專利名稱：注射用香菇多糖的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)，更具體涉及多糖分離純化。
背景技術(shù)：
香菇多糖(lentinan)系傘燕科真菌香燕子實(shí)體中提取純化的一種單一組分多糖(I)，是 --種免疫調(diào)節(jié)型抗腫瘤藥物，它通過增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫防御反應(yīng)而產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的抗 腫瘤效果，發(fā)揮間接的抗腫瘤作用，對正常細(xì)胞不產(chǎn)生毒副作用，因此香菇多糖是國際公 認(rèn)安全有效的抗腫瘤藥物(參考發(fā)明專利ZL200410086152.4)。臨床上香菇多糖主要用于胃 癌、肺癌、腸癌及癌性腹水等惡性腫瘤的治療，另外香菇多糖對提高肝炎及艾滋病病人的 免疫功能均有較好作用。
1985年香燕多糖最先在日本作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床，我國1988年開始進(jìn)口日本味 之素的香菇多糖。目前國內(nèi)市場上銷售的主要是南京振中生物工程有限公司生產(chǎn)的注射用 香菇多糖(ZL專利號00112407.2)，其原料藥生產(chǎn)工藝系參考文獻(xiàn)"Chihara.G., Maeda. Y.,, Hamuro.G" et al. Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes(berk.) sing. Nature, 1965,222,687-688"，生產(chǎn)過程中要用到十六烷基三甲基銨、氯仿、 正丁醇、醋酸等大量的有機(jī)試劑，工藝流程十分復(fù)雜，勞動(dòng)強(qiáng)度大，環(huán)境污染大，而且香 菇多糖的得率非常低，僅為0.015%，成本相當(dāng)高，lmg香菇多糖的價(jià)格達(dá)200元以上，極 大地限制了香燕多糖的臨床應(yīng)用。故尋找一種工藝簡單、產(chǎn)率高、成本低廉的香菇多糖提 取純化方法是更好地發(fā)揮香薛多糖制劑臨床作用的首要任務(wù)，有利于減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)， 將給廣大癌癥患者帶來福音，也有利于節(jié)約資源和保護(hù)環(huán)境，將大大地造福于人類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供注射用香燕多糖的一種新的分離純化方法，使其具有工藝簡單、產(chǎn) 率高、成本低廉等特點(diǎn)。
'實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的注射用香菇多糖分離純化方法系采用水提醇沉 法結(jié)合三氯醋酸法去蛋白得到香燕多糖粗品，香菇多糖粗品經(jīng)過氧化氫脫色得脫色多糖， 脫色多糖再經(jīng)凝膠色譜法得注射用香菇多糖。
本發(fā)明提供的注射用香菇多糖的分離純化方法包括以下步驟 a.取新鮮香菇或干香菇，經(jīng)粉粹或不經(jīng)粉粹；b.采用熱水提取，濃縮； C.乙醇沉淀分離粗多糖；
d. 三氯醋酸去蛋白；
e. 乙醇沉淀；
f. 過氧化氫脫色；
g. 乙醇沉淀；
h. 凝膠色譜法除雜質(zhì)多糖和小分子；
i. 冷凍干燥。
上述步驟中所述的采用熱水提取，濃縮的具體方法是加入相當(dāng)于香菇干重8倍體積水， 沸水提取2次，濃縮至相當(dāng)于香菇干重的2倍體積，得濃縮液；所述的乙醇沉淀分離粗多 糖的具體方法是向濃縮液中加入乙醇，使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，分離沉淀，得粗多 糖；所述的三氯醋酸去蛋白的具體方法是用水溶解粗多糖得粗多糖溶液，加入粗多糖溶 液體積1~2倍、濃度為5%三氯醋酸溶液，得去蛋白溶液；所述的向去蛋白溶液中加入乙醇， 使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，分離沉淀，得去蛋白多糖；所述的過氧化氫脫色的具體方法是
去蛋白多糖以水溶解，滴加30%過氧化氫溶液，調(diào)終濃度為5~15%，過氧化氫脫色中水浴
溫度為40 60'C水浴,得脫色溶液；所述的過氧化氫脫色后的乙醇沉淀的具體方法是向脫 色溶液中加入乙醇，使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，分離沉淀，得脫色多糖；所述的凝膠色譜
