專利名稱：：網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及在基因傳遞中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及在基因傳遞中的應用。
背景技術(shù)：
：隨著近代生物技術(shù)的發(fā)展與人類基因庫的不斷完善，使人類從分子水平上認識某些疾病根源已逐步成為可能，為基因治療提供了理論基礎(chǔ)。在具體實施中，如何獲取安全有效的基因載體日益成為制約基因治療臨床應用的瓶頸問題。利用病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移是基因治療中應用最廣泛的方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒等載體。但是病毒類載體在臨床應用中存在著很大的安全隱患，造成了基因治療歷史上首例患者死亡事件以及著名的法國“氣泡嬰兒”事件。相對于病毒類基因載體的不安全性，人工合成的陽離子聚合物由于其無免疫源性，分子設(shè)計多樣，尺寸可控并能夠連接靶向物質(zhì)逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點。在眾多已經(jīng)報道的聚陽離子載體中，聚乙烯亞胺(PEI)由于其具有獨特的“質(zhì)子海綿效應”能夠?qū)崿F(xiàn)高效的基因傳遞而倍受關(guān)注[參見Boussif0，ZantaΜ.A，BehrJ.P.etal.AVersatileVectorforGeneandOligonucleotideTransferintoCellsinCultureandinVivo-Polyethylenimine.PNAS，1995;92:7297_7301]。PEI的轉(zhuǎn)染性能強烈依賴于分子量，普遍使用分子量25000的PEI(PEI25k)作為轉(zhuǎn)染載體。PEI的優(yōu)點在于電荷密度集中，對基因物質(zhì)有強的復合能力，在低氮磷比(N/P)比即能獲得最佳轉(zhuǎn)染效率。但是單純使用均聚物PEI作為基因載體，往往受限于其不可降解性和高的細胞毒性。聚-β-氨酯/酰胺是一類通過邁克爾(Michael)加成反應制備的具有良好生物相容性并可實現(xiàn)生物體內(nèi)降解的高分子材料，由于性能優(yōu)異、制備方法簡單，引起越來越多的研究者興趣，最近其在基因傳遞中的應用更是受到重點關(guān)注。文獻報道，AndersonD.G.等研究者通過對聚_氨酯的合成和篩選，成功獲得了一系列高效低毒的基因載體材料[參見AndersonD.G,LangerR.etal.Apolymerlibraryapproachtosuicidegenetherapyforcancer.PNAS，2004;101:16028-16033]；而LinC.等研究者也通過相似的Michael加成反應制備了一系列可實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染的聚-β-氨酰胺載體材料[參見LinC，JanF.J.etal.Linearpoly(amidoamine)swithsecondaryandtertiaryaminogroupsandvariableamountsofdisulfidelinkages:Synthesisandinvitrogenetransferproperties.JournalofControlledRelease，2006;116:130_137]。雖然會邑夠協(xié)助外源基因?qū)崿F(xiàn)高效的體外轉(zhuǎn)染，但是由于分子中的荷質(zhì)比太低，在與負電荷的基因物質(zhì)復合時，往往需要大量的聚-β-氨酯/酰胺才能實現(xiàn)有效包裹，嚴重限制了其在體內(nèi)傳遞的應用。最近的研究報道中，雙丙烯酸酯或雙丙烯酰胺被直接作為交聯(lián)劑使用，通過與聚乙烯亞胺Michael加成反應制備交聯(lián)型的聚陽離子基因載體[參見KimT.H，etal.Adegradablehyperbranchedpoly(esteramine)basedonpoloxamerdiacrylateandpolyethylenimineasagenecarrier.MacromolecularBioscience，2007；7:611_619]0這類交聯(lián)型聚陽離子雖然制備簡單，但是交聯(lián)反應難以控制，可重復性差，無法研究分子結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)染性能之間的關(guān)系，并且過度的交聯(lián)容易造成產(chǎn)物溶解性差，影響其生物應用性能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及在基因傳遞中的應用。所合成的網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物為可降解陽離子聚合物，未見文獻報道。網(wǎng)狀聚氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物兼具了PEI與聚-β-氨酯/酰胺的優(yōu)點，其分子電荷密度較高，對基因物質(zhì)負載能力強，具有良好的生物相容性，克服了PEI均聚物高毒性、不可降解性以及聚-β-氨酯/酰胺電荷密度不夠集中、復合能力弱的缺點。網(wǎng)狀聚_β_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物是對基因物質(zhì)負載能力強，能夠自由調(diào)節(jié)帶電骨架的形狀、電荷密度，具有優(yōu)良生物相容性的高效基因傳遞載體。