專利名稱：一種固定化豬胰脂肪酶載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于固定化酶載體的制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固定化豬胰脂肪 酶載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
酶是生物催化劑，具有專一性強(qiáng)、催化效率高和作用條件溫和等顯著特點(diǎn)。 因而其應(yīng)用很廣泛，可用在輕工、食品、伺料、醫(yī)藥、化工、環(huán)保與能源、分 析檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。但是由于自由酶存在與產(chǎn)物難分離且易失活的缺點(diǎn)，人們 嘗試了通過各種方法對(duì)酶分子進(jìn)行修飾，其中方法之一就是固定化酶的研究， 從而改變酶的某些特性和功能，使其克服自由酶的缺點(diǎn)。固定化酶的研究始于
上世紀(jì)50年代，經(jīng)過50多年的研究和發(fā)展，在酶的固定化方面，先后開發(fā)了 性能多樣的載體材料和固定化方法，然而真正投入工業(yè)化應(yīng)用的固定化酶卻不 多，其原因是酶固定化使用的試劑和載體成本高、固定化效率低、穩(wěn)定性差等。 在我國大力倡導(dǎo)建立資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會(huì)的今天，進(jìn)一步開發(fā)性能更 加優(yōu)異而價(jià)廉的載體材料，使酶的固定化更簡便、更實(shí)用，讓更多的固定化酶 獲得工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用，仍是現(xiàn)今追求的目標(biāo)。
在酶固定化載體材料方面，主要包括無機(jī)載體材料、有機(jī)載體材料和高 分子載體材料等，其中高分子載體材料是較為重要的載體材料。高分子載體材 料又分為天然高分子載體材料和合成高分子載體材料。合成高分子載體材料是 目前研究最為活躍的固定化酶載體材料，也是目前應(yīng)用和報(bào)道得最多的一類固 定化酶載體材料，主要是由合成高分子載體材料的化學(xué)穩(wěn)定性高、機(jī)械性能好、 與酶的固定化擔(dān)載量大決定的。
酶的固定化方法主要包括包埋法、交聯(lián)法和載體結(jié)合法三種；其中的載體 結(jié)合法又包括離子結(jié)合法、物理吸附法和共價(jià)結(jié)合法。對(duì)于合成高分子載體材 料與酶的固定化，主要是共價(jià)結(jié)合法。共價(jià)結(jié)合法是酶蛋白分子上的官能團(tuán)和固相支持物表面上的活潑基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接(酶蛋白的非必需基團(tuán) 通過共價(jià)鍵和載體形成不可逆的連接)，從而固定酶的方法。由于酶與載體間 連接牢固，不易發(fā)生酶脫落，有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，是目前研究最為 活躍的一類酶固定化方法。
對(duì)酶的共價(jià)結(jié)合法研究而言，載體固定化酶時(shí)要求載體中含有能與酶分子 中的某一基團(tuán)(如氨基、羧基、巰基、羥基、酚基、咪唑基等的其中一種基團(tuán)) 反應(yīng)的活潑基團(tuán)，而活潑基團(tuán)與酶分子反應(yīng)后又不破壞酶分子的活性中心。這 些活潑基團(tuán)通常包括重氮基團(tuán)、迭氮基團(tuán)、亞氨碳酸基團(tuán)、二氯-均三嗪基團(tuán)、 環(huán)氧基團(tuán)等。
目前，在合成高分子載體材料方面，國外最具代表性的包括Kotha等以 環(huán)己醇為致孔劑、二乙烯苯為交聯(lián)劑制得GM-三丙烯酸三甲醇基丙烷酯共聚物，
Ponmthnam等研究大孔交聯(lián)甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)共聚物載體的制備， 德國的ROM公司生產(chǎn)EupergitC等含環(huán)氧基團(tuán)的固定化酶載體等。而在國內(nèi)， 從事這方面研究的主要包括華東理工大學(xué)的盧冠忠及其弟子烏云高娃、薛屏 等人合成含環(huán)氧基團(tuán)的固定化酶載體，烏云高娃等選用反應(yīng)性單體甲基丙烯酸 縮水甘油酯(GMA)、以N，N'-亞甲基雙(丙烯酰胺)(MBAA)為交聯(lián)劑、甲酰胺 為致孔劑，用反相懸浮聚合方法制得一系列珠狀共聚物載體；薛屏等選用含有 活性環(huán)氧基團(tuán)的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和親水性的N-乙烯吡咯烷酮(NVP) 兩種單體，以N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、甲醇水溶液作致孔劑、 液體石蠟為主介質(zhì)，通過反相懸浮聚合技術(shù)成功地合成了親水性大孔GMA-NVP -MBAA三元共聚物載體(G麗)，另設(shè)計(jì)反相懸浮聚合體系，制備了聚甲基丙烯酸 縮水甘油酯(GMA)-甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA) -N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA) 親水性磁性聚合物GHM微球，并且還制備了含鈷MCM-48和MCM-41等的介孔分 子篩用作酶固定化的載體；南開大學(xué)的黃家賢等人合成含環(huán)碳酸酯基團(tuán)的固定 化酶載體，此合成載體是以乙烯撐碳酸酯(VCA)為反應(yīng)性單體、親水性N，N '-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑，分別選用N-乙烯基吡咯垸酮(NVP) 和丙烯酸-0-羥乙酯(HEMA)兩種親水性共單體為合成酶載體的成分，首次以二甲基甲酰胺和線型高分子聚乙二醇400為復(fù)合致孔劑，同時(shí)還通過反相懸浮
