專利名稱：凈化的β-(1,3)-D-葡聚糖的制備方法
凈化的β-(1，3)-D-葡聚糖的制備方法本發(fā)明涉及一種用于制備凈化的β-(1，3)- -葡聚糖的方法，其包括下面的關(guān)鍵 步驟堿化β-(1，3)- -葡聚糖初始水溶液來(lái)降低該溶液的粘度，過(guò)濾該低粘度溶液和通 過(guò)酸化來(lái)恢復(fù)初始粘度，并且加熱所獲得的含有β-(1，3)- -葡聚糖的濾液。分類為i3-(l，3)_D-葡聚糖的多糖種類的特征在于以β_(1，3)形式連接的D-葡 萄糖殘基主鏈，其中不同的β _(1，3)-D-葡聚糖在它們的側(cè)基和分子量方面的結(jié)構(gòu)是彼此 不同的。例如凝膠多糖完全由β _(1，3)-D-葡萄糖主鏈組成，而裂褶多糖，硬葡聚糖和酵母 葡聚糖包含β_(1，6)_糖基側(cè)鏈。由于它們強(qiáng)的增稠性能和獨(dú)特的流變性能，這些多糖已 經(jīng)獲得了諸多的工業(yè)應(yīng)用，特別是在人類食品或者動(dòng)物飼料領(lǐng)域中，作為化妝品，水彩畫， 印刷油墨的成分，以及用在石油工業(yè)中，例如在鉆探泥漿，隔離液中，和作為浙青乳液的穩(wěn) 定劑。β _(1，3)-D-葡聚糖類型的多糖通常是通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)的，并且該發(fā)酵 液通常是直接使用和以稀釋形式使用的，通常是在巴氏滅菌之后使用(參見例如US專利 3301848)。但是，對(duì)于某些應(yīng)用而言，需要更高純度的i3-(l，3)-D-葡聚糖，其應(yīng)當(dāng)不包含 微生物細(xì)胞和/或該發(fā)酵液的其他水溶性成分。在這種情況中，通常使用沉淀方法，其包括加入水溶性有機(jī)溶劑(典型的是 異丙醇)或者另外一種沉淀劑例如聚乙二醇，來(lái)沉淀β-(1，3)- -葡聚糖(參見例如 EP0266163A2和US3301848)。在沉淀后，將沉淀物與含水介質(zhì)經(jīng)由過(guò)濾器分離，或更優(yōu)選， 經(jīng)由離心分離進(jìn)行分離。所形成的沉淀物或者“凝結(jié)物”然后可以加壓來(lái)除去盡可能多的 其中所含的液體，然后可以干燥和研磨成為β-(1，3)- -葡聚糖粉末，如本領(lǐng)域已知的那 樣(參見例如 US5224988 和 US3301848)。但是，雖然β _(1，3)-D-葡聚糖直接由發(fā)酵液中沉淀會(huì)提供良好的回收產(chǎn)率，但 是所獲得的沉淀物混有微生物細(xì)胞，并且因此不能用于某些應(yīng)用。所以，期望的是使β _(1， 3)-D-葡聚糖從無(wú)細(xì)胞的溶液中開始沉淀，該溶液可以通過(guò)任何便利的技術(shù)例如過(guò)濾或者 離心分離來(lái)獲得。一種特別有利的將β _(1，3)-D-葡聚糖與發(fā)酵液的其他成分，特別是微生物細(xì)胞 進(jìn)行分離的技術(shù)是過(guò)濾。但是，目前的對(duì)含有β-(1，3)- -葡聚糖的溶液的過(guò)濾技術(shù)具 有這樣的缺點(diǎn)，即，這樣的溶液太粘稠而不能容易的進(jìn)行過(guò)濾(參見例如ΕΡ0266163Α2和 US3301848)。具體的，該高的粘度會(huì)導(dǎo)致過(guò)濾壓力的升高或者過(guò)濾器的完全堵塞。為此原 因，目前的方法包括在過(guò)濾之前，為了降低粘度，用大量的溶劑來(lái)稀釋含有β-(1，3)- -葡 聚糖的溶液的步驟。結(jié)果，該常規(guī)的方法在生產(chǎn)率和生產(chǎn)成本方面是不令人滿意的。本發(fā)明因此的目標(biāo)是提供一種用于制備凈化的i3-(l，3)_D-葡聚糖的方法，其提 供了高的產(chǎn)率，并且是比現(xiàn)有的β _(1，3)-D-葡聚糖制備方法更加成本有效的。已經(jīng)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)這個(gè)問(wèn)題是通過(guò)所要求 保護(hù)的方法來(lái)解決的，該方法包括下 面的關(guān)鍵步驟通過(guò)加入堿來(lái)堿化β-(1，3)- -葡聚糖初始水溶液，以產(chǎn)生不太粘稠的溶 液，過(guò)濾該低粘度溶液，和使用酸來(lái)酸化所獲得的濾液，來(lái)恢復(fù)初始粘度，并且加熱所形成 的酸性β-(1，3)- -葡聚糖溶液。
