專利名稱：一種組織工程用海藻酸鈉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程用天然多糖，具體地說(shuō)是一種組織工程用海藻酸鈉的制備方 法。
背景技術(shù)：
海藻酸鈉(簡(jiǎn)寫NaAlG)又名褐藻膠，由β -D甘露糖醛酸(M)和α -L古羅糖醛酸 (G)通過(guò)(1-4)糖苷鍵聚合而成的線性陰離子天然多糖，生物相容性良好，是組織工程熱點(diǎn) 材料之一 [Wang W, Liu XD, Ma XJ, et al. J. Mater. Chem.，2006，16 :3252_3267]。現(xiàn)有海 藻酸鈉制備方法包括酸凝酸化法、鈣凝酸化法、鈣凝離子交換法、酶解提取法等，但研究表 明海藻酸鈉中殘留的雜蛋白、內(nèi)毒素等雜質(zhì)是影響其生物相容性的重要因素[Zimmermarm U, Klock G, Federlin K, et al. Electrophoresis 1992，13 (5) :269_74·]，對(duì)此，從上世紀(jì) 七十年代開始，許多研究者都致力于海藻酸鈉中雜蛋白、內(nèi)毒素等雜質(zhì)的去除研究，其中德 國(guó)學(xué)者Klock等提出的Klock法與荷蘭學(xué)者De Vos P提出的De Vos P法對(duì)于上述雜質(zhì) 的去除效果較好。Klock法可分為13個(gè)步驟[Klock G, Frank H, Houben R, et al. Appl Microbiol Biotechnol 1994Jan ；40 (5) :638_43] (1)首先將海藻酸鈉粉末分散在氯仿溶 液中，萃取0.5小時(shí)后，分離海藻酸鈉；(2)將海藻酸鈉溶解在蒸餾水中(1.5%w/v) ； (3)向 海藻酸鈉溶液中加入酸性活性炭，攪拌4小時(shí)后，溶液經(jīng)膜過(guò)濾；(4)向海藻酸鈉溶液中加 入中性活性炭，攪拌4小時(shí)后，溶液經(jīng)膜過(guò)濾，(5)將海藻酸鈉溶液滴加到BaCl2溶液中形成 凝膠微球；(6)將上述凝膠微球置于IM醋酸溶液中浸泡14小時(shí)(pll 2. 3)，將凝膠微球用 蒸餾水洗滌，此步驟重復(fù)3次；(7)再將凝膠微球置于500mM檸檬酸鈉溶液中浸泡8小時(shí)(pH 8. 0)將凝膠微球用蒸餾水洗滌，此步驟重復(fù)3次；(8)將凝膠微球浸泡在5L(含有5%的丙 酮)50%乙醇溶液中16小時(shí)；(9)再將凝膠微球轉(zhuǎn)移至5L (含有5%的丙酮)70%乙醇溶液 中，浸泡16小時(shí)后，先后經(jīng)BaCl2溶液與蒸餾水充分洗滌；(10)將凝膠微球置于到IL 250mM 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液中過(guò)夜(ρΗΙΟ. 0)，得到的溶液經(jīng)0. 2 μ m硝酸纖維素膜過(guò)濾； (11)將溶液置于進(jìn)行透析20小時(shí)(膜截流分子量為50kDa) ； (12)最后在無(wú)菌環(huán)境中，用 無(wú)水乙醇將海藻酸鈉沉淀出來(lái)；(13)將上述海藻酸鈉沉淀經(jīng)12小時(shí)干燥，得到純化海藻酸 鈉。該方法與本發(fā)明相比較=Klock法使用了氯仿毒性較大的有試劑；處理過(guò)程冗長(zhǎng)；產(chǎn)率 低。De Vos P 法可分為 9 個(gè)步驟[De Vos P, De Haan BJ, Wolters GH, Strubbe JH, Van Schilfgaarde R. Diabetologia 1997 ；40 (3) 262-270] [KR20020039473 20020708] (1) 將海藻酸鈉粗品溶解在ImM乙二醇二乙醚二胺四乙酸鈉(EGTA)溶液中(1. 0% w/v)，經(jīng)膜 過(guò)濾；(2)將溶液用2N HCl與20mM NaCl混合溶液調(diào)節(jié)pH 2. 0，形成凝膠沉淀，用布氏漏斗 過(guò)濾后(1. 5mm)，再用0. OlN HCl與20mM NaCl混合溶液洗滌凝膠沉淀3次；(3)將凝膠沉 淀分散到IOOmL 0. OlN HCl與20mM NaCl混合溶液中，再加入20mL氯仿和5mL正丁醇，劇 烈震蕩0. 