聚合，以液體石蠟為介質(zhì)、VCA為反應(yīng)性單體、甲基丙烯酸-3-羥乙酯(HE^0 及丙烯酸羥丙酯(HPA)為親水性共聚單體，合成出一系列交聯(lián)樹脂聚合物作為 固定化酶載體；河北大學(xué)李源勛等以丙烯酸反應(yīng)性單體和二乙烯基苯為交聯(lián) 劑、石油醚為致孔劑，通過懸浮聚合制備固定化酶的載體；除此以外，還有其 他研究者對(duì)于固定化酶載體都作了不同層面的研究。
從以上這些合成高分子載體材料來看，其中的活潑基團(tuán)主要是環(huán)氧基團(tuán)， 環(huán)碳酸酯基團(tuán)等活潑基團(tuán)。
脂肪酶(lipase, E.C.3.1.1.3)也可定義為羧酸酯酶，它催化長鏈脂酰 甘油水解為甘油、游離脂肪酸和單、雙甘油酯?？捎糜诿杆軕?yīng)用的各個(gè)領(lǐng)域， 如用于食品加工和品質(zhì)改良，作面包改進(jìn)劑，用于奶酪增香等；在紡織加工中 用于脫脂處理，作為洗滌劑的添加劑可以達(dá)到更好的去污目的；更重要的還可 用于生產(chǎn)生物柴油，生物柴油是生物質(zhì)能的一種形式，具有綠色、可再生、能 耗低等優(yōu)點(diǎn)，與普通柴油相比，具有環(huán)境友好的特點(diǎn)，其柴油車尾氣中有毒有 機(jī)物排放量僅為10%，顆粒物為20%， C02和C0排放量僅為10%，據(jù)分析，對(duì)整 個(gè)大氣的影響，生物柴油排放的C02要比礦物柴油少約50%，可見，將固定化 脂肪酶用于生產(chǎn)生物柴油將是一項(xiàng)很有前途的事業(yè)，能夠緩解石油即將枯竭和 環(huán)境污染對(duì)人類造成的危機(jī)。
關(guān)于脂肪酶的固定化和應(yīng)用等的研究報(bào)道，主要包括國外有印度喜馬偕 爾邦大學(xué)的.Kanwar合成丙烯酸類載體固定化脂肪酶研究，馬來西亞博特拉大 學(xué)的Yimas用聚(甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸甲酯，二乙烯基苯)微球固定化 脂肪酶，MahiranBasri用疏水有機(jī)載體固定脂肪酶，日本京都大學(xué)的Toshio Hayashi將脂肪酶固定到多孔聚乙烯醇珠、聚丙烯醛珠上進(jìn)行研究；國內(nèi)有中
國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所的辛嘉英等，中國科學(xué)院微生物研究所的寇秀 芬，南開大學(xué)的徐慧顯用丙烯酸類載體固定化脂肪酶，江蘇石油化工學(xué)院的盛
梅，北京化工大學(xué)譚天偉及其弟子彭立鳳等對(duì)脂肪酶的固定化及其應(yīng)用研究。
豬胰脂肪酶作為脂肪酶中的一種，從結(jié)構(gòu)上也同樣具有脂肪酶的結(jié)構(gòu)特
6點(diǎn)， 一是都包括同源區(qū)段:His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W- Gly (X、 Y、 W、 Z是可變的氨基酸殘基)；二是活性中心為絲氨酸殘基，正常情況 下受一個(gè)a-螺旋蓋保護(hù)。從性質(zhì)上同時(shí)具有酶的優(yōu)缺點(diǎn)，也有很多具體的應(yīng)用， 如可以催化以己二酸二乙烯酯與1， 4-丁二醇為代表的非手性羧酸衍生物聚合 反應(yīng)，也可以催化手性羧酸衍生物的聚合，Dafha.Knani等以豬胰脂肪酶(PPL) 作催化劑，進(jìn)行光活性側(cè)取代羥基酯的聚合，結(jié)果得到具有光學(xué)活性的低聚體。 目前，對(duì)于合成高分子載體對(duì)豬胰脂肪酶的固定化及應(yīng)用方面的研究還并 不多，巴西圣保羅大學(xué)的Arieva V Paula將豬胰脂肪酶固定于聚硅氧烷-乙烯 醇上制備生物柴油，武漢大學(xué)的賀楓、南開大學(xué)的謝志東等對(duì)豬胰脂肪酶的固 定化也進(jìn)行過研究。
但到目前為止，還未有可實(shí)現(xiàn)商品化的固定化豬胰脂肪酶上市。主要原因 正如前面所談到的，由于制備方法復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、成本高等缺點(diǎn)，致使 其難以達(dá)到工業(yè)化的要求，制得的產(chǎn)品酶固定化的效率低，且固定化酶活性保 持的穩(wěn)定性差。
本發(fā)明的目的是提供一種新的固定化豬胰脂肪酶載體，其固定化豬胰脂肪 酶的效率高，且固定化酶活性保持的穩(wěn)定性好。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法， 可克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的載體制備復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、成本高、難工業(yè)化等 缺點(diǎn)。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是
一種固定化豬胰脂肪酶載體，它是一種含琥珀酰亞胺酯基基團(tuán)的大孔珠狀 交聯(lián)聚合物，具有下述通式I所表示的結(jié)構(gòu)

發(fā)明內(nèi)容
通式I其中，[B是以丙烯酸(AA)為反應(yīng)性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA) 為交聯(lián)劑形成的高聚物中除羧基以外的部分。
上述固定化豬胰脂肪酶載體，可通過下述方法制備以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復(fù)合分散劑、煤油為分散相、丙烯酸(AA)為反應(yīng)性 單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙二醇為致孔劑，采用反 相懸聚合技術(shù)制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活 化，即制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。
Span40禾口 Span80的HLB值(Hydrophily and Lipophilyty Balance,親
水親油平衡值)分別為6.7和4.3，在本發(fā)明上述固定化豬胰脂肪酶載體的制 備方法中作為復(fù)合分散劑時(shí)，將二者混合后的HLB值調(diào)節(jié)至4.5 6即可，以 此控制Span40和Span80 二者的用量比例；復(fù)合分散劑的總用量可按分散相煤 油質(zhì)量的10% 30%計(jì)算。
