專利名稱：纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素水解領(lǐng)域，尤其是利用纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的領(lǐng)域。
技術(shù)背景傳統(tǒng)能源的緊缺引起燃料乙醇產(chǎn)業(yè)迅速崛起，以玉米、小麥等糧食作物為原料生產(chǎn)燃料 酒精易引發(fā)糧食短缺，為此各國(guó)政府開(kāi)始積極鼓勵(lì)通過(guò)農(nóng)業(yè)廢棄物如秸稈、蔗渣等木質(zhì)纖維 素原料生產(chǎn)燃料乙醇。該技術(shù)主要通過(guò)對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理、纖維素酶水解及酒精發(fā)酵獲得產(chǎn) 品。其中纖維素酶水解木質(zhì)纖維素是該技術(shù)中的關(guān)鍵步驟，屬于較為復(fù)雜的異相生物化學(xué)反 應(yīng)體系。該領(lǐng)域目前的研究熱點(diǎn)主要集中在提高酶利用率、維持酶活力、減少微生物污染等， 最終目的都在于提高糖化率及纖維素轉(zhuǎn)化率，目前普通酶解的纖維素轉(zhuǎn)化率一般在50%左右， 經(jīng)非離子表面活性劑增強(qiáng)后可升高到75%左右。事實(shí)上，纖維素酶在反應(yīng)底物中木質(zhì)素表面 的吸附會(huì)造成部份酶的失效，通過(guò)添加非離子型的表面活性劑可以抑制酶的無(wú)效吸附，改善 物質(zhì)在兩相間的擴(kuò)散性質(zhì)，迅速提高反應(yīng)速率，但反應(yīng)一段時(shí)間后，其在底物及酶分子表面 的吸附達(dá)到平衡，使反應(yīng)面更新速度下降，體系逐漸處于相對(duì)不靈活狀態(tài)。超聲的作用可迅 速去除已反應(yīng)表面剩余的固態(tài)顆粒，更新反應(yīng)面，增強(qiáng)傳質(zhì)，促進(jìn)反應(yīng)，但超聲產(chǎn)生的極端 理化條件容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使酶失活。當(dāng)反應(yīng)條件(如表面活性劑的用量，超聲強(qiáng)度， 超聲方式，超聲時(shí)間等)控制合理，表面活性劑和超聲的聯(lián)合可產(chǎn)生互補(bǔ)效應(yīng)，明顯改善反 應(yīng)效果。發(fā)明內(nèi)容為了克服上述纖維素酶在水解木質(zhì)纖維素過(guò)程存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種以聚乙二醇 作為添加劑并采用間歇超聲處理的纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，通過(guò)聚乙二醇的加入， 以及超聲的作用，克服水解過(guò)程纖維素酶的無(wú)效吸附，提高反應(yīng)活性點(diǎn)更新速度及反應(yīng)物的 接觸頻率，抑制酶失活，減少酶用量，增強(qiáng)體系反應(yīng)能力，提高纖維素轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明主要通過(guò)以下的方法實(shí)現(xiàn)將木質(zhì)纖維素分散于檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液中，添加聚乙二醇和纖維素酶，反應(yīng)15 35h后，按每20 30min間歇性施加功率為20 80W的超聲，每次超聲處理時(shí)間1 10s，總 超聲時(shí)間為2 10min;其中每1L緩沖溶液添加木質(zhì)纖維素20 60g，聚乙二醇1.0 5.0g， 纖維素酶0.2 1.0g。反應(yīng)溫度控制在45 55°C。其中超聲功率優(yōu)選20 60W，每次超聲處理的時(shí)間優(yōu)選2 8s，總超聲的時(shí)間優(yōu)選3 8min，聚乙二醇用量?jī)?yōu)選L5 4.5g/L，木質(zhì)纖維素30 50 g/L，纖維素酶0.4 0.8 g/L。上述水解反應(yīng)的木質(zhì)纖維素由植物纖維通過(guò)下述方法預(yù)處理得到植物纖維烘干并粉碎至60 80目，分散在堿液中蒸煮處理2 6h，過(guò)濾，并用水洗滌至 濾液pH為5 7，烘干即得。其中堿液可以選擇氫氧化鈉溶液或者氫氧化鉀溶液等，植物纖維可以是玉米秸稈、甘蔗 渣、稻草秸稈、木屑或竹粉等，反應(yīng)固液比為l: 10g/mL。本發(fā)明通過(guò)在纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的體系中加入聚乙二醇，改善物質(zhì)在兩相間的擴(kuò) 散性質(zhì)，提高初期反應(yīng)速率，同時(shí)為了防止因吸附作用所導(dǎo)致的反應(yīng)活性的降低，在反應(yīng)進(jìn) 行一段時(shí)間后如進(jìn)行2 10小時(shí)后，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行間歇性的超聲處理， 一方面，適當(dāng)強(qiáng)度 的超聲可破壞表面活性劑吸附層，加速反應(yīng)表面的更新，增強(qiáng)傳質(zhì)，促進(jìn)反應(yīng)。