專利名稱：羧基化熒光編碼微球及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高分子材料，尤其是涉及一種羧基化熒光編碼微球及其合成方法。
背景技術(shù)：
液相芯片技術(shù)被喻為后基因組時(shí)代的芯片技術(shù)，又稱流式微珠技術(shù)。20世紀(jì)90年代以 來，這種綜合了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、光學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域的新技術(shù)得到蓬勃發(fā)展，成為影響 最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，也是FDA唯一批準(zhǔn)的可應(yīng)用于臨床診斷的芯片技術(shù)。液相芯片 技術(shù)的載體是表面功能化的熒光編碼微球，表面功能化的熒光微球以其強(qiáng)大的固定生物大分 子的能力及穩(wěn)定而高效的發(fā)光效率,在許多領(lǐng)域尤其是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很高的研究應(yīng)用價(jià)值。
熒光微球是指粒徑在納米到微米范圍內(nèi)，負(fù)載有熒光物質(zhì)，受外界能量激發(fā)而發(fā)射熒光 的固體微粒。其外形可為任意形狀，典型外形為球形。根據(jù)載體及熒光物質(zhì)的不同，熒光微球 可分為兩類 一類是無機(jī)/有機(jī)熒光微球(一種是以無機(jī)材料為載體,熒光物質(zhì)為有機(jī)化合物； 另一種是有機(jī)高分子為載體，熒光物質(zhì)為無機(jī)物)；另一類為有機(jī)/有機(jī)微球(微球載體是合成或 天然的高分子材料,熒光物質(zhì)是有機(jī)物)。其中有機(jī)/有機(jī)微球可以在其表面方便地修飾各種各 樣實(shí)際需要的功能團(tuán)，可選擇不同的共聚單體和聚合工藝進(jìn)行高分子微球設(shè)計(jì)，又因微球的 密度與水相近而使得固定在微球表面的生物大分子可在均相中進(jìn)行各類反應(yīng)，因此有機(jī)/有機(jī) 熒光微球一直是科研人員以及企業(yè)研究的熱點(diǎn)。其中美國德克薩斯州，Austin的Luminex Corporation開發(fā)的100種熒光編碼微球就是有機(jī)/有機(jī)熒光微球的一個(gè)典型例子。
制備熒光微球的方法主要包括共價(jià)結(jié)合法和包埋吸附法。共價(jià)結(jié)合法包括將熒光分子共 價(jià)聚合在微球的內(nèi)部以及將熒光分子共價(jià)結(jié)合于微球表面兩種方式；前者是先將熒光分子和 聚合反應(yīng)的單體通過化學(xué)反應(yīng)制得含有熒光團(tuán)的聚合單體，然后通過聚合反應(yīng)制備熒光微球。 Rembaum等(美國專利US 4326008)將丹磺酰氯與丙烯胺反應(yīng)，生成含有熒光團(tuán)的單體，再 通過聚合反應(yīng)制備出熒光微球。Peterson (美國專利US 4194877)通過丙烯酰胺將熒光染料 連接到聚合單體上后再通過乳液聚合制備出熒光微球。但這種方法往往需要熒光分子帶有特 殊的反應(yīng)基團(tuán)，對于沒有相應(yīng)反應(yīng)基團(tuán)的熒光分子就很難適用，而且由于熒光分子連接到單 體上往往使聚合得到的微球均勻性下降，因此大大限制了微球的應(yīng)用范圍。共價(jià)結(jié)合法制備 熒光微球的另一種方式是先通過聚合反應(yīng)制備微球并在微球表面修飾相應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)，然后
