專利名稱：：聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基因治療被科學(xué)家寄望成為未來解決疑難病癥的重要醫(yī)療手段，然而如何將治療基因片段高效傳遞至病灶細(xì)胞內(nèi)一直飽受困擾。目前廣泛應(yīng)用于臨床的病毒類載體存在著重大的安全隱患，造成了基因治療歷史上首例患者死亡事件以及著名的法國"氣泡嬰兒"事件。相對于病毒類基因載體的不安全性，人工合成的陽離子聚合物由于其無免疫源性，分子設(shè)計多樣，尺寸可控并能夠連接靶向物質(zhì)逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點。在眾多已經(jīng)報道的聚陽離子載體中，聚乙烯亞胺(PEI)由于其具有獨特的"質(zhì)子海綿效應(yīng)"能夠?qū)崿F(xiàn)高效的基因傳遞而倍受關(guān)注[參見Boussif0,ZantaM.A,BehrJ.P,etal.Aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinv/vo—polyethylenimine.PAWS,1995;92:7297-7301]。PEI的轉(zhuǎn)染性能強烈依賴于分子量，普遍使用分子量25000的PEI(PEI25k)作為轉(zhuǎn)染載體。PEI的優(yōu)點在于電荷密度集中，對基因物質(zhì)有強的復(fù)合能力，在低氮磷比(N/P)比即能獲得最佳轉(zhuǎn)染效率。但是單純使用均聚物PEI作為基因載體，往往受限于其不可降解性和高的細(xì)胞毒性。聚乙二醇(PEG)因為其優(yōu)異的抑制非特異性吸附能力和良好生物相容性，在已有的報道中經(jīng)常被應(yīng)用于陽離子基因載體的修飾[參見PetersenH,FechnerP.M,FischerD,KisselT.Synthesis,characterization,andbiocompatibilityofpolyethylenimine-graft-poly(ethyleneglycol)blockcopolymers.M/crawo/ecwfes,2002;35:6867-6874]。各種研究表明經(jīng)PEG修飾后，PEI與基因物質(zhì)的納米顆粒復(fù)合物能避免自身凝聚，降低顆粒大小，有效拮抗血清對轉(zhuǎn)染的抑制，降低紅細(xì)胞的聚集。PEG化可以屏蔽復(fù)合物顆粒表面的正電荷，增加其在體內(nèi)高鹽環(huán)境中的穩(wěn)定性，降低細(xì)胞毒性。聚碳酸酯是一種具有良好生物相容性并可實現(xiàn)生物體內(nèi)降解的高分子材料，其中一些帶有功能化基團的聚碳酸酯已經(jīng)被廣泛報道應(yīng)用于藥物釋放載體(參考文獻HuX丄，ChenX.S,LiuS,ShiQ,JingX.B.Novelaliphaticpoly(ester-carbonate)withpendantallylestergroupsanditsfolicacidfiinctionalization.Jowma/尸o/y附erSdewce:尸"W爿..尸o/;/附erC7je附/對/^,2007;1852-1861]。)
發(fā)明內(nèi)容為了解決已有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及應(yīng)用。所合成的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物為可降解陽離子聚合物，未見文獻報道。聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物兼具了聚乙二醇、聚碳酸酯與聚乙烯亞胺的優(yōu)點，克服了PEI均聚物高毒性、不可降解性的缺點。聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物是具有良好的生物相容性，能夠有效地拮抗血清對轉(zhuǎn)染的抑制的高效基因傳遞載體。本發(fā)明提供的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物的結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中，PEI為聚乙烯亞胺，結(jié)構(gòu)為線型或者支化，其結(jié)構(gòu)式如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中聚合度m、n、a、b和c均等于或者大于l。聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備步驟和條件如下(1)按照聚乙二醇單甲醚(mPEG)與2-甲基-2-芐氧羰基碳酸丙烯酯(MBC)的摩爾配比為1:101:100，將兩者投料到干燥的反應(yīng)器中，以mPEG和MBC的總質(zhì)量g與甲苯的體積ml的配比為1:550加入無水甲苯，在13(TC共沸除水至少2小時，共沸除水完成后，控溫13015(TC蒸出部分甲苯，以mPEG和MBC的總質(zhì)量g與剩余的甲苯的體積ml的配比為1:220，作為蒸餾結(jié)束點；將催化劑二乙基鋅以濃度為0.050.5mmol/ml溶解在無水甲苯中，以二乙基鋅與MBC單體的摩爾配比1:100300加入二乙基鋅/甲苯溶液，控溫100130。C攪拌反應(yīng)至少12小時，反應(yīng)完成后在正己垸中沉降，過濾，干燥濾餅，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-芐氧羰基碳酸丙烯酯嵌段共聚物(mPEG-6-PMBC);按照mPEG-6-PMBC質(zhì)量g與四氫呋喃體積ml的配比1:550，將兩者混合溶解后一起投料到反應(yīng)釜中；再按照四氫呋喃與甲醇體積配比為25:1量取甲醇，以催化劑氫氧化鈀/碳與mPEG-6-PMBC質(zhì)量配比1:210稱取氫氧化鈀/碳均勻懸浮在甲醇中，然后一起投料至反應(yīng)釜中；充入氮氣，加氫至壓力0.5，反應(yīng)完成后，過濾除去氫氧化鈀/碳，濾液在乙醚中沉降，過濾，干燥濾餅，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物(mPEG各PMCC);(2)按照mPEG-WPMCC質(zhì)量g與二甲亞砜體積ml的配比為1:10100，將兩者投料到反應(yīng)器中，攪拌溶解，以mPEG-6-PMCC中的羧基與聚乙烯亞胺的摩爾配比為l:14，將聚乙烯亞胺加入至反應(yīng)器中，再按照mPEG-6-PMCC中的羧基與l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)的摩爾配比為l:12，將EDC.HC1也加到反應(yīng)器中，控溫203(TC，攪拌反應(yīng)至少2小時，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液裝入截留分子量為10005000的透析袋中對去離子水透析至少24小時，將透析后的液體冷凍干燥，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物(mPEG-6-PMCC-g-PEI，簡稱聚乙二醇-聚碳酸酯接枝聚乙烯亞胺共聚物)。以下介紹聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。其用法的步驟和條件如下(1)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37。