專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種肝素的提取、分離、純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種肝素的提取、分離、純化方法。
背景技術(shù)：
：肝素(h印arin)是天然的抗凝血物質(zhì)，因而受到了世界各國(guó)的重視。肝素廣泛分布在哺乳動(dòng)物的組織中，如肝、肺、腸粘膜、心、脾、腎、胸腺、胎盤(pán)、肌肉和血液中都有存在。肝素在體內(nèi)多以與蛋白質(zhì)結(jié)合以糖蛋白復(fù)合物的形式存在。這種復(fù)合物沒(méi)有抗凝血活性，但在去除蛋白質(zhì)后，這種抗凝活性逐漸表現(xiàn)出來(lái)。肝素用于臨床雖有60余年的歷史，但到目前為止還沒(méi)有一種能夠完全代替它的產(chǎn)品，所以它仍然是最重要抗凝血和抗血栓的生化藥物之一。肝素具有強(qiáng)抗凝作用，是防治深層靜脈血栓形成等血栓栓塞性疾病的首選藥物，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肝素不但有抗凝、抗血栓形成和調(diào)整血脂的作用，還有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗癌等多種生物學(xué)功能。肝素主要來(lái)源于畜禽副產(chǎn)物中的豬小腸黏膜、牛肺等，并且我國(guó)是國(guó)際上最主要的肝素供應(yīng)國(guó)，肝素鈉是我國(guó)最重要的創(chuàng)匯產(chǎn)品之一，80%的粗品或精品肝素出口到美國(guó)和德國(guó)。但我國(guó)應(yīng)用的低分子肝素主要依靠進(jìn)口，是由國(guó)外將肝素鈉再行降解形成低分子肝素后再輸入到我國(guó)。目前臨床上用于抗血栓的藥劑主要是肝素制劑，據(jù)IMS統(tǒng)計(jì)，2004年肝素市場(chǎng)的全球銷(xiāo)售額已突破40億美元。不斷完善從粗品原料到精品再到成品制劑完備的產(chǎn)業(yè)鏈，研究肝素制備技術(shù)的提升、創(chuàng)新將具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)效益。豬小腸粘膜肝素是我國(guó)重要的出口的生化藥物，但目前生產(chǎn)的肝素產(chǎn)品存在著效價(jià)低、提取率低、環(huán)境污染大、不符合藥典標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品毒副作用大、活性低等缺陷，大多數(shù)是以粗品肝素的形式存在。
發(fā)明內(nèi)容為解決
背景技術(shù)：
中的不足，本發(fā)明提供一種肝素的提取、分離、純化方法，該方法所得到的肝素具有以下特點(diǎn)(l)提取率可達(dá)230.81mg/kg，比傳統(tǒng)方法提高40%;(2)肝素的效價(jià)提高為150U/mg。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案內(nèi)容是該肝素的提取、分離、純化方法，按如下步驟進(jìn)行蛋白酶水解法提取肝素、超聲波輔助鹽析法、樹(shù)脂吸附分離肝素及肝素的純化。蛋白酶水解法、超聲波輔助鹽析法提取肝素及樹(shù)脂吸附分離肝素包括下列步驟-(1)酶解、鹽解及過(guò)濾將勻漿后的豬小腸粘膜移入提取鍋，需要加l:15倍重量的水，用NaOH調(diào)pH至8.5，55。C加熱半小時(shí)，加入豬小腸粘膜質(zhì)量2%的胰蛋白酶反應(yīng)2小時(shí)，加入混合液質(zhì)量5%的NaCL在6(TC反應(yīng)2小時(shí)，之后將上述混合液加入到超聲波藥品處理機(jī)內(nèi)，超聲溫度為40。C，超聲時(shí)間為40min，超聲功率為300W，超聲處理之后用300目的濾布過(guò)濾；(2)吸附將上述濾液移入吸附罐中，在液體溫度為4(TC的條件下，按原來(lái)豬小腸粘膜質(zhì)量的8°/。加入樹(shù)脂，攪拌吸附3小時(shí)；(3)清洗把(2)中的樹(shù)脂倒入不銹鋼桶中，用1.2mol/L的NaCL浸泡洗滌30min;'(4)洗脫把(3)中的樹(shù)脂移入桶中用5mol/L的NaCL浸泡3小時(shí)，要不時(shí)輕輕攪動(dòng)，促使肝素解析；(5)酸處理將洗脫液用HCL調(diào)pH值至3.5處理30min;(6)堿處理將(5)得到的洗脫液用NaOH調(diào)pH至10處理3h;(7)乙醇沉淀將(6)中所得的洗脫液用1.5倍體積的95%酒精處理12h，攪拌靜置，虹吸出上層清液；(8)干燥把下層沉淀取出濾干，在60'C下真空干燥,得到肝素粗品。肝素的純化包括下列步驟(1)S印hadexG50凝膠柱層析分離肝素①溶膠用燒杯取2gS印hadexG50凝膠，用緩沖液在IO(TC水浴中加熱凝膠13h，然后采用傾泄法傾去上層小顆粒的浮膠，防止層析時(shí)堵塞凝膠網(wǎng)孔，將溶好的凝膠與過(guò)濾后的去離子水按3"(W/V)進(jìn)行混合，柱子中應(yīng)先裝入35mm緩沖液并關(guān)閉出水口；②裝柱將①中溶好的凝膠與去離子水的混合液用玻璃棒攪拌均6勻后引流灌入3.6*85cm的柱子中，讓凝膠自然沉積，打開(kāi)出水口，待凝膠自然沉積完畢后，關(guān)閉出水口，灌好后的柱子應(yīng)該表面平整，柱體沒(méi)有氣泡，以免影響分離，如表面不平就用玻璃棒將膠面輕輕攪起，讓其再自然沉降。