另一方面， 表面活性劑以膠束形式與酶的疏水位點(diǎn)相結(jié)合，通過(guò)屏蔽變性蛋白質(zhì)間的疏水作用來(lái)抑制其 聚集并輔助復(fù)性，因此一定程度上可保護(hù)受超聲影響的酶，同時(shí)可以穩(wěn)定超聲波引起的超聲 空化、表面不穩(wěn)定、微沖流等現(xiàn)象。因此通過(guò)上述聚乙二醇和超聲的協(xié)同作用，可以在較為 溫和的條件下使纖維素轉(zhuǎn)化率提高到80%以上。實(shí)施例中所述的DNS法和HPLC法的具體原理如下DNS法纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸(DNS)還原，生成棕紅色的氨基化合物，在540nm波長(zhǎng)處有最大光吸收，在一 定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利用比色法測(cè)定其還原糖生成的量就 可測(cè)定纖維素酶的活力。HPLC法是用高效液相法檢測(cè)還原糖。由于還原糖在紫外無(wú)吸收，所以選擇示差折光檢測(cè)器。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。 實(shí)施例1玉米秸稈粉碎至60 80目，以固液比為l: 10g/mL，分散在1.0% NaOH溶液中，蒸煮 處理2h，趁熱過(guò)濾，并用水洗滌至濾液pH為5 7，烘干備酶解使用。甘蔗渣粉碎至60 80目，以固液比為l: 10 g/mL，分散在1.0% KOH溶液屮，蒸煮處 理3h，趁熱過(guò)濾，并用水洗滌至濾液pH為5 7，烘干備酶解使用。稻草秸稈粉碎至60 80目，以固液比為l: 10g/mL，分散在0.9% NaOH溶液中，蒸煮 處理5h，趁熱過(guò)濾，并用水洗滌至濾液pH為5 7，烘干備酶解使用。實(shí)施例2取玉米秸稈預(yù)處理得到的木質(zhì)纖維素40g/L，分散于pH為5. 0的0. lmol/L檸檬酸—檸 檬酸鈉緩沖溶液，搖勻后添加0.6g/L纖維素酶開(kāi)始水解。反應(yīng)60小時(shí)后，以DNS法和HPLC測(cè)濾液中總還原糖及葡萄糖含量，總還原糖得率為328mg/g干料，最終纖維素轉(zhuǎn)化率為55.8 %。實(shí)施例3取玉米秸稈預(yù)處理得到的木質(zhì)纖維素40g/L，分散于pH為5. 0的0. lmol/L檸檬酸一檸 檬酸鈉緩沖溶液，加入2.0g/L聚乙二醇4000，搖勻，50。C靜置2小時(shí)后添加0.6g/L纖維素 酶開(kāi)始水解。反應(yīng)60小時(shí)后，以DNS法和HPLC測(cè)濾液中總還原糖及葡萄糖含量，總還原糖 得率為398mg/g干料，最終纖維素轉(zhuǎn)化率為72. 1%。實(shí)施例4:取稻草秸稈預(yù)處理得到的木質(zhì)纖維素50g/L，分散于pH為5. 0的0. lmol/L檸檬酸一檸 檬酸鈉緩沖溶液，搖勻后添加0. 8g/L纖維素酶開(kāi)始水解。反應(yīng)15小時(shí)后，每間歇20min，施 加功率30W的超聲波處理3s，總超聲時(shí)間6min，以DNS法和HPLC測(cè)濾液中總還原糖及葡萄 糖含量，總還原糖得率為357mg/g干料，最終纖維素轉(zhuǎn)化率為63.2%。實(shí)施例5取玉米秸稈預(yù)處理得到的木質(zhì)纖維素40g/L，分散于pH為5. 0的0. lniol/L檸檬酸一檸 檬酸鈉緩沖溶液，加入2. Og/L聚乙二醇4000,搖勻后5(TC靜置2小時(shí)后添加0. 8g/L纖維素 酶開(kāi)始水解。反應(yīng)15小時(shí)后，每間歇20min，施加功率30W的超聲波處理3s,總超聲時(shí)間 6min，以DNS法和HPLC測(cè)濾液中總還原糖及葡萄糖含量，總還原糖得率為447mg/g干料，最 終纖維素轉(zhuǎn)化率為80.8%。實(shí)施例6取甘蔗渣預(yù)處理得到的木質(zhì)纖維素40g/L，分散于pH為5. 0的0. lmol/L檸檬酸一檸檬 酸鈉緩沖溶液，加入3. Og/L聚乙二醇4000，搖勻后48。C靜置2小時(shí)后添加0. 8g/L纖維素酶 開(kāi)始水解。反應(yīng)15小時(shí)后，每間歇20min,施加功率40W的超聲波處理3s,總超聲時(shí)間6min， 以DNS法和HPLC測(cè)濾液中總還原糖及葡萄糖含量，總還原糖得率為510mg/g干料，最終纖維 素轉(zhuǎn)化率為84.6%。實(shí)施例7取稻草秸稈預(yù)處理得到的木質(zhì)纖維素50g/L，分散于pH為5. 0的0. lniol/L檸檬酸一檸 檬酸鈉緩沖溶液，加入2.5g/L聚乙二醇4000，搖勻后50。C靜置2小時(shí)后添加0.54g/L纖維 素酶開(kāi)始水解。反應(yīng)15小時(shí)后，每間歇20min，施加功率30W的超聲波處理3s，總超聲時(shí)間 6min，以DNS法和HPLC測(cè)濾液中總還原糖及葡萄糖含量，總還原糖得率為421mg/g干料，最終纖維素轉(zhuǎn)化率為77.8%。 實(shí)施例8取玉米秸稈預(yù)處理得到的木質(zhì)纖維素50g/L，分散于pH為5. 