5小時(shí)后用布氏漏斗過(guò)濾，此步驟重復(fù)3次；(4)將凝膠沉淀用0. 5N NaOH與20mM NaCl混合溶液(pH = 7. 0)溶解；(5)將溶液用氯仿/正丁醇混合液萃取0. 5小時(shí)(每IOOmL 海藻酸鈉溶液加入20mL氯仿和5mL正丁醇)，離心相分離，得到海藻酸鈉溶液；(6)向海藻酸鈉溶液中加入無(wú)水乙醇形成海藻酸鈉沉淀(V海藻酸鈉溶液V乙醇=1 2)，經(jīng)布氏漏 斗過(guò)濾；(7)將海藻酸鈉沉淀先后經(jīng)無(wú)水乙醇和乙醚洗滌；(8)最后在無(wú)菌環(huán)境中，將上述 海藻酸鈉沉淀經(jīng)12小時(shí)干燥，得到純化海藻酸鈉。該方法與本發(fā)明相比較De Vos P法原 理為形成海藻酸凝膠，這使得高分子多糖易降解，產(chǎn)率低。方法中使用了氯仿毒性較大的有 試劑，操作安全性差。目前，我國(guó)國(guó)內(nèi)海藻酸鈉的生產(chǎn)制備僅限于食品級(jí)，對(duì)于海藻酸鈉中的雜蛋白、內(nèi) 毒素等雜質(zhì)的去除方法未見(jiàn)報(bào)道[周家華，崔英德，楊輝，等.食品添加劑[M].北京化學(xué) 工業(yè)出版社，2001 =250-254.],[中國(guó)專利01115139. 0]?，F(xiàn)有國(guó)內(nèi)的海藻酸鈉的制備方法 不能滿足我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(www. sfda. gov. cn/WS01/CL0055/29538_l. html) 頒布的組織工程用的高純度海藻酸鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(YY/T 0606. 8-2008《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第 8部分海藻酸鈉》)
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)國(guó)內(nèi)尚無(wú)符合組織工程標(biāo)準(zhǔn)(YY/T 0606. 8-2008)的海藻酸鈉制備方 法的現(xiàn)狀，提出了一種組織工程用海藻酸鈉的制備方法，本發(fā)明對(duì)已經(jīng)公開的移植用海藻 酸鈉制備方法進(jìn)行了工藝優(yōu)化，提高了海藻酸鈉中雜蛋白、內(nèi)毒素的去除效果和純化海藻 酸鈉的產(chǎn)率，建立了符合我國(guó)即將頒布的組織工程用海藻酸鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種組織工程用海藻酸鈉的制備方法，包括去除原料海藻酸鈉中雜蛋白、內(nèi)毒素 等雜質(zhì)形成組織工程用產(chǎn)品的制備過(guò)程，以市售食品級(jí)海藻酸鈉為原料，經(jīng)活性炭吸附并 形成凝膠，此凝膠分別經(jīng)酸性溶液和堿性溶液浸泡，再經(jīng)鰲合劑溶解并過(guò)濾與透析，最后在 無(wú)菌環(huán)境下，用有機(jī)溶液將海藻酸鈉析出并冷凍干燥。通過(guò)上述過(guò)程去除海藻酸鈉中雜蛋 白、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，獲得組織工程用海藻酸鈉。具體操作步驟如下1)將所述原料海藻酸鈉(NaALG)溶解在蒸餾水中，其濃度為0. 1 4% (w/v, g/ ml)，加入一定質(zhì)量活性炭(w海藻酸鈉w活性炭=20 1 1 1)，室溫條件下機(jī)械攪 拌0.5 20小時(shí)，溶液經(jīng)膜過(guò)濾(0.8μm硝酸纖維素膜)去除固體雜質(zhì)，獲得的海藻酸鈉 溶液；2)海藻酸鈉(NaALG)溶液滴加到二價(jià)金屬M(fèi)鹽溶液中形成凝膠微球(M Ba2+，Ca2+)，經(jīng)0.5 1小時(shí)聚合過(guò)程后，用蒸餾水充分洗滌凝膠微球；反應(yīng)式為 NaALG+M2+— M(ALG)2 J, +Na+ ；3)將2)中海藻酸鹽(M(ALG)2)凝膠微球轉(zhuǎn)移至稀酸溶液中浸泡5 24小時(shí)(稀 酸溶液鹽酸，醋酸，或二者任意比混合酸，調(diào)節(jié)溶液PH 2. 0 4. 