如柱內(nèi)有細(xì)小的氣泡則應(yīng)該重新裝柱；③平衡灌好的柱子膠面上用緩沖液加滿(mǎn)直至進(jìn)樣口，并確保沒(méi)有氣泡進(jìn)入，然后進(jìn)行平衡25柱床體積；④上樣將肝素樣品500mg用10mL緩沖液溶解后，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾，等緩沖液液面距離膠面2mm左右時(shí)將過(guò)濾后的肝素溶液延柱壁緩慢加入，要注意在加樣時(shí)防止將膠面沖起影響分離。上樣的流速2mL/min，上樣體積為1.5mL;⑤洗脫樣液進(jìn)入膠床后與膠床基本平齊時(shí)用0.2mol/LNH4HC03為流動(dòng)相洗脫樣品，流速為5mL/min，為便于洗脫緩沖液中應(yīng)加入0.lmol/L的NaCL，用咔唑法檢測(cè)，收集不同的洗脫峰，獲得Mr不同的肝素分離組分；收集將各次分離的相同洗脫峰樣品合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，凍干，選擇經(jīng)過(guò)S印hadexG50第一次分離、凍干樣品用0.2mol/L的NH4HC0s溶解，上樣流速為2mL/min;用Superdex30凝膠層析柱進(jìn)行第二次分離，用0.2mol/LNH4HC03為流動(dòng)相洗脫樣品，流速為5mL/min，用咔唑法檢測(cè)，再收集不同的分離組分，濃縮、凍干，得到不同Mr的寡糖片段；(2)QFFSpharose離子交換色譜分離肝素①裝柱將SPS印haroseFF凝膠填料用玻璃棒攪拌均勻后緩慢倒入玻璃柱內(nèi)，使凝膠自然沉積，要注意不要有氣泡出現(xiàn)，待膠面平整后進(jìn)行洗柱；②洗柱用蒸餾水清洗凝膠柱約lh，直至pH為中性，流速為2.0mL/min進(jìn)行壓柱；③平衡用0.2Mol/L的NaCl溶液即A液來(lái)平衡柱子，直到pH為中性；④進(jìn)樣將經(jīng)過(guò)QFFS印harose凝膠柱層析分離系統(tǒng)分離后所獲得的Mr分布范圍小即分子量3000-20000Da的組分20mg溶解于10mL蒸餾水中，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾，上QFFS印harose(90um，2.0求25cm)強(qiáng)陰離子交換柱，以L0mL/min流度，進(jìn)樣量為1.5mL，其上樣方法與凝膠層析的方法一樣；⑤洗雜用A液繼續(xù)洗脫，流速為1.OmL/min，當(dāng)用平衡緩沖液洗脫至基線(xiàn)時(shí)，洗脫停止，這主要是洗脫掉不能吸附的色素及一些雜蛋白等物質(zhì)，這時(shí)檢測(cè)紫外波長(zhǎng)在280nm的吸光值，每2mL為一管收集洗脫液并檢測(cè)有無(wú)肝素；(D洗脫采用梯度洗脫法將事先配好的2mol/L的NaCl溶液裝入恒流泵的B液瓶中，等A液瓶中的洗脫液即A液低于B液時(shí)并且已經(jīng)洗脫至基線(xiàn)時(shí)，將恒流泵中A、B液中間的閥門(mén)打開(kāi)，使A、B混合，并流入層析柱中進(jìn)行洗脫；流速為5.OmL/min，在216nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，QFFSpharose離子交換色譜分離肝素條件為用水和2mol/L的NacL為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為5.OmL/min，在216nm波長(zhǎng)處檢測(cè)；⑦收集在紫外216nm處在線(xiàn)檢測(cè)洗脫液，分別收集各階段洗脫峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，凍干，可獲得不同肝素分離產(chǎn)物。上述方案的緩沖液為去離子水。本發(fā)明的有益效果是由本發(fā)明采用蛋白酶水解法提取肝素及超聲波輔助鹽析法提取肝素相結(jié)合的方法，純化采用S印hadexG50凝膠柱層析分離肝素的方式，由上述方法得到的肝素提取率可達(dá)230.81mg/kg，比傳統(tǒng)方法提高40%，肝素的效價(jià)提高為150U/mg，達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。圖1是酶水解溫度對(duì)肝素提取物率的影響曲線(xiàn)；圖2是酶水解時(shí)間對(duì)肝素提取物率的影響曲線(xiàn)；圖3是料液比對(duì)肝素提取物率的影響(w/v)曲線(xiàn)；圖4是超聲功率和肝素提取率的變化關(guān)系曲線(xiàn)；圖5是超聲溫度和肝素提取率的變化關(guān)系曲線(xiàn)；圖6是超聲時(shí)間對(duì)肝素提取物率的影響曲線(xiàn)；圖7是溫度對(duì)肝素吸附量的影響曲線(xiàn)；圖8是吸附時(shí)間對(duì)肝素吸附量的影響曲線(xiàn)；圖9S印hadexG-50分離肝素圖譜；圖10QFFs印harose離子交換層析分離肝素圖譜；圖11肝素PAGE電泳結(jié)果；圖12是柱層析前的肝素的紫外光譜圖；圖13是柱層析后的肝素的紫外光譜圖；圖14為柱層析純化前的肝素的紅外譜圖；圖15為柱層析純化后的肝素的紅外譜圖；圖16標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物的HPLC圖譜見(jiàn)圖17肝素樣品的HPLC圖譜。