專利名稱：一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸固相有機載體及其制備方法，更具體的說，是涉及一種通用型聚苯乙烯 基質(zhì)核酸固相有機合成載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
核酸固相有機合成是將固相合成和亞磷酰胺法相結(jié)合，借助于商品化的DNA/RNA合成 儀(如ABI公司的392 DNA/RNA合成儀或GE公司的KTA oligopilot DNA/RNA合成儀)，在 固相載體上依次按照核酸序列進行偶聯(lián)，實現(xiàn)快速、高效、穩(wěn)定的核酸合成。由于固相有機 合成具有自動化程度高、產(chǎn)物量大、沒有序列限制、合成產(chǎn)物易進行化學(xué)修飾等優(yōu)點，因此 是目前獲得大量核酸最主要的途徑之一。
目前大多數(shù)核酸固相載體均是在可控孔度玻璃(CPG)載體上連接目標(biāo)核酸的起始核苷單 體，以此提供核酸序列衍生的活性位點，在此基礎(chǔ)上依次進行目標(biāo)序列的合成，如Sigma公 司的核酸合成系列載體就是將CPG與核苷單體通過琥珀酸鍵連接得到的，CPG上核苷單體作 為合成核酸序列的起始核苷。除琥珀酸鍵外，還有一些化學(xué)間臂也能用于連接CPG和起始核 苷單體，如Alul和Pon分別采用乙二酰鍵和對苯二酚-O,O，-乙酰乙酸鍵作為連接間臂，得到 了不同的CPG固相有機合成載體(Alul, Nucleic Acids Research(19):1527(1991); Pon, Nucleic Acids Research(25) :3629-363 5(1997))。
CPG作為一種無機硅氧基載體，具有表面易衍生、反應(yīng)活性較高、不溶脹等優(yōu)點，但由 于其表面富含羥基，親水性較強，且其保護基在合成過程中易脫落， 一定程度上影響了核酸 的合成效率和質(zhì)量。此外，傳統(tǒng)的固相載體根據(jù)連接的起始核苷(A、 T、 C、 G、 U)分為不同 的種類，要滿足不同序列的合成要求需備齊全部種類的固相載體，提高了試驗成本和工作量。 聚苯乙烯(PS)是一種性能優(yōu)異的有機載體，McCollum C等利用甲基聚苯乙烯偶聯(lián)核苷單 體琥珀酸衍生物作為固相有機合成載體進行DNA的合成，取得了較好的合成效果(McCollum, Tetrahedron Letters 32:4069-4072(1991))。聚苯乙烯表面疏水，通過無水溶劑的淋洗能夠徹底 除去表面的殘留水分，減少水分對核酸合成的干擾，其表面經(jīng)過氨基衍生后活性位點相對較 少，核酸合成過程中不易產(chǎn)生錯誤序列，產(chǎn)物純度較高。針對傳統(tǒng)載體需分類的問題，Lyttle 等開發(fā)了一類以CPG為基質(zhì)的通用載體，它僅提供核酸合成的位點(活性羥基)而不連接起始 核苷，能夠滿足不同核酸序列合成，解決了固相載體分類的麻煩(Lyllle， Nucleic Acids Research24:2793-2798(1996))。 Nelson等也開發(fā)了一種名為"Rainbow "的通用CPG載體，合成性 能也相當(dāng)優(yōu)異(Nelson, BioTechniques 22:752-759(1997))。
本發(fā)明將氨甲基聚苯乙烯與3-氨基-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-l,2-丙二醇通過琥珀酸鍵連 接，制備了一種通用型的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種核酸固相有機合成載體。
本發(fā)明的目的還在于提供一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體，它載量高于傳統(tǒng)載
體，能夠滿足各種核酸序列的合成需要，具有較好的合成性能。
本發(fā)明的目的還在于提供一種核酸固相有機合成載體的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體的制備方法。
本發(fā)明提供的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體，它是將氨甲基衍生的聚苯乙烯載體
通過琥珀酸鍵與3-氨基-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-l,2-丙二醇偶聯(lián)得到的固相載體。載體的載
量大于60pmol/g載體，合成反應(yīng)中每步偶聯(lián)效率大于95%。同時，它具有通用性，能夠滿
足各種核酸序列的合成需要。