0)，取出凝膠微球用蒸餾 水充分洗滌；4)將3)中得到的凝膠微球轉(zhuǎn)移至堿性溶液中浸泡2 12小時(shí)(堿性溶液梓檬 酸鈉溶液，磷酸鈉鹽溶液，二者任意比混合溶液，調(diào)節(jié)溶液pH 8. 0 9. 0)，取出凝膠微球用 蒸餾水充分洗滌；5)將4)中得到的凝膠微球溶解到螯合鹽溶液中(螯合鹽溶液EDTA，EGTA，二者 任意比混合液，調(diào)節(jié)溶液PH 10. 0 12. 0)，溶液經(jīng)膜過(guò)濾(0. 45 μ m，0. 22 μ m硝酸纖維素膜)，再透析20 30小時(shí)得到海藻酸鈉(NaALG)溶液(膜截流分子量12 14kDa)，最后 在無(wú)菌環(huán)境中，將NaALG溶液緩慢倒入有機(jī)溶液中形成絮狀沉淀(有機(jī)溶液C1 C3的醇、 醚、酮或他們的任意比混合物，ν NaALG溶液ν有機(jī)溶液=1 2 1 10)，最后冷凍干 燥獲得組織工程用海藻酸鈉。本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明利用物理吸附和化學(xué)螯合的協(xié)同作用方法去除原料海藻酸鈉中雜蛋白、 多酚等雜質(zhì)，制備的海藻酸鈉可作為的組織工程產(chǎn)品使用。2、本發(fā)明采用制備方法簡(jiǎn)便易行，純化后的海藻酸鈉仍保持其物理化學(xué)的本質(zhì)特 征。


圖1為海藻酸鈉照片，其中a為海藻酸鈉原料(食品級(jí))，外觀淡黃色粉末，b為 純化后的海藻酸鈉，外觀白色粉末；圖2為不同方法制備的海藻酸鈉中雜蛋白含量檢測(cè)結(jié)果，其中圖2a為標(biāo)準(zhǔn)曲線， 圖2b中A為海藻酸鈉原料(食品級(jí))；B為本發(fā)明制備的海藻酸鈉；C為文獻(xiàn)方法制備的海 藻酸鈉(Klock法)；D為文獻(xiàn)方法制備的海藻酸鈉(De Vos P法)；圖3為不同方法制備的海藻酸鈉中內(nèi)毒素含量檢測(cè)，其中圖3a為標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖3b 中A為海藻酸鈉原料(食品級(jí))；B為本發(fā)明制備的海藻酸鈉；C為文獻(xiàn)方法制備的海藻酸 鈉(Klock法)；D為文獻(xiàn)方法制備的海藻酸鈉(De Vos P法)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、將市售食品級(jí)海藻酸鈉12g溶解在1. 2L蒸餾水中，加入1. 2g活性炭，物理吸附 1小時(shí)后，經(jīng)硝酸纖維素膜(0.8μπι)過(guò)濾得到無(wú)固體雜質(zhì)的海藻酸鈉溶液；2、將步驟1中得到的海藻酸鈉溶液通過(guò)噴頭加到4. 5L 50mM的BaCl2中形成海藻 酸鋇凝膠微球，經(jīng)0. 5小時(shí)聚合過(guò)程后，取出凝膠微球，用蒸餾水充分洗滌凝膠微球；3、將步驟2中得到的海藻酸鋇凝膠微球轉(zhuǎn)移到4. 5L IM醋酸中(pH 2. 0，浸泡IOh 后取出凝膠微球，用蒸餾水充分洗滌；4、將步驟3中得到的凝膠微球轉(zhuǎn)移至4. 5L 500mM的檸檬酸鈉(pH 8. 0)中浸泡5 小時(shí)，然后取出凝膠微球，用蒸餾水充分洗滌；5、將步驟4中得到的凝膠微球溶解到200mL 250mM EDTA中(ρΗΙΟ. 0)，溶液分別經(jīng) 0. 45 μ m和0. 22 μ m硝酸纖維素膜過(guò)濾，再透析20小時(shí)(膜截流分子量12 14kDa)，得到 海藻酸鈉(NaALG)溶液；6、最后在無(wú)菌環(huán)境中，將NaALG溶液緩慢倒入IL無(wú)水乙醇中形成絮狀沉淀，沉淀 經(jīng)冷凍干燥(-50°C，10Pa)獲得組織工程用海藻酸鈉(圖1)。7、采用日本島津公司UV-2250IPC型紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定不同方法制備的海 藻酸鈉中雜蛋白殘余量，于562nm處測(cè)定吸光度。(圖2)市售食品級(jí)海藻酸鈉中的雜蛋白 的含量為0. 433%，本發(fā)明制備的海藻酸鈉中雜蛋白含量為0. 174%，文獻(xiàn)報(bào)道的方法處理 的海藻酸鈉中雜蛋白含量分別為0. 292%和0. 325%。