法除雜質(zhì)多糖和小分子的具體方法是取脫色多糖，以交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-150 或S印hadexG-200為固定相，0.01~0.05M氯化鈉或0.01~0.05M硫酸鈉為流動(dòng)相，進(jìn)行 凝膠色譜分離，收集香菇多糖組分溶液；除雜質(zhì)多糖和小分子；所述的冷凍干燥的具體方 法是將收集的香菇多糖組分溶液置冷凍千燥機(jī)內(nèi)凍干，得白色粉末狀注射用香菇多糖。
本發(fā)明得到的注射用香菇多糖為白色粉末，含量為98 102%，重均分子量Mw為400 000 800 000Da(見圖2)，得率為0.67% (以終產(chǎn)品與干香燕質(zhì)量比計(jì)算)；傅立葉紅外光 譜顯示香菇多糖的特征吸收，主要特征為在3350~3300cm—'處為糖環(huán)上O-H的伸縮振動(dòng)、 在2925-2915cm—'處為糖環(huán)上C-H的伸縮振動(dòng)、在1100~1000cm—1處為糖環(huán)上C-0的伸 縮振動(dòng)、在898 884cm—'處為p吡喃糖的C,-H彎曲振動(dòng)，見圖1。以上香菇多糖特征均符 合國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-320 (X-263) -2004Z。
注射用香菇多糖的含量測定方法為:精密量取香菇多糖對照品和供試品各25mg，分別 加0.5mol/L氫氧化鈉溶液溶解配成25u g ml-1的對照品溶液和供試品溶液;精密量取對 照品溶液和供試品溶液2.5ml,分別沿管壁緩緩加至已精密加入硫酸蒽酮溶液5ml的試管中，使分層(以上操作均在冰浴中進(jìn)行)，待劇烈振搖混勻后，立即置沸水浴中加熱，自振搖起
計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)6分鐘，將試管移至冰浴中冷卻后，放至室溫。自振搖起，應(yīng)在20 40分 鐘內(nèi)，以水為空白，照分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄IV)在625nm的波長處 測定吸收度，計(jì)算即得。
注射用香菇多糖的重均分子量測定方法為
色譜條件PL aquagel MIXED凝膠色譜柱(300mmx7.5 mm);流動(dòng)相為0.05M的NaCI 溶液，pH7.0;流速0.5mL/min;柱溫30'C;進(jìn)樣量25jiL;標(biāo)樣為己知分子量DEXTRAN(分 子量1 000， 100 000， 40 000， 70 000， 500 000， 2 000 000 F，uka公司)；檢測器為示差折 光檢測器。
測定方法將樣品和已知分子量的標(biāo)樣葡聚糖，分別用流動(dòng)相溶解制成每1mL中約含 10mg的溶液，分別注入25^L標(biāo)準(zhǔn)品溶液，記錄示差色譜圖，用WATERS GPC軟件作標(biāo) 準(zhǔn)曲線，計(jì)算重均分子量及其分布。
本發(fā)明提供的香菇多糖分離純化方法與現(xiàn)有的香菇多糖生產(chǎn)工藝相比，具有產(chǎn)率高、污 染小、成本低的優(yōu)點(diǎn)，適合于注射用香燕多糖的工業(yè)化生產(chǎn)(見表1)。
表l香菇多糖的工藝比較工藝所用主要有機(jī)試劑產(chǎn)率 成本(每克香菇多糖)
原工藝乙醇、醋酸、十六垸基三0.15% 8000元
甲基溴化銨、三氯甲烷、
正丁醇
本工藝乙醇、三氯醋酸0.67% 40元


圖1為本發(fā)明得到的注射用香菇多糖的傅立葉紅外光譜圖； 圖2為注射用香菇多糖的高效液相凝膠色譜洗脫圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施實(shí)例1
稱取1000g香恭子實(shí)體，剪碎,沸水煎煮1,過濾；藥渣加水再煮沸1h，過濾；合并2次濾液， 濃縮；向濃縮液中緩緩加入無水乙醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，靜置 過夜后抽濾，沉淀置低于60"C干燥，得粗品；力口0.5M氫氧化鈉使粗品溶解，向溶液中加入 1~2倍體積5%三氯醋酸，攪拌，放置過夜，抽濾；濾液調(diào)pH值至6 8，加入無水乙醇/95% 乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上,放置過夜,抽濾，沉淀置低于60'C干燥，得香菇
6粗多糖50g。
取香菇粗多糖25.0g，加水溶解成深棕褐色溶液；4(TC水浴，滴加30%過氧化氫溶液， 調(diào)終濃度為5~15%，待溶液顏色變?yōu)榈S色后停止水浴；向溶液中緩慢加入無水乙醇/95% 乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，立即出現(xiàn)乳白色沉淀，靜置過夜；傾去上清， 減壓抽濾，沉淀以乙醇/乙醚/丙酮洗滌數(shù)次，直至濾液無色，得灰白色沉淀；沉淀置低于60 'C干燥，得白色塊狀物9.6g。 '