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例l、首先對(duì)蛋白酶水解法提取肝素步驟中酶水解溫度、酶水解時(shí)間、料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)。(1)酶水解溫度對(duì)肝素提取率的影響設(shè)定料液比為1:15，提取時(shí)間2h，溫度在4070。C之間取7個(gè)點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，然后測(cè)定吸光值，求出平均值，用空白溶液做對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行樣。根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出肝素提取率與酶水解溫度的關(guān)系曲線(xiàn)圖1。如圖1所示，隨著溫度的提高肝素提取率增加顯著，溫度在55'C時(shí)肝素提取率最高。但溫度過(guò)高肝素提取率明顯下降。(2)酶水解時(shí)間對(duì)肝素提取率的影響試驗(yàn)設(shè)定在提取溫度55'C，料液比1:15條件下，酶水解時(shí)間在0.53.5h之間取7個(gè)點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，然后測(cè)定吸光值，求出平均值，用空白溶液做對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行樣。根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制肝素提取率與酶水解時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，提取時(shí)間在2h之內(nèi)酶水解速度較快，水解2h肝素提取物率最高，以后增加趨于平緩。這表明目的產(chǎn)物與酶解時(shí)間密切相關(guān)，時(shí)間過(guò)短水解不充分，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而使肝素提取物率降低。(3)料液比對(duì)肝素提取率的影響試驗(yàn)設(shè)定在固定溫度55。C、提取時(shí)間2h，料水比在1:51:35之間選取7個(gè)點(diǎn)。然后測(cè)定吸光值，求出平均值，用S白溶液做對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行樣。根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出肝素提取率與料液比的關(guān)系曲線(xiàn)圖，肝素提取率隨料液比的變化規(guī)律如圖3所示。如圖3所示，隨著料液比的增大，肝素的得率提高，料液比在1:51:15之間是上升趨勢(shì)的，當(dāng)料液比為l:15時(shí)肝素提取率達(dá)到最大值，隨著料液比的增大肝素的提取率逐漸減小。通過(guò)單因素試驗(yàn)及其對(duì)結(jié)果分析確定試驗(yàn)因素水平編碼表見(jiàn)表1。試驗(yàn)因素水平編碼表表l編碼水平Xl溫度X2時(shí)間X3料液比-l5011:505521:1016031:15利用SAS(version8.2)軟件對(duì)表中肝素提取率試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析、回歸方差分析顯著性分析。結(jié)果顯示模型的R2=0.9810，說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線(xiàn)形關(guān)系顯著，可以用于肝素酶法提取試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還表明方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是高度顯著的，并且交互項(xiàng)中X1與義3項(xiàng)顯著，因此各個(gè)具體試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)形關(guān)系。