL(100 )al/孔)的密度接種在96孔板中，并在37。C/5。/。 C02下培養(yǎng)24小時。在無血 清、無L-谷氨酰胺的生長介質(zhì)中制備1.5%的HABA、 HAIA和HA( 120 kDa) 的儲備溶液(stock solution),并且使用0.1 M NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至7.5-8。 然后通過0.45 pm的針頭式過濾器單元(syringe driven filter unit)來過濾溶 液以確保無菌。然后除去生長介質(zhì)，并用IOO pL的無血清、無L-谷氨酰胺 的介質(zhì)洗滌細胞兩次。將工作溶液(在IOO pL無血清、無L-谷氨酰胺的介 質(zhì)中各自為1.5%、 1%、 0.6%、 0.2%和0.1%)添加至細胞上，并且再培養(yǎng)該 板24小時。未處理的細胞用作對照。將四唑化合物MTS (Cell-Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI)還原成 有色的甲臜(formazan)產(chǎn)物來評定細胞生存能力。還原的鹽在可以用光譜 方法監(jiān)控的490 nm下具有吸光度最大值，且顏色的強度與孔中的能生存的 細胞的數(shù)量成比例。
凝膠化研究。在IX PBS緩沖液中，在7-8的pH下制備1.5% HABA和 HAIA溶液。pH 7-8的IX PBS中的3%的DTPH修飾的甲基化的HA(CHMA) 和明膠-DTPH溶液用于交聯(lián)。CHMA的合成在國際公布No. WO 2005/056608 中有公開，在此引入該國際公布作為參考。鹵化的HA衍生物和交聯(lián)劑 (CHMA或明膠-DTPH，兩者均為含有巰基的化合物)溶液以不同的體積比
(1: 1、 1: 2、 2: 1、 1: 3禾tl 3: 1)混合并在室溫下放置。最快的交聯(lián)發(fā)
生在明膠-DTPH/HAIA混合物(體積比為3: 1)中。親電體衍生的HA含量 較高不適合于交聯(lián)。結(jié)果總結(jié)在表1中。
43表1.用于HA-BA和HA-IA水凝膠的凝膠化條件。
原料體積比(v/v) (摩爾比)1: 1 (1.52: 1)1: 2 1: 1.322: 1 (3: 1)1: 3 (1: 2)3: 1 (4.5: 1)
凝膠化時間(小時)CHMA/HABA24_9一9
C畫A/HAIA8.5226.5—6
明膠DTP願ABA8.5455一4
明膠DTP應(yīng)AIA22265454
用于凝膠化測試的工作溶液是在IX PBS中2%重量/體積的CMHA-S， 2%重量/體積的HABA和2%重量/體積的HAIA溶液，通過添加1 M NaOH 調(diào)節(jié)pH為7.0、 8.0、 9,0、 10.0、 11.0禾卩12.0。通過使用3: l摩爾比的親核 體與親電體來獲得含有鹵代乙酸酯HA的水凝膠。通過暴露于空氣，僅 CMHA-S的水凝膠(對照物)通過二硫鍵交聯(lián)。通過試管倒置方法測定溶液 (可流動的液體)至凝膠(非流動的水凝膠)的轉(zhuǎn)變時間。該試驗重復(fù)三次， 具有一致的結(jié)果。
非粘著的水凝膠。在無菌過濾后，通過溶解CMHA-S、 HABA和HAIA (1XPBS， pH至9.0)的2%重量/體積的溶液并以3: l摩爾比的親核體與 親電體使它們混合來獲得由CMHA-S和鹵代乙酸酯HAs組成的水凝膠。通 過暴露于空氣，僅CMHA-S的水凝膠(對照物)通過二硫鍵交聯(lián)。然后， 該復(fù)合物被澆注于96孔組織培養(yǎng)板中，并使其于室溫下在罩中凝膠并固化。 細胞粘著的水凝膠。通過向上述非粘著的水凝膠中添加巰基修飾的明膠 (Gtn-DTPH)來獲得細胞粘著的水凝膠。簡言之，將Gtn-DTPH (1XPBS， pH 9.0)的2%重量/體積的溶液與2%重量/體積的CMHA-S (9: 1體積/ 體積)混合，然后在無菌過濾后，在3: 1的摩爾比的親核體與親電體下與
442%重量/體積的鹵代乙酸酯HA溶液(1XPBS， pH9.0)反應(yīng)。通過暴露于 空氣，CMHA-S與Gtn-DTPH水凝膠(沒有鹵代乙酸酯HAs)通過二硫鍵交 聯(lián)。當具有非粘著的凝膠時，該復(fù)合物被澆注于96孔組織培養(yǎng)板中，并使 其于室溫下在罩中凝膠并固化。含有Gtn-DTPH的生物材料的凝膠化時間與 非粘著的水凝膠相似。