交聯(lián)劑N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)的質(zhì)量可優(yōu)選為單體丙烯酸(AA) 質(zhì)量的40% 60%;
致孔劑乙二醇的用量可為單體丙烯酸(AA)質(zhì)量的70% 100%;
此外，本發(fā)明上述固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法中，還可加入過硫酸 銨(AP)作為自由基反應(yīng)的催化劑，催化劑AP的加入量可為單體丙烯酸(AA) 質(zhì)量的1.5% 4%;同時(shí)還可加入四甲基乙二胺(TMEDA)作為加速AP產(chǎn)生自由 基的加速劑(由于TMEDA本身容易產(chǎn)生自由基從而加速AP產(chǎn)生自由基發(fā)生反 應(yīng)，所以TMEDA的加入量與實(shí)際的反應(yīng)有關(guān)，只要能使反應(yīng)發(fā)生便可，結(jié)合成 本等進(jìn)行考慮，可按催化劑AP質(zhì)量的7 10倍計(jì)算)。
上述制備方法可優(yōu)選包括下述主要步驟
(1) 、制備油相
將Span40和Span80組成的復(fù)合分散劑溶解于有機(jī)分散相煤油中，混勻； 再加入四甲基乙二胺(TMEDA)，混勻，構(gòu)成油相；
(2) 、制備水相-
將丙烯酸(AA)、 N，N、-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于水中(按體積比計(jì)算，水的用量可為丙烯酸體積的1 4倍)，加入過硫酸銨(AP)，混 勻，構(gòu)成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
以0.5 2d/s的速度將(2)步制得的水相滴加(可用滴液漏斗或其它方 式滴加，以保證滴加進(jìn)入油相的水相液滴大小基本相似)于(1)步制得的油 相中進(jìn)行分散(其中油相與水相的體積比控制在^4即可，從節(jié)約成本考慮， 可以4:1 10:1為佳)，控制攪拌速度為100 350r/min;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下10 3CTC的室溫進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間1 2小時(shí)；
反應(yīng)結(jié)束后，回收上層溶液(可通過傾倒上層液體等方式回收)，向反應(yīng) 產(chǎn)物中加入體積濃度》65%的乙醇(其用量以浸沒產(chǎn)物即可)，混勻后靜置5小 時(shí)以上(考慮生產(chǎn)周期的問題，可靜置5 24小時(shí))，除去上層乙醇溶液；再 反復(fù)用水洗至無煤油味和酒精味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥 箱中35 6(TC烘干至恒重，得未活化載體備用；
(4) 、制備活化載體
取(3)步干燥至恒重的未活化載體，在四氫呋喃(THF)作溶劑的條件下， 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作脫水劑，與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在10 30 T反應(yīng)2 4小時(shí)，反應(yīng)過程中不斷攪拌(因?yàn)檫@是一個(gè)放熱反應(yīng)，攪拌的目 的是散熱)；反應(yīng)結(jié)束后回收溶劑；再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲 (DCU)，抽濾，于真空干燥箱中35 6(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為本 發(fā)明上述固定化豬胰脂肪酶載體(一種含琥珀酰亞胺酯基基團(tuán)的大孔珠狀交聯(lián) 聚合物)。
上述步驟(4)制備活化載體過程中，反應(yīng)物(未活化載體、NHS)、與脫 水劑DCC的用量可按未活化載體中反應(yīng)性單體:N-羥基琥珀酰亞胺:二環(huán)己基碳 二亞胺(摩爾比)二1:(1 1.2):(1 1.2)計(jì)算(未活化載體中反應(yīng)性單體的摩 爾量可根據(jù)反應(yīng)率計(jì)算)；NHS與DCC可稍過量，以保證未活化載體中的羧基充 分反應(yīng)；溶劑THF的用量以能溶解DCC、 NHS即可。
上述制備方法的反應(yīng)過程中，所發(fā)生的主要化學(xué)反應(yīng)式如下所示<formula>formula see original document page 10</formula>
本發(fā)明上述制備方法中合成大孔珠狀交聯(lián)聚合物與豬胰脂肪酶的固定化 方法為共價(jià)結(jié)合法。
根據(jù)豬胰脂肪酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本發(fā)明以丙烯酸(AA)為反應(yīng)性單體、N，N' -亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙二醇為致孔劑，以煤油為有機(jī)分散 相，采用反相懸浮聚合技術(shù)合成水不溶性支持物交聯(lián)丙烯酸多孔微球，以N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化此聚合物而引入琥珀酰亞胺酯活性基團(tuán)，此活性 基團(tuán)在室溫下就可與豬胰脂肪酶中的氨基酸殘基反應(yīng)而不破壞活性中心達(dá)到 固載酶的目的。
本發(fā)明固定化豬胰脂肪酶載體在固定化豬胰脂肪酶時(shí)，上述活化載體通過 琥珀酰亞胺酯活性基團(tuán)與豬胰脂肪酶中的H2N-基團(tuán)反應(yīng)，達(dá)到固定化豬胰脂肪 酶的作用。
上述固定化豬胰脂肪酶載體，除可作為豬胰脂肪酶的固定化載體外，還可 作為其它脂肪酶、中性蛋白酶、a-淀粉酶等的固定化載體。
在固定化豬胰脂肪酶等的過程中，其主要反應(yīng)式可表示如下<formula>formula see original document page 10</formula>