通過化學(xué)反應(yīng)將熒光分子共價(jià)連接到微球表面。Schwartz等(美國專利US 4609689)用l， 3 一丙二胺對表面含有環(huán)氧基團(tuán)的微球進(jìn)行修飾，然后將異硫氰酸熒光素(FITC)通過氨基共 價(jià)連接到微球而制備熒光微球。Chandler等(美國專利US 6268222)先將納米聚苯乙烯顆粒 溶脹吸附熒光物質(zhì)，再通過化學(xué)反應(yīng)將納米顆粒共價(jià)連接微米級的聚苯乙烯微球表面，從而 實(shí)現(xiàn)對微球進(jìn)行編碼。Cheung等(美國專利US 5194300)用熒光胺與表面含有羧酸酯的微球 反應(yīng)制得熒光微球。這種制備熒光微球的方式同樣需要熒光分子具有相應(yīng)反應(yīng)基團(tuán)，而且由 于熒光分子與微球表面官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，因此大大降低微球表面官能團(tuán)的數(shù)量而限制其在生 物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。
包埋吸附的方式主要是在聚合反應(yīng)中加入熒光分子，使得熒光分子隨著單體的聚合反應(yīng) 而被包埋在微球的內(nèi)部或表層或者先合成出種子微球再用溶劑溶脹的方法包埋熒光分子。在 聚合反應(yīng)之前將染料溶解到單體中通常會(huì)由于染料在聚合過程中的自由基鏈終止作用而造成 轉(zhuǎn)化率降低和形成多分散的微球(不同粒徑的微球混合物)。為了減少熒光分子對微球粒徑 均一性的影響，很多包埋熒光分子的方法一般是在聚合反應(yīng)的中后期再加入熒光物質(zhì)或者采 用溶劑溶脹的方法制備粒徑比較均一的熒光微球。Haugland等(美國專利US 5723218)利用 溶脹的方法將氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川類化合物(BODIPY)包埋到微球里來制備熒光微球； Schwartz (美國專利US 5,073,498)中用溶脹的方法制出熒光微球。Zhang， YuZhong等也利 用溶脹的方法制出具有環(huán)帶的熒光微球；Fulwyler等(美國專利US 4,717,655)則將兩種染料 配成五種不同比率的溶液，制出五種編碼的熒光微球。Chandler等(美國專利US 65142 95， 6528165， 6649414)也是用溶劑對微球進(jìn)行溶脹從而達(dá)到對微球進(jìn)行染色，最多可以做出64 種熒光編碼微球。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單易行的合成羧基化熒光編碼微球的方法，合成的羧基化 熒光編碼微球粒徑均一、大小可控、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、熒光分散變異系數(shù)小，可應(yīng)用于液相芯 片分析。
本發(fā)明所述的羧基化熒光編碼微球是一種表面含有羧基并包埋了有機(jī)熒光分子的聚苯乙 烯微球，其粒徑均一，大小為l 10pm，通過控制反應(yīng)條件使微球包埋不同種類和數(shù)量的熒 光物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)熒光微球的編碼。
本發(fā)明所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法包括以下步驟
1)采用分散聚合法合成聚苯乙烯種子微球?qū)⒈揭蚁?St)和甲基丙烯酸(MAA)溶于 乙醇，以聚乙烯基吡咯垸酮(PVP)作為分散劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，在氮?dú)?br> 保護(hù)下反應(yīng)，離心，洗滌后烘干，得聚苯乙烯種子微球；
2) 制備羧基化微球?qū)⑸鲜鲋频玫木郾揭蚁┓N子微球分散到水溶液中，加入過硫酸鉀、 烯酸和二乙烯基苯(DVB)，混勻后通N2，反應(yīng)后洗滌，得羧基化微球；
3) 制備羧基化熒光編碼微球?qū)⒉襟E2)所得的羧基化微球分散于水中，加入有機(jī)熒光 分子，避光反應(yīng)，得羧基化熒光編碼微球。
在步驟l)中，按質(zhì)量百分比，甲基丙烯酸的用量最好為苯乙烯的0.5% 6.0%，聚乙烯 基吡咯烷酮的用量最好為苯乙烯的2% 4%，偶氮二異丁腈的用量最好為苯乙烯的1% 2.5%;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)的溫度最好為60 90'C，反應(yīng)的時(shí)間最好為12 24h;所述洗滌可 分別用水和乙醇各至少洗l次；所述聚乙烯基吡咯垸酮可選用PVPK-30、 PVP360、 PVP 106 中的至少一種。所述的苯乙烯最好用按質(zhì)量百分比計(jì)算濃度為10%的氫氧化鈉溶液按等體積 洗滌兩次后用二次水洗滌3 4次，再用無水硫酸鈉干燥保存，以除去苯乙烯單體中的阻聚劑； 偶氮二異丁腈最好用乙醇重結(jié)晶。