本發(fā)明還提供了一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體的制備方法，包括以下步驟
(a) 在濃度為0.1 5.0mmol/g載體的催化劑存在條件下，聚苯乙烯載體與N-氯甲基鄰苯二 甲酰亞胺在有機溶液中反應(yīng)，得到鄰苯二甲酰亞胺甲基聚苯乙烯載體；
(b) 鄰苯二甲酰亞胺甲基聚苯乙烯載體在濃度為3 30%肼的乙醇溶液中反應(yīng)，得到氨甲 基聚苯乙烯載體；
(c) 氨甲基聚苯乙烯載體與琥珀酸酐在有機溶液中于室溫反應(yīng)，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙 烯載體；
(d) 在有機溶液中，琥珀酰胺甲基聚苯乙烯載體與3-氨基-1-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇間臂在濃度為1 10mmol/g載體的催化劑催化下于室溫反應(yīng)，得到所述核酸固相有機 備成載體。
上述制備方法中，所使用的聚苯乙烯載體二乙烯基苯交聯(lián)度為0.5% 15%，更優(yōu)選的是 1%~3%;載體粒徑范圍為20 100(Him，更優(yōu)選的是30 30(Him;所使用的有機溶劑為二氯甲 烷、四氫呋喃、N,N，-二甲基甲酰胺、乙腈、三乙胺、吡啶、2，6-二甲基吡啶中的一種或幾種 的混合溶劑；有機溶劑的用量2 100mL，更優(yōu)選的是4 50mL;反應(yīng)時間為2~48h，更優(yōu)選的 是2 24h;反應(yīng)溫度為室溫 80。C。上述制備方法中，步驟(a)中所使用的催化劑為甲基磺酸、四氯化錫、氫氟酸、三氯化鐵、 三氯化鐵-二苯甲酮、硝基甲垸中的一種；催化劑用量為0.1 5.0mmol/g載體，更優(yōu)選的是 0.2~2.0mmol/g載體；N-氯甲基鄰苯二甲酰亞胺的用量為0.2 5.0mmol/g載體，更優(yōu)選的是 0.5-2.0 mmol/g載體。
上述制備方法中，步驟(b)中所使用的肼的乙醇溶液的濃度為3 30%，更優(yōu)選的是 5%~15°/。；用量為5 50mL/g載體，更優(yōu)選的是10~25mL/g載體。
上述制備方法中，步驟(c)中琥珀酸酐的用量為0.5 10mmol/g載體，更優(yōu)選的是 l~5mmol/g載體。
上述制備方法中，步驟(d)中載體與間臂偶聯(lián)時，3-氨基-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-l,2-丙 二醇間臂的用量為0.5 10mmol/g載體，更優(yōu)選的是l~5mm0l/g載體；反應(yīng)所用的催化劑為 1-羥基苯并三唑、N，N'二環(huán)己基碳二亞胺、N,N'-二異丙基碳二亞胺中的一種或幾種的混合物； 催化劑用量為1 10mmol/g載體，更優(yōu)選的是2 5mmol/g載體。
本發(fā)明公開的制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點
1. 本發(fā)明提供了一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體的制備方法，并得到了一種合 成性能優(yōu)良的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體。
2. 本發(fā)明制備的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體載量大于60pmol/g，高于傳統(tǒng)載體 載量。
3. 本發(fā)明制備的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體能夠滿足各種核酸序列的合成需 要，具有通用性。
4. 本發(fā)明的操作方法簡單易行，反應(yīng)條件溫和，易于工業(yè)化的放大生產(chǎn)。 具體實施方法
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā)明并不僅僅限制于該實施例中。 實施例1
