專利名稱：：多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及在基因傳遞中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及在基因傳遞中的應用。
背景技術(shù)：
：隨著近代生物技術(shù)的發(fā)展與人類基因庫的不斷完善，使人類從分子水平上認識某些疾病根源已逐步成為可能，為基因治療提供了理論基礎。在具體實施中，如何獲取安全有效的基因載體日益成為制約基因治療臨床應用的瓶頸問題。利用病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移是基因治療中應用最廣泛的方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒等載體。但是病毒類載體在臨床應用中存在著很大的安全隱患，造成了基因治療歷史上首例患者死亡事件以及著名的法國"氣泡嬰兒"事件。相對于病毒類基因載體的不安全性，人工合成的陽離子聚合物由于其無免疫源性，分子設計多樣，尺寸可控并能夠連接耙向物質(zhì)逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點。在眾多已經(jīng)報道的聚陽離子載體中，聚乙烯亞胺(PEI)由于其具有獨特的"質(zhì)子海綿效應"能夠?qū)崿F(xiàn)高效的基因傳遞而倍受關(guān)注[參見Boussif0,ZantaM.入BehrJ.P.etal.AVersatileVectorforGeneandOligonucleotideTransferintoCellsinCultureandinWvo-Polyethylenimine.尸薦，1995;92:7297-7301]。PEI的優(yōu)點在于電荷密度集中，對基因物質(zhì)有強的復合能力，在低氮磷比(N/P)比即能獲得最佳轉(zhuǎn)染效率。但是單純使用均聚物PEI作為基因載體，往往受限于其不可降解性和高的細胞毒性。人工合成的聚氨基酸(酯)具有與天然多肽相似的性質(zhì)，能在生物體內(nèi)被酶所降解，具有很好的生物降解性和生物相容性，是組織工程和藥物釋放體系載體材料中理想的醫(yī)用材料之一。近期Xiong等研究者使用2-羥基吡卩定做催化劑，通過胺解反應成功將支化的PEI分子接枝到線型的聚天冬氨酸骨架上，制備得到了線型聚天冬氨酸接枝聚乙烯亞胺共聚物，并通過實驗證實了該陽離子共聚物是一種高效低毒并可降解的體外基因轉(zhuǎn)染載體[參見XiongMP,KwonG.S.etal.Poly(aspartate-g畫PEI800)，apolyethylenimineanalogueoflowtoxicityandhightransfectionefficiencyforgenedelivery.Biomaterials,2007;(28):4889-4900]。然而，相對于分子量為25000的PEI均聚物(PEI25k)該載體需在較高的N/P比才能實現(xiàn)最佳的轉(zhuǎn)染效果，說明線型聚天冬氨酸接枝聚乙烯亞胺共聚物相對于PEI25k電荷密度不夠集中，負載基因物質(zhì)能力下降。在體內(nèi)血清蛋白等復雜環(huán)境中，過高的N/P比例將使基因傳遞不穩(wěn)定從而限制其應用。文獻報道聚陽離子載體復合基因物質(zhì)的能力以及基因傳遞時的轉(zhuǎn)染效率隨著電荷的密度、帶電骨架的形狀(支化或直鏈)、以及帶電基團的位置等因素而變化。其中支化結(jié)構(gòu)的聚合物分子均方半徑小，電荷密度集中，有利于提高基因物質(zhì)的負荷能力，提高傳遞效率[參見PetersenH.K,Kunath,etal.Star-shapedpoly(ethyleneglycol)曙block-polyethyleniminecopolymersenhanceDNAcondensationoflowmolecularweightpolyethylenimines.Biomacromolecules,2002;3(5):926-936]。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及在基因傳遞中的應用。所合成的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物具有支化結(jié)構(gòu)、電荷密度集中，克服了PEI均聚物高毒性不可降解以及線型聚合物接枝PEI電荷密度不夠集中的缺點。多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物是對基因物質(zhì)負載能力強，能夠自由調(diào)節(jié)帶電骨架的形狀、電荷密度，具有優(yōu)良生物相容性的高效基因傳遞載體。所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物的結(jié)構(gòu)式如下PEI為聚乙烯亞胺，結(jié)構(gòu)為線型或者支化，其結(jié)構(gòu)式如下式所示:其中聚合度均大于或等于0;m,n,x2,y2，z2，a,b,c均大于或等于h所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備步驟和條件如下(1)在無水無氧條件下，按照，芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐單體或者P-芐基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐單體質(zhì)量g，與無水氯仿或者無水N'N'-二甲基甲酰胺的體積ml的配比為510:501000，將兩者投料到干燥的反應器中，充入氮氣保護，攪袢溶解；然后將支化聚乙烯亞胺作為多胺引發(fā)劑溶解在無水氯仿或者無水N，N，-二甲基甲酰胺中，并加入反應器內(nèi)，其中引發(fā)劑與單體的摩爾配比為110:10010000，控溫050。