結(jié)果表明本發(fā)明制備的海藻酸鈉中雜蛋白去除率約為60 %，效果最好。8、采用天津大學(xué)無(wú)線電廠BET32C型內(nèi)毒素測(cè)定儀，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 (2005版)二部分附錄XI E規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定不同純化方法制備的海藻酸鈉中內(nèi)毒素物 質(zhì)殘余量。(圖3)市售食品級(jí)海藻酸鈉中內(nèi)毒素含量為2.933X 103EU/mL，本發(fā)明制備的 海藻酸鈉內(nèi)毒素含量為0. 153X 103EU/mL，文獻(xiàn)報(bào)道的純化方法制備的海藻酸鈉的內(nèi)毒素 含量由分別降為0. 284X 103EU/mL和0. 407X 103EU/mL。結(jié)果表明，本發(fā)明制備的海藻酸鈉 中內(nèi)毒素去除率達(dá)95%，效果最好。實(shí)施例21、將市售食品級(jí)海藻酸鈉18g溶解在1. 2L蒸餾水中，加入3g活性炭，物理吸附4 小時(shí)后，經(jīng)硝酸纖維素膜(0.8μπι)過(guò)濾得到無(wú)固體雜質(zhì)的海藻酸鈉溶液；2、將海藻酸鈉溶液通過(guò)噴頭加到4. 5L 75mM的BaCl2中形成海藻酸鋇凝膠微球， 經(jīng)1小時(shí)聚合過(guò)程后，取出凝膠微球，用蒸餾水充分洗滌凝膠微球；3、海藻酸鋇凝膠微球轉(zhuǎn)移到4. 5L 1. 5M醋酸中(pH 2. 0)，浸泡5h后取出凝膠微 球，用蒸餾水充分洗滌；4、將步驟3中得到的凝膠微球轉(zhuǎn)移至4. 5L 250mM的檸檬酸鈉(pH 8. 0)中浸泡8 小時(shí)，然后將膠珠再次用蒸餾水充分洗滌；5、將步驟4中得到的凝膠微球溶解到400mL 400mM EDTA中(ρΗΙΟ. 0)，溶液經(jīng)膜過(guò) 濾(分別經(jīng)0. 45 μ m和0. 22 μ m硝酸纖維素膜過(guò)濾)，再透析20小時(shí)(膜截流分子量12 14kDa)得到海藻酸鈉(NaALG)溶液；6、最后在無(wú)菌環(huán)境中，將NaALG溶液緩慢倒入2L無(wú)水乙醇中形成絮狀沉淀，沉淀 經(jīng)真空干燥沉淀經(jīng)冷凍干燥(-5(TC，10Pa，)獲得組織工程用海藻酸鈉。實(shí)施例31、與實(shí)例1相同；2、二價(jià)金屬M(fèi)鹽溶為CaCl2，其它與實(shí)例1相同；3、將步驟2中得到的海藻酸鈣凝膠微球轉(zhuǎn)移酸性溶液中浸泡8小時(shí)，其它與實(shí)例 1相同；4、將步驟3中得到的凝膠微球堿性溶液中浸泡2小時(shí)，其它與實(shí)例1相同；5、鰲合劑為EGTA，其它與實(shí)例1相同；6、與實(shí)例1相同。實(shí)施例41、與實(shí)例2相同；2、二價(jià)金屬M(fèi)鹽溶為CaCl2，其它與實(shí)例2相同；3、將步驟2中得到的海藻酸鈣凝膠微球轉(zhuǎn)移酸性溶液中浸泡4小時(shí)，其它與實(shí)例 2相同；4、將步驟3中得到的凝膠微球堿性溶液中浸泡5小時(shí)，其它與實(shí)例2相同；5、鰲合劑為EGTA，其它與實(shí)例2相同；6、與實(shí)例2相同。
權(quán)利要求
一種組織工程用海藻酸鈉的制備方法，其特征在于以市售食品級(jí)海藻酸鈉為原料，經(jīng)活性炭吸附并形成凝膠，此凝膠分別經(jīng)酸性溶液和堿性溶液浸泡，再經(jīng)鰲合劑溶解并過(guò)濾與透析，最后在無(wú)菌環(huán)境下，用有機(jī)溶液將海藻酸鈉析出并冷凍干燥。通過(guò)上述過(guò)程去除海藻酸鈉中雜蛋白、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，獲得組織工程用海藻酸鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的制備方法，其特征在于原料食品級(jí)海藻酸鈉經(jīng)活性炭吸 附并形成凝膠的具體操作過(guò)程為，1)將原料市售食品級(jí)海藻酸鈉NaALG溶解在蒸餾水中，其w/v濃度為0.1 4%，加入 活性炭，海藻酸鈉與活性炭的重量比為20 1 1 1，室溫條件下機(jī)械攪拌0.5 20小 時(shí)，將溶液經(jīng)膜過(guò)濾去除固體雜質(zhì)，得海藻酸鈉溶液；2)將海藻酸鈉溶液滴加到過(guò)量的二價(jià)金屬Ba2+或Ca2+鹽溶液中形成凝膠微球，經(jīng) 0. 5 1小時(shí)聚合過(guò)程后，取出凝膠微球，用蒸餾水充分洗滌凝膠微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中過(guò)濾膜的孔徑為 O.Sym的硝酸纖維素膜；步驟2)中二價(jià)金屬鹽溶液為Ba2+或Ca2+的鹽溶液，濃度為50mM lOOmMo