本發(fā)明的方法能夠過(guò)濾未稀釋的β _(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液，該溶液包含高濃度的β _(1，3)-D-葡聚糖，該濃度遠(yuǎn)高于能夠用于常規(guī)方法中的溶液的濃度，同時(shí)最終 所獲得的β _(1，3)-D-葡聚糖的粘度類似于常規(guī)方法的粘度。因此，本發(fā)明的方法表現(xiàn)出 明顯提高的加工生產(chǎn)率。另外，不需要或者僅僅需要有限量的試劑來(lái)稀釋待過(guò)濾的溶液。結(jié) 果，本發(fā)明的方法是比常規(guī)方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)更成本有效的。更具體的，本發(fā)明的方法包括下面的步驟(a)提供pH高于11.0的β _ (1，3)-D-葡聚糖的初始水溶液；(b)過(guò)濾該β _(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液來(lái)獲得含有i3-(l，3)_D-葡聚糖的濾 液；(c)用酸將該含有i3-(l，3)_D-葡聚糖的濾液的pH調(diào)整為低于5.0的pH，來(lái)獲得 酸性β _(1，3)-D-葡聚糖溶液；(d)將該酸性i3-(l，3)_D-葡聚糖溶液加熱到60-160°C的溫度的范圍。本發(fā)明方法的步驟(a)中所提供的β _(1，3)-D-葡聚糖初始溶液可以是任何含有 i3-(l，3)-D-葡聚糖的水溶液。該β _(1，3)-D-葡聚糖可以以下面的高濃度包含在初始溶 液中5g/l或者更高，特別是10g/l或者20g/l或者更高，高到這樣的高濃度例如40或者 50g/l或者仍然更高的濃度。典型的，該初始溶液是發(fā)酵液，未精制的β-(1，3)- -葡聚糖 或者任何其他未精制的β-(1，3)- -葡聚糖制劑的再生溶液。這些初始i3-(l，3)_D-葡聚 糖溶液可以任選的包含少量的，優(yōu)選0-10重量％，更優(yōu)選0-5重量％的混合的另外的物質(zhì)， 例如鹽，表面活性劑，絡(luò)合劑等等。本發(fā)明的“發(fā)酵液”是任何的溶液，該溶液是通過(guò)具有產(chǎn)生i3-(l，3)_D-葡聚糖的 能力的微生物的作用，在介質(zhì)例如基于糖和無(wú)機(jī)鹽的介質(zhì)的發(fā)酵之后獲得的。發(fā)酵液因此 包含用于發(fā)酵的微生物，未發(fā)酵的發(fā)酵介質(zhì)和發(fā)酵代謝物等等。在本發(fā)明含義中的發(fā)酵液 可以進(jìn)一步是這樣一種發(fā)酵液，其在過(guò)濾之前已經(jīng)進(jìn)行了滅菌或者巴氏滅菌。用于發(fā)酵的 微生物可以是細(xì)菌，真菌和藻類。發(fā)酵是如本領(lǐng)域已知的那樣來(lái)進(jìn)行的，并且描述在例如 US3301848 中。當(dāng)在此使用時(shí)，“未精制的β _(1，3)-D-葡聚糖”的“再生溶液”包含任何這樣的 溶液，該溶液能夠通過(guò)將未精制的β _(1，3)-D-葡聚糖粉末溶解在合適的溶劑例如水中而 獲得的。術(shù)語(yǔ)“未精制的β-(1，3)- -葡聚糖”目的是表示液體或者更典型的固體形式的 β _(1，3)-D-葡聚糖制劑，其包含微生物細(xì)胞或者至少其碎片。其例子包括干燥的或者醇 處理過(guò)的發(fā)酵液。該干燥的發(fā)酵液通常是粉末形式的，并且通常包含大約5-60重量％的 β-(1,3)- -葡聚糖，其中其余部分基本上由細(xì)胞和剩余的少量的水組成。