C攪拌反應至少12小時，反應完成后在乙醚或乙醇中沉降，過濾，干燥濾餅，得到多臂聚氨基酸酯；(2)按照多臂聚氨基酸酯中的芐酯基團與聚乙烯亞胺的摩爾配比為110:2200，投料到干燥的反應器中；或者，為避免反應過程中聚氨基酸主鏈斷裂，還加入相同于聚乙烯亞胺摩爾量的2-羥基吡啶作為催化劑；按投料的聚乙烯亞胺質(zhì)量g與無水N，N，-二甲基甲酰胺或者無水二甲基亞砜的體積ml的配比為510:501000，把無水N，N'-二甲基甲酰胺或者無水二甲基亞砜加入反應器中，攪拌溶解，控溫1550'C攪拌反應1080小時；反應完成后，將反應液裝入截留分子量為100010000的透析帶中對去離子水透析至少24小時，將透析后的液體冷凍干燥，得到多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物。多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的應用，其步驟和條件如下(1)細胞的培養(yǎng)細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37'C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。(2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基稀釋，按每孔1乂104細胞的密度接種于％孔培養(yǎng)板，置于37。C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到80~90%。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復合物顆粒以及無血清或者含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積200nl，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入細胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率。(4)細胞毒性測試采用噻唑藍(MTT)比色法比較評價基因載體材料的細胞毒性。實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基稀釋，按每孔lX104細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37'C含體積分數(shù)為5M二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達80~90%。將不同濃度的材料與細胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20pl含質(zhì)量分數(shù)為0.5。/。MTT的PBS溶液?；旌衔镌?7。C繼續(xù)作用4小時，加入200pl二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘。然后用酶標儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm。細胞存活率按下公式計算細胞存活率(C/。)—入a^e/A^t^)X100As皿pte是轉(zhuǎn)染后的細胞樣品孔的吸收，Acontr。!是不與復合物溶液作用的細胞樣品孔的吸收，每組實驗重復三次。多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的應用，其步驟和條件如下取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細胞的細胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5pg熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復合物顆粒溶液10(Hd。第二天重復注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200^1熒光素酶底物。IO分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。有益效果所制備的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物是一種新型高效的聚陽離子基因載體，集成了聚乙烯亞胺和聚氨基酸的性質(zhì)，轉(zhuǎn)染效率高，其在同等條件下對中國倉鼠卵巢上皮細胞介導熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為美國Invitrogen生物公司商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的10倍，細胞毒性小，在最佳轉(zhuǎn)染比例范圍內(nèi)，細胞存活率在80%以上。本發(fā)明所合成的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物能夠通過改變被接枝聚氨基酸(酯)的臂數(shù)和分子量來自由調(diào)節(jié)帶電骨架的形狀；通過改變接枝聚乙烯亞胺的分子量和接枝量來調(diào)節(jié)聚陽離子載體的電荷密度;通過改變聚氨基酸疏水性保護基的脫除率來調(diào)節(jié)聚合物的親水/親油性、生物相容性、生物降解性、聚合物力學強度等性能。因此通過上述的各種調(diào)節(jié)，多臂氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物能夠被優(yōu)化為非常高效的基因傳遞載體。