所述的線型聚-β_氨酯的結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，R為CH2CH2CH2CH2;0HCH2CH2CH2CH2CH2CH2或者*-(CH2CH2o^*<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>所述的線型聚-β-氨酰胺的結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>*其中，R為ch2;所述的聚乙烯亞胺，結(jié)構(gòu)為線型或者支化，其結(jié)構(gòu)式如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，聚合度a，b，c均大于或者等于1；所述的網(wǎng)狀聚-β_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物的結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中，X為偶聯(lián)劑，其為二異氰酸酯類；PEI為聚乙烯亞胺；PAE為線型聚-β-氨酯PAA為線型聚-β-氨酰胺。網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物的結(jié)構(gòu)為分子內(nèi)部分交聯(lián)，其結(jié)構(gòu)示意的表達方法參照已報道的具有相似分子結(jié)構(gòu)的文獻[參見KimS.W，etal.Biodegradablepoly(ethylenimine)forplasmidDNAdelivery.JournalofControlledRelease,2002;80:273-282或者KimΤ.H,etal.Adegradablehyperbranchedpoly(esteramine)basedonpoloxamerdiacrylateandpolyethylenimineasagenecarrier.MacromolecularBioscience,2007；7:611_619]。所述的網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備步驟和條件如下(1)按照雙丙烯酸酯或者雙丙烯酰胺的質(zhì)量g，與有機溶劑的體積ml的配比151020，將兩者投料到反應器中，攪拌溶解，其中有機溶劑選氯仿與甲醇的體積配比為1441的混合溶劑；再按照2-氨基乙醇與雙丙烯酸酯或者雙丙烯酰胺的摩爾配比為2332，將2-氨基乙醇也加入到反應器中，控溫O70°C攪拌反應至少12小時，反應完成后在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，得到線型聚_β_氨酯/酰胺；(2)按照線型聚-β_氨酯/酰胺的質(zhì)量g，與無水氯仿的體積ml的配比151050，將兩者投料到干燥的反應器中，攪拌溶解，再按照線型聚-β-氨酯/酰胺中的羥基與偶聯(lián)劑的摩爾配比21110，加入偶聯(lián)劑至反應器中，選二異氰酸酯類作為偶聯(lián)試劑，控溫O70°C攪拌反應至少2小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至干燥的滴液漏斗中；按照線型聚-β-氨酯/酰胺中的羥基與聚乙烯亞胺的摩爾配比51110，取聚乙烯亞胺于另一干燥反應器中，并按照聚乙烯亞胺的質(zhì)量g，與無水氯仿的體積ml的配比15501000，加入無水氯仿攪拌溶解；將滴液漏斗中的反應液直接滴加到含聚乙烯亞胺的反應器中，至少15分鐘滴加完畢，滴加過程中反應器保持冰浴并攪拌，滴加完畢后，控溫O40°C繼續(xù)攪拌反應272小時，反應完成后在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，再用蒸餾水重新溶解產(chǎn)物，使用截留分子量100010000的超濾管，超濾濃縮以除去未反應的小分子，冷凍干燥濃縮液，得到網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物。網(wǎng)狀聚氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。其用法的步驟和條件如下(1)細胞的培養(yǎng)細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)；(2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基稀釋，按每孔IXIO4細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到8090%，轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復合物顆粒以及無血清或者含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積200μ1，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入細胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率；(4)細胞毒性測試采用噻唑藍(MTT)比色法比較評價基因載體材料的細胞毒性；實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基稀釋，按每孔1XIO4細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達8090%，將不同濃度的材料與細胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20μ1含質(zhì)量分數(shù)為0.5%MTT的PBS溶液，混合物在37°C繼續(xù)作用4小時，加入200μ1二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘，然后用酶標儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm，細胞存活率按下公式計算細胞存活率(％)=(Asample/Acontrol)X100Asample是轉(zhuǎn)染后的細胞樣品孔的吸收，h。。