水凝膠細胞毒性分析。用在pH 9.0下制備的50 ^ CMHA-S、 CMHA-S + HABA、 CMHA-S + HAIA、 CMHA-S + Gtn-DTPH、 CMHA隱S + Gtn-DTPH + HABA和CMHA-S + Gtn-DTPH + HAIA水凝膠來涂覆組織培養(yǎng)板(96孔)， 并使其在罩中固化過夜。未涂覆的孔用作對照。然后用200 p介質(zhì)
(DMEM/F12+10%新生小牛血清+2 111^41^谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素) 洗滌凝膠三次，接著將相同介質(zhì)中的細胞(3.5 x 1(^細胞/mL)接種在每個 孔中(100pl/孔)。隨后細胞在37。C/5。/。C02下培養(yǎng)48小時。將上面描述的 比色分析用于評估能存活的細胞的存在。使用Olympus CKX41顯微鏡 (Olympus America Inc., Melville, NY)用顯微鏡的方法來驗證細胞附著。
水凝膠降解。為了測定在牛睪丸HAse (225 U/mL)存在下水凝膠的酶 降解速率，將0.5 mL凝膠澆注于17 x 60 mm的玻璃瓶(Fisher Scientific) 中并使其固化過夜。接著，凝膠用600 ^illXPBS， pH 7.4 ± HAse覆蓋并放 置于37'C下的150轉(zhuǎn)每分(rpm)的培養(yǎng)箱中。在預(yù)定的時間間隔下，取出 300 pLPBS ± HAse并用分光光度法來評估Aw值(低聚糖的吸光度范圍為 200-240nm)。對于每一個時間點，用新鮮的1XPBS， pH 7.4 (士HAse，如 果需要的話)替換為了分析而取出的上層清液。將完全分解后的那一天記錄 的吸光度值設(shè)定為100%，且將先前幾天所讀出的吸光度值外推為百分比。
統(tǒng)計學(xué)分析。使用t檢驗(Student's t-test) (2尾(2-tailed))來比較由 平均值士標準偏差(S.D.)所表示的數(shù)值，p〈0.05統(tǒng)計學(xué)上認為是有效的， 而p < 0.005或p < 0.001認為是高度有效的。溴乙酸酯衍生的HA (HABA)的合成及表征。通過在堿性的反應(yīng)條件 下用溴乙酸酐處理HA來獲得HABA(圖1)。由于溴乙酸酐和HA之間形成 混合的酸酐，該混合的酸酐可以快速水解，恢復(fù)HA葡糖醛酸的羧酸基團， 因此需要反應(yīng)物摩爾數(shù)過量。而副反應(yīng)不會對HABA的總的生物活性引起 任何干擾，該副反應(yīng)消耗了酸酐試劑并減少了伯羥基的總的溴乙酸酯修飾。 接著，將反應(yīng)混合物滲析以除去水解的溴乙酸酐副產(chǎn)物、溴乙酸鈉和乙二醇 酸鈉。通過凍干凍結(jié)的滲析后的溶液，以78"/。的產(chǎn)率獲得最終產(chǎn)物(HABA)。
通過在020中的^-NMR來確定HABA的結(jié)構(gòu)。與原料(HA)的光譜 圖(圖2A)相比較， 一個新的寬的共振出現(xiàn)在3.84ppm處，對應(yīng)于溴乙酸 酯基團的亞甲基質(zhì)子(COCH2Br)(圖2B)。 HABA的純度和分子量分布通 過GPC來測定(數(shù)據(jù)未示出)。通過折射率和UV兩者來檢測GPC圖并確 定該化合物的純度。該化合物的分子量確定為MW 120 kDa (多分散指數(shù) 2.58)，且分子量的降低(與原料相比較)可以歸因于反應(yīng)和提純過程中的堿 性的水解或酸性的水解。最終的HABA產(chǎn)物完全可溶解于水中。定義為溴 乙酸酯基團每IOO個二糖單位的取代度通過熒光染料衍生化評估為約18%。
碘乙酸酯衍生的HA (HAIA)的合成及表征。將獲得的HABA分成二 等份。 一份用于進一步的化學(xué)和生物表征。第二份用作合成HAIA的原料。 在納米純水(nanopure water)中，使用改進的芬克爾斯坦反應(yīng)(modified Finkelstein reaction)(圖3)來使HABA與Nal反應(yīng)，并且將該溶液滲析并 凍干以97%的產(chǎn)率得到HAIA。與起始的HABA的'H-NMR光譜圖(圖2B) 相比較，對應(yīng)于鹵代乙酸酯基團的亞甲基質(zhì)子的峰(COCH2X，5 = 3.84)向 高磁場移動至3.70 ppm (圖4)。使用GPC來評估HAIA的純度和分子量分 布(數(shù)據(jù)未示出)。該化合物的分子量確定為MW 160 kDa (多分散指數(shù) 2.45)。由于^-NMR峰由5 = 3.84向高磁場移動至5 = 3.70 ppm，因此推測 取代度與HABA相同。