用于本發(fā)明中的i3-(l，3)_D-葡聚糖包括分類為i3-(l，3)_D-葡聚糖的任何多 糖，即，具有β_(1，3)_連接的D-葡萄糖殘基主鏈的任何多糖。這樣的i3-(l，3)-D-葡 聚糖的例子包括凝膠多糖(一種由例如土壤桿真菌屬物種(Agrobacterium spp.)產(chǎn)生 的β_(1，3)_連接的D-葡萄糖殘基的均聚物)，灰樹花多糖(一種由例如真菌Grifola frondosa所產(chǎn)生的支化的β _(1，3)-D-葡聚糖)，香菇多糖(一種在β_(1，3)_主鏈的 每個(gè)第五葡萄糖殘基上連接有兩個(gè)葡萄糖接枝的支化的β-(1，3)- -葡聚糖，其例如是 由真菌埃杜香菇(Lentinus eeodes)產(chǎn)生的)，裂褶多糖(一種在β_(1，3)_主鏈的每個(gè) 第三葡萄糖殘基上具有一個(gè)葡萄糖接枝的支化的3-(l，3)-D-葡聚糖，其例如是由群交裂褶真菌(Schizophyllan commune)產(chǎn)生的)，硬葡聚糖(一種例如由真菌小核菌屬物種 (Sclerotium spp.)所產(chǎn)生的支化的β _ (1，3)-D-葡聚糖，其來(lái)自β - (1，3)-主鏈的三個(gè)葡 萄糖分子中的一個(gè)葡萄糖分子通過(guò)(1，6)-β鍵連接到側(cè)鏈D-葡萄糖單元上)，SSG(—種 例如由真菌油菜核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)所產(chǎn)生的高度支化的β_(1，3)_葡 聚糖)，來(lái)自酵母的可溶性葡聚糖(一種帶有β_(1，6)_連接側(cè)基的i3-(l，3)-D-葡聚糖， 其例如是由啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)產(chǎn)生的)，和海帶多糖(一種帶有 β _(1，3)_葡聚糖和β _(1，6)_葡聚糖側(cè)基的β _(1，3)_葡聚糖，其由例如褐藻類掌狀昆布 (the brown algae Laminariadigitata)產(chǎn)生)0 優(yōu)選用于本發(fā)明中的β _(1，3)-D-葡聚糖不包含側(cè)基，例如凝膠多糖，或者經(jīng)由 β _ (1，6)-連接鍵合到β - (1，3)-主鏈上的一種或多種葡萄糖殘基的接枝，例如裂褶多糖 和硬葡聚糖。此處所用的一種特別優(yōu)選的β _(1，3)-D-葡聚糖是硬葡聚糖。在本發(fā)明方法的步驟(a)中，β _(1，3)-D-葡聚糖初始溶液的pH可以如同本領(lǐng)域 已知的那樣進(jìn)行調(diào)整，例如使用任何的有機(jī)或者無(wú)機(jī)堿來(lái)調(diào)整。根據(jù)本發(fā)明，該P(yáng)H優(yōu)選是 依靠堿性化合物來(lái)調(diào)整的，其具有作為陽(yáng)離子的鉀離子，例如氫氧化鉀，碳酸鉀或者碳酸氫 鉀。但是，雖然不太優(yōu)選，但是也可以使用氫氧化鈉。優(yōu)選將該β _(1，3)-D-葡聚糖初始溶 液的PH設(shè)定到高于11. 0，更優(yōu)選高于12. 0，仍然更優(yōu)選高于12. 2和最優(yōu)選高于12. 3。在 這樣的高堿性條件下，3-(l，3)-D-葡聚糖三重螺旋體以一種變性狀態(tài)而存在，在其中破壞 了該三股螺旋結(jié)構(gòu)，并且分離了所述的股。這導(dǎo)致了粘度的明顯降低，并從而很大的促進(jìn)了 凈化加工，這是因?yàn)槟軌蚴褂酶邼舛鹊?-(l，3)-D-葡聚糖溶液，而沒(méi)有過(guò)濾器堵塞或 者過(guò)濾壓力不利的升高的風(fēng)險(xiǎn)。β _(1，3)-D-葡聚糖初始溶液的提供優(yōu)選是在攪動(dòng)下進(jìn)行的，特別是在攪拌下進(jìn) 行的，來(lái)保證均勻的溶液。攪拌速度對(duì)于分離的和凈化的β-(1，3)- -葡聚糖的產(chǎn)率和粘 度來(lái)說(shuō)是不太重要的，并且可以處于10-150rpm的范圍內(nèi)。典型的，攪拌是以40_80rpm的 攪拌速度來(lái)進(jìn)行的。