在步驟2)中，按質(zhì)量百分比，聚苯乙烯種子微球?yàn)?% 5%，過硫酸鉀為0.1% 1%， 烯酸為0.02% 1%， 二乙烯基苯為0% 0.2%，余為水，通N2的時(shí)間最好為5 30min，反 應(yīng)的溫度最好為60 90。C，反應(yīng)的時(shí)間最好為5 10h，所述洗漆可分別用水和乙醇洗至少1 次；所述的烯酸可選自丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、十一烯酸、油酸等烯酸中的至少一種。
在步驟3)中，按質(zhì)量比，羧基化微球有機(jī)熒光分子為i: (o.ooi 80);所述的有機(jī)
熒光分子可選自熒光素、羅丹明6G、羅丹明101、香豆素染料、氟硼類染料、方酸類染料、 花菁類染料等疏水性熒光物質(zhì)中的至少一種；所述的有機(jī)熒光分子可采用具有至少兩種不同 發(fā)射波長的有機(jī)熒光分子。
本發(fā)明制備的羧基化熒光編碼微球，其粒徑在l 10pm之間，通過對苯乙烯、甲基丙烯 酸以及引發(fā)劑、攪拌速度的控制，可以制得大小均一、粒徑不同的聚苯乙烯熒光微球。這種 微球通過EDC、 NHS等化學(xué)物質(zhì)活化后可將生物分子固定在微球表面。在合適的激發(fā)光照射 下，熒光微球能夠發(fā)射熒光；通過控制加入熒光分子的種類和數(shù)量以及其他條件可制得具有 不同發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度的微球，并可在流式細(xì)胞儀的熒光通道中區(qū)分，從而實(shí)現(xiàn)熒光微球 的編碼。


圖1為實(shí)施例1中得到的粒徑為5.7 pm的聚苯乙烯種子微球顆粒表面形貌電鏡掃描圖 (SEM)。
圖2為實(shí)施例1中得到的粒徑為5.7 ^im的聚苯乙烯種子微球的流式前向光散色圖(FCS)。
在圖2中，橫坐標(biāo)為前向散射光強(qiáng)度FCS A (xl，000)，縱坐標(biāo)為微球數(shù)量Count (個(gè))；微
球粒徑d-5.7tim，標(biāo)準(zhǔn)偏差(^=3.1%。
圖3為實(shí)施例2中羧基化熒光微球的電鏡圖(SEM)。
圖4為實(shí)施例2中羧基化熒光微球?qū)?yīng)的種子微球的電鏡圖(SEM)。
圖5為實(shí)施例2中得到的羧基化熒光微球的流式熒光分布圖(FITC通道)。在圖5中，
橫坐標(biāo)為熒光相對強(qiáng)度FITC A，縱坐標(biāo)為熒光微球數(shù)量Count (個(gè))；標(biāo)準(zhǔn)偏差CV=19.7%。 圖6為實(shí)施例2中得到的羧基化熒光微球的熒光共聚焦顯微鏡掃描圖。 圖7為實(shí)施例4中得到的羧基化熒光編碼微球的流式分布圖(PE通道)。在圖7中，橫
坐標(biāo)為熒光相對強(qiáng)度PE A，縱坐標(biāo)為熒光微球數(shù)量Count (個(gè))。
圖8為實(shí)施例5中得到的羧基化熒光編碼微球的流式分布圖(PE通道)。在圖8中，橫
坐標(biāo)為熒光相對強(qiáng)度PE A，縱坐標(biāo)為熒光微球數(shù)量Count (個(gè))。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明是如何實(shí)現(xiàn)的。 實(shí)施例l:合成粒徑均一的聚苯乙烯種子微球
稱取0.375 g的PVP和0.25 g的AIBN，將稱好的PVP放入100 mL的三頸瓶中，加入 47.5mL的乙醇溶解，加上攪拌棒，固定，攪拌；將稱好的AIBN加至一個(gè)三角燒瓶中，加入 15mL的St，以及0.21 mL的MAA，振蕩使其溶解，溶解后將溶液轉(zhuǎn)移到筒形滴液漏斗中， 然后滴加到三頸瓶中，安裝上溫度計(jì)；通N2l0min，在70。C油浴下反應(yīng)，攪拌速度250 rpm， 反應(yīng)24h后停止。冷卻后，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到50mL的離心管在4000rpm離心5min，然后依次 用乙醇和水各洗三遍。得到的微球在70。C真空烘箱中干燥24 h。得到的微球的粒徑為5.7 pm， 其粒徑的分散系數(shù)為3.1%，單分散性好。
