專利名稱：萃取法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，具體地說涉及從肝素鈉中分離出多硫酸軟骨素的方法。

背景技術(shù)：
肝素鈉是從豬小腸粘膜中提取的一種生化藥品，是手術(shù)中不可替代的、挽救生命的、市場不能斷檔的藥物。自二十世紀四十年代用于臨床以來，其應用范圍不斷擴大，尤其是二十世紀九十年代以來，該產(chǎn)品臨床主要用于防止血栓形成，治療心血管病、血液病、尿毒癥等。西方國家已開始研究肝素鈉對癌癥的防治作用，其新用途不斷增加。
進入二十世紀七十年代以來，我國肝素鈉生產(chǎn)工藝不斷改進，成為世界肝素鈉產(chǎn)量最大的國家。國際市場的肝素鈉產(chǎn)品有70％以上來自中國。肝素鈉精品生產(chǎn)已由高錳酸鉀氧化法發(fā)展到雙氧水氧化法，結(jié)合醇洗分離法，將大量的雜質(zhì)用乙醇帶走。2008年2月11日，美國因注射肝素鈉出現(xiàn)4例死亡，350多例不良反應，成為轟動世界的“肝素鈉事件”。經(jīng)過專家論證，上述死亡和不良反應是由于肝素鈉中含有多硫酸軟骨素所致。多硫酸軟骨素是類肝素的一種，其性質(zhì)與肝素鈉基本相似，經(jīng)過檢測與肝素鈉的區(qū)別是1、肝素鈉是右旋結(jié)構(gòu)；而多硫酸軟骨素是左旋結(jié)構(gòu)；2、絕對分子量多硫酸軟骨素經(jīng)檢測比肝素鈉的分子量大；3、毛細管電泳其峰值比肝素鈉先出現(xiàn)。
我國政府十分重視并關(guān)注事態(tài)發(fā)展，4月7日，國家藥監(jiān)局在北京召開“關(guān)于加強肝素鈉生產(chǎn)質(zhì)量管理座談會”全國肝素鈉原料藥和制劑生產(chǎn)企業(yè)負責人會議，會上公布了國際專家和美國FDA關(guān)于肝素鈉中多硫酸軟骨素是人為加入的的且不能分離的認定，并要求凡是進入市場的含有多硫酸軟骨素的肝素鈉一律召回。4月17至18日和4月24至25日在美國又召開了肝素鈉國際研討會，5月4日，美國FDA官方網(wǎng)站公布，致人死亡的主要原因就是有多硫酸軟骨素，5月7日，中央電視臺報道美國已出現(xiàn)80多例死亡，并且至今還沒有報道有關(guān)從肝素鈉中將多硫酸軟骨素分離的技術(shù)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種萃取法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素的方法，是為了攻克國內(nèi)外專家關(guān)于肝素鈉中的多硫酸軟骨素不能分離的定論，利用多硫酸軟骨素的性質(zhì)，使其溶解在丙酮中，然后將帶有多硫酸軟骨素的丙酮去掉，留底部沉淀的肝素鈉，從而實現(xiàn)用萃取法將肝素鈉與多硫酸軟骨素徹底分離。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn) 一種萃取法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素的方法，其特征在于采用丙酮萃取法將肝素鈉中的多硫酸軟骨素去除。
在發(fā)明的技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征所述丙酮萃取法包括如下步驟 一、提取 1、粗品溶解 開啟水閥，加入一定量飲用水，再將肝素鈉粗品加入到反應罐中，邊攪邊加，按原料與飲用水1∶(6-7)比例溶解，攪拌5-10小時后，用攪拌棒試底部是否全部溶解； 2、酶解 將上一步溶解液，先用鹽酸溶液調(diào)PH7.0-8.0，升溫至50-55℃之間時加入胃蛋白酶5-10g/億單位，再加入10-20g/億單位胰酶，50-55℃保溫2-4小時； 3、急升溫 將上一步酶解液在30～40分鐘內(nèi)升溫至85-90℃，靜止10-30分鐘，開攪拌，通入循環(huán)水降溫，待溫度降至50-55℃時，用2-6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH10.0-12.0，靜止分層20-30小時； 4、底部沉淀的雜質(zhì)離心 虹吸上清，用40-100目濾袋過濾，過濾后的溶液分為上清液和下層沉淀，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機離心，離心后留上層離心液； 二、精制 1、第一次沉淀 待上述上清液和離心液溫度降至20-30℃，加入20-30g/L氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸將濾液調(diào)PH10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時； 2、第一次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時； 3、第二次沉淀溶液加入20-30g/L氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0-7.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時； 4、第二次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時； 5、第三次沉淀溶液加入20-30g/L氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時； 6、第三次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時； 7、第四次沉淀上一步溶液若有沉淀物析出，則用離心機離心，沒有析出則直接加入20-30g/L氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH6.0-7.0，將溶液放冷庫中冷凍至-10℃--5℃，邊攪邊加-10℃--5℃的丙酮，使得丙酮占溶液的質(zhì)量百分含量為40-45％，-5℃-0℃保溫24-30小時，然后將廢丙酮棄去，多硫酸軟骨素被丙酮帶走，留底部沉淀物用純化水溶解，溶液再加入20-30g/L氯化鈉，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0-7.0，邊攪邊加乙醇，使乙醇濃度在20℃時為45-50％，沉淀10-12小時； 8、將沉淀物用純化水按2-5L/億單位溶解后，用孔徑0.22-0.3微米濾膜板框機微濾，用乙醇沉淀，使乙醇濃度達75-80％，再加入23-26％的氯化鈉溶液，每1升溶液加6-10ml氯化鈉溶液，靜止沉淀10-12小時； 9、將上層乙醇棄去，加入無水乙醇脫水，邊攪邊加，使乙醇濃度為97-99％，靜止24-30小時，棄去上層乙醇，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通過管道和過濾瓶把剩余乙醇抽干，待干燥； 10、將抽干的產(chǎn)品均勻放置在不銹鋼盤中，放在真空干燥箱中抽真空，用循環(huán)水加溫，溫度35-60℃，烘干70-80小時； 11、包裝將產(chǎn)品取出，稱重，使每包裝袋5kg，用封口機封口，放在鋁桶中待驗。