同時，本發(fā)明所制備的多臂氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物又具有低-毒并可生物降解性，因為其所選用的多臂聚氨基酸(酯)骨架具有良好的生物相容性，在生理條件下可自行降解、崩潰和代謝，進而被生物體吸收或排出體外，對人體無毒副作用。本發(fā)明所采用聚氨基酸在去除側(cè)鏈保護基后，可進一步連接靶向配體實現(xiàn)靶向性基因轉(zhuǎn)移。因此，本發(fā)明所合成的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在基因傳遞上有很高的使用價值，有廣泛的應用前景。圖1為對比不同載體材料在系列濃度下的細胞毒性測試結(jié)果圖。測試細胞選用中國倉鼠卵巢上皮細胞(CHO細胞)，測試濃度為060微克/毫升，測試材料分別為PEI25k、商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、多臂PLGA-g-PEI2和多臂PLAA-g-PEI2，測試結(jié)果以處理后的細胞存活率(％)來表示。具體實施例方式實施例h使用不同的多胺引發(fā)劑合成多臂聚-L-谷氨酸？芐酯。在無水無氧條件下，分別稱取5克？芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐加入到不同的干燥反應安瓶中，充入氮氣保護，再分別加入500ml的無水氯仿，攪拌使其溶解；將分子量為600或1800的支化聚乙烯亞胺(支化PEI，MW=600;1800)作為多胺引發(fā)劑，以0.01mmol/ml的濃度溶解配制在無水氯仿中，按照表1中的引發(fā)劑體積量，分別吸取并加入到相應的反應安瓶中，控溫在3(TC攪拌反應72小時；反應完成后，分別在5000ml的乙醚中沉降，過濾并干燥濾餅，得到白色固體產(chǎn)物多臂聚-L-谷氨酸Y-芐酯(多臂PBLG)，用核磁計算產(chǎn)物分子量及臂數(shù)，結(jié)果見表l。表l多臂聚-L-谷氨酸Y-芐酯的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例2:使用不同的多胺引發(fā)劑合成多臂聚-L-天冬氨酸p-芐酯。在無水無氧條件下，分別稱取4.7克p-芐基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐加入到不同的干燥反應安瓶中，充入氮氣保護，再分別加入300ml的無水N'N'-二甲基甲酰胺，攪拌使其溶解；將分子量為600或1800的支化聚乙烯亞胺(支化PELMW=600;1800)作為多胺引發(fā)劑，以O.Olmmol/ml的濃度溶解配制在無水氯仿中，按照表2中的引發(fā)劑體積量，分別吸取并加入到相應的反應安瓶中，控溫在30。C攪拌反應72小時；反應完成后，分別在3000ml的乙醚中沉降，過濾并干燥濾餅，得到產(chǎn)物多臂聚-L-天冬氨酸p-芐酯(多臂PBLA)，用核磁計算產(chǎn)物分子量及臂數(shù)，結(jié)果見表2。表2多臂聚-L-天冬氨酸P-芐酯的制備產(chǎn)物編號多胺引發(fā)劑種類引發(fā)劑體積(ml)臂數(shù)產(chǎn)物分子量單臂平均聚合單元數(shù)多臂PBLA1支化PEI(MW=600)192100020多臂PBLA2支化PEI(MW=600)3.810080098多臂PBLA3支化PEI(MW-1800)7.6125550022多臂PBLA4支化PEI(MW=1800)1.61221400085實施例3:催化胺解法合成多臂聚-L-谷氨酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物分別稱取2.2克(含lOmmol芐酯基團)的多臂聚-L-谷氨酸"芐酯(多臂PBLG1或多臂PBLG3)于不同的反應安瓶中，然后按照表3的投料摩爾量分別加入相應的聚乙烯亞胺(PEI)和2-羥基吡啶(HP),投料PEI種類分別是分子量為423的線型聚乙烯亞胺(線型PEl，MW=423)、分子量為600的支化聚乙烯亞胺(支化PEI，MW=600)或者分子量為1800的支化聚乙烯亞胺(支化PEI，MW=1800)，見表3;分別加入200ml的無水二甲基亞砜，攪拌使其溶解，控溫38'C，攪拌反應48小時；反應完成后，分別將反應液裝入截留分子量為3500的不同透析袋中對去離子水透析7天，將各自透析后的液體冷凍干燥，得到多臂聚-L-谷氨酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物(多臂PLGA-g-PEI),使用核磁計算卞酯脫除率，通過凝膠滲透色譜測量產(chǎn)物分子量，結(jié)果見表3。表3多臂聚-L-谷氨酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備臂投料PBLG投料摩爾量產(chǎn)物編號投料PEI種類節(jié)酯脫產(chǎn)物分子量數(shù)種類(mmoD除率多臂PLGA-《-PEl15多臂PBLG1線型PEI(MW=423)PET—HP=2095%4176013多臂PLGA-g-PEI25多臂PBLG1支化PEI(MW=600)PEI=HP=40100%55460多臂PLGA-g-PEI35多臂PBLG1支化PEI(MW=600)PEI=HP=1083%42590多臂PLGA-g-PEI45多臂PBLG1支化PEI〔MW=18O0)PEI=HP=201000/o79100多臂PLGA-g-PEI512多臂PBLG3線型PEI(MW=423)PEI=HP=2090%69160多臂PLGA-g-PEI612多臂PBLG3支化PEI(MW=600)PEI=HP=40鮮/o90420多臂PLGA-g-PEI712多臂PBLG3支化PEI