ntral是不與復合物溶液作用的細胞樣品孔的吸收，每組實驗重復三次。網(wǎng)狀聚氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。其用法的步驟和條件如下取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細胞的細胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5μg熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復合物顆粒溶液100μ1；第二天重復注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果；在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉，麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200μ1熒光素酶底物，10分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。有益效果所制備的網(wǎng)狀聚-β_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物是一種聚陽離子基因載體，集成了聚乙烯亞胺和聚_β_氨酯/酰胺各自的優(yōu)點，轉(zhuǎn)染效率高，其在同等條件下對非洲綠猴腎細胞細胞介導熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為美國Irwitrogen生物公司商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的21倍，細胞毒性小，在最佳轉(zhuǎn)染比例范圍內(nèi)，細胞存活率在80%以上。本發(fā)明所制備的網(wǎng)狀聚-β_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物具有低毒并可生物降解性，因為其所選用的網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺骨架具有良好的生物相容性，在生理條件下可自行降解、崩潰和代謝，進而被生物體吸收或排出體外，對人體無毒副作用。因此，本發(fā)明所合成的網(wǎng)狀聚_β_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在基因傳遞上有很高的使用價值，有廣泛的應用前景。圖1為對比不同載體材料在系列濃度下的細胞毒性測試結(jié)果圖。測試細胞選用非洲綠猴腎細胞(Cos-7細胞)，測試濃度為070微克/毫升，測試材料分別為網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物的代表Ν-ΡΑΕ-ΡΕΙ-6和N-PAA-PEI-4、PEI25k和商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，測試結(jié)果以處理后的細胞存活率(％)來表示。具體實施例方式實施例1使用不同原料合成含側(cè)羥基線型聚-β_氨酯分別按照表1所列投料質(zhì)量，稱取不同種類的雙丙烯酸酯分子IOmmol置于不同的反應安瓶中，再按照表1中相應的溶劑體積，分別量取氯仿與甲醇體積配比21的混合溶齊U，加入相應的反應安瓶中，攪拌溶解后，再分別向各個反應安瓶中加入IOmmol的2-氨基乙醇，控溫在45°C攪拌反應72小時，反應完成后，分別在500ml的乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥得到線型聚_β_氨酯(PAE)，使用凝膠滲透色譜分析產(chǎn)物數(shù)均分子量(Mn)及分子量分布(PDI)，結(jié)果見表1。表1使用不同原料合成含側(cè)羥基線型聚-β_氨酯<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例2使用不同原料合成含側(cè)羥基線型聚_β_氨酰胺分別按照表2所列投料質(zhì)量，稱取不同種類的雙丙烯酰胺分子IOmmol置于不同的反應安瓶中，再按照表2中相應的溶劑體積，分別量取氯仿與甲醇體積配比21的混合溶齊U，加入相應的反應安瓶中，攪拌溶解后，再分別向各個反應安瓶中加入IOmmol的2-氨基乙醇，控溫在45°C攪拌反應72小時，反應完成后，分別在500ml的乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥得到線型聚_β_氨酰胺(PAA)，使用凝膠滲透色譜分析產(chǎn)物數(shù)均分子量(Mn)及分子量分布(PDI)，結(jié)果見表2。表2使用不同原料合成含側(cè)羥基線型聚_β_氨酰胺<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3使用不同原料合成網(wǎng)狀聚-β_氨酯接枝聚乙烯亞胺共聚物分別按照表3中所述的投料種類和投料質(zhì)量，稱取實施例1中制備的線型聚-β-氨酯(PAE)置于不同的反應安瓶中，再按照表3所示，分別量取相應體積的無水氯仿加入各自的反應安瓶中，攪拌溶解后，分別向每個反應安瓶加入20mmol的1，6-己二異氰酸酯(HDI)，控溫在50°C攪拌反應12小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，分別轉(zhuǎn)移至不同的干燥滴液漏斗中，得到側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚-β-氨酯(N-PAE-HDI)；表3側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚_β_氨酯(N-PAE-HDI)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