在發(fā)明的技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征第四次沉淀后的溶液進行QA取樣化驗，測吸光度260nm＜0.1；400nm＜0.02；若不合格，繼續(xù)重復上面過程，若合格移交下一工序。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是 本發(fā)明的肝素鈉精品生產(chǎn)采用雙氧水氧化法，結(jié)合醇洗分離法，將大量的雜質(zhì)用乙醇帶走，再用丙酮萃取法將肝素鈉中的多硫酸軟骨素去除，其精品收率達到83％以上，活性效價在180usp/mg以上，折合WHO國際標準在200iu/mg，其質(zhì)量標準符合中國藥典、美國藥典、英國藥典及西歐藥典所規(guī)定的各項指標。
肝素鈉與多硫酸軟骨素成功的徹底分離，為世界生物醫(yī)藥的發(fā)展作出貢獻；促進了國家的生豬生產(chǎn)；本產(chǎn)品每年出口在10個億以上，為國家出口創(chuàng)匯作出貢獻。又是一個支持三農(nóng)、變廢為寶，環(huán)境保護的好項目。



圖1是分離前含有多硫酸軟骨素的肝素鈉圖譜； 圖2是分離后純肝素鈉的圖譜； 圖3是純多硫酸軟骨素的圖譜。

具體實施例方式 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1 一、提取 1、粗品溶解 開啟水閥，加入900L飲用水，再將150億單位肝素鈉粗品加入到反應罐中，邊攪邊加，攪拌6小時后，用攪拌棒試底部是否全部溶解； 2、酶解 將上一步溶解液，先用鹽酸溶液調(diào)PH7.5，升溫至53℃時加入胃蛋白酶1500g，再加入3000g胰酶，53℃保溫3小時； 3、急升溫 將上一步酶解液在35分鐘內(nèi)升溫至88℃，靜止15分鐘，開攪拌，通入循環(huán)水降溫，待溫度降至50℃時，用6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH11.0，靜止分層24小時； 4、底部沉淀的雜質(zhì)離心 虹吸上清，用80目濾袋過濾，過濾后的溶液分為上清液和下層沉淀，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機離心，離心后留上層離心液； 二、精制 1、第一次沉淀 待上述上清液和離心液溫度降至25℃，加入22.5kg氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸將濾液調(diào)PH10.5，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液920L，沉淀10小時； 2、第一次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物即產(chǎn)品用640L純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH11.0，然后加入20L雙氧水，氧化10小時； 3、第二次沉淀溶液加入12.8kg氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液640L，沉淀10小時； 4、第二次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用640L純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH11.0，然后加入20L雙氧水，氧化10小時； 5、第三次沉淀溶液加入12.8kg氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH6.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液640L，沉淀10小時； 6、第三次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用640L純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH11.0，然后加入21L雙氧水，氧化10小時； 7、第四次沉淀上一步溶液若有沉淀物析出，則用離心機離心，沒有析出則直接加入12.8kg氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH6.0，將溶液放冷庫中冷凍至-6℃，邊攪邊加-10℃的丙酮600L，-3℃保溫24小時，然后將廢丙酮棄去，多硫酸軟骨素被丙酮帶走，留底部沉淀物用純化水溶解，溶液再加入12.8kg氯化鈉，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0，邊攪邊加乙醇640L，沉淀10小時； 8、將沉淀物用300L純化水溶解后，用孔徑0.3微米濾膜板框機微濾，用840L乙醇沉淀，使乙醇濃度達75-80％，再加入26％的氯化鈉溶液11L，靜止沉淀10小時； 9、將上層乙醇棄去，加入500L無水乙醇脫水，邊攪邊加，使乙醇濃度為97-99％，靜止24小時，棄去上層乙醇，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通過管道和過濾瓶把剩余乙醇抽干，待干燥； 10、將抽干的產(chǎn)品均勻放置在不銹鋼盤中，放在真空干燥箱中抽真空，用循環(huán)水加溫，溫度50℃，烘干72小時； 11、包裝將產(chǎn)品取出，稱重，使每包裝袋5Kg，用封口機封口，放在鋁桶中待驗。