各因素經(jīng)回歸擬合后，選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)，得到肝素酶法提取得率對(duì)編碼自變量(提取溫度、時(shí)間和料液比)的二次多項(xiàng)回歸方程為r=9.70+1.54Z2+0.69X3-0.76xj+0.012%,X2—0.58%,%3—0.60%22—084義32通過(guò)響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖考察兩兩因子之間的關(guān)系，為了進(jìn)一步確證最佳點(diǎn)的值，采用SAS軟件的RSREG程序?qū)υ囼?yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，以獲得最大肝素提取得率時(shí)的各提取條件，優(yōu)化后的蛋白酶水解法提取肝素的最佳工藝參數(shù)為提取溫度55°C;時(shí)間2h;料液比1:15，在此條件下肝素提取率為206.83mg/kg，比傳統(tǒng)的鹽析法提取率提高了32%。'實(shí)施例2、超聲波輔助鹽析法實(shí)驗(yàn)(1)超聲功率對(duì)肝素提取率的影響超聲功率分別采取IOOW，150W,200W,250W,300W，350W，400W等7個(gè)水平，料液比為1:15，鹽濃度為5%，溫度為4(TC，超聲時(shí)間1040min，浸漬時(shí)間40min條件下提取，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行樣，按照肝素提取的工藝路線(xiàn)步驟測(cè)定，然后測(cè)定吸光值，求出平均值，同時(shí)用空白溶液做對(duì)照。根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出超聲功率和肝素提取率的變化關(guān)系曲線(xiàn)圖4，功率為300W時(shí)肝素提取率最高。(2)超聲溫度對(duì)肝素提取率的影響超聲溫度分別采取20。C，25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，50°C等7個(gè)水平，在超聲功率300W，超聲時(shí)間40min，料液比為1:15，浸漬時(shí)間40min條件下提取，按照肝素提取的工藝路線(xiàn)步驟測(cè)定，然后測(cè)定吸光值，求出平均值，同時(shí)用空白溶液做對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行樣。根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出肝素提取率與提取溫度的關(guān)系曲線(xiàn)圖5。從圖5可以看出，在所試驗(yàn)的溫度范圍內(nèi)，提取溫度越高，肝素提取率越高，當(dāng)溫度為4(TC時(shí)，肝素提取率最高。(3)超聲時(shí)間對(duì)肝素提取率的影響超聲波時(shí)間分別選取10min，15min，20min，25min，30min，35min，40min等7個(gè)水平，料液比為1:15，在超聲功率300W，溫度40。C，浸漬時(shí)間40min條件下提取，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行樣，按照肝素提取的工藝路線(xiàn)步驟測(cè)定，然后測(cè)定吸光值，求出平均值，同時(shí)用空白溶液做對(duì)照。根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出肝素提取率與超聲時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn)圖6，分析肝素提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)的變化規(guī)律。超聲時(shí)間少于40min時(shí)，超聲波時(shí)間越長(zhǎng)肝素提取率越高，超聲40min時(shí)，肝素提取率達(dá)到最高。超聲時(shí)間再延長(zhǎng)，肝素提取率開(kāi)始下降。在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)五因素二次旋轉(zhuǎn)回歸組合試驗(yàn)優(yōu)化影響超聲波輔助鹽析法提取肝素的工藝條件，選取料液比、超聲溫度、超聲功率、鹽濃度、超聲時(shí)間5個(gè)因素，作為多因素交叉組合試驗(yàn)的考察因子，分別以A、x2、力、A、xs代表，以肝素提取率為響應(yīng)值r，試驗(yàn)因素水平及編碼表見(jiàn)表。試驗(yàn)因素水平及編碼表表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通過(guò)二次旋轉(zhuǎn)回歸組合試驗(yàn)確定肝素提取率的回歸模型方程為Y-30.759722+0.225000X!+1.350000X!2+0.808333X3-1.516667X4-0.300000X5-0.727083X'2+l.300000X1X2+1.187500X2X3+0.448682X'X4-0.025000X2X5+0.435417X22-0.462500X2X3-0.575000X2X4-0.325000X2X5-2.8089583X32-0.287500X3X4+0.448682X3X5-1.464583X42+0.075000X4X5-1.114583X52根據(jù)取得的回歸方程，優(yōu)化后的超聲波輔助鹽析提取肝素的最佳工藝參數(shù)為超聲溫度40'C，超聲時(shí)間40min，將蛋白酶水解法與超聲波輔助鹽析法結(jié)合使用，提取率達(dá)230.81mg/kg，比傳統(tǒng)的鹽析方法提高40%，比單獨(dú)的酶法提取量高22.13%,比單獨(dú)的超聲波法提取高11.66%。