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明固定化豬胰脂肪酶載體，通過以丙烯酸為反應(yīng)性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑形成高聚物，同時(shí)引入了琥珀酰亞胺酯活性基團(tuán)，使其 固定化豬胰脂肪酶等所需的時(shí)間較短，僅需1小時(shí)，且固定化效率高，固定化
酶活性保持的穩(wěn)定性好；其固定化酶表觀活性高，可達(dá)750U/g及以上。而且， 除了可用于固定化豬胰脂肪酶，還可用于固定化其它脂肪酶、中性蛋白酶、a -淀粉酶等。
此外，本發(fā)明提供的上述固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法，可克服現(xiàn)有 技術(shù)中存在的載體制備復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、成本高、難工業(yè)化等缺點(diǎn)，其主
要優(yōu)點(diǎn)如下
第一，原料價(jià)廉易得，且都為低毒或是無毒的試劑，成本較低； 第二，反應(yīng)條件溫和，在我國南方常年根本不須加熱，操作簡單； 第三，所需裝置簡單，可進(jìn)一步降低成本；
第四，反應(yīng)時(shí)間短，可縮短生產(chǎn)周期，保證年產(chǎn)量高，提高經(jīng)濟(jì)效益。 綜合上述優(yōu)點(diǎn)，該制備方法操作簡單、反應(yīng)條件溫和、且成本低、年產(chǎn)量 高，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益好。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1步驟(3)所制得未活化載體的紅外圖譜。 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1步驟(4)所制得活化載體的紅外圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。
實(shí)施例l
本實(shí)施例為通過下述方法制得的固定化豬胰脂肪酶載體
以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復(fù)合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸(AA)為反應(yīng)性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙 二醇為致孔劑，采用反相懸聚合技術(shù)制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)活化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。
ii所用的原料包括
反應(yīng)性單體丙烯酸(AA) 5mL (約5.3g)，
交聯(lián)劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA) 2. lg (為AA質(zhì)量的約40%)， 致孔劑乙二醇4.0mL (約4.5g，為AA質(zhì)量的約85。/。)， 分散劑Span40和Span80的用量比例以將二者混合后的HLB值調(diào)節(jié)至5進(jìn) 行控制，其總用量為12g， 分散相煤油100mL，
催化劑過硫酸銨(AP) 0. lg (為AA質(zhì)量的約1.9%)， 加速劑四甲基乙二胺(TMEDA) lmL (約0.77g，為AP質(zhì)量的約7. 7倍)； 此外，制備活化載體過程中，反應(yīng)物(未活化載體、N-羥基琥珀酰亞胺) 與脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺的用量分別為
未活化載體2g (其中反應(yīng)性單體約為0. 02摩爾)， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 2. 2g (0.02摩爾)， 脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 3.9g (0.02摩爾)。 具體制備方法包括下述主要步驟
(1) 、制備油相
先用小燒杯稱量Span40和Span80組成的復(fù)合分散劑，向燒杯中加入少量 有機(jī)分散煤油，由于Span40是固體，需要稍微加熱使之溶解，然后轉(zhuǎn)入四口 瓶中，再用煤油洗滌燒杯2次轉(zhuǎn)移至四口瓶，攪拌并通氮?dú)饣旌暇鶆颍辉偌尤?四甲基乙二胺(TMEDA)，混勻，構(gòu)成油相；
(2) 、制備水相
將丙烯酸(AA)、 N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于10ml 水中，加入過硫酸銨(AP)，混勻，構(gòu)成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
采用滴液漏斗，以ld/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)制得的 油相中進(jìn)行分散，控制攪拌速度為250r/min;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下約18'C進(jìn)行反應(yīng)， 反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，采用傾倒方式回收上層溶液，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入95%乙醇 100ml，混勻后靜置過夜，除去上層乙醇溶液；再反復(fù)用水洗至無煤油味和酒
精味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中40 45'C烘干至恒重， 得未活化載體共5. 92g，計(jì)算反應(yīng)率，約為80%，備用；