>按照表4所示，分別稱取不同種類和摩爾量的聚乙烯亞胺(PEI)投料于不同的干燥反應安瓶中，向每個反應安瓶分別加入1500ml的無水氯仿攪拌溶解；將上述表3制備的側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚-β_氨酯(N-PAE-HDI)，分別按照表4所示的排列順序，通過滴液漏斗直接滴加到含相應PEI的反應安瓶中，滴加過程中反應安瓶保持冰浴并攪拌，2小時滴加完畢后，控溫在20°C繼續(xù)攪拌反應24小時，反應完成后分別在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，再分別用蒸餾水重新溶解產(chǎn)物，使用截留分子量3500的超濾管，分別超濾濃縮，以除去未反應的小分子，冷凍干燥濃縮液，得到網(wǎng)狀聚-β-氨酯接枝聚乙烯亞胺共聚物(N-PAE-PEI)。使用核磁共振和凝膠滲透色譜分析PEI接枝率及產(chǎn)物數(shù)均分子量，結(jié)果見表4。表4使用不同原料合成網(wǎng)狀聚-β_氨酯接枝聚乙烯亞胺共聚物(N-PAE-PEI)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4使用不同原料合成網(wǎng)狀聚-β_氨酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物分別按照表5中所述的投料種類和投料質(zhì)量，稱取實施例2中制備的線型聚-β-氨酰胺(PAA)置于不同的反應安瓶中，再按照表5所示，分別量取相應體積的無水氯仿加入各自的反應安瓶中，攪拌溶解后，分別向每個反應安瓶加入20mmol的1，6-己二異氰酸酯(HDI)，控溫在50°C攪拌反應12小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，分別轉(zhuǎn)移至不同的干燥滴液漏斗中，得到側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚-β-氨酰胺(N-PAA-HDI)；表5側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚_β_氨酰胺(N-PAA-HDI)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>按照表6所示，分別稱取不同種類和摩爾量的聚乙烯亞胺(PEI)投料于不同的干燥反應安瓶中，向每個反應安瓶分別加入1500mi的無水氯仿攪拌溶解；將上述表5制備的側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚-β-氨酰胺(N-PAA-HDI)，分別按照表6所示的排列順序，通過滴液漏斗直接滴加到含相應PEI的反應安瓶中，滴加過程中反應安瓶保持冰浴并攪拌，2小時滴加完畢后，控溫在20°C繼續(xù)攪拌反應24小時，反應完成后分別在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，再分別用蒸餾水重新溶解產(chǎn)物，使用截留分子量3500的超濾管，分別超濾濃縮，以除去未反應的小分子，冷凍干燥濃縮液，得到網(wǎng)狀聚-β-氨酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物(N-PAA-PEI)。使用核磁共振和凝膠滲透色譜分析PEI接枝率及產(chǎn)物數(shù)均分子量，結(jié)果見表6。表6使用不同原料合成網(wǎng)狀聚-β_氨酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物(N-PAA-PEI)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例5使用不同工藝合成含側(cè)羥基線型聚-β_氨酯分別按照表7所列投料質(zhì)量，稱取數(shù)均分子量為258的聚乙二醇二丙烯酸酯置于不同的反應安瓶中，再按照表7中溶劑的配比和體積，分別量取氯仿與甲醇的混合溶劑，加入相應的反應安瓶中，攪拌溶解后，再按表7所示分別向各個反應安瓶中加入相應量的2-氨基乙醇，并按照表7中的條件控溫攪拌反應，反應完成后，分別在500ml的乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥得到線型聚_β_氨酯(PAE)，使用凝膠滲透色譜分析產(chǎn)物數(shù)均分子量，結(jié)果見表7。表7使用不同工藝合成含側(cè)羥基線型聚_β_氨酯<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例6使用不同工藝合成含側(cè)羥基線型聚-β_氨酰胺分別按照表8所列投料質(zhì)量，稱取雙丙烯酰胱胺置于不同的反應安瓶中，再按照表8中溶劑的配比和體積，分別量取氯仿與甲醇的混合溶劑，加入相應的反應安瓶中，攪拌溶解后，再按表8所示分別向各個反應安瓶中加入相應量的2-氨基乙醇，并按照表8中的條件控溫攪拌反應，反應完成后，分別在500ml的乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥得到線型聚_β_氨酰胺(PAA)，使用凝膠滲透色譜分析產(chǎn)物數(shù)均分子量，結(jié)果見表8。