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(a)中i3-(l，3)_D-葡聚糖初始溶 液的提供包括加入鈣絡(luò)合劑的步驟。鈣絡(luò)合劑降低了鈣離子對(duì)于強(qiáng)堿性條件下的β-α， 3) -D-葡聚糖過(guò)濾能力的不利影響。合適的鈣絡(luò)合劑是例如六偏磷酸鹽，檸檬酸鹽，草酸鹽， 磷酸鹽，碳酸鹽等等，其中六偏磷酸鹽特別適用于本發(fā)明中。在本發(fā)明另外一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(a)中β _(1，3)-D-葡聚糖初始溶 液的提供包括加熱該初始溶液的步驟。加熱到高溫導(dǎo)致了 β-(1，3)- -葡聚糖更完全的溶 解，這在下面的情況中是特別重要的在其中使用β _(1，3)-D-葡聚糖粉末來(lái)制備β-(1， 3)-D-葡聚糖初始溶液，并且來(lái)加速在堿性ρΗ時(shí)粘度降低的過(guò)程，以及來(lái)提高產(chǎn)率。優(yōu)選 使用的加熱溫度范圍是50-80°C。加熱時(shí)間取決于加熱溫度，并且通常的范圍是l_24h。通 常，l"6h的加熱時(shí)間對(duì)于完全溶解β _(1，3)-D-葡聚糖初始溶液和/或?qū)崿F(xiàn)分離的和凈化 的i3-(l，3)-D-葡聚糖的高產(chǎn)率和粘度來(lái)說(shuō)是足夠的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，在70°C 的加熱時(shí)間是大約4h。在本發(fā)明方法的步驟(b)中，過(guò)濾在步驟(a)中所提供的i3-(l，3)_D-葡聚糖初 始水溶液，來(lái)獲得含有β-(1，3)- -葡聚糖的濾液。所獲得的濾液基本上不含微生物細(xì)胞 或者其碎片，例如菌絲體，并且僅僅由水溶性成分組成，例如β _(1，3)-D-葡聚糖本身和來(lái)自該β _(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液的其他水溶性成分，例如鹽，顏料等等。過(guò)濾可以使用任何已知的過(guò)濾手段來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選使用助濾劑 例如珍珠巖，硅藻土或者纖維素。將這些助濾劑在混合下加入到堿性β-(1，3)- -葡聚糖 溶液或者漿體中，來(lái)保證均勻的分散。典型的，堿性β-(1，3)- -葡聚糖溶液中的助濾劑與 i3-(l，3)-D-葡聚糖的重量比是0. 2-5，特別是0. 5-2。然后將該含有助濾劑的堿性β-(1， 3)-D-葡聚糖初始水溶液供給到過(guò)濾器來(lái)分離助濾劑。可以使用任何類型的過(guò)濾來(lái)進(jìn)行該 分離，其中壓濾器或者板式過(guò)濾器特別適用于此。也可以使用潷析離心分離機(jī)，雖然與壓濾 器或者板式過(guò)濾器相比其不太優(yōu)選。任選的，該過(guò)濾步驟還可以包括再循環(huán)直到獲得透明 溶液的步驟，該溶液然后如上所述與微生物細(xì)胞進(jìn)行分離。在過(guò)濾過(guò)程中β _(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液的溫度取決于所用的具體過(guò)濾手 段，待凈化的β-(1，3)- -葡聚糖的性質(zhì)，和其他因素。典型的，過(guò)濾溫度是50-90°C，優(yōu)選 是70-85°C，特別優(yōu)選是80°C。在本發(fā)明方法的步驟(c)中，將步驟(b)中所獲得的濾液通過(guò)加入酸到該含有 β _ (1，3) -D-葡聚糖的濾液中進(jìn)行酸化，來(lái)將所形成的酸性β _ (1，3) -D-葡聚糖溶液的ρΗ 降低到低于5.0，優(yōu)選低于4，更優(yōu)選低于3。特別優(yōu)選的ρΗ范圍是2-4。為了調(diào)整ρΗ，可以 使用任何的酸，除了那些產(chǎn)生帶有鈣離子的不溶性鹽的酸例如硫酸或者磷酸之外。