因此，選擇酶水解結(jié)合超聲波輔助鹽析法為提取肝素的最佳方法。實(shí)施例3、樹(shù)脂選取表3是樹(shù)脂靜態(tài)吸附效果的比較。在表3中列舉了8種大孔徑樹(shù)脂經(jīng)過(guò)靜態(tài)吸附后，對(duì)各自的吸附效果的比較。不同樹(shù)脂的靜態(tài)吸附效果表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>D208大孔徑強(qiáng)堿性二型陰離子樹(shù)脂，常用于提取肝素鈉，肝素效價(jià)及肝素提取率均較高，產(chǎn)品色澤相對(duì)較好；D290大孔徑苯乙烯一型陰離子樹(shù)脂，產(chǎn)品色澤尚可，但肝素吸附率低；D254大孔徑強(qiáng)堿性季銨型陰離子樹(shù)脂，常用于提取肝素鈉，產(chǎn)品效價(jià)及效價(jià)回收率均最高，但產(chǎn)品色澤較黃，選擇性較差，樹(shù)脂的機(jī)械強(qiáng)度和耐磨性較差，不利于肝素精制；D890大孔徑強(qiáng)堿性苯乙烯陰離子樹(shù)脂，產(chǎn)品效價(jià)及效價(jià)回收率較低，產(chǎn)品色澤較黃；D201大孔徑強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂，性能與201*7相似，耐滲透力、耐磨能力強(qiáng)，產(chǎn)品效價(jià)及效價(jià)回收率較低，產(chǎn)品色澤較黃；D202大孔徑二型強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂，用于含鹽量較高的水和糖液純化。抗物理磨損和抗化學(xué)滲透能力好，產(chǎn)品效價(jià)及效價(jià)回收率較低，產(chǎn)品色澤較白；D301，D311是兩種大孔徑弱堿性陰離子樹(shù)脂，具有高交換容量和機(jī)械強(qiáng)度，高抗有機(jī)污染能力，質(zhì)量總交換量也較大，但在強(qiáng)堿條件下樹(shù)脂的吸附效果不好，肝素的效價(jià)和得率較低，產(chǎn)品的色澤黃。綜合以上因素，選用D208樹(shù)脂作為研究對(duì)象。樹(shù)脂預(yù)處理方法取一定量的干樹(shù)脂在蒸餾水中充分浸泡、溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌lh，用蒸餾水洗凈濾干，力Q4倍量的2mol/L的鹽酸攪拌2h，用蒸餾水洗至中性，濾干;加2倍量2mol/L的NaoH溶液攪拌2h，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/L的鹽酸溶液攪拌2h，水洗至中性。(1)溫度對(duì)肝素吸附量的影響所示樹(shù)脂吸附肝素的條件設(shè)定在NaCL濃度為2M，吸附時(shí)間3h，溫度設(shè)定在2080。C之間研究溫度對(duì)肝素吸附量的影響。溫度直接影響物質(zhì)在水中的溶解度，因此對(duì)肝素吸附量會(huì)有比較顯著的影響。本試驗(yàn)選擇不同的提取溫度，隨著溫度的提高肝素提取率增加顯著，溫度4(TC時(shí)提取率最高，但溫度過(guò)高肝素提取率明顯下降。圖7是吸附都樹(shù)脂吸附肝素量的影響的變化曲線(xiàn)。(2)吸附時(shí)間對(duì)肝素吸附量的影響樹(shù)脂吸附肝素的條件設(shè)定在溫度40'C，鹽濃度為2M,吸附時(shí)間在17h之間研究吸附時(shí)間對(duì)肝素吸附量的影響。吸附時(shí)間對(duì)于肝素的吸附有比較明顯的影響。本試驗(yàn)采用不同的吸附時(shí)間如圖12所示，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，肝素的吸附量增加。圖12吸附時(shí)間對(duì)肝素吸附量的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析肝素是一種聚陰離子，在堿性條件下利于吸附。故選擇pH值8.5，在以上單因素分析的基礎(chǔ)上，我們選取溫度，溶液鹽濃度，吸附時(shí)間3個(gè)因素考察其對(duì)D208樹(shù)脂吸附肝素的影響。取濾液100mL加入4%(質(zhì)量百分比)己處理好的濕樹(shù)脂，放入250mL錐形瓶中，試驗(yàn)按表4所列的因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。表5是正交試驗(yàn)結(jié)果分析。U(34)正交試驗(yàn)因素水平表表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>回歸系數(shù)取值及分析結(jié)果表7<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>用SAS統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)對(duì)D208大孔徑陰離子樹(shù)脂吸附分離肝素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)回歸方程的各項(xiàng)進(jìn)行了方差分析，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9876，方程的模型在0.05水平顯著。