發(fā)明人采用KBr壓片方法(參照汪昆化，羅傳秋，周嘯.聚合物近代儀器分 析[M].北京清華大學(xué)出版社，1991:20 44)對(duì)此未活化載體進(jìn)行了檢測(cè)， 獲得了如圖1所示的紅外(IR)圖譜；從圖1中可以看出，3431. 9處為一寬峰， 說明有-C00H存在，同時(shí)在1172. 7和1115. 1出現(xiàn)丙烯酸發(fā)生交聯(lián)聚合的特征 峰，1721. 5為-C00H中-0=0的峰；1650. 2和1452為MBAA中酰胺鍵的特征峰， 1650. 2為-C=0的峰，1452為C-N鍵的振動(dòng)峰；其余的為骨架振動(dòng)峰，從IR 分析圖譜中可以得出AA與MBAA確實(shí)發(fā)生了交聯(lián)聚合得到PAA-MBAA聚合物。 (4)、制備活化載體
取四氫呋喃(THF)分別溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (3.9g， 0.02摩爾) 與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (2. 2g， 0. 02摩爾)，(THF用量分別為40mL、 20mL)， 得到DCC溶液與NHS溶液；
另取(3)步干燥至恒重的未活化載體(2g，其中反應(yīng)性單體約為0. 02mol)， 加入上述NHS溶液，再滴加上述DCC溶液；在密閉圓底燒瓶中約18'C反應(yīng)2.5 小時(shí)，反應(yīng)過程中不斷攪拌(反應(yīng)過程在磁力攪拌器上進(jìn)行，采用磁力攪拌子 攪拌)；反應(yīng)結(jié)束后回收溶劑；再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲(DCU)， 抽濾，于真空干燥箱中40 45t:烘干至恒重，制得活化載體，即為所述的固定 化豬胰脂肪酶載體。
發(fā)明人采用前述KBr壓片方法對(duì)此活化載體進(jìn)行了檢測(cè)，獲得了如圖2所 示的紅外(IR)圖譜；從圖2中可以看出，圖譜中3000以上為尖峰，說明己 無-COOH的存在；而在1738.2， 1208.8， 1075. 9出現(xiàn)了酯基的特征峰，證明有 活性酯的生成；同時(shí)在1820.7， 1782.3新出現(xiàn)了NHS上的-C二0的峰，說明確 實(shí)是NHS參與反應(yīng)生成的酯。
外，發(fā)明人還采用橄欖油乳化液法測(cè)定了此活化載體固定化豬胰脂肪酶對(duì)橄欖油乳化液水解的的表觀活性，測(cè)定結(jié)果為850U/g (以載體干重表示)。
實(shí)施例2
本實(shí)施例為通過下述方法制得的固定化豬胰脂肪酶載體
以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復(fù)合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸(M)為反應(yīng)性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙 二醇為致孔劑，采用反相懸聚合技術(shù)制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)活化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。
所用的原料包括
反應(yīng)性單體丙烯酸(AA) 10mL (約10.5g)，
交聯(lián)劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA) 6.2g (為AA質(zhì)量的約59%)， 致孔劑乙二醇6.7mL (約7.5g，為AA質(zhì)量的約7P/。)， 分散劑Span40和Span80的用量比例以將二者混合后的HLB值調(diào)節(jié)至4. 5 進(jìn)行控制，其總用量為8g， 分散相煤油100mL，
催化劑過硫酸銨(AP) 0. 16g (為AA質(zhì)量的約1.5%)， 加速劑四甲基乙二胺(TMEDA) 2mL (約1. 5g，為AP質(zhì)量的約9. 4倍)； 此外，制備活化載體過程中，反應(yīng)物(未活化載體、N-羥基琥珀酰亞胺) 與脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺的用量分別為
未活化載體5g (其中反應(yīng)性單體約為0.047摩爾)， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 5.5 g (0.048摩爾)， 脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 9.9g (0.048摩爾)。 具體制備方法包括下述主要步驟
(1) 、制備油相
將Span40和Span80組成的復(fù)合分散劑加入有機(jī)分散相煤油中，適當(dāng)加熱 溶解，加入裝有導(dǎo)氣管和攪拌器的四口瓶中，攪拌并通氮?dú)饣旌暇鶆?；再加?四甲基乙二胺(TMEDA)，混勻，構(gòu)成油相；
(2) 、制備水相將丙烯酸(AA)、 N,N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于25ml 水中，加入過硫酸銨(AP)，混勻，構(gòu)成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
采用滴液漏斗，以ld/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)制得的 油相中進(jìn)行分散，控制攪拌速度為350r/min;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下約3(TC進(jìn)行反應(yīng)， 反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)；
反應(yīng)結(jié)束后，采用傾倒方式回收上層溶液，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入65%乙醇 220ml，混勻后靜置過夜，除去上層乙醇溶液；再反復(fù)用水洗至無煤油味和酒 精味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中55 6(TC烘干至恒重， 得未活化載體共12.86g，計(jì)算反應(yīng)率，約為77%，備用；
(4) 、制備活化載體