46HA鹵代乙酸酯的SAMSA熒光素衍生化。兩種HA鹵代乙酸酯衍生物 的大致的結(jié)構(gòu)通過iH-NMR來測定。然而，由于聚合物質(zhì)子光譜的復(fù)雜性， 使用另外的測量方法來測試成功的化學(xué)改變。SAMSA熒光素為一種含有巰 基的熒光試劑，通常用于分析蛋白質(zhì)的馬來酰亞胺和碘乙酰胺部分(圖5A)。 由于新的活性基團的特性，因而選擇SAMSA熒光素衍生化來評估新的部分
(對于HABA為溴乙酸酯和對于HAIA為碘乙酸酯)的存在以及活性。如 在原料與方法中所描述的，HA衍生物與SAMSA熒光素結(jié)合并滲析后，將 該溶液在UV光下拍照以在視覺上評估熒光強度(圖5B)。熒光部分與HA 鹵代乙酸酯的共價連接進一步用色譜方法確認(結(jié)果未示出)。此試驗的結(jié) 果表示了想法的證實并顯示了 HA聚合物的成功的化學(xué)改變。
HA鹵代乙酸酯的細胞毒性。將初級人氣管瘢痕T31成纖維細胞在96 孔板中培養(yǎng)，并用作模型系統(tǒng)以評價HABA和HAIA對非無限增殖的
(non-immortalized)初級細胞的影響。所述細胞最初在含有血清的介質(zhì)中培 養(yǎng)以確保適當?shù)纳L。接著，用無血清的介質(zhì)洗滌細胞，并將位于無血清的 介質(zhì)中的濃度為1.5%、 1%、 0.6%、 0.2%禾卩0.1%重量/體積的HABA或HAIA 添加至細胞。僅用無血清的介質(zhì)處理的細胞用作對照。48小時后，如描述的， 使用MTS分析用比色的方法評估細胞生存的能力。如對于巰基反應(yīng)性的親 電子種所預(yù)期的，兩種HA鹵代乙酸酯聚合物在高濃度下都是細胞毒素的。 然而，在低濃度(0.1%重量/體積)下，這些敏感的細胞可以很好地耐受它 們(圖6)。
HA鹵代乙酸酯交聯(lián)的水凝膠。圖7說明了由HA鹵代乙酸酯制備的兩 種根本上不同的水凝膠。因此，圖7A說明了嚴格地基于兩種化學(xué)修飾的HA 衍生物一一一種親電子的和一種親核的非細胞粘著的水凝膠的制備。圖7B 顯示了通過引入巰基修飾的明膠衍生物，親電子的和親核的HA衍生物可以 共交聯(lián)成細胞粘著的水凝膠。為了測定含有鹵代乙酸酯HA的生物材料的凝膠化時間，通過使
CMHA-S與HABA或HAIA以3: 1的摩爾比混合而制得水凝膠。緊接著研 究了凝膠化時間的pH依賴性。在pH為7.4的IX PBS中制備CMHA-S與 HABA或HAIA的溶液(2%重量/體積)，并將該溶液的pH調(diào)節(jié)至pH 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0和12.0。如預(yù)期的，最快凝固的溶液為pH為9.0和10.0 的溶液(表l)。所得到的凝膠是透明的且不溶于水溶液中(數(shù)據(jù)未示出)。 含有鹵代乙酸酯HA的水凝膠的凝膠化過程是通過導(dǎo)致硫醚形成的親核取代 反應(yīng)而進行的。CMHA-S的巰基具有近似于9的pKa值，這說明為什么該 反應(yīng)的最佳的pH為9-10。在較低的pH值下，所述巰基大部分以其質(zhì)子化 的形式存在，而當pH提高時，陰離子的親核體的相對量增加。高于10的 pH下，氫氧化物開始置換碘化物或溴化物，導(dǎo)致難以獲得碘化物或溴化物 來形成硫醚。
水凝膠的細胞毒性。通過使pH9.0的CMHA-S的2%重量/體積的溶液 與pH9.0的HA鹵代乙酸酯的2%重量/體積的溶液以3: 1的摩爾比的混合 來制備非細胞粘著的水凝膠(圖7A)。然后將混合的溶液用于涂覆96孔板 的孔并使其在罩中凝膠過夜。在細胞接種前，用含有血清的介質(zhì)洗滌水凝膠、 然后接種3.5 x 104細胞/mL (100 (al/ L)并在37°C/5% C02下培養(yǎng)48小時。
前面的研究顯示了基于HA的水凝膠如CarbylanTM-SX不能促進細胞粘 著，而含有共價交聯(lián)的明膠衍生物的基于HA的凝膠支持細胞粘著和增殖。 為了客觀地評價含有鹵代乙酸酯HA的水凝膠的細胞毒性，未涂覆的孔和用 具有共價交聯(lián)的明膠(Gtn-DTPH)的凝膠涂覆的孔用作對照(圖7B)。 24 小時后，用顯微鏡研究細胞。在無Gtn-DTPH的材料上接種的細胞團簇在一 起、成圓形并且沒有粘著，而僅在塑料上生長的細胞或在含有Gtn-DTPH的 材料上生長的的細胞分散開并得到典型的紡垂形的形態(tài)。細胞的生存能力是 通過細胞接種后48小時的MTS比色分析來評估的。不存在Gtn-DTPH時，細胞不能粘著。甚至較少的細胞存在于含有鹵代乙酸酯HA的凝膠上，與這 些材料的細胞毒性作用一致(在水凝膠中，最終的鹵代乙酸酯HA的濃度為