表8使用不同工藝合成含側(cè)羥基線型聚-β_氨酰胺<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例7使用不同工藝合成網(wǎng)狀聚-β-氨酯接枝聚乙烯亞胺共聚物分別按照表9中所述的投料種類和投料質(zhì)量，稱取實施例5制備的線型聚_β_氨酯(PAE)置于不同的反應安瓶中，再按照表9所示溶劑I的體積，分別量取相應體積的無水氯仿加入各自的反應安瓶中，攪拌溶解后，按照表9所示投料量分別向每個反應安瓶加入1,6-己二異氰酸酯(HDI)，按照表9所示活化溫度和活化時間進行攪拌反應，反應完成后，反應液冷卻至室溫，分別轉(zhuǎn)移至不同的干燥滴液漏斗中，得到側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚-β-氨酯；按照表9所示，分別稱取相應摩爾量的數(shù)均分子量600支化聚乙烯亞胺(PEI)投料于不同的干燥反應安瓶中，按照表9所示溶劑II的體積，向每個反應安瓶分別加入相應量的無水氯仿攪拌溶解；將上述制備的側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚_β_氨酯，分別按照表9所示的排列順序，通過滴液漏斗直接滴加到含相應PEI的反應安瓶中，滴加過程中反應安瓶保持冰浴并攪拌，2小時滴加完畢后，按照表9所示反應溫度和反應時間進行攪拌反應，反應完成后分別在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，再分別用蒸餾水重新溶解產(chǎn)物，使用截留分子量3500的超濾管，分別超濾濃縮，以除去未反應的小分子，冷凍干燥濃縮液，得到網(wǎng)狀聚-β-氨酯接枝聚乙烯亞胺共聚物(N-PAE-PEI)。使用凝膠滲透色譜分析產(chǎn)物數(shù)均分子量，結(jié)果見表9。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例8使用不同工藝合成網(wǎng)狀聚一p一氨酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物分別按照表lo中所述的投料種類和投料質(zhì)量，稱取實施例6制備的線型聚-β-氨酰胺(PAA)置于不同的反應安瓶中，再按照表10所示溶劑I的體積，分別量取相應體積的無水氯仿加入各自的反應安瓶中，攪拌溶解后，按照表10所示投料量分別向每個反應安瓶加入1，6_己二異氰酸酯(HDI)，按照表10所示活化溫度和活化時間進行攪拌反應，反應完成后，反應液冷卻至室溫，分別轉(zhuǎn)移至不同的干燥滴液漏斗中，得到側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚-β-氨酰胺；按照表10所示，分別稱取相應摩爾量的數(shù)均分子量600支化聚乙烯亞胺(PEI)投料于不同的干燥反應安瓶中，按照表10所示溶劑II的體積，向每個反應安瓶分別加入相應量的無水氯仿攪拌溶解；將上述制備的側(cè)羥基活化的網(wǎng)狀聚-β-氨酰胺，分別按照表10所示的排列順序，通過滴液漏斗直接滴加到含相應PEI的反應安瓶中，滴加過程中反應安瓶保持冰浴并攪拌，2小時滴加完畢后，按照表10所示反應溫度和反應時間進行攪拌反應，反應完成后分別在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，再分別用蒸餾水重新溶解產(chǎn)物，使用截留分子量3500的超濾管，分別超濾濃縮，以除去未反應的小分子，冷凍干燥濃縮液，得到網(wǎng)狀聚-β-氨酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物(N-PAA-PEI)。使用凝膠滲透色譜分析產(chǎn)物數(shù)均分子量，結(jié)果見表10。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例9網(wǎng)狀聚-B-酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物介導熒光素酶質(zhì)粒對非洲綠猴腎細胞(Cos-7細胞)的體外傳染l、Cos_7細胞的培養(yǎng)取Cos-7細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2、體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期Cos-7細胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔IXIO4細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到8090%。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，更換200μ1/孔含有10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，再選用熒光素酶質(zhì)粒(PGL3)為報告基因，分別加入N-PAE-PEI-6/pGL3；N-PAA-PEI_4/pGL3、PEI25k/pGL3以及商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000/pGL3的復合物顆粒進行轉(zhuǎn)染對比，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。3、體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入細胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，使用照度計測定轉(zhuǎn)染效率，表示為每毫克蛋白的發(fā)光單元數(shù)(RLU/mgProtein)0表11介導熒光素酶質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本發(fā)明中的網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物是一種非常高效的基因傳遞載體材料。表7分別給出了體外轉(zhuǎn)染實驗中N-PAE-PEI-6、N-PAA-PEI-4,PEI25k與Lipofectamine2000的最佳轉(zhuǎn)染效率，通過對比可以看出本發(fā)明中N-PAE-PEI-6和N-PAA-PEI-4所代表的網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物具有更高的轉(zhuǎn)染效率。