最佳提取條件溫度40。C，吸附時(shí)間3h，鹽濃度2%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，在最佳提取工藝下，粗品肝素的效價(jià)達(dá)到150U/mg。實(shí)施例4、純化(1)S印hadexG50分離肝素的結(jié)果將粗品肝素的組分用S印hadexG50凝膠層析分離，其結(jié)果見(jiàn)圖9。S印hadexG50分離條件層析柱3.6*85cm，洗脫液O.2mol/LNMC03溶液，洗脫速度5ml/L，UV檢測(cè)波長(zhǎng):216nm.結(jié)果顯示粗品肝素組分分離后可獲得一大一小兩個(gè)主要的的洗脫峰，肝素組分需要進(jìn)一步的分離，樣品才能獲得較好的分離效果。(2)QFFSpharose分離肝素的結(jié)果經(jīng)過(guò)凝膠分離后的肝素組分已經(jīng)得到了Mr分布范圍很小的組分，再經(jīng)過(guò)QFFS印harose(90um，2.0*25cm)強(qiáng)陰離子交換柱層析分離。QFFSpharose分離結(jié)果如圖10，經(jīng)過(guò)S印hadexG50柱層析后的肝素再用QFFSpharose進(jìn)一步純化，可得到單一的肝素峰，證明肝素經(jīng)過(guò)純化后為均一組分。圖9S印hadexG-50分離肝素圖譜。圖10QFFs印harose離子交換層析分離肝素圖譜。電泳分析結(jié)果肝素PAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖11。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖11所示。D208樹(shù)脂分離后得到的粗品肝素中仍含有少量的雜蛋白和核酸以及硫酸軟骨素等雜質(zhì)，而經(jīng)過(guò)S印hadexG50凝膠層析和QFFs印harose離子交換層析后的肝素為均一組分，基本上去除了蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，電泳顯示為單一的條帶，其分子質(zhì)量在15000Da左右，與標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量相同，說(shuō)明純化后的肝素成分比較均一。從電泳圖可以看出柱層析純化前的肝素的電泳條15帶是連續(xù)的多個(gè)條帶，而經(jīng)過(guò)純化后的肝素電泳條帶是窄而清晰的條帶，說(shuō)明肝素經(jīng)過(guò)純化后是均一的組分，主要成分是肝素寡糖。紫外分析結(jié)果圖12、13分別是柱層析前后的肝素的紫外光譜圖。圖12顯示肝素寡糖組分在280nm和260nm附近有明顯的吸收峰，說(shuō)明肝素寡糖經(jīng)過(guò)S印hadexG50分離后仍含有蛋白質(zhì)和核酸雜質(zhì)；圖13顯示肝素組分在280nm和260nm附近都沒(méi)有明顯的吸收峰，說(shuō)明QFFS印harose離子交換色譜分離后的肝素產(chǎn)品中不含蛋白質(zhì)和核酸，是均一組分的肝素。紅外光譜分析結(jié)果圖14和圖15分別為柱層析純化前和純化后的肝素的紅外譜圖。如圖所示，二譜圖的吸收位置是一致的，在860cm—'和940cm—、處出現(xiàn)肝素的特征吸收峰，其他吸收峰的歸屬見(jiàn)表8。這說(shuō)明肝素原料經(jīng)過(guò)柱層析后得到的肝素的基本結(jié)構(gòu)均沒(méi)有發(fā)生變化。純化前后的肝素相比，大部分吸收峰的位置沒(méi)有發(fā)生變化，但圖14中雜峰較多，說(shuō)明在柱層析之前粗品肝素中含有一定量的雜質(zhì)，經(jīng)過(guò)柱層析分離后得到的肝素純度較高。從紅外光譜圖14和15可以看出，在兩個(gè)譜圖中在3373cm—i和1425cm—'都有特征峰存在，3373cm—'為羥基的伸縮振動(dòng)，1425cm—1:為羥基的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，二者呈寬強(qiáng)峰狀態(tài)，是羥基存在的信號(hào)。621cm—'和586cm—i為羥基的面外彎曲振動(dòng)峰，二者的存在證明了證明了肝素組分中羥基的存在。1670cm—'為酰胺羰基伸縮振動(dòng)，1620cm—1為羧基的羰基伸縮振動(dòng)，二者的存在證明了肝素組分中羰基的存在。表8是肝素寡糖的紅外光譜分析結(jié)果。從表中可以看出肝素寡糖出峰位置、基團(tuán)種類(lèi)和吸收峰類(lèi)型。肝素寡糖的紅外結(jié)果表表8吸收峰類(lèi)型基團(tuán)寡糖峰位-OH,-NH3373(s)rc-h-C-H-2921(w)yc=o-CO-NH(雙建)1670(m)-C021620(s)■yc-o-co-o-(雙鍵)1237(s)yc-o-c-o-1043(s)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>HPLC分析結(jié)果(1)標(biāo)準(zhǔn)品混合物圖譜標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物的HPLC圖譜見(jiàn)圖16。