0.67%重量/體積，因為以1: 3的摩爾比將2%重量/體積的儲備溶液加入到 該聚合物溶液中)(圖8)。與對照水凝膠(僅CMHA-S)相對，含有鹵代乙 酸酯HA的無Gtn-DTPH的水凝膠在細胞粘著/生存能力方面顯示出17% (HABA)至30% (HAIA)的降低(見圖8的插圖)。
HA鹵代乙酸酯水凝膠的降解。用于醫(yī)療目的或任何其它體內(nèi)的應(yīng)用的 HA卣代乙酸酯水凝膠的用途依賴于在透明質(zhì)酸酶作用下的凝膠降解的速 率，所述速率轉(zhuǎn)變成涂覆材料實際上可以在體內(nèi)存在的時間。為了估算水凝 膠的降解速率，用IX PBS, pH 7.4士HAse (225 UmL)來培育無Gtn-DTPH的 水凝膠。我們的結(jié)果顯示通過二硫鍵交聯(lián)的CMHA-S水凝膠比含有HA鹵 代乙酸酯的材料水解得更快(圖9)。到第3天，CMHA-S水凝膠全部降解。 相反，到第5天，含有HABA的水凝膠呈現(xiàn)為全部降解，而CMHA-S/HAIA 水凝膠降解得稍微慢些(至第6天)。不存在酶時，含有HA鹵代乙酸酯的 水凝膠以非常慢的速率水解。僅CMHA-S的水解速率不能測定，因為這種 生物材料具有與含有鹵乙酸酯HA的水凝膠不同的行為，并且在添加上清液 時溶脹。
貫穿本申請，參考了各種公開文本。將將這些公開文本的公開整體結(jié)合 于本申請中作為參考，以更全面地描述本文所述的化合物、組合物和方法。
可以對本文所述的化合物、組合物和方法進行各種修改和變化。通過說 明書的描述和本文公開的化合物、組合物和方法的實踐，本文所描述的化合 物、組合物和方法的其它方面將變得明顯。說明書和實施例應(yīng)該視為示例性 的。
權(quán)利要求
1、一種包括式I的化合物，其中，Y′為大分子的殘基，該大分子選自由低聚核苷酸、核酸或核酸的代謝穩(wěn)定的類似物、多肽、糖蛋白、糖脂、多糖和蛋白質(zhì)所組成的組中；X′為-O-、-S-、-NH-、或-NR＂-；R′為氫、烷基、全氟烷基、芳基、雜芳基、或鹵素；R＂為氫或C1-5烷基；并且A′為離去基團。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述大分子選自由多糖和糖 胺聚糖所組成的組中。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述多糖包括透明質(zhì)酸、硫 酸軟骨素、皮膚素、乙酰肝素、肝素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、褐藻酸、 果膠、殼聚糖、或羧甲基纖維素。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述大分子選自由合成的聚 合物所組成的組中，所述合成的聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、聚乙二 醇、聚丙二醇、多元醇、聚胺、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的三嵌 段聚合物、聚乙二醇的星形聚合物、和聚乙二醇的樹枝狀聚合物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述大分子為蛋白質(zhì)，該蛋 白質(zhì)選自由自然存在的蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)、胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、化學(xué)修飾的 胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、遺傳工程的蛋白質(zhì)、以及胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)部分水解的衍生 物所組成的組中。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Y'包括透明質(zhì)酸的殘基。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Y'包括N-乙酰-葡糖胺殘基， 其中該N-乙酰-葡糖胺殘基的至少一個C-6伯羥基被基團-C(O)CH(R')(A')取代。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其中，所述N-乙酰-葡糖胺殘基的至 少一個仲羥基被基團-C(O)CH(R'XA')取代。