實施例10網(wǎng)狀聚-β_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物的細胞毒性測試1、Cos-7細胞的培養(yǎng)取Cos-7細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2、毒性測試采用MTT的方法比較評價不同濃度N-PAE-PEI-6、N-PAA-PEI-4,PEI25k和商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的材料細胞毒性。實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期的Cos_7細胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1XIO4細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到8090%。將不同濃度的材料與細胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20μ1含質(zhì)量分數(shù)為0.5%MTT的PBS溶液?；旌衔镌?7°C繼續(xù)作用4小時，加入200μ1二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘。然后用酶標儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm。細胞存活率按下公式計算細胞存活率(％)=(Asample/Acontrol)X100Asample是轉(zhuǎn)染后的細胞樣品孔的吸收，Arantral是不與復合物溶液作用的細胞樣品孔的吸收，每組實驗重復三次，測試結(jié)果見圖1。通過圖1我們可以看出不同濃度下各種載體材料處理后的細胞存活率。相對于PEI25k和Lipofectamine2000，本發(fā)明中N-PAE-PEI-6和N-PAA-PEI-4所代表的網(wǎng)狀聚-β_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物材料是一種對細胞毒性很小的轉(zhuǎn)染試劑。實施例11網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物介導體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5yg熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)的N-PAE-PEI-6/pGL3、N-PAA-PEI-4/pGL3與Lipofectamine2000/pGL3復合物顆粒溶液100μ1。第二天重復注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200μ1熒光素酶底物。10分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果表明Ν-ΡΑΕ-ΡΕΙ-6和N_PAA_PEI_4所代表的網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物材料比Lipofectamine2000具有更高的轉(zhuǎn)染效率。權(quán)利要求網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如下所述的線型聚-β-氨酯的結(jié)構(gòu)式如下所述的線型聚-β-氨酰胺的結(jié)構(gòu)式如下所述的聚乙烯亞胺，結(jié)構(gòu)為線型或者支化，其結(jié)構(gòu)式如下所示其中，聚合度a，b，c均大于或者等于1；所述的網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物的結(jié)構(gòu)如下其中，X為偶聯(lián)劑，其為二異氰酸酯類；PEI為聚乙烯亞胺；PAE為線型聚-β-氨酯PAA為線型聚-β-氨酰胺。F2009100672718C00011.tif,F2009100672718C00012.tif,F2009100672718C00013.tif,F2009100672718C00021.tif2.如權(quán)利要求1所述的網(wǎng)狀聚氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備方法，其特征在于步驟和條件如下(1)按照雙丙烯酸酯或者雙丙烯酰胺的質(zhì)量g，與有機溶劑的體積ml的配比151020，將兩者投料到反應器中，攪拌溶解，其中有機溶劑選氯仿與甲醇的體積配比為1441的混合溶劑；再按照2-氨基乙醇與雙丙烯酸酯或者雙丙烯酰胺的摩爾配比為2332，將2-氨基乙醇也加入到反應器中，控溫070°C攪拌反應至少12小時，反應完成后在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，得到線型聚_β_氨酯/酰胺；(2)按照線型聚-β-氨酯/酰胺的質(zhì)量g，與無水氯仿的體積ml的配比151050，將兩者投料到干燥的反應器中，攪拌溶解，再按照線型聚_β_氨酯/酰胺中的羥基與偶聯(lián)劑的摩爾配比21110，加入偶聯(lián)劑至反應器中，選二異氰酸酯類作為偶聯(lián)試劑，控溫070°C攪拌反應至少2小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至干燥的滴液漏斗中；按照線型聚-β-氨酯/酰胺中的羥基與聚乙烯亞胺的摩爾配比51110，取聚乙烯亞胺于另一干燥反應器中，并按照聚乙烯亞胺的質(zhì)量g，與無水氯仿的體積ml的配比15501000，加入無水氯仿攪拌溶解；將滴液漏斗中的反應液直接滴加到含聚乙烯亞胺的反應器中，至少15分鐘滴加完畢，滴加過程中反應器保持冰浴并攪拌，滴加完畢后，控溫040°C繼續(xù)攪拌反應272小時，反應完成后在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上層清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，再用蒸餾水重新溶解產(chǎn)物，使用截留分子量100010000的超濾管，超濾濃縮以除去未反應的小分子，冷凍干燥濃縮液，得到網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物。