5.0g3-氨基-l,2-丙二醇加入50mL三氟乙酸甲酯中，室溫攪拌反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后蒸 餾除去三氟乙酸甲酯，得油狀產(chǎn)物3-三氟乙酰胺-l,2-丙二醇，產(chǎn)物經(jīng)紅外檢測結(jié)構(gòu)正確，離 子阱質(zhì)譜檢測分子量為187.2，與理論值相符。3.0g3-三氟乙酰胺-l，2-丙二醇加入50mL吡啶 中，攪拌同時加入4.5gDMT-Cl，室溫攪拌反應(yīng)8h，加入2mL甲醇終止反應(yīng)。蒸餾除去溶劑， 產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得到淡黃色油狀產(chǎn)物3-三氟乙酰胺-l-DMT-l,2-丙二醇，產(chǎn)物紅外檢測結(jié)構(gòu)正確，離子阱質(zhì)譜檢測分子量為489.1，與理論值相符。2.5g 3-三氟乙酰胺-l-(4，4，-二甲 氧三苯甲基)-l，2-丙二醇溶于100mL6M氨的甲醇溶液中，室溫攪拌反應(yīng)10h，蒸干得無色油 狀產(chǎn)物3-氨基小DMT-l,2-丙二醇，收率卯％， HPLC檢測純度為96.5%，產(chǎn)物紅外檢測結(jié)構(gòu) 正確，離子阱質(zhì)譜檢測分子量為393.2，與理論值相符。
實施例2
稱取l.Og聚苯乙烯載體(二乙烯基苯交聯(lián)度為2%，粒徑為30 80|_im)， 0.15gN-氯甲基 鄰苯二甲酰亞胺，20mL二氯甲烷加入茄形瓶中，攪拌加入200mg三氯化鐵作催化劑，25°C 攪拌反應(yīng)15h。反應(yīng)結(jié)束后，分別用二氯甲烷(5X10mL)，甲醇(2X10mL)淋洗載體，真空干 燥2h，將干燥后的載體加入10mL10。/。肼的乙醇溶液中，回流反應(yīng)7h，然后用乙醇(5X10mL) 淋洗，真空干燥得氨甲基衍生的聚苯乙烯載體。紅外檢測載體結(jié)構(gòu)正確，水楊醛法測載體氨 基載量為0.48mmo1/ g載體。。
實施例3
稱取2.5g聚苯乙烯載體(二乙烯基苯交聯(lián)度為1.5%，粒徑為80 120pm)， 2.0gN-氯甲基 鄰苯二甲酰亞胺，80mL 二氯甲烷加入茄形瓶中，加入0.5mL甲基磺酸作催化劑，60。C攪拌 反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，分別用N，N，-二甲基甲酰胺(3X10mL)，甲醇(2X lOmL)淋洗載體， 真空干燥2h。將干燥后的載體加入50mL12。/。肼的乙醇溶液中，回流反應(yīng)10h，然后用乙醇 (3X10mL)，甲醇(3X10mL)淋洗載體，真空干燥得氨甲基衍生的聚苯乙烯載體。紅外檢測載 體結(jié)構(gòu)正確，水楊醛法測載體氨基載量為0.89mmo1/ g載體。
實施例4
l.Og氨甲基聚苯乙烯，5.0g琥珀酸酐，15mL吡啶混合，室溫振蕩24h，得到琥珀酰胺甲 基聚苯乙烯載體。干燥后的載體與2.0g 3-氨基-l-DMT-l,2-丙二醇，0.8g 1-羥基苯并三唑，10mL 2，6-二甲基吡啶混合，室溫振蕩48h;過濾收集載體，真空干燥2h。 l.Og干燥后的載體懸浮 于30mL四氫呋喃中，加入5mL甲酸和3mL乙酸酐混的合物(3 h內(nèi)加三次，每次1.5mL)進 行甲?；?，室溫振蕩8h;用20mL乙腈淋洗載體，真空干燥2h，得所需的核酸固相有機合成 載體。分光光度法檢測DMT載量為128.75nmol/g。
7實施例5
2.0g氨甲基聚苯乙烯，4.0g琥珀酸酐，25mL吡啶混合，室溫振蕩過夜，得到琥珀酰胺甲 基聚苯乙烯載體。干燥后的載體與5.0g3-氨基-l-DMT-l，2-丙二醇，3.0gN,N'-二異丙基碳二亞 胺，50mL吡錠混合，室溫振蕩36h;過濾收集載體，真空干燥2h。 2.0g載體懸浮于30mL吡 啶:四氫呋喃(3:4)中，加入10mL甲酸和6mL乙酸酐混的合物(5h內(nèi)加三次，每次3mL)進行甲 ?；?，室溫振蕩12h;用30mL四氫呋喃淋洗載體，真空干燥2h，得所需的核酸固相有機合 成載體。分光光度法檢測DMT載量為85.36pmol/g
實施例6
利用例4中得到的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體，合成寡核苷酸片段 5'-AUUGGCCAUGCUA-3'，按照3，一5'的順序依次在載體上偶聯(lián)核苷亞磷酰胺單體，合成規(guī) 模為lpmol，每個偶聯(lián)循環(huán)操作步驟為(a)DMT保護基的脫除反應(yīng)前，使用無水乙腈充分 洗滌反應(yīng)儀器和固相載體，然后加入0.7mL2。/。三氯乙酸的二氯甲烷溶液，反應(yīng)60s，使用無 水乙腈洗滌除去三氯乙酸和水；(b)偶聯(lián)反應(yīng)將lOOpL O.lmmol/mL亞磷酰胺單體溶液和 95.2pL0.25mmol/mL5-乙硫基四氮唑溶液加入反應(yīng)器中，反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后固相載體 用無水乙腈洗滌；(c)封閉反應(yīng)加入10(HiL16。/。N-甲基咪唑的四氫呋喃溶液和100^10%無 水乙酸酐,10%嘧啶的四氫呋喃溶液，反應(yīng)5s; (d)氧化反應(yīng)加入0.5mL碘氧化溶液，反應(yīng) 45s，將亞磷酸三酯氧化為穩(wěn)定的磷酸三酯，結(jié)束本偶聯(lián)周期。重復(fù)偶聯(lián)步驟直至完成核酸片 段的合成。合成結(jié)束后，取出載體，加入2M氨的甲醇溶液，2(TC反應(yīng)lh，將產(chǎn)物從載體上 切割，后加入32y。NH40H， 55'C反應(yīng)4h脫除保護基。產(chǎn)物進行RP-HPLC檢測，出峰時間 與用Sigma公司CPG載體合成的同序列產(chǎn)物出峰時間相同。質(zhì)譜檢測產(chǎn)物分子量也與理論值 符合。合成過程中分光光度法檢測DMT離子吸光度可計算出每步偶聯(lián)效率為96.5%。