取四氫呋喃(THF)分別溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (9. 9g， 0. 048摩爾) 與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(5. 5g， 0. 048摩爾)，(THF用量分別為70ml、30ml)， 得到DCC溶液與NHS溶液；
另取(3)步干燥至恒重的未活化載體(5g，其中反應(yīng)性單體約為0.047 摩爾)，加入上述NHS溶液，再滴加上述DCC溶液；在密閉圓底燒瓶中約30。C 反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)過程中不斷攪拌(反應(yīng)過程在磁力攪拌器上進(jìn)行，采用磁力 攪拌子攪拌)；反應(yīng)結(jié)束后回收溶劑；再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲 (DCU)，抽濾，于真空干燥箱中55 6(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為所 述的固定化豬胰脂肪酶載體。
同樣，發(fā)明人采用橄欖油乳化液法測(cè)定了此活化載體固定化豬胰脂肪酶對(duì) 橄欖油乳化液水解的的表觀活性，測(cè)定結(jié)果為750U/g (以載體干重表示)。
實(shí)施例3
本實(shí)施例為通過下述方法制得的固定化豬胰脂肪酶載體 以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復(fù)合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸(AA)為反應(yīng)性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙 二醇為致孔劑，采用反相懸聚合技術(shù)制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。 所用的原料包括-
反應(yīng)性單體丙烯酸(AA) 2.5mL (約2.6g)，
交聯(lián)劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺MBAA) 1.3g (為AA質(zhì)量的約50%)， 致孔劑乙二醇2. 3mL (約2. 6g，為AA質(zhì)量的約100%)， 分散劑Span40和Span80的用量比例以將二者混合后的HLB值調(diào)節(jié)至6進(jìn) 行控制，其總用量為24g， 分散相煤油100mL，
催化劑過硫酸銨(AP) O.lg (為AA質(zhì)量的約3.890， 加速劑四甲基乙二胺(TMEDA) lmL (約0.77g，為AP質(zhì)量的約7. 7倍)； 此外，制備活化載體過程中，反應(yīng)物(未活化載體、N-羥基琥珀酰亞胺) 與脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺的用量分別為
未活化載體lg (其中反應(yīng)性單體約為0. 01摩爾)， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 1.3g (O.Oll摩爾)， 脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 2.3g (O.Oll摩爾)。 具體制備方法包括下述主要步驟
(1) 、制備油相
將復(fù)合分散劑Span40和Span80加入有機(jī)分散相煤油中，適當(dāng)加熱溶解， 加入裝有導(dǎo)氣管和攪拌器的四口瓶中，攪拌并通氮?dú)饣旌暇鶆?；再加入四甲?乙二胺(TMEDA)，混勻，構(gòu)成油相；
(2) 、制備水相
將丙烯酸(AA)、 N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于10ml 水中，加入過硫酸銨(AP)，混勻，構(gòu)成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
采用滴液漏斗，以2d/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)制得的 油相中進(jìn)行分散，控制攪拌速度為100r/min;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下約l(TC進(jìn)行反應(yīng)， 反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，采用傾倒方式回收上層溶液，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入70%乙醇 80ml，混勻后靜置過夜，除去上層乙醇溶液；再反復(fù)用水洗至無煤油味和酒精
味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中35 4(TC烘干至恒重，得 未活化載體共3. 16g，計(jì)算反應(yīng)率，約為80.9%，備用；
(4)、制備活化載體
取四氫呋喃(THF)分別溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (2. 3g， 0. 011摩爾) 與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(l. 3g， 0. 011摩爾)，(THF用量分別為40mL、20mL)， 得到DCC溶液與NHS溶液；
另取(3)步干燥至恒重的未活化載體(lg，其中反應(yīng)性單體約為0.01摩 爾)，加入上述NHS溶液，再滴加上述DCC溶液；在密閉圓底燒瓶中約l(TC反 應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)過程中不斷攪拌(反應(yīng)過程在磁力攪拌器上進(jìn)行，采用磁力攪 拌子攪拌)；反應(yīng)結(jié)束后回收溶劑，再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲 (DCU)，抽濾，于真空干燥箱中35 4(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為所 述的固定化豬胰脂肪酶載體。
