專利名稱：：一種超低分子肝素鈉(鈣)的生產工藝的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種超低分子肝素(ultralowmolecularweighth印arin、ultraL麗H)的生產方法，具體地說涉及一種超低分子肝素鈉和超低分子肝素鈣的生產工藝，屬于生物制藥領域。
背景技術：
：肝素是一種黏多糖類物質，廣泛存在于腸黏膜和肺等動物器官和組織中，經去脂肪和去蛋白等工藝處理后成為藥用肝素鈉。它具有抗凝血、調血脂等功能，已經廣泛應用于心血管疾病防治領域，然而肝素在臨床上出血副作用較嚴重，臨床應用受到限制。低分子肝素(lowmolecularweighth印arin,LMWH)是20世紀80年代開發(fā)出來的抗凝藥，它是由普通肝素(亦稱未分級肝素，unfractionatedh印arin，UFH)裂解而得。由于LMWH較UFH在低水平抗凝作用時能產生良好而持久的抗血栓作用，副作用較小，可用于防治深部靜脈血栓、肺栓塞、播散性血管內凝血等疾病，因此低分子肝素成為心血管藥物的研究熱點。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是，針對肝素在臨床上出血副作用較嚴重，臨床應用受到限制的情況，提出了在低水平抗凝作用時有更好更安全的抗血栓作用的肝素衍生品，一種超低分子肝素鈉(鈣)的生產工藝。本發(fā)明的技術方案是這樣實現的一種超低分子肝素鈉(鈣)的生產工藝，實現該工藝方法的主要特征包括下列步驟(1)取肝素鈉用水溶解后制成4-8%(w/v)的溶液，分批多次加入亞硝酸鈉溶液，在0。C10。C條件下裂解524小時，裂解過程中監(jiān)控亞硝酸鈉的濃度，添加亞硝酸鈉使其濃度一直維持在0.08%(w/v)以下，并控制亞硝酸鈉總加入量0.2%1.5%(w/v)。(2)用氫氧化鈉或氫氧化鈣或氨水等堿調(1)裂解液使pH值至7.59.0，加入1%-8%(w/v)的氯化鈉，然后通過強堿性陰離子交換柱吸附，去除雜質。強堿性陰離子交換柱可以是D201、D202、717、703、7170等強堿性陰離子交換樹脂填充柱。(3)通過1%—10%氯化鈉(鈣)溶液洗滌，1%10%氯化鈉(鈣)溶液用量為(2)裂解液的20%(v/v)，然后用10%30%氯化鈉(鈣)溶液洗脫得到洗脫液為超低分子肝素鈉(鈣)溶液，10%30%氯化鈉(鈣)溶液用量為(2)裂解液的11.5倍。此步使用氯化鈣可以完成轉鈣，得到超低分子肝素鈣。(4)將(3)洗脫液通過5000D的超濾膜，去除絕大部分分子量大于6000D的超低分子肝素鈉(鈣)，得超濾液;然后用超濾液的1.53倍乙醇沉淀，去除絕大部分分子量小于1500D的超低分子肝素鈉(鈣)，得沉淀物。(5)將(4)沉淀物經過脫鹽、脫水后，室溫至80。C條件下真空干燥得到超低分子肝素鈉(鈣)粗品。(6)將(5)超低分子肝素鈉(鈣)粗品溶解后再次沉淀，重復(5)后得到超低分子肝素鈉(鈣)。(7)注射用水溶解(6)超低分子肝素鈉(鈣)，經活性炭脫色，粗濾，O.22u精濾后的溶液冷凍干燥后制得成品超低分子肝素鈉(鈣)。本發(fā)明的理論依據是-肝素催化ATIII抑制FIIa時需同時結合兩者，故肝素分子鏈應長于18個糖單位，而催化ATIII抑制FXa和FIIa時，只需結合ATIII，因此短的肝素鏈即可發(fā)揮作用，LMWH就是基于該理論被開發(fā)出來的。LMWH較UFH在低水平抗凝作用時能產生良好而持久的抗血栓作用，臨床安全性較好。也基于該理論和LiWH的研究思路，我們研究開發(fā)這一種超低分子肝素，以求得到在低水平抗凝作用時有更好更安全的抗血栓作用的肝素衍生品。本發(fā)明的效果作用是1、通過嚴格控制亞硝酸鈉的濃度和總量，選擇合適超濾膜的超濾技術和沉淀技術，得到分子量分布80%在15005000D、重均分子量23002900D、抗Xa因子效價在100145IU/mg，抗IIa因子效價小于15IU/mg的超低分子肝素，比普通低分子肝素更具安全性和有效性；2、通過在上述純化時選用不同的洗滌劑和洗脫劑氯化鈉或氯化鈣可相應得到超低分子肝素鈉或超低分子肝素鈣；3、本發(fā)明工藝方法所生產的產品，其特征是超低分子肝素鈉(鈣)重均分子量23002900D，分子量在15005000D的比例達到80%;抗Xa因子效價在100145IU/mg，抗IIa因子效價小于15IU/mg。具體實施例方式實施例一100g未分級肝素(抗IIa因子效價143IU/mg，硫酸皮膚素含量0.7%)，溶解在2000ml注射用水中，冷卻到3。C，用醋酸溶液把PH調到3.0，加150mlP/。