取脫色多糖100mg，力卩0.01-0.05M氯化鈉溶解，多糖濃度^ 10mg/ml，溶液為乳白色 溶液；凝膠色譜洗脫條件為填料Sephadex G-150，色譜柱為2.5cm (直徑)X40cm (高 度)，凝膠床高35cm;洗脫液為0.01 0.05M氯化鈉，流速0.4ml/min;上樣量《50ml;收 集洗脫體積為30 60ml的組分，合并溶液，置冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，得白色絮狀物30 40mg。
實(shí)施實(shí)例2
稱取1000g香菇子實(shí)體，粉碎，沸水煎煮lh，過濾；藥渣加水再煮沸l(wèi)h，過濾；合并2
次濾液，濃縮；向濃縮液中緩緩加入無水乙醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以 上，靜置過夜后抽濾，沉淀置低于6(TC干燥，得粗品；加0.5M氫氧化鈉使粗品溶解，向溶 液中加入1 2倍體積5%三氯醋酸，攪拌，'放置過夜，抽濾；濾液調(diào)pH值至6 8，加入無水乙 醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，放置過夜，抽濾，沉淀置低于60'C干燥， 得香菇粗多糖50g。
取香菇粗多糖25.0g，加水溶解成深棕褐色溶液；5(TC水浴，滴加30%過氧化氫溶液， 調(diào)終濃度為5 15%，待溶液顏色變?yōu)榈S色后停止水浴；向溶液中緩慢加入無水乙醇/95% 乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，立即出現(xiàn)乳白色沉淀，靜置過夜；傾去上清， 減壓抽濾，沉淀以乙醇/乙醚/丙酮洗滌數(shù)次，直至濾液無色，得灰白色沉淀；沉淀置低于60 'C干燥，得白色塊狀物9.6g。
取脫色多糖100mg，加0.01-0.05M氯化鈉溶解，多糖濃度》10mg/ml，溶液為乳白色 溶液；凝膠色譜洗脫條件為填料Sephadex G-l50，色譜柱為2.5cm (直徑)X40cm (高 度)，凝膠床高35cm;洗脫液為0.01~0.05M氯化鈉，流速0.4ml/min;上樣量《50ml;收 集洗脫體積為30 60ml的組分，合并溶液，置冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，得白色絮狀物30 40mg。
實(shí)施實(shí)例3
稱取1000g香范子實(shí)體，粉碎，沸水煎煮lh，過濾；藥渣加水再煮沸l(wèi)h，過濾；合并2
次濾液，濃縮；向濃縮液中緩緩加入無水乙醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以 上，靜置過夜后抽濾，沉淀置低于6(TC干燥，得粗品；加0.5M氫氧化鈉使粗品溶解，向溶液中加入1 2倍體積5%三氯醋酸，攪拌，放置過夜，抽濾；濾液調(diào)pH值至6 8，加入無水乙 醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，放置過夜，抽濾，沉淀置低于6(TC干燥， 得香菇粗多糖50g。
取香燕粗多糖25.0g，加水溶解成深棕褐色溶液；6(TC水浴，滴加30%過氧化氫溶液， 調(diào)終濃度為5 15%，待溶液顏色變?yōu)榈S色后停止水浴；向溶液中緩慢加入無水乙醇/95% 乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，立即出現(xiàn)乳白色沉淀，靜置過夜；傾去上清， 減壓抽濾，沉淀以乙醇/乙醚/丙酮洗滌數(shù)次，直至濾液無色，得灰白色沉淀；沉淀置低于60 'C干燥，得白色塊狀物9.6g。
取脫色多糖100mg，力n Q.01 0.05M氯化鈉溶解，多糖濃度》10mg/ml，溶液為乳白色 溶液；凝膠色譜洗脫條件為填料SephadexG-200，色譜柱為2.5cm (直徑)X40cm (高 度)，凝膠床高35cm;洗脫液為0.01~0.05M氯化鈉，流速0.4ml/min;上樣量《50ml;收 集洗脫體積為30 60ml的組分，合并溶液，置冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，得白色絮狀物30 40mg。
實(shí)施實(shí)例4
稱取1000g香菇子實(shí)體，粉碎，沸水煎煮lh，過濾；藥渣加水再煮沸l(wèi)h，過濾；合并2
