專利名稱：一種具有抗腫瘤活性的水溶性低分子蟲草多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蟲草多糖，同時，本發(fā)明還涉及一種所述蟲草多糖的制備方法及 其在抗腫瘤和提高機體免疫力方面的應用。
背景技術(shù)：
蟲草多糖是蟲草中含量較高的抗腫瘤活性物質(zhì)，但蟲草多糖種類繁多，結(jié)構(gòu)復雜， 目前的研究初步認為多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，但目前對蟲草多糖的化學組成、鏈結(jié) 構(gòu)、分子大小與抗腫瘤作用之間的關(guān)系研究較少，尚缺乏規(guī)律性的科學依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蟲草多糖，其活性成分明確、結(jié)構(gòu)清晰、分子量大小明 確、質(zhì)量可控，用于抗腫瘤和提高機體免疫力，效果可靠，并且?guī)缀鯚o不良反應。本發(fā)明的另一目的在于提供該蟲草多糖制備方法，其方法工藝簡單，產(chǎn)品收率高。本發(fā)明的目的還在于提供該蟲草多糖在抗腫瘤和提高機體免疫力方面的應用。本發(fā)明提供的蟲草多糖，其所含活性多糖成分的含量為94. 57%，平均相對分子量 約為9874。糖鏈構(gòu)型為吡喃糖，該多糖由木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖四種單糖組成，其比 例為0.31 0.89 0.54 1。主要以1 — 2、1 — 3位糖苷鍵連接，還含有少量的1 — 6 鍵合的糖基。本發(fā)明提供的蟲草多糖的制備方法，以人工發(fā)酵培養(yǎng)蟲草菌絲體為原料，包括以 下步驟用30%乙醇作提取劑，提取溫度為70°C，料液比為1 20，提取時間為2小時。提 取液經(jīng)去脂、去蛋白、50%乙醇沉淀，經(jīng)DEAE Sephadex A_25柱和S印hadex G_75柱逐級純 化，冷凍干燥后即得到該蟲草多糖。本發(fā)明的體外活性實驗證明該水溶性低分子蟲草多糖能抑制腫瘤細胞株的生長， 在以人肝癌細胞株Bel-7204和人胃癌細胞株SGC-7901為靶細胞的MTT還原法檢測抗腫瘤 活性試驗中，半數(shù)致死量IC5tl分別為3. 756和5. 256 μ g/ml，表明該水溶性低分子蟲草多糖 具有抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。體內(nèi)活性實驗表明，該水溶性多糖對植入小鼠體 內(nèi)的SarcomalSO腫瘤的生長具有明顯的抑制作用，而且無毒副作用。
具體實施例方式實施例1 水溶性低分子蟲草多糖的制備以人工發(fā)酵培養(yǎng)蟲草菌絲體為原料，古尼蟲草菌絲粉一30%乙醇溶液70°C熱回 流提取一離心、抽濾一保留清液，殘渣反復提取一合并提取液一濃縮一冷凍干燥一粗多糖 CPS —脫脂一sevage法去蛋白一離心一保留清液一加入乙醇使?jié)舛冗_到50% —離心得沉 淀，沉淀經(jīng)DEAE-S印hadex A_25柱層析一苯酚硫酸法跟蹤檢測一合并峰值附近洗脫液一冷 凍干燥一得固體一經(jīng)過S印hadex G-75柱層析一得精制多糖。
實施例2 =MTT還原法檢測水溶性低分子蟲草多糖的抗腫瘤活性試驗1.細胞培養(yǎng)MFC細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，青、鏈霉素各100μ g/mL的RPMI-1640培養(yǎng) 基中，5% C02，37°C，飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)，每48h 72h更換一次新鮮培養(yǎng)基，并按 1 3的比例傳代培養(yǎng)，以保證實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。
MFC細胞常規(guī)培養(yǎng)，每48h更換一次新鮮培養(yǎng)基，傳代時用hanks液(不含Ga2+、 Mg2+等離子)洗細胞兩次后，加胰酶(含0. 05%胰酶、0. 02 % EDTA)1 2mL覆蓋培養(yǎng)瓶底 面，于培養(yǎng)箱中消化10 15min，加入3 4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，收集細胞液離心 (1000rpm/min,7. 5min)，離心后傾去上清液加入新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。2抗腫瘤活性的測定MTT法將IX IO5個/mL細胞懸液接種于96孔板中，每孔加100 μ L。