(MW=600)PEI=HP=1085%78430多臂PLGA-g-PEI812多臂PBLG3支化PEI(MW=1800)PEI=HP=20100%114510實施例4:催化胺解法合成多臂聚-L-天冬氨酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物分別稱取2.1克(含lOmmol芐酯基團)的多臂聚-L-天冬氨酸p-芐酯(多臂PBLA1或多臂PBLA3)于不同的反應安瓶中，然后按照表4的投料摩爾量分別加入相應的聚乙烯亞胺(PEI)和2-羥基吡啶(HP),投料PEI種類分別是分子量為423的線型聚乙烯亞胺(線型PEI，MW=423)、分子量為600的支化聚乙烯亞胺(支化PEI，MW=600)或者分子量為1800的支化聚乙烯亞胺(支化PEI，MW=1800)，見表4;分別加入200ml的無水二甲基亞砜，攪拌使其溶解，控溫38'C，攪拌反應48小時；反應完成后，分別將反應液裝入截留分子量為3500的不同透析袋中對去離子水透析7天，將各自透析后的液體冷凍干燥,得到多臂聚-L-天冬氨酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物(多臂PLAA-g-PEI),使用核磁計算卞酯脫除率，通過凝膠滲透色譜測量產(chǎn)物分子量，結(jié)果見表4。表4多臂聚-L-天冬氨酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備產(chǎn)物編號臂數(shù)投料PBLA種類接枝PEI種類投料摩爾量Cmmol)芐酯脫除率產(chǎn)物分子量多臂PLAA-g-PEI15多臂PBLA1線型PEI(MW=423)PEI=HP=20100%43260多臂PLAA-g-PEI25多臂PBLA1支化PEI(MW=600〉PEI=HP=40100%5606014多臂PLAA-g-PEI35多臂PBLA1支化PEI(MW=600)PEI=HP=1087%43150多臂PLAA-g-PEI45多臂PBLA1支化PEI(MW=1800)PEI=HP=20100%74300多臂PLAA-g-PEI512多臂PBLA3線型PEI(MW=423)PEI=HP=20慎70870多臂PLAA-g-PEI612多臂PBLA3支化PEI(MW=600)PEI:HP:40100%86070多臂PLAA-g-P邁712多臂PBLA3支化PEI(MW=600)PEI=HP=1082%83120多臂PLAA-g-PEI812多臂PBLA3支化PEI(MW-1800)PEI=HP=20匿/098260實施例5:多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物介導熒光素酶質(zhì)粒對中國倉鼠卵巢上皮細胞(CHO細胞)的體外轉(zhuǎn)染1、CHO細胞的培養(yǎng)取CHO細胞置于含體積分數(shù)為10。/。胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37'C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2、體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期CHO細胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1X1(^細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于5%<:02、37'C孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達8090%。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，更換200^1/孔含有10%胎牛血淸的新鮮DMEM培養(yǎng)液，再選用突光酶質(zhì)粒(pGL3)分別加入多臂PLGA-g-PEI2/pGL3、多臂PLAA-g-PEI2/pGL3、PEI25k/pGL3以及商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000/pGL3的復合物顆粒進行轉(zhuǎn)染對比，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。3、體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入細胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，使用照度計測定轉(zhuǎn)染效率，表示為每亳克蛋白的發(fā)光單元數(shù)(RLU/mgProtein)。表5介導熒光素酶質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本發(fā)明中的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物是一種復合能力強并且非常高效的基因傳遞載體材料，其中以多臂PLGA-g-PEI2和多臂PLAA-g-PEI2為代表。表5中分別給出了體外轉(zhuǎn)染實驗中四種材料的最佳轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染氮磷比(N/P)，通過對比可以看出，多臂PLGA-g-PEI2和多臂PLAA-g-PEI2具有更高的轉(zhuǎn)染效率，并且最佳轉(zhuǎn)染比例出現(xiàn)在較低的N/P。