C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)；(2)體外轉(zhuǎn)染I無血清轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基稀釋，按每孔1乂104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37。C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到80~90%,轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，加入基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及無血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積20(HU/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，更換200^1/孔含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)20小時；II含血清轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基稀釋，按每孔1乂104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37"C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到80~90%，轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，加入基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積200pl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率；(4)細(xì)胞毒性測試采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法比較評價基因載體材料的細(xì)胞毒性；實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基稀釋，按每孔lX104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°(:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達80~90%，將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20pl含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5Q/。MTT的PBS溶液，混合物在37'C繼續(xù)作用4小時，加入200^d二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘，然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收值，測試波長選用492nm，細(xì)胞存活率按下公式計算細(xì)胞存活率(e/。h(A^pie/Ac。自i)X100As^^是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收值，Ac。ntrd是不與復(fù)合物溶液作用的細(xì)胞樣品孔的吸收值，每組實驗重復(fù)三次。聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。其用法的步驟和條件如下取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組9只，分別在瘤內(nèi)注射含5jiig熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒溶液lOOpl;第二天重復(fù)注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果；在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉，麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入20(Hil熒光素酶底物，IO分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。有益效果所制備的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物是一種聚陽離子基因載體，集成了聚乙二醇、聚碳酸酯和聚乙烯亞胺各自的優(yōu)點，轉(zhuǎn)染效率高，其在同等條件下對非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為美國Invitrogen生物公司商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的14倍，并能夠有效地拮抗血清對轉(zhuǎn)染的抑制作用，細(xì)胞毒性小，其濃度在不高于200微克/毫升范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率在80%以上。本發(fā)明所制備的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物具有低毒并可生物降解性，因為其所選用的聚乙二醇-聚碳酸酯接枝骨架具有良好的生物相容性，在生理條件下可自行降解、崩潰和代謝，進而被生物體吸收或排出體外，對人體無毒副作用。本發(fā)明所合成的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物在基因傳遞上有很高的使用價值，有廣泛的應(yīng)用前景。圖1為對比不同載體材料在系列濃度下的細(xì)胞毒性測試結(jié)果圖。測試細(xì)胞選用非洲綠猴腎細(xì)胞(Cos-7細(xì)胞)，測試濃度為0200微克/毫升，測試材料分別為聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物的代表PPP-11、PPP-14和PPP-17以及PEI25k和商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，測試結(jié)果以處理后的細(xì)胞存活率(％)來表示。具體實施例方式實施例1:聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物的制備分別按照表1所列投料量，稱取數(shù)均分子量為5000的聚乙二醇單甲醚(mPEG5(KK))與2-甲基-2-節(jié)氧羰基碳酸丙烯酯(MBC)，將兩者投料到不同的干燥的反應(yīng)器中，分別加入300ml的無水甲苯130。