同樣，發(fā)明人采用橄欖油乳化液法測(cè)定了此活化載體固定化豬胰脂肪酶對(duì) 橄欖油乳化液水解的的表觀活性，測(cè)定結(jié)果為830U/g (以載體干重表示)。
實(shí)施例4
本實(shí)施例為通過下述方法制得的固定化豬胰脂肪酶載體 以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復(fù)合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸(AA)為反應(yīng)性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙 二醇為致孔劑，采用反相懸聚合技術(shù)制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)活化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。 所用的原料包括
反應(yīng)性單體丙烯酸(AA) 5mL (約5.3g)，
交聯(lián)劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺MBAA) 2. lg (為AA質(zhì)量的約40%)，
致孔劑乙二醇4. 6mL (約5. 2g，為AA質(zhì)量的約100%)，
分散劑Span40和Span80的用量比例以將二者混合后的HLB值調(diào)節(jié)至5進(jìn)
17行控制，其總用量為5.4g，
分散相煤油45mL,
催化劑過硫酸銨(AP) 0. llg (為AA質(zhì)量的約20/0)， 加速劑四甲基乙二胺(TMEDA) lmL (約0. 77g，為AP質(zhì)量的7倍)； 此外，制備活化載體過程中，反應(yīng)物(未活化載體、N-羥基琥珀酰亞胺) 與脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺的用量分別為
未活化載體2g (其中反應(yīng)性單體約為0.02摩爾)， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 2.8g (0.024摩爾)， 脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 5.0g (0.024摩爾)。 具體制備方法包括下述主要?dú)i驟
(1) 、制備油相
將復(fù)合分散劑Span40和Span80加入有機(jī)分散相煤油中，適當(dāng)加熱溶解， 加入裝有導(dǎo)氣管和攪拌器的四口瓶中，攪拌并通氮?dú)饣旌暇鶆?；再加入四甲?乙二胺(頂EDA)，混勻，構(gòu)成油相；
(2) 、制備水相
將丙烯酸(AA)、 N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于5ml水 中，加入過硫酸銨(AP)，混勻，構(gòu)成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
采用滴液漏斗，以0.5d/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)制得 的油相中迸行分散，控制攪拌速度為250r/min;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下約l(TC進(jìn)行反 應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)；
反應(yīng)結(jié)束后，采用傾倒方式回收上層溶液，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入95%乙醇 80ml，混勻后靜置過夜，除去上層乙醇溶液；再反復(fù)用水洗至無煤油味和酒精 味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中35 4(TC烘干至恒重，得 未活化載體共5. lg，計(jì)算反應(yīng)率，約為68.7%，備用；
(4) 、制備活化載體
取四氫呋喃(THF)分別溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (5.0g， 0.024摩爾)
18與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(2. 8g， 0. 024摩爾)，(THF用量分別為60mL、20mL)， 得到DCC溶液與NHS溶液；
另取(3)步干燥至恒重的未活化載體(2g，其中反應(yīng)性單體約為0.02摩 爾)，加入上述NHS溶液，再滴加上述DCC溶液；在密閉圓底燒瓶中約l(TC反 應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)過程中不斷攪拌(反應(yīng)過程在磁力攪拌器上進(jìn)行，采用磁力攪 拌子攪拌)；反應(yīng)結(jié)束后回收溶劑，再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲 (DCU)，抽濾，于真空干燥箱中35 4(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為所 述的固定化豬胰脂肪酶載體。
同樣，發(fā)明人采用橄欖油乳化液法測(cè)定了此活化載體固定化豬胰脂肪酶對(duì) 橄欖油乳化液水解的的表觀活性，測(cè)定結(jié)果為800U/g (以載體干重表示)。
上述各實(shí)施例中，測(cè)定固定化豬胰脂肪酶載體表觀活性的橄欖油乳化液 法，均是釆用文獻(xiàn)(趙亞華主編.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程[M].廣州華南理工 大學(xué)出版社，2000:157-159)記載的經(jīng)典橄欖油乳化液法。根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果 可知，其表觀活性均可達(dá)750U/g或750U/g以上(以載體干重表示)。
權(quán)利要求