表9是標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物HPLC圖譜的分析結(jié)果。根據(jù)表中標(biāo)準(zhǔn)雙糖的出峰次序和保留時(shí)間可以分析出代表的雙糖片段。標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物的出峰時(shí)間表9<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(2)肝素寡糖雙糖分析結(jié)果純化后的肝素樣品用肝素酶降解后得到的產(chǎn)物雙糖分析的結(jié)果見(jiàn)圖17和表10。從圖17中可以看出肝素樣品的HPLC圖譜的主要的出峰位置和保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)雙糖樣樣品的出峰位置一致，說(shuō)明檢測(cè)的經(jīng)過(guò)亞硝酸降解的肝素樣品中是均一的肝素組分，不含有其他雜質(zhì)。而且肝素的雙糖組成與標(biāo)準(zhǔn)品一致，說(shuō)明肝素的結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)品相同。肝素樣品的雙糖分析結(jié)果如表io所示。肝素雙糖分析結(jié)果表10<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>圖17和表10顯示肝素雙糖分析結(jié)果顯示，肝素主要組成雙糖為a-4UA-[1-4]-GlcN(65.4%)與a-QUA-[1-4]-GlcNAc(13.9%)，a-4UA一[卜4]-GlcNS-6S含量較少，硫酸基團(tuán)的含量少。本試驗(yàn)采用S印hadexG50凝膠柱層析和QFFS印harose強(qiáng)陰離子交換柱層析純化粗品肝素，肝素的效價(jià)從135U/mg提高的純化后的150U/mg。將純化后的肝素用紫外光譜、紅外光譜、PAGE電泳、HPLC進(jìn)行檢測(cè)。紫外光譜掃描的結(jié)果顯示，純化后的樣品在260nm和280mn沒(méi)有吸收峰；肝素的紅外光譜測(cè)定結(jié)果顯示，肝素結(jié)構(gòu)中含有羥基、羧基、酰胺鍵；HPLC雙糖分析結(jié)果顯示，純化后的肝素樣品的主要的出峰位置和保留時(shí)間與肝素標(biāo)準(zhǔn)品雙糖混合物的出峰位置一致肝素主要組成雙糖為a-4UA-[1-4]-GlcN(65.4%)與a-QUA-[1-4]-GlcNAc(13.9%);PAGE電泳色譜圖中可以看出，肝素樣品的分子量范圍很大，純化后的肝素電泳條帶是窄而清晰的條帶。根據(jù)以上的鑒定結(jié)果可以看出，純化后的肝素中不含有蛋白質(zhì)核酸等雜質(zhì)；肝素的結(jié)構(gòu)在純化前后沒(méi)有變化；肝素的分子量從3000到30000Da都有分布；肝素經(jīng)過(guò)純化后是純的均一的組分。本發(fā)明中的超聲波藥品處理機(jī)是由濟(jì)寧金百特電子有限公司制造的，型號(hào)為JBT。權(quán)利要求1、一種肝素的提取、分離、純化方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行蛋白酶水解法提取肝素、超聲波輔助鹽析法、樹(shù)脂吸附分離肝素及肝素的純化。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素的提取、分離、純化方法，其特征在于蛋白酶水解法、超聲波輔助鹽析法提取肝素及樹(shù)脂吸附分離肝素包括下列步驟(1)酶解、鹽解及過(guò)濾將勻漿后的豬小腸粘膜移入提取鍋，需要加l:15倍重量的水，用Na0H調(diào)pH至8.5，55"C加熱半小時(shí)，加入豬小腸粘膜質(zhì)量2%的胰蛋白酶反應(yīng)2小時(shí)，加入混合液質(zhì)量5%的NaCL在6(TC反應(yīng)2小時(shí)，之后將上述混合液加入到超聲波藥品處理機(jī)內(nèi)，超聲溫度為40。C，超聲時(shí)間為40min，超聲功率為300W，超聲處理之后用300目的濾布過(guò)濾；(2)吸附將上述濾液移入吸附罐中，在液體溫度為4(TC的條件下，按原來(lái)豬小腸粘膜質(zhì)量的8%加入樹(shù)脂，攪拌吸附3小時(shí)；(3)清洗把(2)中的樹(shù)脂倒入不銹鋼桶中，用1.2mol/L的NaCL浸泡洗滌30min;(4)洗脫把(3)中的樹(shù)脂移入桶中用5mol/L的NaCL浸泡3小時(shí)，要不時(shí)輕輕攪動(dòng)，促使肝素解析；(5)酸處理將洗脫液用HCL調(diào)pH值至3.5處理30min;(6)堿處理將(5)得到的洗脫液用NaOH調(diào)pH至10處理3h;(7)乙醇沉淀將(6)中所得的洗脫液用1.5倍體積的95%酒精處理12h，攪拌靜置，虹吸出上層清液；(8)干燥把下層沉淀取出濾干，在60。C下真空干燥，得到肝素粗品。