C共沸除水5小時，共沸除水完成后，控溫13(TC蒸出部分甲苯，以剩余的甲苯的體積為50ml作為各自蒸餾結(jié)束點；將催化劑二乙基鋅以摩爾濃度0.2mmol/ml溶解配置在無水甲苯中，分別按照表l中的二乙基鋅投料量加入二乙基鋅/甲苯溶液至相應(yīng)的反應(yīng)器中，并遵照表1中的聚合溫度和聚合時間分別進行各自的攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后分別在正己垸中沉降，過濾，干燥濾餅，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-芐氧羰基碳酸丙烯酯嵌段共聚物(mPEG-6-PMBC);將各自的中間產(chǎn)物mPEG-6-PMBC分別溶解在100ml的四氫呋喃中，并投料到不同的反應(yīng)釜中，分別稱取表1中所示相應(yīng)投料量的氫氧化鈀/碳催化劑，并各自均勻懸浮在30ml甲醇中，投料至相應(yīng)的反應(yīng)釜中，充入氮氣，再分別依照表1中相應(yīng)的氫氣壓力充入氫氣，并依照表1所示的氫化溫度和氫化時間分別進行各自的攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后，過濾除去氫氧化鈀/碳，濾液分別在乙醚中沉降，過濾，干燥濾餅，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物(mPEG-Z)-PMCC)，使用核磁共振譜分析產(chǎn)物數(shù)均分子量(Mn)，結(jié)果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例2:聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備分別按照表2中所列出的mPEG-6-PMCC的種類稱取相應(yīng)的投料量，與表2中所述的相應(yīng)反應(yīng)體積的二甲亞砜一起投料到不同的反應(yīng)器中，攪拌溶解，再依照表2所示的聚乙烯亞胺(PEI)種類和投料摩爾量，分別稱取PEI并加入相應(yīng)的反應(yīng)器中，再按照表2所示的投料摩爾量，分別稱取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)也加到相應(yīng)的反應(yīng)器中，控溫25°C，分別依照表2中反應(yīng)時間，各自進行攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液分別裝入截留分子量為3500的透析袋中對去離子水透析72小時，最后分別將透析后的液體冷凍干燥，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物(mPEG-6-PMCC-g-PEI),簡稱PPP，使用核磁共振譜分析產(chǎn)物數(shù)均分子量(Mn)，結(jié)果見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例3:聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒對非洲綠猴腎細(xì)胞(Cos-7細(xì)胞)的體外轉(zhuǎn)染1、Cos-7細(xì)胞的培養(yǎng)取Cos-7細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37'C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2、體外轉(zhuǎn)染(1)無血清轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期Cos-7細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1X104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37'C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到8090%。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，更換200^0/孔不含有胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，再選用熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)為報告基因，分別加入PPP-ll/pGL3、PPP-14/pGL3、PPP-17/pGL3、PEI25k/pGL3以及商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000/pGL3的復(fù)合物顆粒進行轉(zhuǎn)染對比，培養(yǎng)4小時后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，更換200^0/孔含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)20小時。(2)含血清轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期Cos-7細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1X104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37"C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到80~90%。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，更換200^0/孔含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，再選用熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)為報告基因，分別加入PPP-ll/pGL3、PPP-14/pGL3、PPP-17/pGL3、PEI25k/pGL3以及商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000/pGL3的復(fù)合物顆粒進行轉(zhuǎn)染對比，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。3、體外轉(zhuǎn)染效率的測定胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，使用照度計測定轉(zhuǎn)染效率，表示為每毫克蛋白的發(fā)光單元數(shù)(RLU/mgProtein)。表3介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>本發(fā)明中的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物是一種非常高效的基因傳遞載體材料，并且具有拮抗血清對轉(zhuǎn)染的抑制作用。表3分別給出了體外轉(zhuǎn)染實驗中PPP-ll、PPP-14、PPP-17、PEI25k與Lipofectamine2000的最佳轉(zhuǎn)染效率，通過對比可以看出本發(fā)明中PPP-ll、PPP-14和PPP-17所代表的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物具有更高的轉(zhuǎn)染效率；并且通過轉(zhuǎn)染時有血清與無血清實驗結(jié)果的對比，可以看出PPP-ll、PPP-14和PPP-17所代表的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物能夠有效拮抗血清對轉(zhuǎn)染的抑制作用，相對于無血清轉(zhuǎn)染，PPP-11、PPP-14和PPP-17轉(zhuǎn)染效率(RLU/mgProtein)絕對值在有血清轉(zhuǎn)染時下降為45%、52%、58%，而PEI25k與Lipofectamine2000卻分別下降為9%、11%。