優(yōu)選使 用鹽酸。在本發(fā)明方法的步驟(d)中，將步驟(C)中所獲得的酸性i3-(l，3)_D-葡聚糖 溶液進(jìn)行熱處理，來(lái)恢復(fù)3-(l，3)-D-葡聚糖的初始粘度。優(yōu)選該加熱處理包括將酸性 3-(1，3)-0-葡聚糖溶液加熱到60-1601，優(yōu)選80-1401，更優(yōu)選100-120°C的溫度范圍 內(nèi)。加熱時(shí)間取決于加熱溫度，并且能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)來(lái)容易的確定。典 型的，該加熱時(shí)間的范圍在高溫情況中是幾秒，至在低溫情況中是幾小時(shí)。例如，20s的加熱 時(shí)間在130°C的加熱溫度可能是足夠的，而在120°C的加熱溫度可能需要大約Imin的加熱 時(shí)間。在90°C批次處理3h也可以適用于恢復(fù)β-(1，3)- -葡聚糖的粘度。加熱可以以批次或者UHT模式來(lái)進(jìn)行。在批次模式中，將大體積的β _ (1，3) -D-葡 聚糖溶液進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間(通常大于10分鐘)的處理。該UHT處理是一種連續(xù)的加熱，在這里將 一定體積的β-(1，3)- -葡聚糖溶液進(jìn)行短時(shí)間(通常小于10分鐘)的熱處理。UHT方法 還能夠處理大體積，但是是以連續(xù)流動(dòng)模式來(lái)進(jìn)行。加熱時(shí)間可以通過(guò)所謂的“ chambrage ” 的另外階段根據(jù)期望來(lái)增加。在本發(fā)明方法的步驟(d)之后，所獲得的含有i3-(l，3)_D-葡聚糖的溶液可以根 據(jù)期望來(lái)進(jìn)一步加工。例如，如果期望分離包含在β-(1，3)- -葡聚糖初始溶液中的其他 水溶性成分，則β _(1，3)-D-葡聚糖可以與任何已知的沉淀劑以足夠的量進(jìn)行混合，來(lái)沉 淀β-(1，3)- -葡聚糖。該沉淀劑可以是例如溶劑，特別是醇，例如甲醇，乙醇，丙醇，或者 丙酮。為了進(jìn)行該沉淀，便利的，將足夠量的沉淀劑在期望的溫度加入到步驟(d)中所獲 得的加熱的含有β-(1，3)- -葡聚糖的溶液中。通常，所形成的溶液的沉淀溫度范圍是 70-100°C，優(yōu)選是80-95°C。典型的，該沉淀溫度是90°C。 在沉淀之后，β _ (1，3) -D- 葡聚糖可以通過(guò)任何便利的方法與液體進(jìn)行分離，例如 過(guò)濾，離心分離或者潷析。如果期望，所獲得的β _(1，3)-D-葡聚糖產(chǎn)物可以如下來(lái)進(jìn)一步 凈化用上述有機(jī)溶劑的一種進(jìn)行清洗，或者將該β-(1，3)- -葡聚糖再分散到水中，并且以上述相同的方式來(lái)重新沉淀。在本發(fā)明的上下文中，一種優(yōu)選的沉淀方法是使用異丙醇的醇沉淀方法。更具體 的，將該含有β _(1，3)-D-葡聚糖的溶液與等價(jià)的或者較大體積的異丙醇進(jìn)行混合，通常 1-1.5重量份的異丙醇，基于1重量份的含有i3-(l，3)-D-葡聚糖的溶液。沉淀通常是在高 溫例如在90°C進(jìn)行的。優(yōu)選然后將所獲得的沉淀物用70%的異丙醇清洗至少一次，來(lái)獲得 含有水和溶劑的β _(1，3)-D-葡聚糖的纖維性產(chǎn)物。然后可以通過(guò)任何已知的方式來(lái)干燥該i3-(l，3)_D-葡聚糖產(chǎn)物因此將該獲得 的凈化的β _(1，3)-D-葡聚糖產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成為粉末形式，所述的方式是例如空氣干燥，醇 或者丙酮干燥，噴霧干燥，轉(zhuǎn)鼓干燥或者流化床干燥。在干燥之前，還可以壓榨該凈化的 β - (1，3)-D-葡聚糖產(chǎn)物，來(lái)除去盡可能多的包含在其中的液體。