次濾液，濃縮；向濃縮液中緩緩加入無水乙醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以 上，靜置過夜后抽濾，沉淀置低于6(TC干燥，得粗品；加0.5M氫氧化鈉使粗品溶解，向溶 液中加入1 2倍體積5%三氯醋酸，攪拌，放置過夜，抽濾；濾液調(diào)pH值至6 8，加入無水乙 醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，放置過夜，抽濾，沉淀置低于6(TC干燥， 得香菇粗多糖50g。
取香燕粗多糖25.0g，加水溶解成深棕褐色溶液；4(TC水浴，滴加30%過氧化氫溶液， 調(diào)終濃度為5~15%，待溶液顏色變?yōu)榈S色后停止水??；向溶液中緩慢加入無水乙醇/95% 乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，立即出現(xiàn)乳白色沉淀，靜置過夜；傾去上清， 減壓抽濾，沉淀以乙醇/乙醚/丙酮洗滌數(shù)次，直至濾液無色，得灰白色沉淀；沉淀置低于60 'C干燥，得白色塊狀物9.6g。
取脫色多糖100mg,加0.01 0.05M硫酸鈉溶解，多糖濃度》10mg/ml，溶液為乳白色 溶液；凝膠色譜洗脫條件為填料SephadexG-200，色譜柱為2.5cm (直徑)X40cm (高 度)，凝膠床高35cm;洗脫液為0.01 0.05M硫酸鈉，流速0.4ml/min;上樣量《50ml;收集 洗脫體積為30 60ml的組分，合并溶液，置冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，得白色絮狀物30 40mg。
實(shí)施實(shí)例5
'稱取1000g香燕子實(shí)體，剪碎，沸水煎煮lh,過濾；藥渣加水再煮沸l(wèi)h，過濾；合并2次濾液，濃縮；向濃縮液中緩緩加入無水乙醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以 上，靜置過夜后抽濾，沉淀置低于60。C干燥，得粗品；加0.5M氫氧化鈉使粗品溶解，向溶 液中加入1 2倍體積5%三氯醋酸，攪拌，放置過夜，抽濾；濾液調(diào)pH值至6-8，加入無水乙 醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，放置過夜，抽濾，沉淀置低于60。C干燥， 得香菇粗多糖50g。
取香菇粗多糖25.0g，加水溶解成深棕褐色溶液；5(TC水浴，滴加30。/。過氧化氫溶液， 調(diào)終濃度為5~15%，待溶液顏色變?yōu)榈S色后停止水??；向溶液中緩慢加入無水乙醇/95% 乙醇Z75。/。乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，立即出現(xiàn)乳白色沉淀，靜置過夜；傾去上清， 減壓抽濾，沉淀以乙醇/乙醚/丙酮洗滌數(shù)次，直至濾液無色，得灰白色沉淀；沉淀置低于60 'C干燥，得白色塊狀物9.6g。
取脫色多糖lOOmg，力n 0.01~0.05M氯化鈉溶解，多糖濃度》10mg/ml，溶液為乳白色 溶液；凝膠色譜洗脫條件為填料Sephadex G-150，色譜柱為2.5cm (直徑)X40cm (高 度)，凝膠床高35cm;洗脫液為0.01~0.05M氯化鈉，流速0.4ml/min;上樣量《50m；收 集洗脫體積為30 60ml的組分，合并溶液，置冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，得白色絮狀物30 40mg。
實(shí)施實(shí)例6
稱取1000g香菇子實(shí)體，剪碎，沸水煎煮lh，過濾；藥渣加水再煮沸l(wèi)h，過濾；合并2
次濾液，濃縮；向濃縮液中緩緩加入無水乙醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以 上，靜置過夜后抽濾，沉淀置低于6(TC干燥，得粗品；加0.5M氫氧化鈉使粗品溶解，向溶 液中加入1~2倍體積5%三氯醋酸，攪拌，放置過夜，抽濾；濾液調(diào)pH值至6 8，加入無水乙 醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，放置過夜，抽濾，沉淀置低于6(TC干燥，
得香燕粗多糖50g。
取香菇粗多糖25.0g，加水溶解成深棕褐色溶液；6(TC水浴，滴加30%過氧化氫溶液， 調(diào)終濃度為5~15%，待溶液顏色變?yōu)榈S色后停止水??；向溶液中緩慢加入無水乙醇/95% 乙醇/75%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，立即出現(xiàn)乳白色沉淀，靜置過夜；傾去上清， 減壓抽濾，沉淀以乙醇/乙醚/丙酮洗滌數(shù)次，直至濾液無色，得灰白色沉淀；沉淀置低于60 'C干燥，得白色塊狀物9.6g。 ，