3.如權(quán)利要求1所述的網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在基因傳遞中的應用，其特征在于，網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。4.如權(quán)利要求3所述的網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其特征在于，步驟和條件如下(1)細胞的培養(yǎng)細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)，(2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔IXIO4細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到8090%，轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復合物顆粒以及無血清或者含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200μ1，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率；(4)細胞毒性測試采用噻唑藍比色法比較評價基因載體材料的細胞毒性；實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔IXIO4細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C含體積分數(shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達8090%，將不同濃度的材料與細胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20μ1含質(zhì)量分數(shù)為0.5%噻唑藍的磷酸鹽緩沖液，混合物在37°C繼續(xù)作用4小時，加入200μ1二甲基亞砜溶解噻唑藍甲臢結(jié)晶10分鐘，然后用酶標儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm，細胞存活率按下公式計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>Asample是轉(zhuǎn)染后的細胞樣品孔的吸收，Arantral是不與復合物溶液作用的細胞樣品孔的吸收，每組實驗重復三次。5.如權(quán)利要求1所述的網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在基因傳遞中的應用，其特征在于，網(wǎng)狀聚_氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。6.如權(quán)利要求5所述的網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其特征在于，步驟和條件如下取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細胞的細胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5μg熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復合物顆粒溶液100μ1，第二天重復注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果，在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉，麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200μ1熒光素酶底物，10分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。全文摘要本發(fā)明涉及網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及在基因傳遞中的應用。將雙丙烯酸酯或雙丙烯酰胺與2-氨基乙醇溶解在有機溶劑中，制備帶有側(cè)羥基的線型聚-β-氨酯/酰胺；偶聯(lián)劑活化線型聚-β-氨酯/酰胺中側(cè)羥基，并形成交聯(lián)型的網(wǎng)狀分子結(jié)構(gòu)，活化后的網(wǎng)狀聚-β-氨酯/酰胺加入到含聚乙烯亞胺的有機溶劑中形成接枝共聚物。所述的共聚物是一種聚陽離子基因載體，集成了聚乙烯亞胺和聚-β-氨酯/酰胺的優(yōu)點，轉(zhuǎn)染效率高，在同等條件下對非洲綠猴腎細胞介導熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為美國Invitrogen生物公司轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的21倍，細胞毒性小，細胞存活率80％以上。文檔編號C08G81/02GK101812179SQ20091006727公開日2010年8月25日申請日期2009年7月14日優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日發(fā)明者夏加亮,景遐斌,李非凡,田華雨,陳學思,陳磊,黃宇彬申請人:中國科學院長春應用化學研究所