實(shí)施例2:制備羧基化熒光微球
稱取4.73 nm聚苯乙烯種子微球1 g，十二烷基磺酸鈉(SDS) 25 mg，過硫酸鉀(K2S208) 250 mg，熒光素5mg，加至100mL三頸瓶中，加入40mL蒸餾水，超聲5分鐘至固體完全 分散。另取一支15 mL離心管，加入4 mL甲醇，980 i^—烯酸，10 ^L二乙烯基苯，混 勻，移取250jiL溶液至三頸瓶中，通N2 5 20分鐘。機(jī)械攪拌(250rpm)，置于70'C油浴 中反應(yīng)7.5h，停止取出。所得的微球在6000rpm下離心4分鐘，用乙醇洗三遍，最后用去離 子水再洗三遍，加入去離子水保存于4°C。得到的微球粒徑與種子粒徑相比基本沒有變化， 且均一性好、微球的熒光分布窄。
實(shí)施例3:檢測微球表面的羧基固定生物大分子的能力
準(zhǔn)確移取80 nL的活化緩沖溶液(10mM醋酸鈉，pH5.0)至1.5mL的離心管中，加入 5.0 x 106微球。混勻后分別加入0.5 mg和3.3 mg新制的NHS和EDC溶液，混合物在室溫下 孵化20 min，離心(10000 rpm x 1 min)移去未反應(yīng)的NHS和EDC。加入250 [iL活化緩沖 溶液洗滌一次后離心得到微球；加入500 活化緩沖溶液，混勻，加入30 ng的戊肝抗體 (HbeAb)，混勻后在室溫下置于水平搖床上反應(yīng)3.5 h;之后加入500nL洗滌緩沖溶液混勻， 離心(10000 rpm x lmin)后移去上清液，最后加入500 pL保存緩沖溶液保存。
移取50 ^L濃度為10 ng/mL的藻紅蛋白標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(PE GAM)稀釋液至 每個(gè)1.5mL離心管，再分別移入偶聯(lián)了HBeAb的微球2pL (2"04個(gè)微球)在37'C孵育30 分鐘。加入500 洗滌緩沖溶液混勻，離心(10000 rpm / min)移去上清液，最后加入500 PBS，用Luminex200液相芯片儀檢測偶聯(lián)效率。結(jié)果表明制得的羧基化熒光微球表面羧基固 定生物大分子的能力與美國Spherotech公司商品化的聚苯乙烯微球一致，加入熒光分子并不 會(huì)影響微球固定生物大分子的能力。
實(shí)施例4:控制熒光分子加入量制備羧基化熒光編碼微球
所用的種子微球的制備方法和實(shí)施例1相同，微球的粒徑為4.92 pm，所用的熒光物質(zhì)為 羅丹明6G。取三份種子微球，分別加入Omg、 2mg、 5mg的羅丹明6G，其他物質(zhì)的加入量 以及反應(yīng)條件均與上述實(shí)施例2相同，制備出三種熒光微球。然后將三種熒光微球混合，到 流式細(xì)胞儀上檢測，用PE熒光通道作為檢測通道?？梢杂^察到三種熒光微球可以很好的區(qū) 分開來，在PE通道的熒光強(qiáng)度分布直方圖上出現(xiàn)三個(gè)峰
實(shí)施例5:控制反應(yīng)條件制備羧基化熒光編碼微球
所用的種子微球的制備方法和實(shí)施例1相同，微球的粒徑為3.86nm。取四份種子微球(各 lg)，分別加入羅丹明6G 4 mg，控制四份的溫度和DVB的含量分別為65'C 10 LDVB、 70°C 10 LDVB、 75°C 10 LDVB、 70°C20 LDVB，其他物質(zhì)的加入量以及反應(yīng)條件與 上述實(shí)施例2相同，制備出四種熒光微球。然后將四種熒光微球混合，到流式細(xì)胞儀上檢測， 用PE熒光通道作為檢測通道?？梢杂^察到四種熒光微球可以很好的區(qū)分開來，在PE通道的 熒光強(qiáng)度分布直方圖上出現(xiàn)四個(gè)峰。
權(quán)利要求
1. 羧基化熒光編碼微球，其特征在于是一種表面含有羧基并包埋了有機(jī)熒光分子的聚苯乙烯微球，其粒徑均一，大小為1～10μm。