該干燥的產(chǎn)物然后壓碎和 /或研磨成為粉末，其可以方便的用于寬泛的應(yīng)用中。本發(fā)明現(xiàn)在將通過(guò)下面的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例 下面的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了與通常使用的凈化方法相比，本發(fā)明制備凈化的硬葡聚糖 的有益性能，硬葡聚糖是一種β-(1，3)- -葡聚糖，其在β-(1，3)_主鏈中的每三個(gè)葡萄糖 上具有β_(1，6)_連接的側(cè)D-葡萄糖殘基。具體的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)硬葡聚糖溶液在過(guò)濾之前的 粘度在高PH值時(shí)會(huì)顯著降低，以及發(fā)現(xiàn)通過(guò)將ρΗ降低到酸性范圍，并且加熱處理該酸性溶 液，能夠?qū)V液的粘度恢復(fù)到與常規(guī)方法中所獲得的這些濾液大致相同的值。進(jìn)一步可見 本發(fā)明方法的產(chǎn)率與常規(guī)方法大致相同。因此，本發(fā)明的方法允許過(guò)濾高濃縮的硬葡聚糖 溶液，該溶液包含了高出常規(guī)方法所用的硬葡聚糖溶液大約5倍的硬葡聚糖。作為其結(jié)果， 本發(fā)明方法的生產(chǎn)率明顯的高于常規(guī)的，并因此提供了大的成本節(jié)約潛力。對(duì)比例根據(jù)常規(guī)方法的硬葡聚糖的凈化將體積為150L的自來(lái)水加熱到80°C，并且在80rpm的攪拌下加入2. 4kg的 polytran N(最終濃度8g/L)(粉末形式的無(wú)水醇處理過(guò)的發(fā)酵液，以商標(biāo)名ACTIGUM CS6 獲自法國(guó)Cargill of Baupte)，隨后在80°C攪拌2h。接下來(lái)，加入5. 625kg的floM(最 終濃度18. 75g/L)( 一種珍珠巖類型的助濾劑，以商標(biāo)名CLARCEL FloM獲自法國(guó)Ceca ofHonfleur)，將所形成的混合物用水稀釋到300L，在80°C連續(xù)攪拌14h。然后在l_4bar的 壓力和80°C的溫度使用壓濾器(獲自法國(guó)Choquenet ofChauny)過(guò)濾該混合物。向所獲得的濾液中加入基于1重量份的濾液為1重量份的異丙醇，來(lái)沉淀該硬葡 聚糖。使用尼龍過(guò)濾器對(duì)沉淀物排水，并且用1重量份的70%異丙醇重新清洗。使用Coq 螺旋壓榨機(jī)來(lái)壓榨最終的沉淀物。最后，將壓榨過(guò)的硬葡聚糖在75°C的空氣流化床干燥機(jī) 中進(jìn)行干燥，隨后使用帶有常規(guī)篩網(wǎng)的球磨機(jī)進(jìn)行研磨和過(guò)篩，來(lái)獲得粒度為大約250 μ m 的硬葡聚糖粉末。通過(guò)這種常規(guī)方法所獲得的硬葡聚糖的產(chǎn)率、粘度和ρΗ表示在表1中。ρΗ和粘度 值是分別使用PH計(jì)和Brookfield粘度計(jì)，通過(guò)測(cè)量的硬葡聚糖溶液來(lái)確定的，該溶液 是通過(guò)將所獲得的250 μ m的硬葡聚糖粉末在25°C的去離子水中再溶解成1重量％而獲得 的。產(chǎn)率對(duì)應(yīng)于所獲得的硬葡聚糖粉末的干重量百分比，基于所使用的polytran N粉末的干重量。表1.常規(guī)凈化的硬葡聚糖的產(chǎn)率、粘度和pH 要注意的是在這個(gè)實(shí)施例中所用的加工參數(shù)對(duì)應(yīng)于在一系列初步的試驗(yàn)中所確定的最佳的加工參數(shù)。在這些初步的試驗(yàn)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于獲得高產(chǎn)率和高粘度的最佳條 件包括將polytran N起始溶液加熱到大約80°C。進(jìn)一步提高該溫度不會(huì)明顯的提高產(chǎn)率或者增加粘度。