(v/v)亞硝酸鈉溶液，用醋酸溶液調PH到2.7，裂解經過6小時候后，加入150mll%(v/v)亞硝酸鈉溶液，裂解經過12小時候后，加入100mll%(v/v)亞硝酸鈉溶液，裂解經過18小時候后，用氫氧化鈉調以上裂解液pH值至7.5終止裂解。裂解液中加入2°/。的氯化鈉，溶解后，溶液通過陰離子交換柱，循環(huán)吸附2小時。4000ml2。/。的氯化鈉溶液洗滌交換柱，用1000ml20%的氯化鈉溶液洗脫得到超低分子肝素鈉的溶液。溶液通過5000D的超濾膜后，用2.0倍乙醇沉淀，沉淀物分別用85%乙醇洗滌兩次脫鹽，再用無水乙醇洗滌兩次脫水后，真空干燥得到超低分子肝素鈉粗品69.34g。取以上粗品50g溶解在600ml注射用水中，用2.0倍乙醇沉淀，沉淀物分別用85%乙醇洗漆兩次脫鹽，再用無水乙醇洗滌兩次脫水后，真空干燥得到44.28g產品，用450ml注射用水溶解，經活性炭脫色和兩次精密過濾后，冷凍干燥后制得成品超低分子肝素鈉43.18g。產品質量指標見下表。實施例二100g未分級肝素(抗IIa因子效價143IU/mg，硫酸皮膚素含量0.7%)，溶解于2000ml注射用水，冷卻到5"C，用醋酸溶液調PH到3.0，加入160mll%(v/v)亞硝酸鈉溶液，用醋酸溶液把PH調到2.5，裂解經過7小時候后，加入160mll。Z。(v/v)亞硝酸鈉溶液，裂解經過14小時候后，加入120mll%(v/v)亞硝酸鈉溶液，裂解經過20小時候后，用氫氧化鈉調以上裂解液pH值至8.0終止裂解。裂解液中加入2%的氯化鈉，溶解后，溶液通過陰離子交換柱，循環(huán)吸附2小時。6000m11.8%的氯化鈣溶液洗滌交換柱，用1000ml24%的氯化鈣溶液洗脫得到超低分子肝素鈣的溶液。溶液通過5000D的超濾膜后，用2.0倍乙醇沉淀，沉淀物分別用85%乙醇洗滌兩次脫鹽，再用無水乙醇洗滌兩次脫水后，真空干燥得到超低分子肝素鈣粗品71,35g。取以上粗品50g溶解在600ml注射用水中，用2.0倍乙醇沉淀，沉淀物分別用85%乙醇洗滌兩次脫鹽，再用無水乙醇洗滌兩次脫水后，真空干燥得到43.23g產品，用450ml注射用水溶解，經活性炭脫色和兩次精密過濾后，冷凍干燥后制得成品超低分子肝素鈣41.97g。產品質量指標見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1、一種超低分子肝素鈉(鈣)的制備方法，其特征是包括下列步驟A、分多次添加亞硝酸鈉在低溫條件下長時間裂解，得到裂解液。B、用氫氧化鈉調以上裂解液pH值至7.5～9.0，加入1％～8％的氯化鈉，然后通過陰離子交換柱吸附。C、通過1％～10％的氯化鈉(鈣)溶液洗滌后，用10％～30％的氯化鈉(鈣)溶液洗脫得到超低分子肝素鈉(鈣)的溶液。D、上述溶液通過5000D的超濾膜后，用1.5～3倍乙醇得沉淀物。E、上沉淀物經過脫鹽、脫水后真空干燥得到超低分子肝素鈉(鈣)粗品。F、以上超低分子肝素鈉(鈣)粗品溶解后再次沉淀，重復(5)后得到超低分子肝素鈉(鈣)。G、注射用水把以上超低分子肝素鈉(鈣)溶解，經活性炭脫色和兩次過濾后的溶液冷凍干燥后制得成品超低分子肝素鈉(鈣)。2、根據權利要求1所述超低分子肝素鈉(鈣)的制備方法，其特征是步驟A所述分多次添加亞硝酸鈉，所述亞硝酸鈉濃度一直維持在0.08%以下，總亞硝酸鈉加入量0.15%1.5%，溫度在0。C10。C，反應時間在524小時。3、根據權利要求1所述超低分子肝素鈉(鈣)的制備方法，其特征是步驟B所述使用陰離子交換的方法去除雜質，陰離子交換的方法還可以完成轉鈣，所述陰離子交換柱所填充為強堿性陰離子樹脂。4、根據權利要求1所述超低分子肝素鈉(鈣)的制備方法，其特征是步驟D所述用超濾的方法去除硫酸皮膚素和較大分子肝素。5、根據權利要求1所述超低分子肝素鈉(鈣)的制備方法，其特征是所述本制備方法制得的超低分子肝素鈉(轉)的產品為重均分子量23002900D，分子量在15005000D的比例達到80%;抗Xa因子效價在100145IU/mg，抗IIa因子效價小于15IU/mg。全文摘要本發(fā)明針對肝素在臨床上出血副作用較嚴重，臨床應用受到限制的情況，向人們公開了一種超低分子肝素鈉(鈣)的生產工藝；本發(fā)明工藝步驟包括取肝素鈉溶液，加入亞硝酸鈉溶液，進行裂解；堿調裂解液，再用陰離子交換柱吸附雜質；洗滌，得到超低分子肝素鈣；用超濾膜過濾，再用乙醇得沉淀物；經脫鹽、脫水后，再沉淀，經冷凍干燥后制得成品超低分子肝素鈉(鈣)；本發(fā)明工藝方法所生產的產品具有在低水平抗凝作用時有更好更安全的抗血栓作用，可廣泛用于防治深部靜脈血栓、肺栓塞、播散性血管內凝血等疾病。文檔編號C08B37/00GK101519459SQ20081002076公開日2009年9月2日申請日期2008年2月26日優(yōu)先權日2008年2月26日發(fā)明者激陳申請人:蘇州法思特生物制藥科技有限公司