實施例7
利用例5中得到的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體，合成寡核苷酸片段 5，-UAUCCGCUAUUGCA-3，，按照3，一5'的順序依次在載體上偶聯(lián)核苷亞磷酰胺單體，合成 規(guī)模為ll^mo1，每個偶聯(lián)循環(huán)操作步驟為(a)DMT保護基的脫除反應(yīng)前，使用無水乙腈充 分洗滌反應(yīng)儀器和固相載體，然后加入0.70mL2。/。三氯乙酸的二氯甲烷溶液，反應(yīng)60s，使 用無水乙腈洗滌除去三氯乙酸和水；(b)偶聯(lián)反應(yīng)將lOOpL O.lmmol/mL亞磷酰胺單體溶液 和95.2nL0.25mmol/mL5-乙硫基四氮唑溶液加入反應(yīng)器中，反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后固相載體用無水乙腈洗滌；(c)封閉反應(yīng)加入100pL16。/。N-甲基咪唑的四氫呋喃溶液和100pL10% 無水乙酸酐,10%嘧啶的四氫呋喃溶液，反應(yīng)5s; (d)氧化反應(yīng)加入0.5mL碘氧化溶液，反 應(yīng)45s，將亞磷酸三酯氧化為穩(wěn)定的磷酸三酯，結(jié)束本偶聯(lián)周期。重復(fù)偶聯(lián)步驟直至完成核酸 片段的合成。合成結(jié)束后，取出載體，加入2M氨的甲醇溶液，2(TC反應(yīng)lh，將產(chǎn)物從載體 上切割，后加入32%氨水，55。C反應(yīng)4 h脫除保護基。產(chǎn)物進行RP-HPLC檢測，出峰時間 與用Sigma公司CPG載體合成的同序列產(chǎn)物出峰時間相同。質(zhì)譜檢測產(chǎn)物分子量也與理論值 符合。合成過程中分光光度法檢測DMT離子吸光度可計算出每步偶聯(lián)效率為97%。
權(quán)利要求
1. 一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體，其特征在于，它是將氨甲基聚苯乙烯載體與3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇通過琥珀酸鍵偶聯(lián)得到的固相載體，具有如下結(jié)構(gòu)式其中，PS為聚苯乙烯載體，DMT為4，4’-二甲氧三苯甲基。
2. —種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體的制備方法，包含如下步驟(a) 在濃度為0.1 5.0mmol/g載體的催化劑存在條件下，聚苯乙烯載體與N-氯甲基鄰苯二 甲酰亞胺在有機溶液中反應(yīng)，得到鄰苯二甲酰亞胺甲基聚苯乙烯載體；(b) 鄰苯二甲酰亞胺甲基聚苯乙烯載體在濃度為3 30%肼的乙醇溶液中反應(yīng)，得到氨甲 基聚苯乙烯載體；(c) 氨甲基聚苯乙烯載體與琥珀酸酐在有機溶液中反應(yīng)，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯載體；(d) 在有機溶液中，琥珀酰胺甲基聚苯乙烯載體與3-氨基-1-(4，4，-二甲氧三苯甲基)-1,2-丙二醇間臂在濃度為1 10mmol/g載體的催化劑催化下于室溫反應(yīng)，得到如權(quán)利要求1所述 聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中所使用的有機溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、N，N'-二甲 基甲酰胺、乙腈、三乙胺、吡啶、2,6-二甲基吡啶中的一種或幾種的混合溶劑。
4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中所使用的有機溶劑的量為2 100mL，更優(yōu)選的是 4~50mL。
5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中的反應(yīng)時間為248h，更優(yōu)選的是2 24h。
6. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中的反應(yīng)溫度為室溫 8(TC。
7. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(a)所使用的聚苯乙烯載體DVB交聯(lián)度為0.5 15。/。， 更優(yōu)選的是1%~3%。
8. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(a)所使用的聚苯乙烯載體粒徑范圍為20 100(^m， 更優(yōu)選的是30~300|xm。
9. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(a)所使用的催化劑是甲基磺酸、四氯化錫、氫氟酸、 三氯化鐵、三氯化鐵-二苯甲酮、硝基甲垸中的一種。
10. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(a)所使用的催化劑的用量為0.1 5.0mmol/g載體，更優(yōu)選的是0.2~2.0mmol/g載體。
11. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(a)所使用的N-氯甲基鄰苯二甲酰亞胺的用量為0.2 5.0mmol/g載體，更優(yōu)選的是0.5~2.0mmol/g載體。
12. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(b)所使用的肼的乙醇溶液的濃度為3 30%，更優(yōu) 選的是5%~15%。
13. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(b)所使用的肼的乙醇溶液的用量為5 50mL/g載 體，更優(yōu)選的是10 25mL/g載體。
14. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(c)所使用的琥珀酸酐的用量為0.5 10mmol/g載體， 更優(yōu)選的是l~5mmol/g載體。
15. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(d)所使用的3-氨基-1-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇間臂的用量為0.5 10mmol/g載體，更優(yōu)選的是l~5mmol/g載體。
16. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(d)所使用的催化劑種類為1-羥基苯并三唑、N，N' 二環(huán)己基碳二亞胺、N,N'-二異丙基碳二亞胺中的一種或幾種的混合物。
17. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟(d)所使用的催化劑的用量為1 10mmol/g載體， 更優(yōu)選的是2~5mmol/g載體。
18. 如權(quán)利要求1所述的核酸固相有機合成載體，其特征在于，所述的載體載量大于60(imol/g， 偶聯(lián)效率大于95%。
19. 如權(quán)利要求1所述的核酸固相有機合成載體，其特征在于，所屬的載體能夠滿足不同序列 核酸合成的需要，是一種通用型的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體及其制備方法。將低交聯(lián)度的聚苯乙烯載體與N-氯甲基鄰苯二甲酰亞胺反應(yīng)，然后通過肼解反應(yīng)得到氨甲基聚苯乙烯載體；再將3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇與氨甲基聚苯乙烯載體通過琥珀酸鍵進行偶聯(lián)，得到聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體，具有如下結(jié)構(gòu)式，式中PS為聚苯乙烯載體，DMT為4，4’-二甲氧三苯甲基。本發(fā)明得到的載體具有載量高，合成性能優(yōu)異，能夠滿足不同序列核酸固相有機合成的需要等優(yōu)勢，是一種通用型的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機合成載體。
文檔編號C08F112/00GK101519467SQ200910080949
公開日2009年9月2日 申請日期2009年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日
發(fā)明者競 張, 洪 梁, 蘇志國, 馬光輝 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所