在提高的溫度例如80°C，16h的溶解時(shí)間(solubilization time)足以達(dá) 到高的產(chǎn)率和粘度。另外，已經(jīng)證實(shí)混合速度是不太重要的。此外和重要的，已經(jīng)證實(shí)過(guò)濾 器在高于8g/l的polytran N濃度時(shí)發(fā)生了堵塞。因此，常規(guī)硬葡聚糖凈化方法是使用Sg/ 1的polytran N濃度來(lái)進(jìn)行的，其在80rpm的攪拌下在80°C溶解了 16h。本發(fā)明的實(shí)施例按照本發(fā)明的堿方法來(lái)凈化硬葡聚糖將體積為300L水加熱到60°C，加入0. 599kg的六偏磷酸鈉(對(duì)應(yīng)于在最終的溶液 中，六偏磷酸鹽與polytran N的比例為0.057 1. 0)，以及加入5. 04kg的氫氧化鉀(對(duì) 應(yīng)于在最終的溶液中，氫氧化鉀與polytran N的比例為0. 48 1.0),隨后加入10. 5kg的 polytran N(對(duì)應(yīng)于大約35g/l的最終濃度)。將所形成的混合物保持在60°C，并在SOrpm 攪拌16h。在攪拌完成后，在攪拌下加入7. 38kg的floM(最終濃度為大約28g/l)，隨后連 續(xù)攪拌大約15分鐘。然后，使用壓濾器(獲自法國(guó)Choquenet of Chauny)過(guò)濾該混合物。在過(guò)濾后，加入鹽酸(大約15L的6N HCI)將濾液的pH調(diào)整到3。然后在約15分 鐘內(nèi)將該酸性溶液從60°c加熱到110°C，然后在110°C保持 ο分鐘。向所獲得的加熱濾液 中加入1. 5重量份的異丙醇，基于1重量份的濾液，來(lái)沉淀硬葡聚糖。使用尼龍過(guò)濾器對(duì)沉 淀物排水，并且用1重量份的70%異丙醇重新清洗。然后使用Coq螺旋壓榨機(jī)來(lái)壓榨最終 的沉淀物，并干燥壓榨過(guò)的硬葡聚糖，隨后如對(duì)比例所述進(jìn)行研磨和過(guò)篩，來(lái)獲得粒度為大 約250 μ m的硬葡聚糖粉末。在上述方法過(guò)程中粘度的變化表示在表2中，并且將最終所獲得的硬葡聚糖的產(chǎn) 率、粘度和PH性能表示在表3。該pH、粘度和產(chǎn)率如對(duì)比例中所述來(lái)確定。表2.在本發(fā)明方法過(guò)程中粘度的變化。 表2中所示的粘度值證實(shí)了在堿化和過(guò)濾步驟之后，polytran N溶液(35g/l)的 粘度下降到小于大約20cP的粘度，隨后粘度升高到高于3000cP。
表3.本發(fā)明方法凈化的硬葡聚糖的產(chǎn)率、粘度和pH 從表3中顯然可見，通過(guò)本發(fā)明所凈化的硬葡聚糖是以與常規(guī)凈化的硬葡聚糖大 致相同的產(chǎn)率來(lái)獲得的，并且表現(xiàn)出大致相同的粘度(參見表1)。但是，本發(fā)明的方法允許 使用濃度高得多的硬葡聚糖溶液，這導(dǎo)致了生產(chǎn)率顯著的提高。更具體的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠沒(méi) 有任何問(wèn)題的對(duì)polytran N濃度高到40g/L的溶液進(jìn)行過(guò)濾。在高于40g/L的濃度，過(guò)濾 所需的壓力開始升高，這使得過(guò)濾更加困難(結(jié)果未示出)。
權(quán)利要求
一種用于制備凈化的β-(1，3)-D-葡聚糖的方法，該方法包括提供pH高于11.0的β-(1，3)-D-葡聚糖的初始水溶液，過(guò)濾該β-(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液來(lái)獲得含有β-(1，3)-D-葡聚糖的濾液，用酸將該含有β-(1，3)-D-葡聚糖的濾液的pH調(diào)整為低于5.0的pH，來(lái)獲得酸性β-(1，3)-D-葡聚糖溶液；將該酸性β-(1，3)-D-葡聚糖溶液加熱到60-160℃的溫度的范圍。