實驗組同時分別加 入不同濃度的測試藥物，每個濃度6個平行孔，另設(shè)6個不加藥物的細胞孔作為陰性對照。 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后1000rpm/min離心lOmin，棄去上清。再向每孔加入0. 5mg/ mL的MTT與ρΗ7· 4的PBS緩沖液的混合液100 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，1500rpm/min離心 15min，棄去上清液，每孔加入150 μ L 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩2min使細胞中的結(jié)晶物充 分溶解，用酶標儀測定570nm波長下的吸光度值，并計算各濃度藥物對細胞生長的抑制率 (M)。繪制細胞活力曲線圖，求出IC5tl值。試驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，水溶性低分子 蟲草多糖具有較強的細胞毒性，其毒性對正常細胞和癌細胞具有一定的選擇性；水溶性低 分子蟲草多糖可用于制備抗腫瘤藥物。表1.水溶性低分子蟲草多糖的細胞毒性試驗結(jié)果
試驗細胞正常人肝細胞株人肝癌細胞株人胃癌細胞株
_L-02_Bel-7204_SGC-7901
ICso Wml)_13.422_3.756_5.256_實施例3 體內(nèi)抑瘤活性實驗小鼠于接種Sarcoma 180腫瘤細胞后第2天靜脈注射給藥，連續(xù)10天，觀察小鼠 的各種表現(xiàn)、腫瘤生長及死亡情況，停藥后1天處死S180實體瘤小鼠，觀察藥物的抑瘤率， 結(jié)果表明①25、50、100mg/kg對S180腫瘤的生長有抑制作用，分別是41.2、51.5、70. 1%, 提示水溶性低分子蟲草多糖具有較強的抗腫瘤作用。


附圖1為蟲草多糖CPS-50-A1的1H NMR譜和13C NMR譜；附圖2為蟲草多糖CPS-50-A1的HSQC圖譜；附圖3為蟲草多糖CPS-50-A1提取分離純化流程。
權(quán)利要求
一種具有抗腫瘤活性的水溶性低分子多糖，由下法制得用30％乙醇作提取劑，從蟲草菌種深層發(fā)酵培養(yǎng)出的菌絲體中提取蟲草多糖，通過單因素和正交實驗確定了古尼蟲草多糖的最佳提取工藝溫度為70℃，料液比為1∶20，提取時間為2小時。提取液經(jīng)去脂、去蛋白、50％、70％乙醇沉淀，冷凍干燥后得到粗多糖。經(jīng)DEAE SephadexA-25柱和SephadexG-75柱逐級純化，冷凍干燥得到一種水溶性低分子多糖CPS-50-A1。
2.權(quán)利要求1所述水溶性低分子多糖的制備方法，其特征在于用30%乙醇作提取 齊U，從蟲草菌種深層發(fā)酵培養(yǎng)出菌絲體中提取蟲草多糖，通過單因素和正交實驗確定了古 尼蟲草多糖的最佳提取工藝溫度為70°C，料液比為1 20，提取時間為2小時。提取液經(jīng) 去脂、去蛋白、50%、70%乙醇沉淀，冷凍干燥后得到粗多糖。經(jīng)DEAE Sephadex A-25柱和 SephadexG-75柱逐級純化，冷凍干燥得到一種水溶性低分子多糖CPS-50-A1。
3.權(quán)利要求1所述的水溶性低分子多糖在制備抗腫瘤藥物中的用途。
4.權(quán)利要求1所述的水溶性低分子多糖在制備提高機體免疫功能的保健品中的用。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有抗腫瘤活性的人工培養(yǎng)的蟲草菌絲體水溶性低分子多糖及其制備方法和用途。用30％乙醇作提取劑，最佳提取工藝溫度為70℃，料液比為1∶20，提取時間為2小時。經(jīng)去脂、去蛋白、50％、70％乙醇沉淀，冷凍干燥后得到粗多糖。粗多糖經(jīng)DEAE SephadexA-25柱和Sephadex G-75柱逐級純化，得到一種水溶性低分子多糖。該多糖純度較高，其多糖含量為94.57％，相對分子質(zhì)量約為9874。該水溶性多糖對人肝癌細胞株Bel-7204和人胃癌細胞株SGC-7901的增殖有顯著的抑制效果，對植入小鼠體內(nèi)的S180腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用。本發(fā)明水溶性低分子蟲草多糖活性成分明確，質(zhì)量可控，可用作抗腫瘤藥物或提高機體免疫功能的保健品。
文檔編號C08B37/00GK101805412SQ20091007032
公開日2010年8月18日 申請日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者劉安軍, 原靜, 司傳領(lǐng), 朱振元, 鐘玥如 申請人:天津科技大學