2. 如權(quán)利要求1所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于包括以下步驟1) 采用分散聚合法合成聚苯乙烯種子微球?qū)⒈揭蚁┖图谆┧崛苡谝掖?，以聚乙?基吡咯垸酮作為分散劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)，離心，洗滌后烘干， 得聚苯乙烯種子微球；2) 制備羧基化微球?qū)⑸鲜鲋频玫木郾揭蚁┓N子微球分散到水溶液中，加入過硫酸鉀、 烯酸和二乙烯基苯，混勻后通N2，反應(yīng)后洗滌，得羧基化微球；3) 制備羧基化熒光編碼微球?qū)⒉襟E2)所得的羧基化微球分散于水中，加入有機(jī)熒光 分子，避光反應(yīng)，得羧基化熒光編碼微球。
3. 如權(quán)利要求2所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于在步驟l)中，按 質(zhì)量百分比，甲基丙烯酸的用量為苯乙烯的0.5% 6.0%，聚乙烯基吡咯垸酮的用量為苯乙 烯的2% 4%，偶氮二異丁腈的用量為苯乙烯的1% 2.5%。
4. 如權(quán)利要求2所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于在步驟l)中，在 氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)的溫度為60 90'C，反應(yīng)的時(shí)間為12 24h。
5. 如權(quán)利要求2所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于在步驟l)中，所 述聚乙烯基吡咯垸酮為PVPK-30、 PVP360、 PVP1()6中的至少一種。
6. 如權(quán)利要求2所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于在步驟2)中，按 質(zhì)量百分比，聚苯乙烯種子微球?yàn)?% 5%，過硫酸鉀為0.1% 1%，烯酸為0.02% 1%， 二乙烯基苯為0% 0.2%，余為水。
7. 如權(quán)利要求2所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于在步驟2)中，通 N2的時(shí)間為5 30min，反應(yīng)的溫度為60 90°C，反應(yīng)的時(shí)間為5 10h。
8. 如權(quán)利要求2所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于在步驟2)中，所 述的烯酸選自丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、十一烯酸、油酸中的至少一種。
9. 如權(quán)利要求2所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于在步驟3)中，按質(zhì)量比，羧基化微球有機(jī)熒光分子為i : o.ooi 80。
10. 如權(quán)利要求2或9所述的羧基化熒光編碼微球的合成方法，其特征在于在步驟3) 中，所述的有機(jī)熒光分子選自熒光素、羅丹明6G、羅丹明101、香豆素染料、氟硼類染料、 方酸類染料、花菁類染料中的至少一種。
全文摘要
羧基化熒光編碼微球及其合成方法，涉及一種高分子材料。提供一種簡單易行的合成羧基化熒光編碼微球的方法。羧基化熒光編碼微球是一種表面含有羧基并包埋了有機(jī)熒光分子的聚苯乙烯微球，其粒徑均一，大小為1～10μm，通過控制反應(yīng)條件使微球包埋不同種類和數(shù)量的熒光物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)熒光微球的編碼。采用分散聚合法合成聚苯乙烯種子微球，再制備羧基化微球，最好制備羧基化熒光編碼微球。合成的羧基化熒光編碼微球粒徑均一、大小可控、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、熒光分散變異系數(shù)小，可應(yīng)用于液相芯片分析。
文檔編號C08F8/00GK101392172SQ20081007205
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月1日
發(fā)明者張志靈, 潘建波, 許艷軍, 顏曉梅 申請人:廈門大學(xué)