取脫色多糖lOOmg，力口 0.01~0.05M硫酸鈉溶解，多糖濃度》10mg/ml，溶液為乳白色 溶液；凝膠色譜洗脫條件為填料Sephadex G-l50，色譜柱為2.5cm (直徑)X40cm (高 度)'凝膠床高35cm;洗脫液為0.01 0.05M硫酸鈉，流速0.4ml/min;上樣量《50ml;收集 洗脫體積為30 60ml的組分，合并溶液，置冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，得白色絮狀物30 40mg。
9
權(quán)利要求
1.注射用香菇多糖的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟a.取新鮮香菇或干香菇，經(jīng)粉粹或不經(jīng)粉粹；b.采用熱水提取，濃縮；c.乙醇沉淀分離粗多糖；d.三氯醋酸去蛋白；e.乙醇沉淀；f.過氧化氫脫色；g.乙醇沉淀；h.凝膠色譜法除雜質(zhì)多糖和小分子；i.冷凍干燥。
2 .根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射用香菇多糖的分離純化方法，其特征在于，所述的采用 熱水提取，濃縮的具體方法是加入相當(dāng)于香菇干重8倍體積水，沸水提取2次，濃縮至 相當(dāng)于香菇干重的2倍體積，得濃縮液。
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的注射用香薛多糖的分離純化方法，其特征在于，所述的乙醇 沉淀分離粗多糖的具體方法是向濃縮液中加入乙醇，使溶液乙醇濃度達(dá)50%以上，分離沉淀，得粗多糖。
4 .根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射用香菇多糖的分離純化方法，其特征在于，所述的三氯醋酸去蛋白的具體方法是用水溶解粗多糖得粗多糖溶液，加入粗多糖溶液體積1~2倍、濃度為5%三氯醋酸溶液，得去蛋白溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的注射用香菇多糖的分離純化方法，其特征在于，所述的向 去蛋白溶液中加入乙醇，使溶液乙醇濃度達(dá)50V。以上，分離沉淀，得去蛋白多糖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的注射用香菇多搪的分離純化方法，其特征在于，所述的過氧化氫脫色的具體方法是去蛋白多糖以水溶解，滴加30%過氧化氫溶液，調(diào)終濃度為5~15%，過氧化氫脫色中水浴溫度為40 60'C水浴，得脫色溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的注射用香菇多糖的分離純化方法，其特征在于，所述的過 氧化氫脫色后的乙醇沉淀的具體方法是，向脫色溶液中加入乙醇，使溶液乙醇濃度達(dá)50% 以上，分離沉淀，得脫色多糖。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的注射用香菇多糖的分離純化方法，其特征在于，所述的凝膠色譜法除雜質(zhì)多糖和小分子的具體方法是取脫色多糖，以交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-150或SephadexG-200為固定相，0.01-0.05M氯化鈉或0.01 0.05M硫酸鈉為流動(dòng)相，進(jìn) 行凝膠色譜分離，收集香菇多糖組分溶液；除雜質(zhì)多糖和小分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求l所述的注射用香菇多糖的分離純化方法，其特征在于，所述的冷 凍干燥的具體方法是將收集的香菇多糖組分溶液置冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，得白色粉末狀注 射用香菇多糖。 .
全文摘要
本發(fā)明提供了注射用香菇多糖的分離純化方法，采用水提醇沉法結(jié)合三氯醋酸法去蛋白得到香菇多糖粗品，香菇多糖粗品經(jīng)過氧化氫脫色得脫色多糖，脫色多糖再經(jīng)凝膠色譜法得注射用香菇多糖。本發(fā)明提供的注射用香菇多糖分離純化方法工藝簡單、產(chǎn)率高、顯著降低制劑成本，有利于減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，節(jié)約資源和保護(hù)環(huán)境，可用于注射用香菇多糖工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C08B37/00GK101643515SQ20081004872
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者玉 張, 王凱平, 明 辜, 陳志祥 申請人:華中科技大學(xué)