實施例6:多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物的細胞毒性測試1、CHO細胞的培養(yǎng)取CHO細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37'C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2、毒性測試采用MTT的方法比較評價不同濃度多臂PLGA-g-PEI2、多臂PLAA-g-PEI2、PEI25k和商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的材料細胞毒性。實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期的CHO細胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1乂104細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37。C含體積分數(shù)為5M二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到8090%。將不同濃度的材料與細胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20pl含質(zhì)量分數(shù)為0.5Q/cMTT的PBS溶液。混合物在37'C繼續(xù)作用4小時，加入20(Hil二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘。然后用酶標儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm。細胞存活率按下公式計算細胞存活率(％)=(入311)16/入。此。1)乂100As,^是轉(zhuǎn)染后的細胞樣品孔的吸收，Ac。ntrd是不與復合物溶液作用的細胞樣品孔的吸收，每組實驗重復三次，測試結(jié)果見圖l。通過圖l我們可以看出不同濃度下各種載體材料處理后的細胞存活率。顯然相對于PEI25k和Lipofectamine2000，本發(fā)明中多臂PLGA-g-PEI2和多臂PLAA-g-PEI2所代表的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物材料是一種對細胞毒性很小的轉(zhuǎn)染試劑。實施例7:多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物介導體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細胞的細胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5pg熒光酶質(zhì)粒(pGL3)的多臂PLGA-g-PEI2/pGL3、多臂PLAA-g-PEI2/pGL3與Lipofectamine2000/pGL3復合物顆粒溶液100^1。第二天重復注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200^1熒光素酶底物。IO分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果表明多臂PLGA-g-PEI2和多臂PLAA-g-PEI2所代表的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物材料比Lipofectamine2000具有更高的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。權(quán)利要求1、多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如下R＝-CH2或者-CH2CH2；id="icf0002"file="A2009100671070002C2.tif"wi="37"he="14"top="98"left="88"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>PEI為聚乙烯亞胺，結(jié)構(gòu)為線型或者支化，其結(jié)構(gòu)式如下式所示式中，聚合度x1，y1，z1均大于或等于0；m，n，x2，y2，z2，a，b，c均大于或等于1。2、如權(quán)利要求1所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備方法，其特征在于步驟和條件如下(1)在無水無氧條件下，按照Y-芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐單體或者(3-節(jié)基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐單體質(zhì)量g，與無水氯仿或者無水N，N，-二甲基甲酰胺的體積ml的配比為510:501000，將兩者投料到干燥的反應器中，充入氮氣保護，攪拌溶解；然后將支化聚乙烯亞胺作為多胺弓i發(fā)劑溶解在無水氯仿或者無水N'N'-二甲基甲酰胺中，并加入反應器內(nèi)，其中多胺引發(fā)劑與單體的摩爾配比為110:10010000，控溫05(TC攪拌反應至少12小時，反應完成后在乙醚或乙醇中沉降，過濾，干燥濾餅，得到多臂聚氨基酸酯；(2)按照多臂聚氨基酸酯中的芐酯基團與聚乙烯亞胺的摩爾配比為110:2200，投料到干燥的反應器中；或者，為避免反應過程中聚氨基酸主鏈斷裂，還加入相同于聚乙烯亞胺摩爾量的2-羥基吡啶作為催化劑；按投料的聚乙烯亞胺質(zhì)量g與無水N，N，-二甲基甲酰胺或者無水二甲基亞砜的體積ml的配比為510:501000，把無水N，N，-二甲基甲酰胺或者無水二甲基亞砜加入反應器中，攪拌溶解，控溫1550°C攪拌反應1080小時；反應完成后，將反應液裝入截留分子量為100010000的透析帶中對去離子水透析至少24小時，將透析后的液體冷凍干燥，得到多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物。