0的0. lmol./L檸檬酸一檸 檬酸鈉緩沖溶液，加入3. 0g/L聚乙二醇4000，搖勻后5(TC靜置2小時(shí)后添加0. 8g/L纖維素 酶開(kāi)始水解。反應(yīng)15小時(shí)后，每間歇20min，施加功率40W的超聲波處理2s，總超聲時(shí)間 4niin，以DNS法和HPLC測(cè)濾液中總還原糖及葡萄糖含量，總還原糖得率為545mg/g干料，最 終纖維素轉(zhuǎn)化率為85.3%。實(shí)施例9取稻草秸稈預(yù)處理得到的木質(zhì)纖維素45g/L，分散于pH為5. 0的0. lmol/L檸檬酸一檸 檬酸鈉緩沖溶液，加入3. 5g,/L聚乙二醇4000，搖勻后52。C靜置2小時(shí)后添加0. 8g/L纖維素 酶開(kāi)始水解。反應(yīng)15小吋后，每間歇20min，施加功率50W的超聲波處理2s，總超聲時(shí)間 4min，以DNS法和HPLC測(cè)濾液中總還原糖及葡萄糖含量，總還原糖得率為497mg/g千料，最 終纖維素轉(zhuǎn)化率為81.8%。由上述實(shí)施例可得，申.純用纖維素酶進(jìn)行水解處理，木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化率很低，大概只 要55%左右，如實(shí)施例2只有55.8%，單獨(dú)添加聚乙二醇或者單獨(dú)進(jìn)行超聲處理后，纖維素 酶水解的效果有所提高，如實(shí)施例3是在聚乙二醇的作用下進(jìn)行水解，轉(zhuǎn)化率達(dá)到72. 1%， 實(shí)施例4是在超聲作用下進(jìn)行水解，轉(zhuǎn)化率達(dá)到63.2%。將間歇性超聲處理處理和聚乙二醇 結(jié)合起來(lái)以后，水解的效果明顯提升，如實(shí)施例8，最高可以達(dá)到85.3%的轉(zhuǎn)化率。
權(quán)利要求
1. 一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于將木質(zhì)纖維素分散于檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液中，添加聚乙二醇和纖維素酶，反應(yīng)15～35h后，按每20～30min間歇性施加功率為20～80W的超聲，每次超聲處理時(shí)間1～10s，總超聲時(shí)間為2～10min；其中每1L緩沖溶液添加木質(zhì)纖維素20～60g，聚乙二醇1.0～5.0g，纖維素酶0.2～1.0g。反應(yīng)溫度控制在45～55℃。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于所述的超聲功 率為20 60W。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于每次超聲處理的時(shí)間為2 8秒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于總超聲時(shí)間為3 8分鐘
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4所述的任一一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于所述 的木質(zhì)纖維素由下述方法預(yù)處理得到植物纖維烘干后粉碎至60 80目，在堿液中蒸煮處理2 6小時(shí)，過(guò)濾，并用水洗滌 至濾液pH為5 7，烘干即得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于所述的堿液為 氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于所述的植物纖 維可以是玉米秸稈、甘蔗渣、稻草秸稈、木屑或竹粉。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于所述的植物纖維和堿液的固液比為l: 10g/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的方法，通過(guò)將木質(zhì)纖維素分散于檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入聚乙二醇和纖維素酶，在間歇性超聲作用下進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維素的水解，本發(fā)明的技術(shù)方案克服了單純加入聚乙二醇對(duì)酶的吸附以及單純使用超聲造成酶的失活影響，有效提高了纖維素酶水解木質(zhì)纖維素的效率。
文檔編號(hào)C08B15/00GK101544699SQ200910039240
公開(kāi)日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2009年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者偉 劉, 浩 龐, 兵 廖, 計(jì)紅果 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州化學(xué)研究所