實施例10:聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物的細(xì)胞毒性測試1、Cos-7細(xì)胞的培養(yǎng)取Cos-7細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37'C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2、毒性測試采用MTT的方法比較評價不同濃度PPP-ll、PPP-14、PPP-17、PEI25k和商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectaminem2000的材料細(xì)胞毒性。實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期的Cos-7細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1乂104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37'C含體積分?jǐn)?shù)為5。/。二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達至|」80~90%。將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20pl含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5。/。MTT的PBS溶液?；旌衔镌?7。C繼續(xù)作用4小時，加入200pl二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘。然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收值，測試波長選用492nm。細(xì)胞存活率按下公式計算細(xì)胞存活率(G/?！?Asampie/Ac。ntr。l)X100As^^是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收值，Ac。ntr。!是不與復(fù)合物溶液作用的細(xì)胞樣品孔的吸收值，每組實驗重復(fù)三次，測試結(jié)果見圖l。通過圖l我們可以看出不同濃度下各種載體材料處理后的細(xì)胞存活率。相對于PEI25k和Lipofectamine，2000，本發(fā)明中PPP-ll、PPP-14和PPP-17所代表的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物是一種對細(xì)胞毒性很小的轉(zhuǎn)染試劑。實施例11:聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細(xì)胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組9只，分別在瘤內(nèi)注射含5pg熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)的PPP-14/pGL3、PPP-17/pGL3與Lipofectamine2000/pGL3復(fù)合物顆粒溶液10(^1。第二天重復(fù)注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200]Lil熒光素酶底物。IO分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果表明PPP-14和PPP-17所代表的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物比Lipofectamine2000具有更高的轉(zhuǎn)染效率。權(quán)利要求1、聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如下PEI為聚乙烯亞胺，結(jié)構(gòu)為線型或者支化，其結(jié)構(gòu)式如下所示其中聚合度m、n、a、b和c均等于或者大于1。2、如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物的制備方法，其特征在于步驟和條件如下(1)按照聚乙二醇單甲醚與2-甲基-2-芐氧羰基碳酸丙烯酯的摩爾配比為l:101:100，將兩者投料到干燥的反應(yīng)器中，以聚乙二醇單甲醚和2-甲基-2-節(jié)氧羰基碳酸丙烯酯的總質(zhì)量g與甲苯的體積ml的配比為1:550加入無水甲苯，在13(TC共沸除水至少2小時，共沸除水完成后，控溫130150'C蒸出部分甲苯，以聚乙二醇單甲醚和2-甲基-2-節(jié)氧羰基碳酸丙烯酯的總質(zhì)量g與剩余的甲苯的體積ml的配比為l:220，作為蒸餾結(jié)束點；將催化劑二乙基鋅以濃度為0.050.5mmol/ml溶解在無水甲苯中，以二乙基鋅與2-甲基-2-節(jié)氧羰基碳酸丙烯酯單體的摩爾配比1:100300加入二乙基鋅/甲苯h2溶液，控溫10013(TC攪拌反應(yīng)至少12小時，反應(yīng)完成后在正己'烷中沉降，過濾，干燥濾餅，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-節(jié)氧羰基碳酸丙烯酯嵌段共聚物；按照聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-芐氧羰基碳酸丙烯酯嵌段共聚物質(zhì)量g與四氫呋喃體積ml的配比1:550，將兩者混合溶解后一起投料到反應(yīng)釜中；再按照四氫呋喃與甲醇體積配比為25:l量取甲醇，以催化劑氫氧化鈀/碳與聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-節(jié)氧羰基碳酸丙烯酯質(zhì)量配比1:210稱取氫氧化鈀/碳均勻懸浮在甲醇中，然后一起投料至反應(yīng)釜中；充入氮氣，加氫至壓力0.52MPa，控溫4060°C，攪拌反應(yīng)2472小時，反應(yīng)完成后，過濾除去氫氧化鈀/碳，濾液在乙醚中沉降，過濾，干燥濾餅，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物；(2)按照聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物質(zhì)量g與二甲亞砜體積ml的配比為1:10100，將兩者投料到反應(yīng)器中，攪拌溶解，以聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物中的羧基與聚乙烯亞胺的摩爾配比為l:14，將聚乙烯亞胺加入至反應(yīng)器中，再按照聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯中的羧基與l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾配比為l:12，將l-(3-二甲氨基丙萄-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽也加到反應(yīng)器中，控溫203(TC，攪拌反應(yīng)至少2小時，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液裝入截留分子量為10005000的透析袋中對去離子水透析至少24小時，將透析后的液體冷凍干燥，得到聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物。