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其中，所述N-乙酰-葡糖胺殘基的 1%的C-6伯羥基至約100%的C-6伯羥基被基團-C(O)CH(R')(A')取代。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，X'為-O-、或-NH-。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，R'為甲基或氫。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A'為鹵素。
13、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Y'為透明質(zhì)酸的殘基，其中 至少一個羥基被-C(0)CH2Cl、 -C(0)CH2Br、或-<:(0)0121取代。
14、 一種制備化合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，該方法包括使含 有至少一個親核基團的大分子與包括式XV的化合物反應(yīng)，其中，R'為氫或烷基；并且Ai和A^蟲立地為相同或不同的離去基團。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述大分子包括糖胺聚糖。
16、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述大分子包括透明質(zhì)酸。
17、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，R'為氫。
18、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，八1形成式乂￥1的化合物，R'為氫或烷基，其中每個R'為相同的基團；并且每個八2為相同的離去基團。
19、根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，入2為鹵素。
20、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述大分子為透明質(zhì)酸，且 包括式XV的化合物選自由氯乙酸酐、溴乙酸酐、和碘乙酸酐所組成的組中。
21、 一種用于偶聯(lián)兩個以上大分子的方法，該方法包括使包括權(quán)利要求 1中的式I的第一大分子與含有至少一個親核基團的第二大分子反應(yīng)。
22、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述大分子為透明質(zhì)酸，且 包括式XV的化合物為酰鹵、酸酐、或羧酸酰胺。
23、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子選自由低聚 核苷酸、核酸或核酸的代謝穩(wěn)定的類似物、多肽、糖蛋白、和糖脂所組成的 組中。
24、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子包括具有至 少一個SH基團的多糖。
25、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子包括具有至 少一個SH基團的糖胺聚糖。
26、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子選自由具有 至少一個SH基團的硫酸軟骨素、皮膚素、乙酰肝素、肝素、硫酸皮膚素、 硫酸乙酰肝素、褐藻酸、果膠、殼聚糖、羧甲基纖維素、和透明質(zhì)酸所組成 的組中。
27、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子包括式II，<formula>formula see original document page 6</formula>其中，Z為大分子的殘基，并且L選自由聚亞烷基、聚醚基、聚酰胺基、聚亞氨基、芳基、聚酯基、和 聚硫醚基所組成的組中。
28、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述大分子選自由低聚核苷 酸、核酸或核酸的代謝穩(wěn)定的類似物、多肽、糖蛋白、糖脂、多糖、蛋白質(zhì)、 和糖胺聚糖、或者藥學(xué)上可接受的化合物所組成的組中。