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的制備方法，其特征在于所述凝膠微球分別經(jīng)酸性溶液和 堿性溶液浸泡的具體操作過(guò)程為，1)將海藻酸鹽凝膠微球置于pH2. 0 4. 0,0. 5M 3M酸性溶液中浸泡5 24小時(shí)， 取出凝膠微球用蒸餾水充分洗滌；2)將步驟1)中得到的凝膠微球轉(zhuǎn)移至pH8. 0 9. 0、55mM 800mM的堿性溶液中浸 泡2 12小時(shí)，然后將凝膠微球取出，再次用蒸餾水充分洗滌。
5.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中酸性溶液為鹽酸溶 液、醋酸溶液、或它們二者任意比混合酸溶液；所述步驟2)中堿性溶液為檸檬酸鈉溶液、磷 酸鈉鹽溶液、或它們二者任意比混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的制備方法，其特征在于凝膠再經(jīng)鰲合劑溶解并過(guò)濾與透 析的具體操作過(guò)程為，1)將經(jīng)酸性溶液、堿性溶液浸泡后的凝膠微球溶解到pH10. 0 12. 0、55mM 500mM 的螯合鹽溶液中，溶液經(jīng)膜過(guò)濾；2)將步驟1)中得到的溶液再透析20 30小時(shí)，得到海藻酸鈉溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求書6所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中螯合鹽溶液為 EDTA、EGTA、或者它們二者任意比混合液；凝膠體積與螯合鹽溶液體積比=1 1 1 5; 所述步驟2)膜過(guò)濾為分別經(jīng)孔徑為0. 45 y m和0. 22 P m硝酸纖維素膜過(guò)濾溶液；所述透析 膜截流分子量12 14kDa。
8.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的制備方法，其特征在于在無(wú)菌環(huán)境下，用有機(jī)溶液將海藻 酸鈉析出并冷凍干燥的具體操作過(guò)程為，將被透析膜截留的NaALG溶液緩慢倒入有機(jī)溶液 中形成絮狀沉淀，沉淀經(jīng)冷凍干燥獲得組織工程用海藻酸鈉。所述有機(jī)溶液為C1 C3的 醇、醚、酮或它們的任意比混合物，NaALG溶液與有機(jī)溶液體積比=1 2 1 10。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組織工程用海藻酸鈉的制備方法，其以市售食品級(jí)海藻酸鈉為原料，經(jīng)活性炭吸附并形成凝膠，此凝膠分別經(jīng)酸性溶液和堿性溶液浸泡，再經(jīng)鰲合劑溶解并過(guò)濾與透析，最后在無(wú)菌環(huán)境下，用有機(jī)溶液將海藻酸鈉析出并冷凍干燥。本發(fā)明通過(guò)上述過(guò)程去除海藻酸鈉中雜蛋白、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，獲得組織工程用海藻酸鈉。
文檔編號(hào)C08B37/04GK101831002SQ20091001065
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2009年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者于煒婷, 張英, 朱靜, 謝威揚(yáng), 謝紅國(guó), 馬小軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所