1. 一種固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法，其特征在于它是一種含琥珀酰亞胺酯基基團(tuán)的大孔珠狀交聯(lián)聚合物，具有下述通式I所表示的結(jié)構(gòu)通式I，其中是以丙烯酸為反應(yīng)性單體、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑形成的高聚物中除羧基以外的部分。
2. —種權(quán)利要求l所述的固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法，其特征在于該制備方法以表面活性劑Span40和Span80為復(fù)合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸為反應(yīng)性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑、乙二醇為致孔劑， 采用反相懸聚合技術(shù)制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基琥珀酰亞胺活 化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體；具體包括下述主要步驟(1) 、制備油相將Span40和Span80組成的復(fù)合分散劑溶解于有機(jī)分散相煤油中，混勻； 再加入四甲基乙二胺，混勻，構(gòu)成油相；(2) 、制備水相將丙烯酸、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺、乙二醇溶解于水中，加入過硫酸銨， 混勻，構(gòu)成水相；(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物以0. 5 2d/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)步制得的油相中進(jìn) 行分散，控制攪拌速度為100 350r/min;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下10 3(TC進(jìn)行反應(yīng)， 反應(yīng)時(shí)間1 2小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，回收上層溶液，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入體積濃度>65%的乙醇， 混勻后靜置5 24小時(shí)，除去上層乙醇溶液；再反復(fù)用水洗至無煤油味和酒精 味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中35 6(TC烘干至恒重，得未活化載體備用；(4)、制備活化載體取(3)步干燥至恒重的未活化載體，在四氫呋喃作溶劑的條件下，二環(huán) 己基碳二亞胺作脫水劑，與N-羥基琥珀酰亞胺在10 3(TC反應(yīng)2 4小時(shí)，反 應(yīng)過程中不斷攪拌；反應(yīng)結(jié)束后回收溶劑；再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán) 己脲，抽濾，于真空干燥箱中35 6(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為本發(fā) 明上述固定化豬胰脂肪酶載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述的復(fù)合分散劑中，Span40 和Span80的比例按照二者混合后的HLB值為4. 5 6進(jìn)行調(diào)節(jié)；復(fù)合分散 劑的總用量為分散相煤油質(zhì)量的10% 30%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑N，N，-亞甲 基雙丙烯酰胺的質(zhì)量為單體丙烯酸質(zhì)量的40% 60% 。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的致孔劑乙二醇的用 量為單體丙烯酸質(zhì)量的70% 100% 。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的過硫酸銨的加入量 為單體丙烯酸質(zhì)量的1.5% 4%;所述的四甲基乙二胺的加入量為過硫酸銨 質(zhì)量的7 10倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)中，水的 用量為丙烯酸體積的1 4倍。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中，油相 與水相的體積比為4:1 10:1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)中，未活 化載體、N-羥基琥珀酰亞胺、與二環(huán)己基碳二亞胺的用量按未活化載體中 反應(yīng)性單體:N-羥基琥珀酰亞胺二環(huán)己基碳二亞胺摩爾比=1" 1. 2:1 1. 2計(jì)算；溶劑THF的用量以能溶解DCC、 NHS即可。
10. 權(quán)利要求l所述的固定化豬胰脂肪酶載體的應(yīng)用，將其作為豬胰脂肪酶、 其它脂肪酶、中性蛋白酶、a-淀粉酶的固定化載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化豬胰脂肪酶載體，它是一種含琥珀酰亞胺酯基基團(tuán)的大孔珠狀交聯(lián)聚合物，具有通式I所表示的結(jié)構(gòu)。該載體通過以丙烯酸為反應(yīng)性單體、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑形成高聚物，同時(shí)引入了琥珀酰亞胺酯基活性基團(tuán)，使其固定化豬胰脂肪酶所需的時(shí)間較短，僅需1小時(shí)，且固定化效率高，固定化酶活性保持的穩(wěn)定性好；其固定化酶表觀活性高，可達(dá)750U/g及以上。本發(fā)明還公開了一種上述固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C08F220/56GK101531732SQ20091005837
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者粟慧君, 莉 蔡, 趙仕林 申請(qǐng)人:四川師范大學(xué)