3、如權(quán)利要求1所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在基因傳遞中的應用，其特征在于，所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。4、如權(quán)利要求3所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其特征在于，步驟和條件如下(1)細胞的培養(yǎng)細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37。C，含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)；(2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔1X1(^細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37"C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到80~90%，轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復合物顆粒以及無血清或者含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200^1，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率；(4)細胞毒性測試采用噻唑藍比色法比較評價基因載體材料的細胞毒性；實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔lX104細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37。C含體積分數(shù)為5y。二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到80~90%，將不同濃度的材料與細胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入2(^1含質(zhì)量分數(shù)為0.5%噻唑藍的磷酸鹽緩沖液，混合物在37'C繼續(xù)作用4小時，加入200nl二甲基亞砜溶解噻唑藍甲臢結(jié)晶10分鐘，然后用酶標儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm，細胞存活率按下公式計算細胞存活率(。/。)KAsa^e/Ac。麵)X100As,pk是轉(zhuǎn)染后的細胞樣品孔的吸收，Ac。^。i是不與復合物溶液作用的細胞樣品孔的吸收，每組實驗重復三次。5.如權(quán)利要求1所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在基因傳遞中的應用，其特征在于，所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。6.如權(quán)利要求5所述的多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其特征在于，步驟和條件如下取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細胞的細胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5pg熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復合物顆粒溶液10(^1，第二天重復注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果，在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉，麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200^1熒光素酶底物，IO分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。全文摘要本發(fā)明涉及多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及其在基因傳遞中的應用。將多胺引發(fā)劑溶解在有機溶劑中，在無水無氧條件下引發(fā)芐基保護的α-氨基酸-N-羧酸酐開環(huán)聚合得到多臂聚氨基酸酯；然后多臂聚氨基酸酯側(cè)鏈的芐酯與聚乙烯亞胺的氨基發(fā)生完全或部分胺解反應，形成接枝共聚物。該共聚物是一種新型高效的聚陽離子基因載體，集成了聚乙烯亞胺和聚氨基酸的性質(zhì)，轉(zhuǎn)染效率高，其在同等條件下對中國倉鼠卵巢上皮細胞介導熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為美國Invitrogen生物公司商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine^TM2000的10倍，細胞毒性小，在最佳轉(zhuǎn)染比例范圍內(nèi)，細胞存活率在80％以上，有廣泛應用前景。文檔編號C08G69/00GK101575416SQ20091006710公開日2009年11月11日申請日期2009年6月15日優(yōu)先權(quán)日2009年6月15日發(fā)明者夏加亮,景遐斌,李非凡,田華雨,磊陳,陳學思申請人:中國科學院長春應用化學研究所