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素的提取、分離、純化方法，其特征在于肝素的純化包括下列步驟(1)S印hadexG50凝膠柱層析分離肝素①溶膠用燒杯取2gS印hadexG50凝膠，用緩沖液在IO(TC水浴中加熱凝膠13h，然后采用傾泄法傾去上層小顆粒的浮膠，將溶好的凝膠與過(guò)濾后的去離子水按3:1(W/V)進(jìn)行混合，柱子中應(yīng)先裝入35mm緩沖液并關(guān)閉出水口；②裝柱將①中溶好的凝膠與去離子水的混合液用玻璃棒攪拌均勻后引流灌入3.6*85cm的柱子中，讓凝膠自然沉積，打開(kāi)出水口，待凝膠自然沉積完畢后，關(guān)閉出水口；③平衡灌好的柱子膠面上用緩沖液加滿(mǎn)直至進(jìn)樣口，并確保沒(méi)有氣泡進(jìn)入，然后進(jìn)行平衡25柱床體積；上樣將肝素樣品500mg用10mL緩沖液溶解后，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾，等緩沖液液面距離膠面2mra左右時(shí)將過(guò)濾后的肝素溶液延柱壁緩慢加入，上樣的流速2mL/min，上樣體積為1.5mL;⑤洗脫樣液進(jìn)入膠床后與膠床基本平齊時(shí)用0.2mol/LNH4HC03為流動(dòng)相洗脫樣品，流速為5mL/min，用咔唑法檢測(cè)，收集不同的洗脫峰，獲得Mr不同的肝素分離組分；⑥收集將各次分離的相同洗脫峰樣品合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，凍干，選擇經(jīng)過(guò)S印hadexG50第一次分離、凍干樣品用0.2mol/L的NH4HC03溶解，上樣流速為2mL/min;用Superdex30凝膠層析柱進(jìn)行第二次分離，用0.2mol/LNH4HC03為流動(dòng)相洗脫樣品，流速為5mL/min，用咔唑法檢測(cè)，再收集不同的分離組分，濃縮、凍干，得到不同Mr的寡糖片段；(2)QFFSpharose離子交換色譜分離肝素①裝柱將SPS印haroseFF凝膠填料用玻璃棒攪拌均勻后緩慢倒入玻璃柱內(nèi)，使凝膠自然沉積，待膠面平整后進(jìn)行洗柱；②洗柱用蒸餾水清洗凝膠柱約lh，直至pH為中性，流速為2.0mL/min進(jìn)行壓柱；③平衡用0,2Mol/L的NaCl溶液即A液來(lái)平衡柱子，直到pH為中性；④進(jìn)樣將經(jīng)過(guò)QFFS印harose凝膠柱層析分離系統(tǒng)分離后所獲得的Mr分布范圍小即分子量3000-20000Da的組分20mg溶解于10mL蒸餾水中，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾，上QFFS印harose(90um，2.0氺25cm)強(qiáng)陰離子交換柱，以1.0mL/min流度，進(jìn)樣量為1.5mL，其上樣方法與凝膠層析的方法一樣；⑤洗雜用A液繼續(xù)洗脫，流速為1.0mL/min，當(dāng)用平衡緩沖液洗脫至基線(xiàn)時(shí)，洗脫停止，這主要是洗脫掉不能吸附的色素及一些雜蛋白等物質(zhì)，這時(shí)檢測(cè)紫外波長(zhǎng)在280mn的吸光值，每2mL為一管收集洗脫液并檢測(cè)有無(wú)肝素；⑥洗脫采用梯度洗脫法將事先配好的2mol/L的NaCl溶液裝入恒流泵的B液瓶中，等A液瓶中的洗脫液即A液低于B液時(shí)并且已經(jīng)洗脫至基線(xiàn)時(shí)，將恒流泵中A、B液中間的閥門(mén)打開(kāi)，使A、B混合，并流入層析柱中進(jìn)行洗脫；流速為5.OmL/min，在216nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，QFFSpharose離子交換色譜分離肝素條件為用水和2mol/L的NacL為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為5.0mL/min，在216nm波長(zhǎng)處檢測(cè)；⑦收集在紫外216nm處在線(xiàn)檢測(cè)洗脫液，分別收集各階段洗脫峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，凍干，可獲得不同肝素分離產(chǎn)物。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的肝素的提取、分離、純化方法，其特征在于緩沖液為去離子水。全文摘要本發(fā)明涉及一種肝素的提取、分離、純化方法。該方法包括蛋白酶水解法提取肝素、超聲波輔助鹽析法提取肝素、離子交換樹(shù)脂吸附分離肝素及肝素的純化。該方法所得到的肝素具有以下特點(diǎn)(1)提取率可達(dá)230.81mg/kg，比傳統(tǒng)方法提高40％；(2)肝素的效價(jià)提高為150U/mg。文檔編號(hào)C08B37/00GK101597344SQ20091007197公開(kāi)日2009年12月9日申請(qǐng)日期2009年5月7日優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日發(fā)明者宋大巍,張麗萍,曹榮安,李良玉,李雷剛,楠楊申請(qǐng)人:張麗萍