如圖1所示，分離前含有多硫酸軟骨素的肝素鈉圖譜中，多硫酸軟骨素的毛細管電泳峰值比肝素鈉先出現(xiàn)，而且比較高。
圖1與圖2、圖3相比，即分離前含有多硫酸軟骨素的肝素鈉圖譜與分離后純肝素鈉的圖譜以及純多硫酸軟骨素的圖譜相比，圖2和圖3中的圖譜中沒有其它峰值，說明含量比較純。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
權(quán)利要求
1、一種萃取法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素的方法，其特征在于采用丙酮萃取法將肝素鈉中的多硫酸軟骨素去除。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的萃取法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素的方法，其特征在于所述丙酮萃取法包括如下步驟
一、提取
1、粗品溶解
開啟水閥，加入一定量飲用水，再將肝素鈉粗品加入到反應罐中，邊攪邊加，按原料與飲用水1∶(6-7)比例溶解，攪拌5-10小時后，用攪拌棒試底部是否全部溶解；
2、酶解
將上一步溶解液，先用鹽酸溶液調(diào)PH7.0-8.0，升溫至50-55℃之間時加入胃蛋白酶5-10g/億單位，再加入10-20g/億單位胰酶，50-55℃保溫2-4小時；
3、急升溫
將上一步酶解液在30～40分鐘內(nèi)升溫至85-90℃，靜止10-30分鐘，開攪拌，通入循環(huán)水降溫，待溫度降至50-55℃時，用2-6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH10.0-12.0，靜止分層20-30小時；
4、底部沉淀的雜質(zhì)離心
虹吸上清，用40-100目濾袋過濾，過濾后的溶液分為上清液和下層沉淀，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機離心，離心后留上層離心液；
二、精制
1、第一次沉淀
待上述上清液和離心液溫度降至20-30℃，加入20-30g/L氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸將濾液調(diào)PH10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時；
2、第一次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時；
3、第二次沉淀溶液加入20-30g/L氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0-7.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時；
4、第二次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時；
5、第三次沉淀溶液加入20-30g/L氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時；
6、第三次氧化棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時；
7、第四次沉淀上一步溶液若有沉淀物析出，則用離心機離心，沒有析出則直接加入20-30g/L氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH6.0-7.0，將溶液放冷庫中冷凍至-10℃--5℃，邊攪邊加-10℃--5℃的丙酮，使得丙酮占溶液的質(zhì)量百分含量為40-45％，-5℃-0℃保溫24-30小時，然后將廢丙酮棄去，多硫酸軟骨素被丙酮帶走，留底部沉淀物用純化水溶解，溶液再加入20-30g/L氯化鈉，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0-7.0，邊攪邊加乙醇，使乙醇濃度在20℃時為45-50％，沉淀10-12小時；
8、將沉淀物用純化水按2-5L/億單位溶解后，用孔徑0.22-0.3微米濾膜板框機微濾，用乙醇沉淀，使乙醇濃度達75-80％，再加入23-26％的氯化鈉溶液，每1升溶液加6-10ml氯化鈉溶液，靜止沉淀10-12小時；
9、將上層乙醇棄去，加入無水乙醇脫水，邊攪邊加，使乙醇濃度為97-99％，靜止24-30小時，棄去上層乙醇，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通過管道和過濾瓶把剩余乙醇抽干，待干燥；
10、將抽干的產(chǎn)品均勻放置在不銹鋼盤中，放在真空干燥箱中抽真空，用循環(huán)水加溫，溫度35-60℃，烘干70-80小時；
11、包裝將產(chǎn)品取出，稱重，使每包裝袋5kg，用封口機封口，放在鋁桶中待驗。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的萃取法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素的方法，其特征在于第四次沉淀后的溶液進行QA取樣化驗，測吸光度260nm＜0.1；400nm＜0.02；若不合格，繼續(xù)重復上面過程，若合格移交下一工序。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種萃取法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素的方法，攻克了國內(nèi)外專家關(guān)于肝素鈉中的多硫酸軟骨素不能分離的定論，技術(shù)方案是采用丙酮萃取法將肝素鈉中的多硫酸軟骨素去除，通過粗品溶解、酶解、急升溫、雜質(zhì)離心以及多次沉淀、氧化的精制步驟來實現(xiàn)肝素鈉與多硫酸軟骨素徹底分離，肝素鈉精品收率達到83％以上，活性效價在180usp/mg以上，折合WHO國際標準在200iu/mg以上，其質(zhì)量標準符合中國藥典、美國藥典、英國藥典及西歐藥典所規(guī)定的各項指標。
文檔編號C08B37/10GK101575385SQ200810015869
公開日2009年11月11日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者曲士業(yè), 劉乃山, 遲培升 申請人:青島九龍生物醫(yī)藥有限公司