3、如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物的應(yīng)用，其特征在于，其在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。4、如權(quán)利要求3所述的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其特征在于步驟和條件如下(1)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37。C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)；(2)體外轉(zhuǎn)染I無血清轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔1乂104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37'C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到80~90%，轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，加入基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及無血清的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200^tl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，更換20(^1/孔含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的新鮮達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20小時；II含血清轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔1乂104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37'C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達到8090%，轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，加入基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200^1/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率；(4)細(xì)胞毒性測試采用噻唑藍(lán)比色法比較評價基因載體材料的細(xì)胞毒性；實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔lX104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°0含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達80~90%，將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入2(^1含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%噻唑藍(lán)的磷酸鹽緩沖液，混合物在37'C繼續(xù)作用4小時，加入200pl二甲基亞砜溶解噻唑藍(lán)甲臢結(jié)晶10分鐘，然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收值，測試波長選用492nm，細(xì)胞存活率按下公式計算.-細(xì)胞存活率(c/。MAsampie/Ac。:^)X100Asan^是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收值，Ac。ntr。i是不與復(fù)合物溶液作用的細(xì)胞樣品孔的吸收值，每組實驗重復(fù)三次。5、如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物的應(yīng)用，其特征在于，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。6、如權(quán)利要求5所述的聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其特征在于步驟和條件如下取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組9只，分別在瘤內(nèi)注射含5pg熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒溶液100^1，第二天重復(fù)注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果，在進行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉，麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200^il熒光素酶底物，IO分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。全文摘要本發(fā)明涉及聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亞胺共聚物與制法及應(yīng)用。將聚乙二醇單甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物中的羧基與聚乙烯亞胺中的氨基通過水溶性碳二亞胺直接縮合形成接枝共聚物。所述的共聚物是一種聚陽離子基因載體，集成了聚乙二醇、聚碳酸酯和聚乙烯亞胺的優(yōu)點，轉(zhuǎn)染效率高，其在同等條件下對非洲綠猴腎細(xì)胞介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為美國Invitrogen生物公司轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine<sup>TM</sup>2000的14倍，并能夠有效地拮抗血清對轉(zhuǎn)染的抑制作用，細(xì)胞毒性小，其濃度在不高于200微克/毫升范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率在80％以上。文檔編號C08G81/00GK101638484SQ20091006742公開日2010年2月3日申請日期2009年8月24日優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日發(fā)明者景遐斌,琳林,田華雨,郭兆培,杰陳,磊陳,陳學(xué)思,黃宇彬申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所