29、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，Z為透明質(zhì)酸的殘基，且L 為CH2CH2或CH2CH2CH2。
30、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，Z為明膠的殘基，且L為CH2CH2 或CH2CH2CH2。
31、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子包括式XX，Y-X畫R匿SH XX其中，Y為大分子的殘基；X為-O-、 -S-、 NH、或-NR"-;R"為氫或d.5烷基；并且R為取代的或未取代的C2或C3亞垸基。
32、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述大分子選自由低聚核苷酸、核酸或核酸的代謝穩(wěn)定的類似物、多肽、糖蛋白、糖脂、多糖、蛋白質(zhì)、 和合成的聚合物、糖胺聚糖、或者藥學(xué)上可接受的化合物所組成的組中。
33、 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述多糖選自由硫酸軟骨素、 皮膚素、乙酰肝素、肝素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、褐藻酸、果膠、殼 聚糖、透明質(zhì)酸、或羧甲基纖維素所組成的組中。
34、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述大分子選自由合成的聚 合物所組成的組中，所述合成的聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、聚乙二 醇、聚丙二醇、多元醇、聚胺、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的三嵌 段聚合物、聚乙二醇的星形聚合物、和聚乙二醇的樹枝狀聚合物。
35、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述大分子是蛋白質(zhì)，該蛋 白質(zhì)選自由自然存在的蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)、胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、化學(xué)修飾的 胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、遺傳工程的蛋白質(zhì)、以及胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)部分水解的衍生 物所組成的組中。
36、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，X為-O-、或-NH-。
37、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，R為CH2CH2、 CH2CH2CH2、 CH2CHR5、 CHR5CHR5、 C(R5)2CHR5、或C(R5)2C(R5)2，其中R5為烷基。
38、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，R為CH2CH2。
39、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，Y為透明質(zhì)酸的殘基，其中至少一個羥基被-CH2CH2SH取代。
40、 一種由權(quán)利要求21所述的方法制備的化合物。
41、 一種化合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽，該化合物、或其藥學(xué)上可接 受的鹽具有包括式VII的至少一個片段，其中，Y'為第一大分子的殘基；X'為-O-、 -S-、 -NH-、或-NR"-;R'為氫或烷基； R"為氫或C,.5烷基；并且 G'包括第二大分子的殘基。
42、 一種藥物組合物，該藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的化合物和一種 或多種如權(quán)利要求1所述的化合物。
43、 一種藥物組合物，該藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的化合物和一種 或多種如權(quán)利要求41所述的化合物。