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該β-(1，3)- -葡聚糖完全由β_(1，3)_連接的D-葡萄糖 殘基組成，或者完全由β _ (1，3)-連接的D-葡萄糖殘基的主鏈組成，該主鏈帶有一種或多 種葡萄糖殘基的β_(1，6)_連接的接枝。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該i3-(l，3)-D-葡聚糖選自硬葡聚糖、裂褶多糖和凝膠多糖。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的方法，其中該β_(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液是發(fā)酵液 或者未精制的β-(1，3)- -葡聚糖的再生溶液。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的方法，其中將該β-(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液的ρΗ調(diào) 整到高于12.3。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)加入足量的堿來(lái)調(diào)整該初始水溶液的ρΗ。
7.權(quán)利要求6的方法，其中用于調(diào)整該初始i3-(l，3)-D-葡聚糖溶液的ρΗ的堿是氫氧 化鉀或者碳酸鉀。
8.權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的方法，其中使用選自下面的助濾劑來(lái)過(guò)濾該初始β-(1， 3)-D-葡聚糖溶液珍珠巖、硅藻土和纖維素。
9.權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的方法，其中將該含有β-(1，3)-D-葡聚糖的濾液的ρΗ用 酸調(diào)整到低于3。
10.權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的方法，其中用來(lái)獲得酸性i3-(l，3)-D-葡聚糖溶液的酸是鹽酸。
11.權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的方法，其中將該酸性β-(1，3)-D-葡聚糖溶液加熱到 85-135°C的溫度范圍。
12.權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的方法，其中提供β_(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液的步 驟包括將鈣絡(luò)合劑加入到該初始溶液中的步驟。
13.權(quán)利要求1-12中任何一項(xiàng)的方法，其中提供β_(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液的步 驟包括將該初始溶液加熱到50-80°C溫度范圍的步驟。
全文摘要
這里提供了一種用于制備凈化的β-(1，3)-D-葡聚糖的方法，其包括步驟提供pH高于11.0的β-(1，3)-D-葡聚糖的初始水溶液，過(guò)濾該β-(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液來(lái)獲得含有β-(1，3)-D-葡聚糖的濾液，用酸將該含有β-(1，3)-D-葡聚糖的濾液的pH調(diào)整為低于5.0的pH，來(lái)獲得酸性β-(1，3)-D-葡聚糖溶液，和將該酸性β-(1，3)-D-葡聚糖溶液加熱到60-160℃的溫度的范圍。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101848941SQ200880114327
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日
發(fā)明者J·P·洛諾伊, J·馬祖瓦耶 申請(qǐng)人:卡吉爾公司