44、 一種藥物組合物，該藥物組合物含有活的細胞和一種或多種如權(quán)利 要求l所述的化合物。
45、 一種藥物組合物，該藥物組合物含有活的細胞和一種或多種如權(quán)利 要求41所述的化合物。
46、 一種在需要改善傷口愈合的受試者體內(nèi)改善傷口愈合的方法，該方法包括使所述受試者的傷口與一種或多種如權(quán)利要求1所述的化合物接觸。
47、 一種在需要改善傷口愈合的受試者體內(nèi)改善傷口愈合的方法，該方 法包括使所述受試者的傷口與一種或多種如權(quán)利要求41所述的化合物接觸。
48、 一種向需要輸送藥學(xué)上可接受的化合物的患者輸送至少一種藥學(xué)上 可接受的化合物的方法，該方法包括使至少一個能接收該藥學(xué)上可接受的化 合物的組織與權(quán)利要求42所述的組合物接觸。
49、 權(quán)利要求1所述的化合物作為生長因子、抗炎劑、抗癌劑、止痛劑、 抗感染劑、或者抗細胞附著劑的用途。
50、 權(quán)利要求41所述的化合物作為生長因子、抗炎劑、抗癌劑、止痛 劑、抗感染劑、或者抗細胞附著劑的用途。
51、 一種含有一種或多種如權(quán)利要求1所述的化合物的基質(zhì)。
52、 一種含有一種或多種如權(quán)利要求41所述的化合物的基質(zhì)。
53、 根據(jù)權(quán)利要求51所述的基質(zhì)，其中，所述基質(zhì)包括層壓材料、凝 膠、珠子、海綿體、膜、網(wǎng)狀物、電紡的納米纖維、編織的網(wǎng)狀物、或者非 編織的網(wǎng)狀物。
54、 一種使多個細胞生長的方法，該方法包括(a)將母體細胞沉積在 權(quán)利要求51所述的基質(zhì)上，以及(b)對具有沉積的細胞的基質(zhì)進行培養(yǎng)以促進所述細胞的生長。
55、 一種使細胞生長的方法，該方法包括使所述細胞與一種或多種如權(quán) 利要求1所述的化合物接觸。
56、 一種使細胞生長的方法，該方法包括使所述細胞與一種或多種如權(quán) 利要求41所述的化合物接觸。
57、 根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述細胞包括干細胞。
58、 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述細胞包括干細胞。
59、 一種修復(fù)受試者體內(nèi)的受損傷的彈性組織的方法，該方法包括使所 述受損傷的組織與一種或多種如權(quán)利要求1所述的化合物接觸。
60、 一種修復(fù)受試者體內(nèi)的受損傷的彈性組織的方法，該方法包括使所 述受損傷的組織與一種或多種如權(quán)利要求41所述的化合物接觸。
61、 根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述組織包括聲帶、心血管 組織、肌肉、腱、韌帶、膀胱組織、尿道內(nèi)的組織、括約肌、或者胃腸道內(nèi) 的肌肉。
62、 一種生物人造材料，該生物人造材料含有由一種或多種如權(quán)利要求 1所述的化合物與含有至少兩個巰基的大分子反應(yīng)而得到的產(chǎn)物。
63、 一種生物人造材料，該生物人造材料含有由一種或多種如權(quán)利要求41所述的化合物與含有至少兩個巰基的大分子反應(yīng)而得到的產(chǎn)物。
64、 根據(jù)權(quán)利要求62所述的生物人造材料，其中，所述大分子包括具 有至少兩個巰基的類似彈性蛋白的肽。
65、 一種假器官裝置，該假器官裝置包括一種或多種如權(quán)利要求62所 述的生物人造材料。
全文摘要
本文描述了用親電子基團修飾的大分子及其制備和使用方法。為了制備“無交聯(lián)劑的”水凝膠，描述了HA的巰基反應(yīng)性的、親電子的衍生物的制備，以及能在溫和的條件下偶聯(lián)兩種以上分子(如大分子)的化合物和方法。具體公開了在大量存在于HA聚合物上的羥基上引入反應(yīng)性的溴乙酸酯官能團和碘乙酸酯官能團。所描述的“無交聯(lián)劑的”水凝膠具有眾多的應(yīng)用，包括但不限于藥物輸送、小分子輸送、傷口愈合、燒傷愈合、組織再生/組織工程、細胞培養(yǎng)和生物人造材料。
文檔編號C08B37/08GK101511876SQ200780032676
公開日2009年8月19日 申請日期2007年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月11日
發(fā)明者G·D·普雷斯特維奇, M·謝爾班 申請人:猶他大學(xué)研究基金會